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Biology

वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन की कल्पना करने और एचआईवी, एचटीएलवी, एचबीवी, एचसीवी, जीका वायरस और इन्फ्लूएंजा संक्रमण की निगरानी के लिए सिंगल-सेल मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस इमेजिंग

Published: October 29, 2020 doi: 10.3791/61843
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 1, 1
1Laboratory of Biochemical Pharmacology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहां प्रस्तुत एक फ्लोरेसेंस इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए एक प्रोटोकॉल है, एमअल्टिप्लेक्स आईएम्यूनोफ्लोरोसेंट सीएल-आधारित डी एटेक्शन ऑफ डीएनए, आरएनए, और पीरोटिन (एमआईसीडीडीआरपी), एक विधि जो विभिन्न प्रकार और स्ट्रैंडनेस के वायरल प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड के एक साथ फ्लोरेसेंस सिंगल-सेल विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम है। इस दृष्टिकोण को सिस्टम की एक विविध श्रृंखला पर लागू किया जा सकता है।

Abstract

वायरस की गतिशील प्रतिकृति और असेंबली प्रक्रियाओं को कैप्चर करना मजबूत इन सीटू संकरण (आईएसएच) प्रौद्योगिकियों की कमी से बाधित हुआ है जो वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन के संवेदनशील और एक साथ लेबलिंग को सक्षम करते हैं। सीटू संकरण (फिश) विधियों में पारंपरिक डीएनए फ्लोरेसेंस अक्सर इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संगत नहीं होते हैं। इसलिए हमने एक इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित किया है, एमआईसीडीडीआरपी (एमअल्टिप्लेक्स आईम्यूनोफ्लोरोसेंट सीएल-आधारित डीएटेक्शन ऑफ डीएनए, आरएनए और पीरोटिन), जो डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के एक साथ एकल-सेल विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है। पारंपरिक डीएनए मछली की तुलना में, एमआईसीडीडीआरपी शाखित डीएनए (बीडीएनए) आईएसएच तकनीक का उपयोग करता है, जो नाटकीय रूप से ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच संवेदनशीलता और पहचान में सुधार करता है। एमआईसीडीडीआरपी के छोटे संशोधन विभिन्न स्ट्रैंडेडनेस के न्यूक्लिक एसिड (आरएनए या डीएनए) के साथ सहवर्ती वायरल प्रोटीन की इमेजिंग को सक्षम करते हैं। हमने मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी)-1, मानव टी-लिम्फोट्रोपिक वायरस (एचटीएलवी)-1, हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी), जीका वायरस (जेडकेवी), और इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी) सहित कई वायरल रोगजनकों के जीवन चक्रों का अध्ययन करने के लिए इन प्रोटोकॉल को लागू किया है। हमने प्रदर्शित किया कि हम वायरस की एक विविध श्रृंखला में वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन को कुशलतापूर्वक लेबल कर सकते हैं। ये अध्ययन हमें कई वायरल सिस्टम की बेहतर यांत्रिक समझ प्रदान कर सकते हैं, और इसके अलावा, सेलुलर सिस्टम के व्यापक स्पेक्ट्रम में डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस इमेजिंग के आवेदन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में काम करते हैं।

Introduction

जबकि पारंपरिक इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण के माध्यम से प्रोटीन को विशेष रूप से लेबल करने के लिए हजारों वाणिज्यिक एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, और जबकि संलयन प्रोटीन को एक नमूने1 में कई प्रोटीनों को ट्रैक करने के लिए फोटो-अनुकूलित फ्लोरोसेंट टैग के साथ इंजीनियर किया जा सकता है, प्रोटीन का सूक्ष्म विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर सीटू संकरण (फिश) 2 में पारंपरिक डीएनए प्रतिदीप्ति के साथ संगत नहीं होता है। . प्रतिदीप्ति-आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन में तकनीकी सीमाओं ने वायरस प्रतिकृति की गहन समझ में बाधा डाली है। संक्रमण के दौरान वायरल न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन दोनों को ट्रैक करने से वायरोलॉजिस्ट को मौलिक प्रक्रियाओं की कल्पना करने की अनुमति मिलती है जो वायरस प्रतिकृति और असेंबली 3,4,5,6 को कम करते हैं।

हमने एक इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित किया है, जो डीएनए, आरएनए और पी रोटिन (एमआईसीडीआरपी) 3 के एम अल्टिप्लेक्स आईएम्यूनोफ्लोरोसेंट सीएल-आधारित डीईटक्शन का उपयोग करता है, जो न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार करने के लिए सीटू तकनीक में शाखित डीएनए (बीडीएनए) का उपयोग करताहै। . इसके अलावा, यह विधि बढ़ी हुई विशिष्टता के लिए युग्मित जांच का उपयोग करती है। बीडीएनए अनुक्रम-विशिष्ट जांच एक तीव्र और स्थानीय संकेत का उत्पादन करने के लिए ब्रांचिंग प्रीएम्पलीफायर और एम्पलीफायर डीएनए का उपयोग करती है, जो पिछले संकरण विधियों पर सुधार करती है जो डीएनए9 में दोहराए गए क्षेत्रों को लक्षित करने पर निर्भर थीं। नैदानिक संदर्भ में संक्रमित कोशिकाओं में अक्सर प्रचुर मात्रा में वायरल आनुवंशिक सामग्री नहीं होती है, जो नैदानिक सेटिंग्स में फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील विधि के लिए एक वस्तु प्रदान करती है। आरएनएस्कोप7 और व्यूआरएनए10 जैसे दृष्टिकोणों के माध्यम से बीडीएनए प्रौद्योगिकी के व्यावसायीकरण ने इस जगह को भर दिया है। बीडीएनए फ्लोरेसेंस इमेजिंग की संवेदनशीलता की सेल बायोलॉजी में भी महत्वपूर्ण उपयोगिता है, जिससे सेल कल्चर मॉडल में दुर्लभ न्यूक्लिक एसिड प्रजातियों का पता लगाने की अनुमति मिलती है। संवेदनशीलता का विशाल सुधार वायरस का अध्ययन करने के लिए बीडीएनए-आधारित इमेजिंग विधियों को उपयुक्त बनाता है। हालांकि, एक संभावित कमी यह है कि ये विधियां आरएनए या आरएनए और प्रोटीन की कल्पना करने पर ध्यान केंद्रित करती हैं। सभी प्रतिकृति कोशिकाओं और कई वायरस में डीएनए जीनोम होते हैं या उनके प्रतिकृति चक्र के दौरान डीएनए बनाते हैं, जिससे आरएनए और डीएनए, साथ ही प्रोटीन दोनों की इमेजिंग करने में सक्षम तरीके अत्यधिक वांछनीय होते हैं।

एमआईसीडीडीआरपी प्रोटोकॉल में, हम संशोधनों के साथ आरएनएस्कोप विधि का उपयोग करके वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए बीडीएनए फिश करतेहैं। इस प्रोटोकॉल के प्रमुख संशोधनों में से एक रासायनिक निर्धारण के बाद प्रोटीज उपचार का अनुकूलन है। प्रोटीज उपचार जांच संकरण दक्षता में सुधार के लिए न्यूक्लिक एसिड से बंधे प्रोटीन को हटाने की सुविधा प्रदान करता है। प्रोटीज उपचार के बाद शाखित ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच (ओं) के साथ इनक्यूबेशन किया जाता है। बीडीएनए जांच (ओं) के आवेदन के बाद, नमूनों को धोया जाता है और बाद में सिग्नल प्री-एम्पलीफायर और एम्पलीफायर डीएनए के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। मल्टीप्लेक्स इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन (आईएसएच), कई जीन लक्ष्यों की लेबलिंग, वर्णक्रमीय भेदभाव के लिए विभिन्न रंग चैनलों के साथ लक्ष्य जांच की आवश्यकता होतीहै। डीएनए एम्पलीफायरों के साथ इनक्यूबेशन के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) होता है।

बीडीएनए आईएसएच लक्ष्य-विशिष्ट संकेतों के प्रवर्धन द्वारा सिग्नल-टू-शोर में सुधार प्रदान करता है, जिसमें गैर-विशिष्ट संकरण घटनाओं से पृष्ठभूमि शोरमें कमी आती है। लक्ष्य जांच को सार्वजनिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर प्रोग्रामों का उपयोग करके डिज़ाइन किया गया है जो गैर-विशिष्ट संकरण घटनाओं की संभावना की भविष्यवाणी करते हैं, साथ ही जांच-लक्ष्य हाइब्रिड 7,11 के पिघलने तापमान (टीएम) की गणना करते हैं। लक्ष्य जांच में लक्ष्य डीएनए / आरएनए अनुक्रम, एक स्पेसर अनुक्रम और 14-बेस टेल अनुक्रम के पूरक 18- से 25-आधार क्षेत्र होते हैं। लक्ष्य जांच की एक जोड़ी, प्रत्येक एक अलग पूंछ अनुक्रम के साथ, एक लक्ष्य क्षेत्र (~ 50 आधारों तक फैली हुई) में संकरण करती है। दो पूंछ अनुक्रम प्री-एम्पलीफायर जांच के लिए एक संकरण साइट बनाते हैं, जिसमें एम्पलीफायर जांच के लिए 20 बाध्यकारी साइटें होती हैं, जिसमें लेबल जांच के लिए 20 बाध्यकारी साइटें होती हैं। एक उदाहरण के रूप में, न्यूक्लिक एसिड अणु पर एक किलोबेस (केबी) क्षेत्र को 20 जांच जोड़े द्वारा लक्षित किया जाता है, जिससे प्रीएम्पलीफायर, एम्पलीफायर और लेबल जांच के साथ अनुक्रमिक संकरण के लिए एक आणविक मचान बनता है। इस प्रकार यह प्रति न्यूक्लिक एसिड अणु में 8000 फ्लोरोसेंट लेबल की सैद्धांतिक उपज का कारण बन सकता है, जिससे एकल अणुओं का पता लगाया जा सकता है और पारंपरिक फिश दृष्टिकोण 7 पर विशाल सुधार होसकता है (बीडीएनए सिग्नल प्रवर्धन के योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 ए देखें)। मल्टीप्लेक्स आईएसएच के लिए जांच स्थापित करने के लिए, प्रत्येक लक्ष्य जांच एक अलग रंग चैनल (सी 1, सी 2, या सी 3) में होनी चाहिए। विभिन्न रंग चैनलों के साथ इन लक्ष्य जांचों में अलग-अलग 14-बेस पूंछ अनुक्रम होते हैं। ये पूंछ अनुक्रम अलग-अलग फ्लोरोसेंट जांच के साथ अलग-अलग सिग्नल एम्पलीफायरों को बांधेंगे, इस प्रकार कई लक्ष्यों में आसान वर्णक्रमीय भेदभाव को सक्षम करेंगे। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, चरण 9 में तालिका 4, फ्लोरोसेंटली लेबलिंग लक्ष्य जांच पर अधिक जानकारी प्रदान करता है। इसके अलावा, चित्रा 2 और चित्रा 3 उदाहरण प्रदान करते हैं कि हमने एचआईवी -1 और एचटीएलवी -1 संक्रमणों के बाद कई वायरल न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों के विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त एम्पलीफायर 4-एफएल (ए, बी, या सी) (फ्लोरोसेंट जांच और अंतिम संकरण चरण) कैसे चुना।

हमने आरएनए, डीएनए और प्रोटीन के एक साथ प्रतिदीप्ति विज़ुअलाइज़ेशन के कई अनुप्रयोगों का प्रदर्शन किया है, जो उच्च स्थानिक संकल्प 3,4,5 के साथ वायरस प्रतिकृति के महत्वपूर्ण चरणों का अवलोकन करते हैं। उदाहरण के लिए, वायरल आरएनए, साइटोप्लाज्मिक और परमाणु डीएनए, और प्रोटीन के एक साथ एकल-कोशिका विज़ुअलाइज़ेशन ने हमें एचआईवी -1 संक्रमण के दौरान प्रमुख घटनाओं की कल्पना करने की अनुमति दी है, जिसमें परमाणु प्रवेश से पहले साइटोप्लाज्म में कोर युक्त आरएनए और प्रोवायरल डीएनए3 का एकीकरण शामिल है। इसके अलावा, हमने वायरल संक्रमण और प्रतिकृति 4,5 पर मेजबान कारकों और दवा उपचार के प्रभावों को चिह्नित करने के लिएएमआईसीडीडीआरपी लागू किया है। उका एट अल में, हमने एचआईवी प्रतिलेखन और विलंबता रिवर्सल4 की कल्पना करने के लिए विभिन्न विलंबता-रिवर्सिंग एजेंटों के साथ इलाज किए गए विलंबता सेल मॉडल में एचआईवी -1 प्रतिलेखन के पुनर्सक्रियन को ट्रैक किया। इसके अलावा, एमआईसीडीडीआरपी हमें छोटे अणु उपचार या मेजबान कारक प्रतिबंध के लिए जिम्मेदार एंटीवायरल निषेध से जुड़े फेनोटाइपिक परिवर्तनों की कल्पना करने की अनुमति दे सकता है। हमारे दृष्टिकोण की मजबूती और व्यापक प्रयोज्यता के लिए अवधारणा के प्रमाण के रूप में, हमने प्रदर्शित किया है कि हम न केवल मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) -1 में संक्रमण का पालन करने के लिए वायरल न्यूक्लिक एसिड को कुशलतापूर्वक लेबल करने के लिए अपने प्रोटोकॉल के संशोधनों का उपयोग कर सकते हैं, बल्कि मानव टी-लिम्फोट्रोपिक वायरस (एचटीएलवी) -1, हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी), हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी), जीका वायरस (जेडआईकेवी), और इन्फ्लूएंजा ए वायरस (आईएवी)। चूंकि एचआईवी -1 जीवन चक्र में वायरल डीएनए और आरएनए प्रजातियां दोनों शामिल हैं, इसलिए हमने एचआईवी -1 प्रतिकृति कैनेटीक्स के बाद एमआईसीडीडीआरपी के हमारे अनुकूलन का अधिकांश प्रदर्शन किया है। हालांकि, इसके अलावा, हमने प्रदर्शित किया है कि हम वायरल ट्रांसक्रिप्शन और प्रतिकृति 3,4,5,6 की निगरानी के लिए जेडआईकेवी, आईएवी, एचबीवी और एचसीवी जैसे वायरस में या तो या दोनों सेंस (+) और एंटीसेंस (-) स्ट्रैंडनेस के विभिन्न वायरल आरएनए प्रतिलेख के संश्लेषण को ट्रैक कर सकते हैं। अध्ययन का उद्देश्य कई वायरल प्रक्रियाओं की यंत्रवत समझ में सुधार करना है और सेलुलर मॉडल की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस फ्लोरेसेंस इमेजिंग तकनीक को लागू करने के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में काम करना है।

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Protocol

1. कवरलिप्स या चैंबर स्लाइड्स पर बीज कोशिकाएं (निलंबन बनाम अनुयायी कोशिकाएं) (प्रस्तुत प्रोटोकॉल कवरलिप्स का उपयोग करता है)।

  1. निलंबन कोशिकाओं का बीजीकरण
    1. पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल) लेपित कवरलिप्स तैयार करें (कवरस्लिप के लिए निलंबन कोशिकाओं के पालन की सुविधा) पहले इथेनॉल (ईटीओएच) में कवरलिप्स को 5 मिनट के लिए इंजेक्ट करके (कवरलिप को निष्फल करता है और किसी भी अवशेष को हटा देता है)। फिर कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट (मिनट) के लिए पीडीएल (20 μg / mL) में कवरलिप्स को इनक्यूबेट करने से पहले फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 2x धो लें।
    2. पीडीएल निकालें और पीबीएस में 2x धो लें। पेलेट कोशिकाएं (पहले वांछित इमेजिंग स्थितियों के आधार पर संक्रमित / इलाज किया गया) और पीबीएस के 50 μL में 106कोशिकाओं को पुन: निलंबित करती हैं। कांच (पीडीएल-लेपित) पर कोशिकाओं के 50 μL को स्पॉट करें और 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  2. अनुगामी कोशिकाओं का बीजारोपण
    1. बाँझ कवरस्लिप पर कल्चर कोशिकाओं को 6-वेल डिश में रखा जाता है और वायरल कणों के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करता है या ब्याज के यौगिक के साथ इलाज करता है। इमेजिंग प्रयोगों के लिए नमूना तैयार करने से पहले कोशिकाओं को 50-70% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने की अनुमति दें।

2. सेलुलर निर्धारण: प्रतिदीप्ति इमेजिंग अध्ययन के लिए सेलुलर आकृति विज्ञान को संरक्षित करने के लिए

नोट: सेलुलर निर्धारण से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए आरटी में 4% पीएफए और पीबीएस रखें।

  1. सेलुलर मीडिया को एस्पिरेट करें, पीबीएस में कवरलिप्स 3 एक्स पर कोशिकाओं को धोएं, और 30 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में कोशिकाओं को ठीक करें। पीबीएस 2 एक्स में एस्पिरेटेड पीएफए और वॉश सेल।
    नोट: कोशिकाओं को अब निर्जलित और संग्रहीत किया जा सकता है, अगर प्रयोगकर्ता किसी अन्य तिथि पर प्रयोग को फिर से शुरू करना चाहता है। भंडारण से पहले ईटीओएच में निश्चित कोशिकाओं को निर्जलित किया जा सकता है।
    1. सेलुलर निर्धारण के बाद धोने के बाद पीबीएस को हटा दें और 50% ईटीओएच (पानी में वी / वी) के 500 μL के साथ प्रतिस्थापित करें। 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    2. 50% EtOH को हटा दें और 70% ETOH के 500 μL से प्रतिस्थापित करें। 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    3. 70% EtOH को हटा दें और 100% ETOH के 500 μL से प्रतिस्थापित करें। 5 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    4. 100% EtOH को हटा दें और ताजा 100% ETOH के साथ बदलें।
      नोट: निर्जलित कोशिकाओं को 6 महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। ईटीओएच के वाष्पीकरण को रोकने के लिए भंडारण से पहले टेप या पैराफिल्म के साथ प्लेटों को सील करें।
    5. कोशिकाओं/वायरस के मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस लेबलिंग पर जाने के लिए पुनर्जलीकरण कोशिकाएं।
    6. 100% ETOH को हटा दें और 70% ETOH के 500 μL से प्रतिस्थापित करें। 2 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: कोशिकाओं को किसी भी समय सूखने न दें। सभी कोशिकाओं को डुबोने के लिए हमेशा पर्याप्त समाधान का उपयोग करें।
    7. 70% EtOH को हटा दें और 50% ETOH के 500 μL से प्रतिस्थापित करें। 2 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    8. 50% EtOH निकालें और 1x PBS से बदलें।
      नोट: प्रोटीज उपचार (चरण 4) और लक्ष्य जांच अनुप्रयोग (चरण 5) से पहले प्रोटीज तनुकरण, संकरण जांच और वॉश बफर तैयार करें। अभिकर्मक तैयारी पर विशिष्ट निर्देश प्रत्येक संबंधित चरण की शुरुआत में प्रस्तुत किए जाते हैं।
अभिकर्मकों अन्य नोट्स
प्रोटीज समाधान 1X PBS में तैयार करें
लक्ष्य ऑलिगोन्यूक्लिटोडी जांच (ओं) संकरण बफर में पतला
वॉश बफर लक्ष्य संकरण चरणों के बाद धोएं
संकरण बफर तालिका 3 में प्रस्तुत नुस्खा

तालिका 1: MICDDRP प्रोटोकॉल में प्रमुख अभिकर्मक।

3. सेल परमेबिलाइजेशन: बड़े अणुओं (एंटीबॉडी, न्यूक्लिक एसिड संकरण जांच) के प्रवेश के लिए सेल और सेलुलर ऑर्गेनेल में पहुंच बढ़ाता है

  1. सेलुलर निर्धारण या पुनर्जलीकरण के बाद 1x PBS को हटा दें और 1x PBS में 0.1% (v/v) ट्वीन -20 के 500 μL से प्रतिस्थापित करें। 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें। एक-एक करके बदलें। 1x PBS के 500 μL के साथ एक बार धो लें और ताजा 1x PBS जोड़ें।

4. संकरण दक्षता में सुधार के लिए निश्चित वायरल / सेलुलर न्यूक्लिक एसिड से न्यूक्लिक एसिड बाइंडिंग प्रोटीन को हटाने के लिए ग्लास स्लाइड और प्रोटीज उपचार पर कवरस्लिप स्थिरीकरण

नोट: सेलुलर परमेबिलाइजेशन के दौरान पतला प्रोटीज III ( सामग्री की तालिका में अभिकर्मक की बारीकियां देखें) समाधान तैयार करें। प्रोटीज को परमेबिलाइजेशन से पहले 10 मिनट के लिए आरटी तक पहुंचने दें।

  1. एक निष्फल ग्लास स्लाइड पर नेल पॉलिश की एक छोटी बूंद रखें। पीठ को सुखाएं (बिना किसी सेल परत के साथ) और नेल पॉलिश ड्रॉप पर कवरस्लिप के किनारे को रखें, जिसमें पालन की गई कोशिकाओं के साथ साइड ऊपर की ओर हो। सूखने से रोकने के लिए स्थिर कवरस्लिप पर पीबीएस की कुछ बूंदें जोड़ें।
    1. कवरस्लिप की परिधि के चारों ओर एक सर्कल (कवरस्लिप से लगभग 3 मिमी दूर) खींचें, जो अब हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन (पानी-रिपेलेंट पेन जो अभिकर्मकों को कोशिकाओं पर स्थानीयकृत रखता है) का उपयोग करके स्लाइड का पालन करता है।
  2. 1x PBS में पतला प्रोटीज III (100 μL/कवरस्लिप)।
    नोट: प्रोटीज एकाग्रता को अनुभवजन्य अनुकूलन के माध्यम से सेल प्रकार, जांच या लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड (ओं) में अंतर के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है (चर्चा देखें)। विभिन्न वायरल प्रणालियों में सबसे कुशल आरएनए / डीएनए लेबलिंग के लिए, हमें नीचे दी गई तालिका 2 में प्रस्तुत निम्नलिखित कमजोर पड़ने के साथ सफलता मिली, जिसमें (1 से 2) -(1 से 15) (प्रोटीज से 1 एक्स पीबीएस) तक के कमजोर पड़ने की संभावना थी।
जांच के लक्ष्य 1X PBS में प्रोटीज तनुकरण (प्रोटीज III से 1X PBS)
एचआईवी -1 डीएनए / 1 से 5
एचटीएलवी -1 डीएनए / 1 से 5
एचबीवी पीजीआरएनए और कुल एचबीवी आरएनए 1 से 15
आईएवी आरएनए 1 से 15
ZIKV RNA 1 से 2

तालिका 2: वायरल न्यूक्लिक एसिड संकरण के लिए पीबीएस में प्रोटीज III कमजोर पड़ना।

  1. स्थिरीकरण के बाद कवरस्लिप पर 1x PBS को निर्धारित करें और पतला प्रोटीज III लागू करें।
  2. 15 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड ओवन में इनक्यूबेट करें।
  3. डिकेंट प्रोटीज समाधान और 1x PBS में स्लाइड ्स को डुबोना। आरटी में 2 मिनट के लिए रॉकिंग डिश के साथ आंदोलन करें। नए 1x PBS के साथ दोहराएं।
    1. केवल डीएनए का पता लगाने के लिए, नमूनों को 2 मिनट के लिए न्यूक्लियस-मुक्त पानी के साथ तीन बार धोएं, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पीबीएस में पतला 5 मिलीग्राम / एमएल आरएनएस ए के साथ इनक्यूबेशन करें।
    2. एक घोल, और अल्ट्राप्योर पानी से 2 मिनट के लिए 3 गुना धो लें। लक्ष्य जांच के आईएसएच के साथ जारी रखें।
      नोट: हाइब्रिडाइजेशन बफर प्रस्तुत परिणामों के लिए वीआरएनए धुंधला दक्षता को प्रभावित किए बिना वीडीएनए का पता लगाने में सुधार करता है (प्रतिनिधि परिणाम)। पतला डीएनए चैनल 1 (सी 1) संकरण जांच के साथ 1: 1 की जांच करता है। संकरण बफर में पतला आरएनए सी 2 और सी 3 जांच। हमारे इमेजिंग अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले सी 2 और सी 3 जांच 50 एक्स समाधान (1: 50; संकरण बफर के लिए लक्ष्य जांच) में हैं।
  4. नीचे दिए गए चरण-दर-चरण प्रक्रिया का पालन करते हुए न्यूक्लियस-मुक्त पानी में संकरण बफर तैयार करें:
    1. एक 15 एमएल ट्यूब में, न्यूक्लियस फ्री-वाटर का 700 μL, 50% का 300 μL (वजन/ मात्रा (w /v)) डेक्सट्रान सल्फेट, 5 M NaCl का 300 μL, 200 mM सोडियम साइट्रेट (pH 6.2), और 375 mg (पाउडर) एथिलीन कार्बोनेट जोड़ें।
    2. एथिलीन कार्बोनेट को भंग करने के लिए एक भंवर का उपयोग करके अच्छी तरह से मिलाएं (सुनिश्चित करें कि सभी पाउडर घुल गए हैं और स्पष्ट समाधान हैं)।
    3. 2.5 एमएल (2x घोल) को पूरा करने के लिए 10% (वॉल्यूम/वॉल्यूम (v/v)) ट्वीन -20 का 25 μL और पर्याप्त न्यूक्लियस-मुक्त पानी जोड़ें।
      नोट: प्रस्तुत संकरण बफर के लिए नुस्खा नीचे तालिका 3 में पाया जा सकता है। समाधान एक सप्ताह के लिए स्थिर है। घोल के बुदबुदाहट को रोकने के लिए सावधान रहते हुए ट्वीन -20 डिटर्जेंट का पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करें।
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) स्टॉक एकाग्रता अतिरिक्त नोट्स
न्यूक्लियस मुक्त पानी ना
डेक्सट्रान सल्फेट 50% (w/v) बहुत चिपचिपा
सोडियम क्लोराइड 5 M
सोडियम साइट्रेट (पीएच 6.2) 200 mM 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें
एथिलीन कार्बोनेट ना चूर्ण
ट्वीन -20 10% (v/v)

तालिका 3: अभिकर्मकों की संकरण बफर सूची।

आरएनए लक्ष्य संकरण जांच के साथ इनक्यूबेशन: लक्ष्य ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच रुचि के क्षेत्र (ओं) से जुड़ती है, जिससे प्री-एम्पलीफायरों, एम्पलीफायरों और फ्लोरोसेंट जांच के लिए एक आणविक मचान बनता है।

नोट: 10 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर गर्म डीएनए / आरएनए जांच (सेल परमेबिलाइजेशन के दौरान) और कम से कम 10 मिनट के लिए आरटी तक ठंडा करें, अगर कोई आरएनएस-उपचार शामिल नहीं है। यदि लक्ष्य जांच संकरण से पहले RNase-उपचार या आगे नमूना उपचार की आवश्यकता होती है, तो तदनुसार गर्म जांच करें। वार्मिंग के बाद सी 2 और सी 3 प्रोब को स्पिन करें और संकरण बफर में पतला करें। कमजोर पड़ने के बाद, सी 2 और सी 3 जांच को संक्षेप में गर्म किया जा सकता है। गर्म 50x वॉश बफर (अधिक विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) 10-20 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर और आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी में 1x तक पतला करें।

  1. संकरण जांच (ओं) को जोड़ने से पहले 10 मिनट के लिए 67 डिग्री सेल्सियस पर संकरण बफर के 200 μL को इनक्यूबेट करें। संकरण बफर में पतला जांच ( तालिका 2 में सूचीबद्ध नुस्खा)। 50 μL/कवरस्लिप जोड़ें।
  2. 2 घंटे (एच) के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड ओवन में इनक्यूबेट करें। 1x वॉश बफर में डिकैंट प्रोब और जलमग्न स्लाइड। आरटी पर 2 मिनट के लिए रॉकिंग डिश द्वारा आंदोलन करें। नए 1x वॉश बफर के साथ दोहराएं।

6. एम्पलीफायर (एएमपी) 1-एफएल हाइब्रिडाइजेशन: प्री-एम्पलीफायर का अतिरिक्त जो लक्ष्य डीएनए / आरएनए जांच के पूंछ अनुक्रम का पूरक है (चरण 5)

नोट: एम्पलीफायरों को उपयोग से पहले आरटी पर होना चाहिए। उपयोग करने से 30 मिनट पहले प्रत्येक व्यक्तिगत एम्पलीफायर को फ्रिज से बाहर निकालें और आरटी पर बेंच पर छोड़ दें।

  1. अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए 1x वॉश बफर से स्लाइड निकालें और टैप / अवशोषित करें।
  2. कवरस्लिप पर एएमपी 1-एफएल की 1 बूंद जोड़ें। 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफायर ओवन में इनक्यूबेट करें।
  3. Decant Amp 1-FL और 1x वॉश बफर में डूब जाओ. आरटी पर 2 मिनट रॉकिंग डिश द्वारा आंदोलन करें। नए 1x वॉश बफर के साथ दोहराएं।

7. एम्प 2-एफएल हाइब्रिडाइजेशन: सिग्नल एम्पलीफायर के साथ इनक्यूबेशन पूर्व-एम्पलीफायरों (एएमपी 1-एफएल) के लिए आत्मीय पहचान अनुक्रम के साथ

  1. अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए 1x वॉश बफर से स्लाइड निकालें और टैप / अवशोषित करें।
  2. कवरस्लिप पर एएमपी 2-एफएल की 1 बूंद जोड़ें। 15 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड ओवन में इनक्यूबेट करें।
  3. Decant Amp 2-FL और 1x वॉश बफर में डूब जाओ. आरटी पर 2 मिनट रॉकिंग डिश द्वारा आंदोलन करें। नए 1x वॉश बफर के साथ दोहराएं।

8. एएमपी 3-एफएल हाइब्रिडाइजेशन: दूसरे सिग्नल एम्पलीफायर के साथ इनक्यूबेशन

  1. अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए 1x वॉश बफर से स्लाइड निकालें और टैप / अवशोषित करें।
  2. कवरस्लिप पर एएमपी 3-एफएल की 1 बूंद जोड़ें। 30 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफायर ओवन में इनक्यूबेट करें।
  3. Decant Amp 3-FL और 1x वॉश बफर में डूब ें। आरटी पर 2 मिनट रॉकिंग डिश द्वारा आंदोलन करें। नए 1x वॉश बफर के साथ दोहराएं।

9. एएमपी 4-एफएल हाइब्रिडाइजेशन: फ्लोरोसेंट लेबल और अंतिम संकरण चरण

नोट: सबसे पहले, लक्ष्य जांच (ओं) के चैनलों के आधार पर उपयुक्त एएमपी 4 (ए, बी, या सी) - एफएल चुनने के लिए तालिका 4 देखें। डीएनए/आरएनए को लेबल करने के लिए क्या आवश्यक है, इसका आकलन करें। एक उदाहरण नीचे दी गई तालिका द्वारा प्रदान किया गया है:

एक B C
डीएनए चैनल 1 (सी 1) 488 550 550
डीएनए / आरएनए चैनल 2 (सी 2) 550 488 647
आरएनए चैनल 3 (सी 3) 647 647 488

तालिका 4: मल्टीप्लेक्स आईएसएच के लिए एएमपी 4 (ए, बी, या सी) -एफएल फ्लोरोसेंट जांच का चयन।

नोट: मल्टीप्लेक्सफिश (कई लक्ष्य) के लिए, सही एएमपी 4 (ए, बी, या सी) - एफएल चुनना आपके हित के लक्ष्य को ठीक से लेबल करने के लिए महत्वपूर्ण है। लक्ष्य जांच (चरण 5) में अलग-अलग रंग चैनल (सी 1, सी 2, या सी 3) होते हैं, जो चुने गए एएमपी 4-एफएल के आधार पर अपने संबंधित फ्लोरोसेंट लेबल (एलेक्सा 488, एट्टो 550, या एलेक्सा 647) को निर्देशित करते हैं। मल्टीप्लेक्स इमेजिंग के लिए फ्लोरोफोरे संयोजन चुनने के उदाहरण चित्रा 2 और चित्रा 3 की किंवदंतियों में प्रदान किए गए हैं। एक अतिरिक्त उदाहरण के रूप में, एएमपी 4 बी-एफएल का चयन चुनिंदा डीएनए सी 1 जांच को एट्टो 550 के साथ और आरएनए सी 3 जांच को एलेक्सा 647 के साथ लेबल करेगा।

  1. अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए 1x वॉश बफर से स्लाइड निकालें और टैप / अवशोषित करें।
  2. कवरस्लिप पर एएमपी 4-एफएल की 1 बूंद जोड़ें। 15 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर ह्यूमिडिफाइड ओवन में इनक्यूबेट करें।
    नोट: चरण 9.2 के बाद, नमूने को कवर रखें, प्रकाश से सुरक्षित रखें।
  3. Decant Amp 4-FL और 1x वॉश बफर में डूब ें। आरटी पर 2 मिनट के लिए रॉकिंग डिश द्वारा आंदोलन करें। नए 1x वॉश बफर के साथ दोहराएं। 1x PBS (2 मिनट) के साथ धो लें और PBS में स्टोर करें।

10. प्रोटीन इम्यूनोस्टेनिंग: रुचि के प्रोटीन (ओं) को लेबल करने के लिए

  1. डीसेंट पीबीएस और कवरस्लिप में 200 μL ब्लॉकिंग बफर (1% w/v BSA, 10% v/v FBS के साथ 0.1% v/v ट्वीन-20 (PBST)) जोड़ें। आरटी पर 1 घंटे इनक्यूबेट करें।
  2. डिसेंट ब्लॉकिंग बफर और पीबीएसटी + 1% डब्ल्यू / वी बीएसए में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μL लागू करें। आरटी पर 1 घंटे इनक्यूबेट करें।
  3. हिलने के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ स्लाइड को दो बार धोएं।
  4. पीबीएसटी + 1% डब्ल्यू / वी बीएसए में आरटी पर 1 घंटे के लिए पसंद के द्वितीयक एंटीबॉडी लागू करें।
  5. हिलने के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएसटी के साथ स्लाइड धो लें।

11. परमाणु धुंधलापन: इम्यूनोस्टेनिंग के बाद काउंटर-स्टेन नाभिक

  1. डीसेंट पीबीएसटी और आरटी पर 1 मिनट के लिए पसंद के DAPI या परमाणु दाग लागू करें।
  2. हिलने के साथ आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ स्लाइड को दो बार धोएं।

12. माउंटिंग

  1. नई बाँझ ग्लास स्लाइड पर एंटीफेड समाधान (जैसे, लम्बा सोना) की 1 बूंद रखें (सबसे पहले, ईटीओएच के साथ स्लाइड साफ करें और यह सुनिश्चित करने के लिए सूखने दें कि कांच पर कोई अवशेष नहीं है)। एक ही टिप के साथ, कवरस्लिप के आकार के लगभग एक क्षेत्र को कवर करने के लिए एंटीफेड समाधान ड्रॉप फैलाएं।
    नोट: एंटीफेड समाधान बहुत चिपचिपा है और पिपेट करना मुश्किल हो सकता है। पाइपिंग से पहले टिप को 200 μL टिप से काटना इन मुद्दों को कम कर सकता है।
  2. स्लाइड से सेल नमूने के साथ कवरस्लिप निकालें और फोर्सप्स और पीबीएस का उपयोग करके पीछे की ओर अवशिष्ट नेल पॉलिश को हटाने के लिए पीबीएस में डूब जाएं। किमविप का उपयोग करके कवरलिप के पीछे सूखी फोर्स और बैक।
  3. धीरे-धीरे एंटीफेड समाधान की बूंद में कवरस्लिप को प्रभावित करें, ड्रॉप पर कवरस्लिप के नमूना पक्ष (सेल परत के साथ साइड) रखें)।
  4. नमूनों को रात भर सूखने दें।

13. इमेजिंग

  1. एपिफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ छवि।

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Representative Results

MICDDRP का एक योजनाबद्ध चित्र 1 में दर्शाया गया है। डीएनए और आरएनए की लेबलिंग के बाद इम्यूनोस्टेनिंग होती है। ब्रांचिंग एम्पलीफायरों का उपयोग सिग्नल को बढ़ाता है, जिससे एकल न्यूक्लिक एसिड अणुओं का पता लगाने की अनुमति मिलती है।

Figure 1
चित्रा 1: MICDDRP और चरण-दर-चरण वर्कफ़्लो का योजनाबद्ध। (ए) वायरल डीएनए (1) और आरएनए प्रजातियों (2) का पता लगाने में वृद्धि करने के लिए ब्रांचिंग प्रीएम्पलीफायर और एम्पलीफायर डीएनए के माध्यम से बीडीएनए सिग्नल को प्रवर्धित किया जाता है। ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड प्रोब को रुचि के लक्ष्य (ओं) के लिए जोड़े (योजनाबद्ध में जेडजेड) में संकरित किया जाता है, जिससे प्री-एम्पलीफायर (एएमपी 1-एफएल, प्रोटोकॉल में चरण 6), एम्पलीफायर (एएमपी 2- और 3-एफएल), और फ्लोरोसेंट प्रोब्स (एएमपी 4, प्रोटोकॉल में चरण 9) के लिए एक मचान बनता है। मल्टीप्लेक्स आईएसएच के लिए उपयुक्त एएमपी 4 (ए, बी, या सी) -एफएल चुनने के लिए तालिका 4 से परामर्श करें। न्यूक्लिक एसिड के लेबलिंग के बाद इम्यूनोस्टेनिंग प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट (3) होता है। (ख) एमआईसीडीडीआरपी प्रोटोकॉल में तेरह मुख्य चरण जिनमें प्रत्येक संबंधित चरण के लिए समय अवधि का आकलन किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एचआईवी -1 संक्रमण के पाठ्यक्रम का अध्ययन करने के लिए एमआईसीडीडीआरपी का अनुप्रयोग प्राथमिक कोशिकाओं में वायरल प्रतिकृति कैनेटीक्स को ट्रैक करने में एक उपयोगी उपकरण रहा है। इस प्रक्रिया की अवधारणा के प्रमाण के रूप में, एचआईवी -1 डीएनए, आरएनए और प्रोटीन को एक साथ लेबल किया जाता है और एकल-कोशिका स्तर पर सूक्ष्म रूप से कल्पना की जाती है (चित्रा 2)। दो एचआईवी -1 डीएनए जीनोम को एक ही कोशिका में देखा जाता है, क्योंकि वे सक्रिय रूप से वायरल आरएनए (वीआरएनए) को ट्रांसक्रिप्ट कर रहे हैं। वीआरएनए को परमाणु छिद्र परिसर के माध्यम से निर्यात किया गया है और वायरल प्रोटीन को साइटोप्लाज्म में संश्लेषित किया जाता है।

Figure 2
चित्रा 2: एचआईवी -1 से संक्रमित प्राथमिक रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीएमबीसी) का एमआईसीडीडीआरपी। 2 की बहुलता में एचआईवी -1 (एनएल 4.3) से संक्रमित पीएमबीसी। संक्रमण (एचपीआई) के 48 घंटे बाद कोशिकाओं को ठीक किया गया था। (ए) एचआईवी -1 बीडीएनए मछली जांच (एटीटीओ 550 के साथ लेबल; चित्र में लाल)। यह जांच सेंस (+) वीआरएनए के साथ क्रॉसस्टॉक को रोकने के लिए टेम्पलेट (3'<-5') वीडीएनए स्ट्रैंड में संकरण करती है। (बी) अनस्प्लिस्ड एचआईवी -1 आरएनए (एलेक्सा 647 के साथ लेबल; चित्रा में हरा)। एचआईवी -1 वीआरएनए जांच 5'->3' अभिविन्यास में स्थानांतरित वायरल प्रतिलेख में संकरण करती है। (सी) एचआईवी -1 कैप्सिड (पी 24) प्रोटीन का इम्यूनोस्टेनिंग (एलेक्सा 488 से संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी; आंकड़े में सफेद)। (डी) विलय छवि। स्केल पट्टी 5 μm का प्रतिनिधित्व करती है। नाभिक को DAPI (नीले) से दाग दिया गया था। एचआईवी -1 डीएनए (डीएनए सी 1 जांच) को क्रमशः एटीटीओ 550 और एचआईवी -1 आरएनए (आरएनए सी 3 जांच) को एलेक्सा 647 के साथ लेबल करने के लिए, नमूनों को एएमपी 4-एफएल 'बी' (संकरण जांच के लिए उपयुक्त चैनल रंग चुनने के लिए प्रोटोकॉल में तालिका 4 से परामर्श करें) के साथ इनक्यूबेट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इसके अलावा, हमने एचटीएलवी -1 संक्रमण का पालन करने के लिए दोहरी वायरल डीएनए (वीडीएनए) और वीआरएनए धुंधला पन किया है। न्यूक्लिक एसिड लेबलिंग के अनुकूलन के लिए, हमने एचआईवी संक्रमण के मल्टीप्लेक्स फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए विकसित वीडीएनए / वीआरएनए स्टेनिंग प्रक्रिया का बारीकी से पालन किया। हमने प्रदर्शित किया है कि हम विशेष रूप से एचटीएलवी -1 डीएनए और आरएनए को एक साथ लेबल कर सकते हैं।

Figure 3
चित्रा 3: एमटी -2 कोशिकाओं में एचटीएलवी -1 वीडीएनए और वीआरएनए की एक साथ लेबलिंग। (ए) एचटीएलवी -1 वीडीएनए (एटीटीओ 550 के साथ लेबल; चित्रा में लाल) (बी) अनस्प्लिस्ड एचटीएलवी -1 सेंस (+) आरएनए (आरएनए सी 2 जांच और एलेक्सा 488 के साथ लेबल; चित्रा में हरा))। (सी) एचटीएलवी -1 एचबीजेड एंटीसेंस (-) वीआरएनए (आरएनए सी 3 जांच और (एलेक्सा 647 के साथ लेबल; चित्रा में सफेद))। (डी) विलय छवि। स्केल बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करता है। नाभिक को DAPI (नीले) से दाग दिया गया था। HTLV-1 ('+' और '-') RNA की मल्टीप्लेक्स लेबलिंग प्राप्त करने के लिए Amp 4-FL 'B' (प्रोटोकॉल में तालिका 4 से परामर्श करें) का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: लक्ष्य जांच विशिष्टता और पृष्ठभूमि का आकलन करने के लिए नियंत्रण प्रयोग। एचआईवी -1 और एचटीएलवी -1 लक्ष्य जांच की विशिष्टता का मूल्यांकन लिम्फोसाइटिक सेल लाइनों (असंक्रमित जुरकट टी कोशिकाओं, एचटीएलवी -1 संक्रमित कोशिकाओं (एमटी 2), और एचआईवी -1 संक्रमित कोशिकाओं (एच 9111 बी)) में संक्रमण के बाद किया गया था। स्केल बार 10 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं( A) कोशिकाओं को एचटीएलवी -1 आरएनए जांच के साथ इलाज किया गया था। (बी) कोशिकाओं को एचआईवी -1 (+) आरएनए जांच (सी-डी) के साथ इलाज किया गया था। एचआईवी -1 के साथ कोई क्रॉस-रिएक्टिविटी के साथ एचटीएलवी -1 जांच की विशिष्टता का और प्रदर्शन। चित्रा 4 सी में सफेद तीर एचटीएलवी -1 डीएनए (लाल) को दर्शाते हैं। (ई-एफ)। वीआरएनए धुंधला (हरा) +/- आरएनएस-उपचार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

संकरण जांच की विशिष्टता को सत्यापित करने के लिए और यह आकलन करने के लिए कि आईएसएच लेबलिंग विधि प्रोटीन धुंधला दक्षता और समग्र पृष्ठभूमि को कैसे प्रभावित करती है, हम प्रयोगों के लिए कठोरता और प्रजनन क्षमता के उच्चतम स्तर को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण नियंत्रण करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 4ए-डी में, हम अपने एचआईवी -1 और एचटीएलवी -1 वीडीएनए और वीआरएनए जांच की विशिष्टता को सत्यापित करते हैं, क्योंकि हम दो वायरस में जांच सेट के बीच बहुत कम या कोई क्रॉस-रिएक्टिविटी नहीं दिखाते हैं। जांच क्रॉस-रिएक्टिविटी की क्षमता वाले दो रेट्रोवायरस के लेबलिंग के बावजूद, एचआईवी -1 जांच केवल एचआईवी -1 आनुवंशिक सामग्री के लिए विशिष्ट है, न कि एचटीएलवी -1। एचटीएलवी -1 जांच के लिए भी यही प्रवृत्ति सच है। इसके अलावा, चित्रा 4 एफ में, हम दिखाते हैं कि हम वीआरएनए धुंधलापन को खत्म कर सकते हैं यदि हम नमूना तैयार करने के दौरान अपनी कोशिकाओं का इलाज करते हैं। आईएसएच (प्रोटीज उपचार (प्रोटोकॉल और चित्रा 1 बी में चरण 4) और संकरण स्थितियों के कारण प्रोटीन धुंधला दक्षता के क्षीणन की संभावना का आकलन करने के लिए, जिससे एपिटोप पहचान या पृष्ठभूमि संकेत में वृद्धि हो सकती है, हम प्रदर्शित करते हैं कि परमाणु बिंदु मार्कर, एससी -35 के लिए प्रोटीन धुंधला दक्षता, एमआईसीडीडीआरपी प्रोटोकॉल के दौरान पारंपरिक आईएफ दृष्टिकोण और इम्यूनोस्टेनिंग में तुलनीय है। पारंपरिक आईएफ प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 0.1% ट्वीन -20 के साथ परमेबिलाइजेशन के बजाय 15 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ प्रतिरक्षित किया गया था, जिसका उपयोग एमआईसीडीडीआरपी प्रोटोकॉल (प्रोटोकॉल में चरण 3 और चित्रा 1 बी में वर्कफ़्लो) में किया जाता है। दोनों स्थितियों (आईएफ बनाम एमआईसीडीडीआरपी) में प्रोटीन धुंधला होने से नियंत्रण (बिना किसी प्राथमिक एंटीबॉडी के एमआईसीडीडीआरपी) से अधिक परिमाण के कई आदेशों का संकेत मिला, जो इस प्रोटोकॉल के बाद उत्पन्न कम पृष्ठभूमि और कुशल इम्यूनोस्टेनिंग के लिए प्रोटीन एपिटोप्स के संरक्षण को प्रदर्शित करता है। प्रति सेल एससी -35 सिग्नल (चित्रा 5 ई) की औसत एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता की छवि परिमाणीकरण पहले वर्णित3 के रूप में किया गया था। दिखाए गए सभी इमेजिंग परिणामों के लिए, हमने जांच और एंटीबॉडी विशिष्टता सुनिश्चित की, साथ ही हमारे आईएसएच दृष्टिकोण के लिए जिम्मेदार किसी भी संभावित गड़बड़ी या सामान्य पृष्ठभूमि शोर से अधिक का आकलन किया।

Figure 5
चित्रा 5: पारंपरिक आईएफ बनाम एमआईसीडीआरपी के बाद प्रोटीन धुंधला दक्षता की तुलना। सेलुलर प्रोटीन, एससी -35, परमाणु झुकाव के लिए एक बायोमार्कर, जुरकट टी कोशिकाओं में इम्यूनोस्टेन्ड था। (ए) असंक्रमित जुरकट टी कोशिकाओं को एमआईसीडीडीआरपी प्रोटोकॉल से गुजरना पड़ा और ऊपर चित्र 2 और चित्रा 4 में उपयोग किए गए एचआईवी -1 डीएनए / आरएनए संकरण जांच के साथ इलाज किया गया। इम्यूनोस्टेनिंग के दौरान, कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नहीं जोड़ा गया था। असंक्रमित जुरकट टी कोशिकाओं को पारंपरिक आईएफ, लेबलिंग एससी -35 (सफेद) से गुजरना पड़ा। कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 के साथ स्थिर किया गया था। एमआईसीडीडीआरपी एचआईवी संक्रमित जुरकट टी कोशिकाओं पर किया गया था। वीआरएनए को हरा, वीडीएनए को लाल और एससी -35 को सफेद लेबल किया गया है। एचआईवी संक्रमित कोशिका में वीआरएनए, वीडीएनए और प्रोटीन लेबलिंग (एससी -35) का क्लोज-अप। (ई) विभिन्न इम्यूनोस्टेनिंग स्थितियों में एससी -35 के प्रति सेल औसत एकीकृत प्रतिदीप्ति संकेत का परिमाणीकरण। वाई-अक्ष एक लघुगणकीय पैमाने पर है। डॉटेड लाइन असंक्रमित कोशिकाओं से पृष्ठभूमि संकेत का प्रतिनिधित्व करती है जो एमआईसीडीडीआरपी प्रोटोकॉल से गुजरे थे जहां कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नहीं जोड़ा गया था। एमआईसीडीडीआरपी बनाम पारंपरिक आईएफ के बाद सिग्नल में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। संबंधित स्थिति तक पहुंचने के लिए परिमाणीकरण के लिए 500 से अधिक कोशिकाओं का नमूना लिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस विधि को आरएनए वायरस का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है जिसमें वायरल प्रतिकृति के लिए डीएनए टेम्पलेट शामिल हो सकते हैं या नहीं भी हो सकते हैं। उदाहरण के लिए, स्ट्रैंड-विशिष्ट बीडीएनए जांच को एचबीवी, एचसीवी, आईएवी और जेडआईकेवी जैसे वायरस में सेंस (+) या एंटीसेंस (-) स्ट्रैंड आरएनए और विभिन्न वीआरएनए प्रजातियों की अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। संक्रमण के दौरान विभिन्न आरएनए प्रजातियों का विज़ुअलाइज़ेशन विभिन्न वायरल सिस्टम के प्रतिकृति कैनेटीक्स में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

एचबीवी संक्रमण के समय के बाद, हम देख सकते हैं कि एचबीवी प्री-जीनोमिक आरएनए (पीजीआरएनए) और कुल एचबीवी आरएनए की मात्रा समय के कार्य के रूप में बढ़ जाती है। इसके अलावा, हमने एक साथ एक सेलुलर होस्ट फैक्टर, एमओवी 10 (चित्रा 6) को इम्यूनोस्टेन्ड किया।

Figure 6
चित्र 6: एचबीवी। 3E8 कोशिकाओं के HBV संक्रमण का समय पाठ्यक्रम। कोशिकाओं को प्रति सेल 300 एचबीवी जीनोम से संक्रमित किया गया था। वायरल प्रतिकृति तीन समय बिंदुओं (24, 48 और 72 एचपीआई) पर दिखाई जाती है। पीजीआरएनए (एटीटीओ 550 के साथ लेबल किया गया; चित्रा में लाल), कुल एचबीवी आरएनए (एलेक्सा 647 के साथ लेबल; चित्रा में हरा), और एमओवी 10 (एलेक्सा 488 के लिए संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी; चित्रा में सफेद)। नाभिक नीले रंग में DAPI के साथ सना हुआ है। मर्ज की गई छवियों पर स्केल बार संक्रमण के बाद 10 μm. hpi का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इमेजिंग 60x तेल-विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से किया गया था। DAPI, Alexa 488, ATTO 550, और Alexa 647 का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले उत्तेजना / उत्सर्जन बैंडपास तरंग दैर्ध्य क्रमशः 405/420-480, 488/505-550, 550/560-610, और 647/655-705 एनएम पर सेट किए गए थे (चित्रा 7, चित्रा 8 और चित्रा 9)।

Figure 7
चित्रा 7: हुह -7.5.1 कोशिकाओं के एचसीवी संक्रमण का समय पाठ्यक्रम। हुह -7.5.1 कोशिकाओं को 0.5 के एमओआई पर हेपेटाइटिस सी वायरस (एचसीवी) जेसी 1 / ग्लूक 2 ए से संक्रमित किया गया था। इंगित किए गए समय अंतराल पर, कोशिकाओं को सेंस (+) वीआरएनए, एंटीसेंस (-) वीआरएनए और एनएस 5 ए (एचसीवी प्रोटीन) के लिए क्रमिक रूप से तय और जांच की गई थी। नाभिक DAPI से सना हुआ था। प्रतिनिधि ने प्रत्येक समय-बिंदु से छवियों को विलय कर दिया, जिसमें हरे रंग में (+) आरएनए (एलेक्सा 647 के साथ लेबल किया गया) (-) लाल रंग में आरएनए (एट्टो 555 के साथ लेबल), सफेद में एनएस 5 ए (एलेक्सा 488 में संयुग्मित द्वितीयक बकरी एंटी-माउस), और नीले रंग में नाभिक दिखाया गया। स्केल बार 10 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। निचली छवियों को संबंधित समय-बिंदु से बढ़ाया गया कट आउट किया जाता है। एचपीआई, संक्रमण के बाद घंटों। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 8
चित्रा 8: स्ट्रैंड-विशिष्ट बीडीएनए मछली और इन्फ्लूएंजा ए वायरस से संक्रमित ए 549 कोशिकाओं का इम्यूनोस्टेनिंग। पीआर 8 फ्लू ए वायरस से संक्रमित ए 549 कोशिकाओं को तय किया गया और (ए) आईएवी न्यूक्लियोप्रोटीन (एनपी) आरएनए (एलेक्सा 488 के साथ लेबल; चित्रा में हरा), और (बी) आईएवी पोलीमरेज़ प्रोटीन (पीबी 1) (द्वितीयक बकरी एंटी-माउस एट्टो 550; चित्रा में लाल) और नाभिक को डीएपीआई (नीले) के साथ दाग दिया गया। (सी) विलय की गई छवि। स्केल पट्टी 10 μm का प्रतिनिधित्व करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 9
चित्रा 9: जीका वायरस (जेडआईकेवी) संक्रमित कोशिकाओं में स्ट्रैंड-विशिष्ट बीडीएनए मछली। वेरो कोशिकाओं को 0.1 के एमओआई पर जेडआईकेवी से संक्रमित किया गया था। कोशिकाओं को 48 एचपीआई पर तय किया गया था। (ए) कोशिकाओं को एक साथ अर्थ (+) वीआरएनए (एलेक्सा 488 के साथ लेबल; चित्रा में हरा) और एंटीसेंस (-) वीआरएनए (एट्टो 550 के साथ लेबल; चित्रा में लाल) के लिए दाग दिया गया था। नाभिक DAPI से सना हुआ था। (ए) में, सफेद बॉक्स (+) और (-) वीआरएनए दोनों के साथ एक क्षेत्र को दर्शाता है। इनसेट (+) वीआरएनए (हरे) और दुर्लभ (-) वीआरएनए प्रजातियों (लाल) का एक क्लोज-अप प्रस्तुत करते हैं। (बी) सेंस (+) वीआरएनए (हरा)। (सी) एंटीसेंस (-) वीआरएनए (लाल)। स्केल पट्टी (A) में 10 μm का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आरएनए, डीएनए और प्रोटीन के एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन के लिए अक्सर व्यापक अनुकूलन की आवश्यकता होती है। दो सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले तरीके 5-एथिनाइल-2-डीऑक्सीयूरिडाइन (ईडीयू) लेबलिंग और डीएनए फिश हैं। ईडीयू लेबलिंग को वायरल डीएनए और प्रोटीन को एक साथ देखने के लिए लागू किया गया है, क्योंकि ईडीयू को नवजात डीएनए में शामिल किया गया है और बाद में क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से एज़ाइड युक्त फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किया गया है। इस प्रकार ईडीयू लेबलिंग का उपयोग प्रतिकृति 12 के लिए डीएनए टेम्पलेट्स के साथ डीएनए वायरस या वायरस के देशी वायरस प्रतिकृति कैनेटीक्स की निगरानी के लिए किया जासकता है। हालांकि, ईडीयू लेबलिंग की एक कमी यह है कि कोशिकाओं को विभाजित करने में, प्रतिकृति जीनोम ईडीयू को शामिल करेगा, जिससे उच्च पृष्ठभूमि और भ्रामक छवि विश्लेषण उत्पन्न होगा। डीएनए फिश सेल चक्र की परवाह किए बिना संबंधित लक्ष्य के लिए सीधे न्यूक्लिक एसिड जांच को संकरण करके इन मुद्दों को दरकिनार कर सकता है। हालांकि, पारंपरिक मछली अक्सर कुशल जांच संकरण प्राप्त करने के लिए उच्च तापमान पर निर्भर करती थी, इम्यूनोस्टेनिंग या यहां तक कि एक साथ आरएनए धुंधला13 में बाधा डालती थी। MICDDRP संभावित रूप से विभिन्न सेलुलर प्रणालियों में डीएनए, आरएनए और प्रोटीन के मजबूत एक साथ फ्लोरोसेंट लेबलिंग प्रदान करने वाले इन मुद्दों को दरकिनार कर सकता है।

जबकि हमने प्रदर्शित किया है कि हम अपने एमआईसीडीआरपी प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड को एक साथ लेबल कर सकते हैं, विभिन्न प्रणालियों में अनुकूलन की आवश्यकता थी। पहला प्रमुख पैरामीटर जिसे हमें अनुकूलित करना था वह प्रोटीज उपचार था। हमने स्थितियों में प्रोटीज III एकाग्रता को अलग-अलग किया। प्रोटीज उपचार का अनुकूलन अनुभवजन्य था, क्योंकि हमने इम्यूनोस्टेनिंग दक्षता से समझौता किए बिना, सबसे बड़ी संकरण दक्षता का आकलन करने के लिए विभिन्न कमजोर पड़ने का उपयोग किया। प्रोब विशिष्टता और प्रोटीज उपचार के लिए जिम्मेदार प्रोटीन धुंधला दक्षता में परिवर्तन का आकलन करने के लिए उचित नियंत्रण साथ-साथ किए गए थे। अगले प्रमुख पैरामीटर जिन्हें अनुकूलन की आवश्यकता थी, वे जांच डिजाइन और जांच संकरण थे।

बीडीएनए प्रौद्योगिकी की संवेदनशीलता और विशिष्टता प्राप्त करने के लिए कैप्चर और एम्पलीफायर जांच का उचित डिजाइन महत्वपूर्ण है। सॉफ्टवेयर पैकेज जो गैर-विशिष्ट संकरण घटनाओं की संभावना की भविष्यवाणी करते हैं, जांच डिजाइन 7,11 में सुधार के लिए उपलब्ध हैं। बीडीएनए इमेजिंग किट के साथ संगतता सुनिश्चित करने के लिए प्री-एम्पलीफायर, एम्पलीफायर और फ्लोरोसेंट लेबल जांच के साथ बीडीएनए जांच अब व्यावसायिक रूप से खरीदी जा सकती है। उपयोगकर्ता निर्माताओं को फास्टा फ़ाइल (न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करने के लिए पाठ-आधारित प्रारूप) के रूप में लक्ष्य क्षेत्र (ओं) के लिए अनुक्रम जानकारी (~ 300-1000 बेस जोड़े) प्रदान कर सकते हैं। लक्ष्य जांच आपूर्ति किए गए अनुक्रम के लिए > 90% अनुक्रम होमोलॉजी के साथ उत्पन्न होती है।

डीएनए लेबलिंग के लिए, हमने पाया है कि प्रोटोकॉल के चरण 5 में वर्णित संकरण बफर में जांच को कमजोर करने से डीएनए संकरण में सुधार होता है। डीएनए और आरएनए दोनों को लेबल करते समय, आरएनए जांच को संकरण बफर में पतला किया जा सकता है। आरएनएस की अनुपस्थिति में डीएनए लेबलिंग इस संभावना को बाहर नहीं कर सकती है कि देखे गए न्यूक्लिक एसिड में लक्षित स्ट्रैंडेडनेस का आरएनए शामिल है। संकरण दक्षता में सुधार के लिए तापमान को भी समायोजित करना पड़ सकता है। बढ़ता तापमान प्रोटीन धुंधला दक्षता को प्रभावित कर सकता है, क्योंकि तापमान में वृद्धि प्रोटीन विकृतीकरण को बढ़ावा दे सकती है, प्राथमिक एंटीबॉडी की एपिटोप पहचान को बढ़ा सकती है। हमारे प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा में, हमने 40 डिग्री सेल्सियस पर आईएसएच का प्रदर्शन किया है।

पारंपरिक डीएनए मछली की तुलना में, एमआईसीडीडीआरपी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से कल्पना करने के लिए डीएनए, आरएनए और प्रोटीन को एक साथ लेबल करने के लिए एक बेहतर प्रक्रिया प्रदान करता है। एक संभावित सीमा यह है कि जांच का चयन संकरण की दक्षता और जांच के बीच डेटा की मात्रात्मक तुलना करने की क्षमता को प्रभावित कर सकता है। यह प्रोटोकॉल हमारे हाथों में विभिन्न सेलुलर और वायरल सिस्टम में प्रभावी रहा है, जिसमें अलग-अलग परिस्थितियों में केवल मामूली अनुकूलन की आवश्यकता है। हाल के उच्च प्रोफ़ाइल प्रकाशनों ने एचआईवी एकीकरण साइट चयन14 और एचआईवी रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन कैनेटीक्स15 का अध्ययन करने के लिए हमारे दृष्टिकोण का उपयोग किया है। एमआईसीडीडीआरपी के भविष्य के अनुप्रयोगों में विशिष्ट सेलुलर जीन और सेलुलर प्रोटीन के न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमों के साथ सहवर्ती वायरल न्यूक्लिक एसिड का विज़ुअलाइज़ेशन शामिल हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119, और U54 AI150472) द्वारा पूरी तरह से या आंशिक रूप से समर्थित किया गया था। हम इन्फ्लूएंजा ए वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए डॉ रेमंड एफ शिनाजी और सैडी अमिचाई को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% PFA
50% dextran sulfate Amreso 198 For DNA hybridization buffer
50X wash buffer ACD Bio 320058
6-well plates
Amplifier 1-FL ACD Bio
Amplifier 2-FL ACD Bio
Amplifier 3-FL ACD Bio
Amplifier 4-FL ACD Bio Consult Amp-4 table in protocol
Anti-HCV NS5a antibody Abcam ab13833 Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4
Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody NIH AIDS Reagent Program 3537
Anti-Mov10 antibody Abcam ab80613 Rabbit polyclonal
Anti-PB1 antibody GeneTex GTX125923 Antibody against flu protein
Bovine serum albumin Blocking reagent for immunostaining
Cell media with supplements Media appropriate for cell model
Coverslips
DAPI ACD Bio Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)
Dulbecco's phosphate buffered saline (1X PBS) Gibco 14190250 No calcium and magnesium
Ethylene carbonate Sigma E26258
Fetal bovine serum (FBS) Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)
Fisherbrand colorfrost plus microscope slides Fisher Scientific 12-550-17/18/19 Precleaned
HCV-GT2a-sense-C2 probe ACD Bio 441371 HCV(+) sense RNA probe
HIV-gagpol-C1 ACD Bio 317701 HIV-1 cDNA probe
HIV-nongagpol-C3 ACD Bio 317711-C HIV-1 RNA probe
HybEZ hybridization oven ACD Bio 321710/321720
ImmEdge hydrophobic barrier pen Vector Laboratories H-4000
Nail polish For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment
Nuclease free water Ambion AM9937
Poly-d-lysine (PDL) Coat coverslips in 20 µg/mL of PDL for 30 minutes
Probe diluent ACD Bio 300041 For diluting RNA C2 or C3 probes
Prolong gold antifade Invitrogen P36930
Protease III ACD Bio 322337
RNAscope® Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP ACD Bio 436221
RNase A Qiagen
Secondary antibodies
Slides
Sodium chloride For DNA hybridization buffer
Sodium citrate, pH 6.2 For DNA hybridization buffer
Tween-20 For DNA hybridization buffer and PBS-T
V-HBV-GTD ACD Bio 441351 Total HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2 ACD Bio 465531-C2 HBV pgRNA probe
V-HCV-GT2a probe ACD Bio 441361 HCV(-) sense RNA probe
V-HTLV-HBZ-sense-C3 ACD Bio 495071-C3 HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ
V-HTLV1-GAG-C2 ACD Bio 495051-C2 HTLV-1 DNA probe
V-HTLV1-GAG-POL-sense ACD Bio 495061 HTLV-1 (+) sense RNA probe
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP ACD Bio 436221 IAV RNA probe
V-ZIKA-pp-O2 ACD Bio 464531 Zika(+) sense RNA probe
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2 ACD Bio 478731-C2 Zika(-) sense RNA probe

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References

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Shah, R., Lan, S., Puray-Chavez, M. N., Liu, D., Tedbury, P. R., Sarafianos, S. G. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (164), e61843, doi:10.3791/61843 (2020).

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