Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

التصوير الفلوري متعدد الخلية أحادي الخلية لتصور الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات ومراقبة فيروس نقص المناعة البشرية و HTLV و HBV و HCV وفيروس زيكا وعدوى الأنفلونزا

Published: October 29, 2020 doi: 10.3791/61843
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Laboratory of Biochemical Pharmacology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

يظهر هنا بروتوكول لنهج التصوير الفلوري ، multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA ، RNA ، و protein (MICDDRP) ، وهي طريقة قادرة على التصور المتزامن لخلية واحدة من البروتين الفيروسي والأحماض النووية من أنواع مختلفة وتقطعت بهم السبل. يمكن تطبيق هذا النهج على مجموعة متنوعة من الأنظمة.

Abstract

وقد أعيق التقاط عمليات النسخ المتماثل والتجميع الديناميكيين للفيروسات بسبب الافتقار إلى تقنيات التهجين في الموقع (ISH) القوية التي تمكن من وضع العلامات الحساسة والمتزامنة للحمض النووي الفيروسي والبروتين. غالبا ما تكون طرق التهجين الموضعي التقليدية للحمض النووي (FISH) غير متوافقة مع التلوين المناعي. لذلك قمنا بتطوير نهج التصوير ، MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA ، RNA و protein) ، والذي يتيح التصور المتزامن لخلية واحدة للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين. بالمقارنة مع أسماك الحمض النووي التقليدية ، يستخدم MICDDRP تقنية الحمض النووي المتفرع (bDNA) ISH ، والتي تعمل على تحسين حساسية مسبار قليل النوكليوتيد واكتشافه بشكل كبير. تتيح التعديلات الصغيرة ل MICDDRP تصوير البروتينات الفيروسية بالتزامن مع الأحماض النووية (RNA أو DNA) ذات الخيوط المختلفة. لقد طبقنا هذه البروتوكولات لدراسة دورات حياة مسببات الأمراض الفيروسية المتعددة ، بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1 ، وفيروس T-lymphotropic البشري (HTLV) -1 ، وفيروس التهاب الكبد B (HBV) ، وفيروس التهاب الكبد C (HCV) ، وفيروس زيكا (ZKV) ، وفيروس الأنفلونزا A (IAV). لقد أثبتنا أنه يمكننا تسمية الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات بكفاءة عبر مجموعة متنوعة من الفيروسات. يمكن أن تزودنا هذه الدراسات بفهم ميكانيكي محسن للأنظمة الفيروسية المتعددة ، بالإضافة إلى ذلك ، تعمل كقالب لتطبيق التصوير الفلوري المتعدد للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين عبر مجموعة واسعة من الأنظمة الخلوية.

Introduction

في حين أن الآلاف من الأجسام المضادة التجارية متاحة لتسمية البروتينات على وجه التحديد من خلال مناهج التلوين المناعي التقليدية ، وبينما يمكن هندسة بروتينات الاندماج باستخدام علامات الفلورسنت المحسنة للصور لتتبع بروتينات متعددة في العينة1 ، فإن التصور المجهري للبروتين غالبا ما يكون غير متوافق مع التهجين التقليدي للحمض النووي في الموقع (FISH)2 . أعاقت القيود التقنية في التصور المتزامن للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين باستخدام الأساليب القائمة على التألق الفهم المتعمق لتكاثر الفيروس. يسمح تتبع كل من الحمض النووي الفيروسي والبروتين أثناء العدوى لعلماء الفيروسات بتصور العمليات الأساسية التي تكمن وراء تكاثر الفيروس وتجميعه3،4،5،6.

لقد طورنا نهجا للتصوير ، multiplex immunofluorescent cell القائم على d etection ل DNA ، RNA ، و Protein (MICDDRP) 3 ، والذي يستخدم تقنية الحمض النووي المتفرع (bDNA) في الموقع لتحسين حساسية الكشف عن الحمض النووي7،8،9 . بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم هذه الطريقة مجسات مقترنة لتحسين الخصوصية. تستخدم المجسات الخاصة بتسلسل bDNA الحمض النووي المضخم المتفرع والحمض النووي المضخم لإنتاج إشارة مكثفة وموضعية ، مما يحسن طرق التهجين السابقة التي اعتمدت على استهداف المناطق المتكررة في الحمض النووي9. غالبا ما لا تحتوي الخلايا المصابة في سياق سريري على مواد وراثية فيروسية وفيرة ، مما يوفر سلعة لطريقة حساسة للكشف عن الحمض النووي الفلوري في إعدادات التشخيص. وقد ملأ تسويق تكنولوجيا bDNA من خلال نهج مثل RNAscope7 و ViewRNA10 هذا المكانة. كما أن حساسية التصوير الفلوري bDNA لها فائدة مهمة في بيولوجيا الخلية ، مما يسمح باكتشاف أنواع الحمض النووي النادرة في نماذج زراعة الخلايا. التحسن الكبير في الحساسية يجعل طرق التصوير القائمة على الحمض النووي البريطاني مناسبة لدراسة الفيروسات. ومع ذلك ، فإن العيب المحتمل هو أن هذه الطرق تركز على تصور الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي الريبي والبروتين. تحتوي جميع الخلايا المتكاثرة والعديد من الفيروسات على جينومات الحمض النووي أو تشكل الحمض النووي أثناء دورة النسخ المتماثل ، مما يجعل الطرق القادرة على تصوير كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي ، وكذلك البروتين ، مرغوبة للغاية.

في بروتوكول MICDDRP ، نقوم بإجراء bDNA FISH للكشف عن الحمض النووي الفيروسي باستخدام طريقة RNAscope ، مع التعديلات7. أحد التعديلات الرئيسية على هذا البروتوكول هو تحسين علاج الأنزيم البروتيني بعد التثبيت الكيميائي. يسهل العلاج بالبروتياز إزالة البروتينات المرتبطة بالحمض النووي لتحسين كفاءة تهجين المسبار. يتبع العلاج بالبروتياز حضانة بمسبار (مسبار) قليل النوكليوتيد المتفرع. بعد تطبيق مسبار (مسبار) bDNA ، يتم غسل العينات وتحضينها لاحقا باستخدام الحمض النووي للإشارة المسبقة ومكبر الصوت. يتطلب التهجين المتعدد في الموقع (ISH) ، ووضع العلامات على أهداف جينية متعددة ، مجسات مستهدفة بقنوات ألوان مختلفة للتمايز الطيفي7. يتبع الحضانة مع مكبرات الحمض النووي التألق المناعي (IF).

يضفي bDNA ISH تحسينات في الإشارة إلى الضوضاء عن طريق تضخيم الإشارات الخاصة بالهدف ، مع تقليل ضوضاء الخلفية من أحداث التهجين غير المحددة 7,11. تم تصميم المجسات المستهدفة باستخدام برامج متاحة للجمهور تتنبأ باحتمال أحداث التهجين غير المحددة ، بالإضافة إلى حساب درجة حرارة الانصهار (Tm) للهجين المستهدفللمسبار 7,11. تحتوي المجسات المستهدفة على منطقة من 18 إلى 25 قاعدة مكملة لتسلسل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المستهدف ، وتسلسل فاصل ، وتسلسل ذيل مكون من 14 قاعدة. زوج من المجسات المستهدفة ، لكل منها تسلسل ذيل مميز ، يهجن إلى منطقة مستهدفة (تمتد ~ 50 قاعدة). يشكل تسلسلا الذيل موقع تهجين لمجسات ما قبل مكبر الصوت ، والتي تحتوي على 20 موقعا ملزما لمجسات مكبر الصوت ، والتي تحتوي بالإضافة إلى ذلك على 20 موقعا ملزما لمسبار الملصق. على سبيل المثال ، يتم استهداف منطقة كيلو قاعدة واحدة (kb) على جزيء الحمض النووي بواسطة 20 زوجا من المسبار ، مما يؤدي إلى إنشاء سقالة جزيئية للتهجين المتسلسل باستخدام المضخم الأولي ومكبر الصوت ومسبار الملصق. وبالتالي يمكن أن يؤدي ذلك إلى عائد نظري يبلغ 8000 ملصق فلورسنت لكل جزيء حمض نووي ، مما يتيح الكشف عن الجزيئات المفردة والتحسينات الكبيرة على نهج FISH التقليدي7 (انظر الشكل 1A للحصول على مخطط لتضخيم إشارة bDNA). لإعداد مجسات ل ISH المتعدد ، يجب أن يكون كل مسبار مستهدف في قناة لونية مختلفة (C1 أو C2 أو C3). تمتلك هذه المجسات المستهدفة ذات القنوات الملونة المختلفة تسلسلات ذيل مميزة من 14 قاعدة. ستربط تسلسلات الذيل هذه مضخمات إشارة مميزة بمجسات فلورية مختلفة ، مما يتيح التمايز الطيفي السهل عبر أهداف متعددة. في البروتوكول المقدم ، يقدم الجدول 4 في الخطوة 9 مزيدا من المعلومات حول وضع العلامات الفلورية على المجسات المستهدفة. بالإضافة إلى ذلك ، يقدم الشكل 2 والشكل 3 أمثلة على كيفية اختيارنا لمكبر الصوت المناسب 4-FL (A أو B أو C) (مسبار الفلورسنت وخطوة التهجين النهائية) لتحقيق وضع علامات فلورية محددة لأهداف الحمض النووي الفيروسي المتعددة بعد عدوى HIV-1 و HTLV-1.

لقد أظهرنا العديد من التطبيقات لتصور التألق المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات ، مع ملاحظة المراحل الحرجة من تكاثر الفيروس بدقة زمانية مكانية عالية3،4،5. على سبيل المثال ، سمح لنا التصور المتزامن لخلية واحدة للحمض النووي الريبي الفيروسي والحمض النووي السيتوبلازمي والنووي والبروتين بتصور الأحداث الرئيسية أثناء الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 ، بما في ذلك اتباع نوى تحتوي على الحمض النووي الريبي في السيتوبلازم قبل الدخول النووي وتكامل الحمض النوويالفيروسي 3. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطبيق MICDDRP لتوصيف آثار العوامل المضيفة والعلاج بالعقاقير على العدوى الفيروسية والتكرار 4,5. في Ukah et al. ، تتبعنا إعادة تنشيط نسخ HIV-1 في نماذج خلايا الكمون المعالجة بعوامل عكس زمن الوصول المختلفة لتصور نسخ فيروس نقص المناعة البشرية وعكس الكمون4. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن يسمح لنا MICDDRP بتصور التغيرات المظهرية المرتبطة بالتثبيط المضاد للفيروسات المنسوب إلى العلاج بالجزيئات الصغيرة أو تقييد عامل المضيف. كدليل على المفهوم على متانة نهجنا وقابليته للتطبيق على نطاق واسع ، أثبتنا أنه يمكننا استخدام تعديلات بروتوكولنا لتسمية الحمض النووي الفيروسي بكفاءة لمتابعة العدوى ليس فقط في فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) -1 ، ولكن أيضا فيروس T-lymphotropic البشري (HTLV) -1 ، فيروس التهاب الكبد B (HBV) ، فيروس التهاب الكبد C (HCV) ، فيروس زيكا (ZIKV) وفيروس الأنفلونزا A (IAV). نظرا لأن دورة حياة HIV-1 تتكون من كل من أنواع الحمض النووي الفيروسي والحمض النووي الريبي ، فقد أجرينا غالبية تحسيننا ل MICDDRP بعد حركية تكرار HIV-1. ومع ذلك ، بالإضافة إلى ذلك ، فقد أثبتنا أنه يمكننا تتبع تخليق نسخ الحمض النووي الريبي الفيروسية المختلفة لأي من أو كليهما من الحس (+) و antisense (-) في الفيروسات مثل ZIKV و IAV و HBV و HCV لمراقبة النسخ الفيروسي والنسخ المتماثل3،4،5،6. تهدف الدراسات إلى تحسين الفهم الميكانيكي للعديد من العمليات الفيروسية وتكون بمثابة مبدأ توجيهي لتنفيذ تقنية التصوير الفلوري هذه لمجموعة واسعة من النماذج الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلايا البذور (الخلايا المعلقة مقابل الخلايا الملتصقة) على أغطية أو شرائح الغرفة (البروتوكول المقدم يستخدم coverslips).

  1. بذر الخلايا المعلقة
    1. تحضير أغطية مطلية ب poly-D-lysine (PDL) (تسهل التصاق خلايا التعليق بغطاء الغطاء) عن طريق احتضان أغطية الغطاء أولا في الإيثانول (EtOH) لمدة 5 دقائق (تعقيم أغطية الغطاء وإزالة أي بقايا). ثم اغسل 2x في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) قبل احتضان أغطية في PDL (20 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة (دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (RT).
    2. إزالة PDL وغسل 2x في برنامج تلفزيوني. خلايا بيليه (مصابة / عالجت سابقا بناء على ظروف التصوير المطلوبة) وإعادة تعليق 106خلايا في 50 ميكرولتر من PBS. ضع 50 ميكرولتر من الخلايا على الزجاج (مطلي ب PDL) واحتضانها في RT لمدة 30 دقيقة.
  2. بذر الخلايا الملتصقة
    1. توضع الخلايا المستزرعة على غطاء معقم في طبق من 6 آبار وتصيب الخلايا بجزيئات فيروسية أو تعالج بمركب ذي أهمية. السماح للخلايا بالوصول إلى التقاء 50-70٪ قبل تحضير العينة لتجارب التصوير.

2. التثبيت الخلوي: للحفاظ على التشكل الخلوي لدراسات التصوير الفلوري

ملاحظة: احتفظ بنسبة 4٪ PFA و PBS في RT لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التثبيت الخلوي.

  1. قم بشفط الوسائط الخلوية ، واغسل الخلايا على أغطية 3x في PBS ، وقم بإصلاح الخلايا في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 30 دقيقة. نضح PFA وغسل الخلايا في PBS 2x.
    ملاحظة: يمكن الآن تجفيف الخلايا وتخزينها ، إذا رغب المجرب في استئناف التجربة في تاريخ آخر. يمكن تجفيف الخلايا الثابتة في EtOH قبل التخزين.
    1. قم بإزالة PBS بعد الغسيل بعد التثبيت الخلوي واستبدله ب 500 ميكرولتر من 50٪ EtOH (v / v في الماء). احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    2. قم بإزالة 50٪ EtOH واستبدلها ب 500 ميكرولتر من 70٪ EtOH. احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    3. قم بإزالة 70٪ EtOH واستبدله ب 500 ميكرولتر من 100٪ EtOH. احتضان في RT لمدة 5 دقائق.
    4. قم بإزالة 100٪ EtOH واستبدله ب EtOH طازج 100٪.
      ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا المجففة في -20 درجة مئوية لمدة 6 أشهر. ختم الألواح بشريط أو بارافيلم قبل التخزين لمنع تبخر EtOH.
    5. إعادة ترطيب الخلايا للانتقال إلى وضع العلامات الفلورية المتعددة للخلايا / الفيروسات.
    6. قم بإزالة 100٪ EtOH واستبدله ب 500 ميكرولتر من 70٪ EtOH. احتضان في RT لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: لا تدع الخلايا تجف في أي وقت. استخدم دائما ما يكفي من الحل لغمر جميع الخلايا.
    7. قم بإزالة 70٪ EtOH واستبدله ب 500 ميكرولتر من 50٪ EtOH. احتضان في RT لمدة 2 دقيقة.
    8. قم بإزالة 50٪ EtOH واستبدله ب 1x PBS.
      ملاحظة: قم بإعداد تخفيف الأنزيم البروتيني ، ومجسات التهجين ، ومحلول الغسيل قبل علاج الأنزيم البروتيني (الخطوة 4) وتطبيق المسبار المستهدف (الخطوة 5). يتم تقديم تعليمات محددة حول إعداد الكاشف في بداية كل خطوة على حدة.
الكواشف ملاحظات أخرى
محلول البروتياز التحضير في 1X PBS
مسبار (مسبار) قليل النوكليتودي المستهدف تمييع في التهجين العازلة
غسل العازلة يغسل باتباع خطوات التهجين المستهدفة
المخزن المؤقت التهجين وصفة معروضة في الجدول 3

الجدول 1: الكواشف الرئيسية في بروتوكول MICDDRP.

3. نفاذية الخلية: يزيد من الوصول إلى الخلية والعضيات الخلوية لدخول الجزيئات الكبيرة (الأجسام المضادة ، مجسات تهجين الحمض النووي)

  1. قم بإزالة 1x PBS بعد التثبيت الخلوي أو الإماهة واستبدله ب 500 ميكرولتر من 0.1٪ (v / v) Tween-20 في 1x PBS. احتضان في RT لمدة 10 دقائق. استبدل واحدا تلو الآخر. اغسل مرة واحدة مع 500 ميكرولتر من 1x PBS وأضف 1x PBS طازجا.

4. تثبيت Coverslip على الشريحة الزجاجية ومعالجة البروتياز لإزالة بروتينات ربط الحمض النووي من الحمض النووي الفيروسي / الخلوي الثابت لتحسين كفاءة التهجين

ملاحظة: تحضير محلول البروتياز الثالث المخفف (انظر تفاصيل الكاشف في جدول المواد) أثناء النفاذية الخلوية. دع البروتياز يصل إلى RT لمدة 10 دقائق قبل النفاذية.

  1. ضع قطرة صغيرة من طلاء الأظافر على شريحة زجاجية معقمة. جفف الظهر (الجانب بدون طبقة خلوية) وضع حافة الغطاء على قطرة طلاء الأظافر ، مع توجيه الجانب مع الخلايا الملتصقة لأعلى. أضف بضع قطرات من PBS على غطاء الغطاء المتجمد لمنع الجفاف.
    1. ارسم دائرة (على بعد حوالي 3 مم من غطاء الغطاء) حول محيط الغطاء الملتصق الآن بالشريحة باستخدام قلم حاجز كاره للماء (قلم طارد للماء يحافظ على الكواشف موضعية على الخلايا).
  2. تمييع البروتياز الثالث في 1x PBS (100 ميكرولتر / غطاء الغطاء).
    ملاحظة: قد يلزم تعديل تركيز الأنزيم البروتيني اعتمادا على الاختلافات في أنواع الخلايا أو المجسات أو الحمض (الأحماض) النووية المستهدفة من خلال التحسين التجريبي (انظر المناقشة). بالنسبة لوضع العلامات الأكثر كفاءة على الحمض النووي الريبي / الحمض النووي عبر الأنظمة الفيروسية المختلفة ، حققنا نجاحا مع التخفيفات التالية المعروضة في الجدول 2 أدناه مع التخفيفات التي تتراوح من (1 إلى 2 ) - (1 إلى 15) (البروتياز إلى 1x PBS).
التحقيق في الأهداف تخفيف البروتياز في 1X PBS (البروتياز الثالث إلى 1X PBS)
HIV-1 الحمض النووي / الحمض النووي الريبي 1 إلى 5
HTLV-1 الحمض النووي / الحمض النووي الريبي 1 إلى 5
HBV pgRNA وإجمالي الحمض النووي الريبي HBV 1 إلى 15
IAV RNA 1 إلى 15
ZIKV RNA 1 إلى 2

الجدول 2: التخفيفات البروتينية III في PBS لتهجين الحمض النووي الفيروسي.

  1. صب 1x PBS على غطاء الغطاء بعد الشلل وتطبيق البروتياز المخفف الثالث.
  2. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. صب محلول الأنزيم البروتيني وغمر الشرائح في 1x PBS. حرك مع طبق هزاز لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل مع 1x PBS الجديد.
    1. للكشف عن الحمض النووي فقط ، اغسل العينات ثلاث مرات بالماء الخالي من النيوكلياز لمدة 2 دقيقة لكل منها ، تليها الحضانة مع 5 ملغ / مل RNase A المخفف في PBS لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    2. صب محلول RNase A ، واغسل 3x لمدة 2 دقيقة بماء عالي النقاء. استمر مع ISH للمسبار (التحقيقات) المستهدفة.
      ملاحظة: يعمل المخزن المؤقت للتهجين على تحسين اكتشاف vDNA دون التأثير على كفاءة تلطيخ vRNA للنتائج المقدمة (النتائج التمثيلية). تمييع مجسات قناة الحمض النووي 1 (C1) 1: 1 مع مسبار التهجين. تمييع مجسات RNA C2 و C3 في المخزن المؤقت للتهجين. مجسات C2 و C3 المستخدمة في دراسات التصوير لدينا موجودة في حلول 50X (1:50 ؛ المسبار المستهدف إلى المخزن المؤقت للتهجين).
  4. قم بإعداد مخزن التهجين المؤقت في الماء الخالي من النيوكلياز باتباع الإجراء خطوة بخطوة أدناه:
    1. في أنبوب سعة 15 مل ، أضف 700 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، و 300 ميكرولتر من 50٪ (الوزن / الحجم (وزن / حجم)) كبريتات ديكستران ، و 300 ميكرولتر من 5 م كلوريد الصوديوم ، و 125 ميكرولتر من 200 مللي مول من سترات الصوديوم (درجة الحموضة 6.2) ، و 375 ملغ (مسحوق) من كربونات الإيثيلين.
    2. تخلط جيدا باستخدام دوامة لإذابة كربونات الإيثيلين (تأكد من إذابة كل المسحوق ومحلول شفاف).
    3. أضف 25 ميكرولتر من 10٪ (الحجم / الحجم (v / v)) Tween-20 وما يكفي من الماء الخالي من النيوكلياز لإكمال 2.5 مل (محلول 2x).
      ملاحظة: يمكن العثور على وصفة المخزن المؤقت للتهجين المقدمة في الجدول 3 أدناه. الحل مستقر لمدة أسبوع. تأكد من الخلط الكافي لمنظف Tween-20 ، مع الحرص على منع فقاعات المحلول.
الكاشف تركيز المخزون ملاحظات إضافية
مياه خالية من النيوكلياز غير متوفر
ديكستران كبريتات 50٪ (وزن / رأسي) لزج جدا
كلوريد الصوديوم 5 م
سترات الصوديوم (درجة الحموضة 6.2) 200 مللي متر يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية
كربونات الإيثيلين غير متوفر ذرور
توين -20 10٪ (V / V)

الجدول 3: قائمة الكواشف العازلة للتهجين.

5. الحضانة باستخدام مجسات التهجين المستهدفة DNA / RNA: ترتبط مجسات قليل النوكليوتيد المستهدفة بالمنطقة (المناطق) ذات الأهمية ، مما يؤدي إلى إنشاء سقالة جزيئية لمكبرات الصوت المسبقة ومكبرات الصوت ومجسات الفلورسنت لربطها.

ملاحظة: يتم تسخين مجسات الحمض النووي / الحمض النووي الريبي عند 40 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (أثناء نفاذية الخلية) وتبرد إلى RT لمدة 10 دقائق على الأقل ، إذا لم يتم تضمين علاج RNase. إذا كانت هناك حاجة إلى معالجة RNase أو مزيد من معالجة العينة قبل تهجين المسبار المستهدف ، فقم بإجراء مجسات دافئة وفقا لذلك. قم بتدوير مجسات C2 و C3 بعد الاحترار وتخفيفها في المخزن المؤقت للتهجين. بعد التخفيف ، يمكن تسخين مجسات C2 و C3 لفترة وجيزة. قم بتسخين محلول الغسيل 50x (انظر جدول المواد لمزيد من التفاصيل) عند 40 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة وقم بتخفيفه إلى 1x في ماء بدرجة البيولوجيا الجزيئية.

  1. احتضان 200 ميكرولتر من مخزن التهجين عند 67 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل إضافة مسبار (مسبار) التهجين. تمييع التحقيق في التهجين العازلة (وصفة المدرجة في الجدول 2). أضف 50 ميكرولتر / غطاء غطاء.
  2. احتضان في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (ساعة). مجسات صب وشرائح غمر في 1x غسل العازلة . حرك بواسطة طبق هزاز لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x.

6. مكبر للصوت (أمبير) 1-FL التهجين: إضافة مضخم مسبق مكمل لتسلسل الذيل لمجسات الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المستهدفة (الخطوة 5)

ملاحظة: يجب أن تكون مكبرات الصوت في RT قبل الاستخدام. أخرج كل مكبر صوت فردي من الثلاجة قبل 30 دقيقة من الاستخدام واتركه على المقعد في RT.

  1. قم بإزالة الشرائح من 1x محلول غسيل واضغط / امتصها لإزالة السائل الزائد.
  2. أضف قطرة واحدة من Amp 1-FL على غطاء الغطاء. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. صب أمبير 1-FL وتغمر في 1x غسل العازلة. حرك عن طريق هزاز الطبق لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x.

7. تهجين Amp 2-FL: الحضانة مع مضخم الإشارة مع تسلسل التعرف المماثل على مكبرات الصوت المسبقة (Amp 1-FL)

  1. قم بإزالة الشرائح من 1x محلول غسيل واضغط / امتصها لإزالة السائل الزائد.
  2. أضف قطرة واحدة من Amp 2-FL على غطاء الغطاء. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. صب أمبير 2-FL وتغمر في 1x غسل العازلة. حرك عن طريق هزاز الطبق لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x.

8. تهجين Amp 3-FL: الحضانة مع مضخم الإشارة الثاني

  1. قم بإزالة الشرائح من 1x محلول غسيل واضغط / امتصها لإزالة السائل الزائد.
  2. أضف 1 قطرة من Amp 3-FL على غطاء الغطاء. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. صب أمبير 3-FL وتغمر في 1x غسل العازلة. حرك عن طريق هزاز الطبق لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x.

9. تهجين Amp 4-FL: تسمية الفلورسنت وخطوة التهجين النهائية

ملاحظة: أولا ، انظر الجدول 4 لاختيار Amp 4 المناسب (A أو B أو C) - FL بناء على قنوات المسبار (المسبار) المستهدف. قم بتقييم ما هو Amp 4-FL المطلوب لتسمية الحمض النووي / الحمض النووي الريبي محل الاهتمام. يتم توفير مثال في الجدول أدناه:

A B C
قناة الحمض النووي 1 (C1) 488 550 550
قناة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي 2 (C2) 550 488 647
قناة الحمض النووي الريبي 3 (C3) 647 647 488

الجدول 4: اختيار مسبار الفلورسنت Amp 4 (A أو B أو C) -FL ل ISH المتعدد.

ملاحظة: بالنسبة ل FISH متعدد الإرسال (أهداف متعددة) ، يعد اختيار Amp 4 (A أو B أو C) - FL الصحيح أمرا بالغ الأهمية لتسمية هدفك (اهتماماتك) بشكل صحيح. تحتوي المجسات المستهدفة (الخطوة 5) على قنوات ألوان مختلفة (C1 أو C2 أو C3) ، والتي تملي تسمية الفلورسنت الخاصة بها (Alexa 488 أو Atto 550 أو Alexa 647) ، بناء على Amp 4-FL المختار. يتم توفير أمثلة على اختيار مجموعات الفلوروفور للتصوير المتعدد في أساطير الشكل 2 والشكل 3. كمثال إضافي ، سيؤدي اختيار Amp 4B-FL إلى تسمية مجسات DNA C1 بشكل انتقائي باستخدام مجسات Atto 550 و RNA C3 باستخدام Alexa 647.

  1. قم بإزالة الشرائح من 1x محلول غسيل واضغط / امتصها لإزالة السائل الزائد.
  2. أضف 1 قطرة من Amp 4-FL على غطاء الغطاء. تحضن في فرن مرطب على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: باتباع الخطوة 9.2 ، احتفظ بالعينات مغطاة ومحمية من الضوء.
  3. صب أمبير 4-FL وتغمر في 1x غسل العازلة. حرك بواسطة طبق هزاز لمدة 2 دقيقة في RT. كرر الغسيل باستخدام محلول غسيل جديد 1x. يغسل مع 1x PBS (2 دقيقة) وتخزينها في PBS.

10. تلطيخ البروتين المناعي: لتسمية البروتين (البروتينات) ذات الأهمية

  1. صب PBS وإضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للحظر (1٪ w / v BSA ، 10٪ v / v FBS في PBS مع 0.1٪ v / v Tween-20 (PBST)) إلى غطاء الغطاء. احتضان 1 ساعة في RT.
  2. صب العازلة حجب وتطبيق 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف في PBST + 1٪ w / v BSA. احتضان 1 ساعة في RT.
  3. اغسل الشريحة مرتين باستخدام PBST لمدة 10 دقائق في RT مع الرج.
  4. تطبيق الجسم المضاد الثانوي المفضل لمدة 1 ساعة في RT في PBST + 1٪ w / v BSA.
  5. اغسل الشريحة باستخدام PBST لمدة 10 دقائق في RT مع الاهتزاز.

11. تلطيخ النووية: مكافحة وصمة عار النوى بعد المناعية

  1. صب PBST وتطبيق DAPI أو بقعة نووية من اختيارك لمدة 1 دقيقة في RT.
  2. اغسل الشريحة مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق في RT مع الاهتزاز.

12. تصاعد

  1. ضع 1 قطرة من محلول مضاد للتلاشي (على سبيل المثال ، Prolong Gold) على شريحة زجاجية معقمة جديدة (أولا ، نظف الشريحة باستخدام EtOH واتركها تجف لضمان عدم وجود بقايا على الزجاج). بنفس الطرف ، انشر قطرة المحلول المضاد للتلاشي لتغطية مساحة بحجم قسيمة الغطاء تقريبا.
    ملاحظة: المحلول المضاد للتلاشي لزج للغاية وقد يكون من الصعب ماصته. قد يؤدي قطع الطرف من طرف 200 ميكرولتر قبل السحب إلى التخفيف من هذه المشكلات.
  2. قم بإزالة غطاء الغطاء مع عينة الخلية من الشريحة واغمرها في PBS لإزالة طلاء الأظافر المتبقي في الخلف باستخدام الملقط و PBS. ملقط جاف وظهر غطاء باستخدام Kimwipe.
  3. قم بتضمين غطاء الغطاء برفق في قطرة المحلول المضاد للتلاشي ، مع وضع جانب العينة (الجانب مع طبقة الخلية) من غطاء الغطاء عند السقوط).
  4. دع العينات تجف بين عشية وضحاها.

13. التصوير

  1. صورة مع المجهر epifluorescent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصور الشكل 1 مخططا ل MICDDRP. يتبع وضع العلامات على الحمض النووي والحمض النووي الريبي تلطيخ المناعة. يزيد استخدام مكبرات الصوت المتفرعة من الإشارة ، مما يسمح باكتشاف جزيئات الحمض النووي المفردة.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي ل MICDDRP وسير العمل خطوة بخطوة. (أ) يتم تضخيم إشارة bDNA عبر الحمض النووي المتفرع للمكبر الأولي ومكبر الصوت لتعزيز الكشف عن الحمض النووي الفيروسي (1) وأنواع الحمض النووي الريبي (2). يتم تهجين مجسات Oligonucleotide في أزواج (ZZ في التخطيطي) إلى الهدف (الأهداف) ذات الأهمية ، مما يؤدي إلى إنشاء سقالة لمكبر الصوت المسبق (Amp 1-FL ، الخطوة 6 في البروتوكول) ، ومكبر الصوت (Amp 2- & 3-FL) ، ومجسات الفلورسنت (Amp 4 ، الخطوة 9 في البروتوكول). راجع الجدول 4 لاختيار Amp 4 (A أو B أو C) -FL المناسب ل ISH المتعدد. يتبع وضع العلامات على الحمض النووي بروتينات مناعية ذات أهمية (3). (ب) ثلاث عشرة خطوة رئيسية في بروتوكول MICDDRP مع تقدير المدة الزمنية لكل خطوة على حدة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

كان تطبيق MICDDRP لدراسة مسار عدوى HIV-1 أداة مفيدة في تتبع حركية تكاثر الفيروس في الخلايا الأولية. كدليل على مفهوم هذا الإجراء ، يتم تصنيف الحمض النووي لفيروس نقص المناعة البشرية -1 والحمض النووي الريبي والبروتين في وقت واحد وتصوره مجهريا على مستوى الخلية الواحدة (الشكل 2). يتم تصور اثنين من جينومات الحمض النووي HIV-1 في خلية واحدة ، حيث يقومون بنشاط بنسخ الحمض النووي الريبي الفيروسي (vRNA). تم تصدير vRNA من خلال مجمع المسام النووية ويتم تصنيع البروتين الفيروسي في السيتوبلازم.

Figure 2
الشكل 2: MICDDRP لخلايا الدم الأولية أحادية النواة (PMBCs) المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1. PMBCs المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 (NL4.3) في تعدد العدوى (MOI) من 2. تم إصلاح الخلايا بعد 48 ساعة من الإصابة (hpi). (أ) مسبار HIV-1 bDNA FISH (المسمى ATTO 550 ؛ أحمر في الشكل). يهجن هذا المسبار إلى القالب (3'<-5') حبلا vDNA لمنع الحديث المتبادل مع الإحساس (+) vRNA. (ب) الحمض النووي الريبي HIV-1 غير المقسم (المسمى Alexa 647 ؛ أخضر في الشكل). يهجن مسبار HIV-1 vRNA إلى نسخ فيروسية تم نسخها في الاتجاه 5 '->3'. (ج) التلوين المناعي لبروتين قفيصة HIV-1 (p24) (جسم مضاد ثانوي مقترن ب Alexa 488 ؛ أبيض الشكل). (د) صورة مدمجة. يمثل شريط المقياس 5 ميكرومتر. كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). لتسمية الحمض النووي ل HIV-1 (مسبار DNA C1) باستخدام ATTO 550 و HIV-1 RNA (مسبار RNA C3) باستخدام Alexa 647 ، على التوالي ، تم تحضين العينات باستخدام Amp 4-FL 'B' (راجع الجدول 4 في البروتوكول لاختيار ألوان القناة المناسبة لمجسات التهجين). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بإجراء تلطيخ الحمض النووي الفيروسي المزدوج (vDNA) و vRNA لمتابعة عدوى HTLV-1. لتحسين وضع العلامات على الحمض النووي ، التزمنا عن كثب بإجراء تلطيخ vDNA / VRNA الذي تم تطويره لتصوير مضان متعدد الإرسال لعدوى فيروس نقص المناعة البشرية. لقد أثبتنا أنه يمكننا تسمية HTLV-1 DNA و RNA على وجه التحديد في وقت واحد.

Figure 3
الشكل 3: وضع العلامات المتزامنة ل HTLV-1 vDNA و vRNA في خلايا MT-2. (أ) HTLV-1 vDNA (المسمى ATTO 550 ؛ أحمر في الشكل) (ب) بمعنى HTLV-1 غير مقسم (+) الحمض النووي الريبي (مسبار RNA C2 & المسمى Alexa 488 ؛ أخضر في الشكل)). (C) HTLV-1 HBZ antisense (-) vRNA (مسبار RNA C3& (المسمى Alexa 647 ؛ أبيض في الشكل)). (د) صورة مدمجة. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. كانت النوى ملطخة ب DAPI (أزرق). تم استخدام Amp 4-FL 'B' (راجع الجدول 4 في البروتوكول) لتحقيق وضع العلامات المتعددة ل HTLV-1 ('+' و '-') RNA. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: تجارب التحكم لتقييم خصوصية المسبار المستهدف وخلفيته. تم تقييم خصوصية مجسات الهدف HIV-1 و HTLV-1 بعد الإصابة في خطوط الخلايا الليمفاوية (خلايا Jurkat T غير المصابة ، والخلايا المصابة HTLV-1 (MT2) ، والخلايا المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية -1 (H9111B)). تمثل قضبان المقياس 10 ميكرومتر. (أ) عولجت الخلايا بمجسات HTLV-1 RNA. (ب) عولجت الخلايا بمسبار الحمض النووي الريبي HIV-1 (+) (C-D). مزيد من التوضيح لخصوصية مجسات HTLV-1 مع عدم وجود تفاعل متقاطع مع HIV-1. تشير الأسهم البيضاء في الشكل 4C إلى الحمض النووي HTLV-1 (أحمر). (E-F). تلطيخ vRNA (أخضر) +/- علاج RNase. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

للتحقق من خصوصية مجسات التهجين وتقييم كيفية تأثير طريقة وضع العلامات ISH على كفاءة تلطيخ البروتين والخلفية العامة ، نقوم بإجراء ضوابط حاسمة لضمان أعلى مستوى من الدقة والتكرار للتجارب. على سبيل المثال ، في الشكل 4A-D ، نتحقق من خصوصية مجسات HIV-1 و HTLV-1 vDNA و vRNA ، حيث نظهر تفاعلا متقاطعا ضئيلا جدا أو معدوما بين مجموعات المسبار عبر الفيروسين. على الرغم من تصنيف اثنين من الفيروسات القهقرية مع إمكانية التفاعل المتبادل للمسبار ، فإن مجسات HIV-1 خاصة فقط بالمادة الوراثية ل HIV-1 وليس HTLV-1. وينطبق نفس الاتجاه على مجسات HTLV-1. بالإضافة إلى ذلك ، في الشكل 4F ، نوضح أنه يمكننا التخلص من تلطيخ vRNA إذا عالجنا خلايانا أثناء تحضير العينة. لتقييم إمكانية توهين كفاءة تلطيخ البروتين بسبب ISH (علاج الأنزيم البروتيني (الخطوة 4 في البروتوكول & الشكل 1B) وظروف التهجين ، والتي يمكن أن تؤدي إلى استئصال التعرف على الحاشية أو زيادة إشارة الخلفية ، أثبتنا أن كفاءة تلطيخ البروتين لعلامة البقع النووية ، SC-35 ، قابلة للمقارنة عبر نهج IF التقليدية والتلوين المناعي خلال بروتوكول MICDDRP. في بروتوكول IF التقليدي ، تم اختراق الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X-100 لمدة 15 دقيقة ، بدلا من النفاذية بنسبة 0.1٪ Tween-20 لمدة 10 دقائق ، والتي تستخدم في بروتوكول MICDDRP (الخطوة 3 في البروتوكول وسير العمل في الشكل 1B). أنتج تلطيخ البروتين عبر كلتا الحالتين (IF مقابل MICDDRP) إشارة أكبر بعدة أوامر من الحجم (MICDDRP بدون جسم مضاد أولي) ، مما يدل بشكل أكبر على الخلفية المنخفضة المتولدة بعد هذا البروتوكول والحفاظ على حوائط البروتين من أجل تلطيخ مناعي فعال. تم إجراء القياس الكمي للصورة لمتوسط شدة التألق المتكاملة لإشارة sc-35 لكل خلية (الشكل 5E) كما هو موضح سابقا3. بالنسبة لجميع نتائج التصوير المعروضة ، تأكدنا من خصوصية المسبار والأجسام المضادة ، بالإضافة إلى تقييم أي اضطرابات محتملة أو ضوضاء خلفية أعلى من المعتاد تعزى إلى نهج ISH الخاص بنا.

Figure 5
الشكل 5: مقارنة كفاءة تلطيخ البروتين بعد IF التقليدي مقابل MICDDRP. كان البروتين الخلوي ، sc-35 ، وهو علامة حيوية للبقع النووية ، ملطخا بالمناعة في خلايا Jurkat T. تمثل جميع قضبان المقياس 10 ميكرومتر. (أ) خضعت خلايا جوركات التائية غير المصابة لبروتوكول MICDDRP وعولجت بمجسات تهجين الحمض النووي / الحمض النووي الريبي لفيروس العوز المناعي البشري -1 المستخدمة في الشكل 2 والشكل 4 أعلاه. أثناء التلوين المناعي ، لم تتم إضافة أي جسم مضاد أولي. (ب). خضعت خلايا Jurkat T غير المصابة ل IF، وسم sc-35 (أبيض). تم اختراق الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X-100 لمدة 15 دقيقة. (ج). تم إجراء MICDDRP على خلايا Jurkat T المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. تم تصنيف vRNA باللون الأخضر ، و vDNA باللون الأحمر ، و sc-35 باللون الأبيض. (د). لقطة مقربة ل vRNA و vDNA ووسم البروتين (sc-35) في الخلية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. (ه) التحديد الكمي لمتوسط إشارة التألق المتكاملة لكل خلية من خلايا sc-35 عبر ظروف التلوين المناعي المختلفة. المحور ص على مقياس لوغاريتمي. يمثل الخط المنقط إشارة الخلفية من الخلايا غير المصابة التي خضعت لبروتوكول MICDDRP حيث لم تتم إضافة أي جسم مضاد أولي. لا يوجد فرق كبير في الإشارة بعد MICDDRP مقابل IF. تم أخذ عينات من أكثر من 500 خلية للقياس الكمي للوصول إلى الحالة المعنية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لدراسة فيروسات الحمض النووي الريبي التي قد تتضمن أو لا تتضمن قوالب الحمض النووي لتكاثر الفيروس. على سبيل المثال ، يمكن تصميم مجسات bDNA الخاصة بالخيوط لمراقبة التعبير عن الحمض النووي الريبي المضاد (+) أو المضاد للحساسية (-) وأنواع مختلفة من vRNA في فيروسات مثل HBV و HCV و IAV و ZIKV. يمكن أن يوفر تصور أنواع الحمض النووي الريبي المختلفة أثناء العدوى نظرة ثاقبة لحركية النسخ المتماثل لمختلف الأنظمة الفيروسية.

باتباع المسار الزمني لعدوى فيروس التهاب الكبد B ، يمكننا أن نرى أن كمية الحمض النووي الريبي قبل الجينومي HBV (pgRNA) وإجمالي الحمض النووي الريبي HBV يزداد كدالة للوقت. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا في نفس الوقت بتلطيخ عامل مضيف خلوي ، MOV10 (الشكل 6).

Figure 6
الشكل 6: HBV. المسار الزمني لعدوى HBV لخلايا 3E8. أصيبت الخلايا ب 300 جينوم HBV لكل خلية. يظهر التكاثر الفيروسي في ثلاث نقاط زمنية (24 و 48 و 72 hpi). pgRNA (المسمى ب ATTO 550 ؛ أحمر في الشكل) ، إجمالي HBV RNA (المسمى ب Alexa 647 ؛ أخضر في الشكل) ، و MOV10 (جسم مضاد ثانوي مقترن ب Alexa 488 ؛ أبيض في الشكل). النوى ملطخة ب DAPI باللون الأزرق. يمثل شريط القياس على الصور المدمجة 10 ميكرومتر. hpi ، ساعات بعد الإصابة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم إجراء التصوير عبر الفحص المجهري متحد البؤر باستخدام هدف الغمر بالزيت 60x. تم ضبط الأطوال الموجية لتمرير نطاق الإثارة / الانبعاث المستخدمة للكشف عن DAPI و Alexa 488 و ATTO 550 و Alexa 647 على 405 / 420-480 و 488 / 505-550 و 550 / 560-610 و 647 / 655-705 نانومتر ، على التوالي (الشكل 7 ، الشكل 8 والشكل 9).

Figure 7
الشكل 7: المسار الزمني لعدوى فيروس التهاب الكبد C لخلايا Huh-7.5.1. أصيبت خلايا Huh-7.5.1 بفيروس التهاب الكبد الوبائي سي (HCV) Jc1 / Gluc2A عند MOI 0.5. في الفترات الزمنية المشار إليها ، تم إصلاح الخلايا وفحصها بالتتابع بحثا عن الإحساس (+) vRNA و antisense (-) vRNA و NS5A (بروتين HCV). كانت النوى ملطخة ب DAPI. صور مدمجة تمثيلية من كل نقطة زمنية ، تظهر (+) RNA باللون الأخضر (المسمى Alexa 647) (-) RNA باللون الأحمر (المسمى Atto 555) ، NS5A باللون الأبيض (الماعز الثانوي المضاد للفأر مترافق مع Alexa 488) ، والنوى باللون الأزرق. تمثل قضبان المقياس 10 ميكرومتر. يتم تكبير الصور السفلية من النقطة الزمنية المقابلة. HPI ، ساعات بعد الإصابة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 8
الشكل 8: bDNA FISH الخاص بالخيوط والتلوين المناعي لخلايا A549 المصابة بفيروس الأنفلونزا A. تم إصلاح خلايا A549 المصابة بفيروس PR8 Flu A وفحصها بحثا عن (A) البروتين النووي IAV (NP) RNA (المسمى Alexa 488 ؛ أخضر في الشكل) ، و (B) بروتين بوليميراز IAV (PB1) (الماعز الثانوي المضاد للفأر Atto 550 ؛ أحمر في الشكل) والنوى كانت ملطخة ب DAPI (أزرق). (ج) صورة مدمجة. يمثل شريط المقياس 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 9
الشكل 9: أسماك bDNA الخاصة بالخيوط في الخلايا المصابة بفيروس زيكا (ZIKV). أصيبت خلايا Vero بفيروس ZIKV عند MOI من 0.1. تم إصلاح الخلايا عند 48 hpi. (أ) تم تلطيخ الخلايا في وقت واحد للإحساس (+) vRNA (المسمى ب Alexa 488 ؛ الأخضر في الشكل) و antisense (-) vRNA (المسمى Atto 550 ؛ أحمر في الشكل). كانت النوى ملطخة ب DAPI. في (A) ، يشير المربع الأبيض إلى منطقة بها كل من (+) و (-) vRNA. تقدم الأجزاء الداخلية لقطة مقربة ل (+) vRNA (أخضر) وأنواع vRNA الأكثر ندرة (-) (أحمر). (ب) الإحساس (+) vRNA (أخضر). (ج) مضاد للحساسية (-) vRNA (أحمر). يمثل شريط المقياس في (A) 10 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

غالبا ما يتطلب التصور المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين تحسينا واسع النطاق. طريقتان شائعتان هما وضع العلامات 5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) و DNA FISH. تم تطبيق وسم EdU لتصور الحمض النووي الفيروسي والبروتين في وقت واحد ، حيث تم دمج EdU في الحمض النووي الناشئ وتم تصنيفه لاحقا بأصباغ فلورية تحتوي على أزيد عبر كيمياء النقر. وبالتالي يمكن استخدام وسم EdU لمراقبة حركية تكاثر الفيروسات الأصلية لفيروسات الحمض النووي أو الفيروسات باستخدام قوالب الحمض النووي للتكرار12. ومع ذلك ، فإن أحد أوجه القصور في وضع العلامات على EdU هو أنه في الخلايا المنقسمة ، سيتضمن الجينوم المكرر EdU ، مما يولد خلفية عالية وتحليلا مربكا للصور. يمكن ل DNA FISH التحايل على هذه المشكلات عن طريق تهجين مسبار الحمض النووي مباشرة إلى الهدف المعني بغض النظر عن دورة الخلية. ومع ذلك ، غالبا ما تعتمد FISH التقليدية على درجات حرارة عالية لتحقيق تهجين فعال للمسبار ، مما يعيق تلطيخ المناعة أو حتى تلطيخ الحمض النووي الريبيالمتزامن 13. يمكن ل MICDDRP التحايل على هذه المشكلات من خلال توفير علامات فلورية قوية ومتزامنة للحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين عبر مجموعة متنوعة من الأنظمة الخلوية.

بينما أثبتنا أنه يمكننا تسمية البروتين والحمض النووي في وقت واحد باستخدام بروتوكول MICDDRP الخاص بنا ، كان هناك حاجة إلى التحسين عبر أنظمة مختلفة. كانت المعلمة الرئيسية الأولى التي كان علينا تحسينها هي علاج الأنزيم البروتيني. قمنا بتغيير تركيز البروتياز الثالث عبر الظروف. كان تحسين علاج الأنزيم البروتيني تجريبيا ، حيث استخدمنا تخفيفات مختلفة لتقييم ما أسفر عن أكبر كفاءة تهجين ، دون المساس بكفاءة التلطيخ المناعي. تم إجراء الضوابط المناسبة جنبا إلى جنب لتقييم خصوصية المسبار والتغيرات في كفاءة تلطيخ البروتين المنسوبة إلى علاج الأنزيم البروتيني. كانت المعلمات الرئيسية التالية التي تحتاج إلى تحسين هي تصميم المسبار وتهجين المسبار.

يعد التصميم السليم لمجسات الالتقاط ومكبر الصوت أمرا بالغ الأهمية لتحقيق حساسية وخصوصية تقنية bDNA. تتوفر حزم البرامج التي تتنبأ باحتمال حدوث أحداث تهجين غير محددة لتحسين تصميم المسبار 7,11. يمكن الآن شراء مجسات bDNA مع مجسات التضخيم المسبق ومكبر الصوت ومجسات التسمية الفلورية المصاحبة تجاريا لضمان التوافق مع مجموعات تصوير bDNA. يمكن للمستخدمين تزويد الشركات المصنعة بمعلومات التسلسل (~ 300-1000 زوج أساسي) للمنطقة (المناطق) المستهدفة في شكل ملف fasta (تنسيق قائم على النص لتمثيل تسلسل النوكليوتيدات). يتم إنشاء المجسات المستهدفة مع تماثل تسلسل بنسبة 90٪ > للتسلسل المقدم.

بالنسبة لوضع العلامات على الحمض النووي ، وجدنا أن تخفيف المجسات في مخزن التهجين الموصوف في الخطوة 5 من البروتوكول يحسن تهجين الحمض النووي. عند وضع علامات على كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، يمكن تخفيف مسبار الحمض النووي الريبي في المخزن المؤقت للتهجين. لا يمكن أن يستبعد وضع علامات الحمض النووي في غياب RNase احتمال أن يحتوي الحمض النووي المرصود على الحمض النووي الريبي للجنوح المستهدف. قد يتعين أيضا تعديل درجة الحرارة لتحسين كفاءة التهجين. قد تؤثر زيادة درجة الحرارة على كفاءة تلطيخ البروتين ، حيث قد تؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى تعزيز تمسخ البروتين ، مما يؤدي إلى إزالة التعرف على الجسم المضاد الأساسي. في بياناتنا التمثيلية المقدمة ، قمنا بإجراء ISH عند 40 درجة مئوية.

بالمقارنة مع أسماك الحمض النووي التقليدية ، يوفر MICDDRP إجراء محسنا لوضع العلامات على الحمض النووي والحمض النووي الريبي والبروتين في وقت واحد للتصور عبر الفحص المجهري الفلوري. أحد القيود المحتملة هو أن اختيار المسبار قد يؤثر على كفاءة التهجين والقدرة على مقارنة البيانات كميا بين المجسات. لقد كان هذا البروتوكول فعالا عبر الأنظمة الخلوية والفيروسية المتنوعة في أيدينا مع الحاجة إلى تحسين طفيف فقط عبر ظروف مختلفة. استخدمت المنشورات الحديثة رفيعة المستوى نهجنا لدراسة اختيار موقع تكامل فيروس نقص المناعة البشرية14 وحركية النسخ العكسي لفيروس نقص المناعة البشرية15. يمكن أن تشمل التطبيقات المستقبلية ل MICDDRP تصور الأحماض النووية الفيروسية بالتزامن مع تسلسل الحمض النووي لجينات خلوية وبروتينات خلوية محددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل كليا أو جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 AI121315 و R01 AI146017 و R01 AI148382 و R01 AI120860 و R37 AI076119 و U54 AI150472). نشكر الدكتور ريموند ف. شينازي وسادي أميشاي على توفير الخلايا المصابة بفيروس الأنفلونزا أ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% PFA
50% dextran sulfate Amreso 198 For DNA hybridization buffer
50X wash buffer ACD Bio 320058
6-well plates
Amplifier 1-FL ACD Bio
Amplifier 2-FL ACD Bio
Amplifier 3-FL ACD Bio
Amplifier 4-FL ACD Bio Consult Amp-4 table in protocol
Anti-HCV NS5a antibody Abcam ab13833 Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4
Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody NIH AIDS Reagent Program 3537
Anti-Mov10 antibody Abcam ab80613 Rabbit polyclonal
Anti-PB1 antibody GeneTex GTX125923 Antibody against flu protein
Bovine serum albumin Blocking reagent for immunostaining
Cell media with supplements Media appropriate for cell model
Coverslips
DAPI ACD Bio Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)
Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) Gibco 14190250 No calcium and magnesium
Ethylene carbonate Sigma E26258
Fetal bovine serum (FBS) Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)
Fisherbrand colorfrost plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-17/18/19 Precleaned
HCV-GT2a-sense-C2 probe ACD Bio 441371 HCV(+) sense RNA probe
HIV-gagpol-C1 ACD Bio 317701 HIV-1 cDNA probe
HIV-nongagpol-C3 ACD Bio 317711-C HIV-1 RNA probe
HybEZ hybridization oven ACD Bio 321710/321720
ImmEdge hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000
Nail polish For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment
Nuclease free water Ambion AM9937
Poly-d-lysine (PDL) Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes
Probe diluent ACD Bio 300041 For diluting RNA C2 or C3 probes
Prolong gold antifade Invitrogen P36930
Protease III ACD Bio 322337
RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP ACD Bio 436221
RNase A Qiagen
Secondary antibodies
Slides
Sodium chloride For DNA hybridization buffer
Sodium citrate, pH 6.2 For DNA hybridization buffer
Tween-20 For DNA hybridization buffer and PBS-T
V-HBV-GTD ACD Bio 441351 Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2 ACD Bio 465531-C2 HBV pgRNA probe
V-HCV-GT2a probe ACD Bio 441361 HCV(-) sense RNA probe
V-HTLV-HBZ-sense-C3 ACD Bio 495071-C3 HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ
V-HTLV1-GAG-C2 ACD Bio 495051-C2 HTLV-1 DNA probe
V-HTLV1-GAG-POL-sense ACD Bio 495061 HTLV-1 (+) sense RNA probe
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP ACD Bio 436221 IAV RNA probe
V-ZIKA-pp-O2 ACD Bio 464531 Zika(+) sense RNA probe
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 ACD Bio 478731-C2 Zika(-) sense RNA probe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
  2. Marini, B., et al. Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection. Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).
  3. Puray-Chavez, M., et al. Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection. Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).
  4. Ukah, O. B., et al. Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells. Viruses. 10 (10), (2018).
  5. Liu, D., et al. Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus. Viruses. 11 (11), (2019).
  6. Achuthan, V., et al. Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration. Cell Host & Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  8. Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification. Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).
  9. Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).
  10. Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution. Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).
  11. Bushnell, S., et al. ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays. Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).
  12. Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection. Journal of Virology. 91 (9), (2017).
  13. Brown, K. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells. Methods. 26 (1), 10-18 (2002).
  14. Francis, A. C., et al. HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains. Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).
  15. Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus. Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).

Tags

علم الأحياء ، العدد 164 ، الحمض النووي المتفرع FISH ، التهجين في الموقع ، الفحص المجهري الفلوري ، التألق المناعي ، علم الفيروسات ، التصوير أحادي الخلية ، فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، فيروس زيكا ، فيروس التهاب الكبد الوبائي سي ، الأنفلونزا ، فيروس التهاب الكبد B ، HTLV-1
التصوير الفلوري متعدد الخلية أحادي الخلية لتصور الأحماض النووية الفيروسية والبروتينات ومراقبة فيروس نقص المناعة البشرية و HTLV و HBV و HCV وفيروس زيكا وعدوى الأنفلونزا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shah, R., Lan, S., Puray-Chavez, M.… More

Shah, R., Lan, S., Puray-Chavez, M. N., Liu, D., Tedbury, P. R., Sarafianos, S. G. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (164), e61843, doi:10.3791/61843 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter