Qui presentiamo un metodo per esprimere proteine istono acetilate usando l'espansione del codice genetico e assemblare nucleosomi ricostituiti in vitro.
Articolo metodologico
Qui presentiamo un metodo per esprimere proteine istono acetilate usando l'espansione del codice genetico e assemblare nucleosomi ricostituiti in vitro.
Le proteine istono acetilate possono essere facilmente espresse in Escherichia coli che codifica per un mutante, Nε-acetil-lisina (AcK) specifico Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-sintetasi (MmAcKRS1) e il suo tRNA imparentato (tRNAPyl)per assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. MmAcKRS1 e tRNAPyl forniscono AcK in un sito di mutazione ambrata nell'mRNA preferito durante la traduzione in Escherichia coli. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per incorporare AcK nei siti di llysina H3. La pirrolisil-tRNA sintetasi (PylRS) può anche essere facilmente evoluta per incorporare altri amminoacidi non canonici (bcAA) per la modifica o la funzionalizzazione delle proteine specifiche del sito. Qui dettagliamo un metodo per incorporare AcK usando il sistema MmAcKRS1 nell'istono H3 e integriamo proteine H3 acetilate in mononucleosomi ricostituiti. I mononucleosomi ricostituiti acetilati possono essere utilizzati in saggi biochimici e leganti, determinazione della struttura e altro ancora. Ottenere mononucleosomi modificati è fondamentale per progettare esperimenti relativi alla scoperta di nuove interazioni e alla comprensione dell'epigenetica.
Abbiamo utilizzato PylRS e tRNAPyl per sintetizzare e assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. PylRS si è dimostrato prezioso come strumento di espansione del codice genetico per produrre proteine con modifiche post traslazionali (PTM) ed è stato geneticamente evoluto per incorporare circa 200 diverse bcAA. PylRS incorpora ad un codone di arresto ambrato, rimuovendo la concorrenza da altri amminoacidi durante la traduzione. Il PylRS è stato scoperto per la prima volta in archea metanogenica, e da allora è stato utilizzato in biologia chimica per incorporare nuovi gruppi chimici reattivi nelle proteine....
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1. Costruzione plasmide
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Dimeri, tetrameri e ottameri possono essere valutati eseguendo un gel SDS PAGE del 12% (Figura 1 e Figura 2). Qui potete vedere che alcuni dei tetrameri acetilati hanno una resa inferiore rispetto ad altri (Figura 1). Infatti, più vicino alla regione centrale, minore è la resa osservata. Ciò è molto probabilmente dovuto all'acetilazione che interferisce con l'assemblaggio del tetramero più ci si avvi.......
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È essenziale seguire questo protocollo in ogni dettaglio durante un esperimento. I nucleosomi non sono molto stabili e molti tentativi ed errori sono andati a determinare questo protocollo. È fondamentale rimuovere i precipitati ad ogni fase (o quando osservato) perché il particolato può facilmente interferire con i processi di assemblaggio. Tieni sempre i campioni di istone sul ghiaccio. Se i nucleosomi vengono conservati a 4 °C per troppo tempo, possono smontare spontaneamente. Assicurarsi di controllare eventuali camp.......
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Nessuno degli autori può dichiarare interessi finanziari concorrenti.
Vorremmo ringraziare il Dr. Wesley Wang per aver posto le basi per questo protocollo e il suo prezioso mentoring. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da National Institutes of Health (Grants R01GM127575 e R01GM121584) e Welch Foundation (Grant A-1715).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 M TE Tampone | NA | NA | 0,5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8 |
| 1 M TE Tampone | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8 |
| 100x TE Tampone | NA | NA | |
| 2 M TE Tampone | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8 | |
| 20 mM TE Tampone | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8 |
| 6 M GuHCl | 6M cloruro di guanidinio, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0 | ||
| Acetillisina | |||
| Colonna Tampone di lavaggio | NA | NA 6 | M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazolo pH 7,8 |
| Tampone di eluizione | NA | NA | |
| Fisherbrand Pompa di trasferimento chimico a portata variabile | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV proteasi | |||
| istone Lisi Tampone | NA | NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 | |
| Ni-NTA Resina | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazolo, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Tampone di lavaggio per pellet | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Tampone di conservazione | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerolo, pH 7.8 |
| Termociclatore |
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