Acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando l'espansione del codice genetico in Escherichia coli

Summary

Qui presentiamo un metodo per esprimere proteine istono acetilate usando l'espansione del codice genetico e assemblare nucleosomi ricostituiti in vitro.

Abstract

Le proteine istono acetilate possono essere facilmente espresse in Escherichia coli che codifica per un mutante, N^ε-acetil-lisina (AcK) specifico Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-sintetasi (MmAcKRS1) e il suo tRNA imparentato (tRNA^Pyl)per assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. MmAcKRS1 e tRNA^{Pyl forniscono} AcK in un sito di mutazione ambrata nell'mRNA preferito durante la traduzione in Escherichia coli. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per incorporare AcK nei siti di llysina H3. La pirrolisil-tRNA sintetasi (PylRS) può anche essere facilmente evoluta per incorporare altri amminoacidi non canonici (bcAA) per la modifica o la funzionalizzazione delle proteine specifiche del sito. Qui dettagliamo un metodo per incorporare AcK usando il sistema MmAcKRS1 nell'istono H3 e integriamo proteine H3 acetilate in mononucleosomi ricostituiti. I mononucleosomi ricostituiti acetilati possono essere utilizzati in saggi biochimici e leganti, determinazione della struttura e altro ancora. Ottenere mononucleosomi modificati è fondamentale per progettare esperimenti relativi alla scoperta di nuove interazioni e alla comprensione dell'epigenetica.

Introduction

Abbiamo utilizzato PylRS e tRNA^{Pyl per} sintetizzare e assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. PylRS si è dimostrato prezioso come strumento di espansione del codice genetico per produrre proteine con modifiche post traslazionali (PTM) ed è stato geneticamente evoluto per incorporare circa 200 diverse bcAA. PylRS incorpora ad un codone di arresto ambrato, rimuovendo la concorrenza da altri amminoacidi durante la traduzione. Il PylRS è stato scoperto per la prima volta in archea metanogenica, e da allora è stato utilizzato in biologia chimica per incorporare nuovi gruppi chimici reattivi nelle proteine^1,2.

MmAcKRS1 è stato evoluto da Methanosarcina mazei PylRS e frequentemente utilizzato nel nostro laboratorio per la sintesi di proteine acetilate^3,4,5,6. MmAcKRS1 consegna AcK in un sito di mutazione ambrata nell'mRNA preferito durante la traduzione in Escherichia coli. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata per incorporare siti di lisina H3 di AcK, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 e K79 istono H3 per studiare l'attività di Sirtuin 1, 2, 6 e 7 sui mononucleosomi acetilati^4,5,6. Qui dettagliamo questo metodo per esprimere istoni acetilati e nucleosomi acetilati ricostituiti.

Protocol

1. Costruzione plasmide

1. Inizia decidendo quale proteina istonina sarà acetilata e in quale sito di lisina. Mutare il sito nel codone di arresto ambrato (TAG) usando la mutagenesi diretta dal sito.
   NOTA: Ci sono quattro plasmidi precedentemente progettati utilizzati per l'espressione delle proteine istone. Tutte e quattro le proteine istonate sono state clonate nel vettore pETDuet-1 con un tag di istidina N-terminale. Histone H4 include anche un tag SUMO, l'origine della replicazione colE1 con un numero di copia di circa 40, resistente all'ampicillina e un promotore T7.
   1. Progettare primer in avanti e inversi che contengono una mutazione TAG nel sito desiderato (sostituendo un codone di lysine esistente con il codone di arresto ambrato) in uno dei quattro plasmidi proteici istoni.
   2. Utilizzare PCR intero plasmide per amplificare il TAG contenente plasmide. Determinare una temperatura di ricottura appropriata per i primer. In generale, la temperatura di fusione (T_m) dei primer meno 5 °C sarà sufficiente. In caso di difficoltà nell'ottenimento di un prodotto PCR, è possibile utilizzare un gradiente di temperatura intorno a T_m - 5 °C per ottimizzare la temperatura di ricottura per l'amplificazione.
      NOTA: In questo esperimento è stata utilizzata una PFU polimerasi espressa internamente per 30 cicli con le seguenti condizioni: 94 °C per 30 s (denaturazione), temperatura di ricottura per 30 s e 72 °C per 6 min (o 1 min per kilobase-pairs). Per ulteriori dettagli su questo tipo di metodo PCR, vedere Liu e Naismith⁷.
   3. Pulire il prodotto PCR con un kit di pulizia PCR seguendo il protocollo del produttore. Analizzare il prodotto PCR mediante elettroforesi del gel di agarosio e successiva colorazione del bromuro di etidio.
   4. Legare il plasmide incubando con T4 ligasi durante la notte a 16 °C.
2. Prima trasformare il TAG contenente plasmide (Amp^R)in Escherichia coli chimicamente competente. Scegli un minimo di 4 colonie dalla trasformazione e purifica il plasmide. Fare le scorte cellulari di ciascuno con glicerolo con metodi standard e conservare a -80 °C. Inviare per il sequenziamento per confermare la mutazione TAG desiderata.
3. Una volta confermata la sequenza, co-trasformare il plasmide contenente TAG (Amp^R)con pEVOL-AckRS (Chl^R) in CobB chimicamente competente (l'unica deacetilasi istonina nota in E. coli.) soppressioni le cellule BL21 utilizzando il metodo dello shock termico. pEVOL è un plasmide con un numero di copia medio a basso numero di copia p15A.
   NOTA: La serie pEVOL di plasmidi è stata costruita sulla base di studi precedenti che hanno mostrato una maggiore espressione della coppia ortogonale aaRS/tRNA^{Tyr è} stata efficace nel ridurre il troncamento proteico e nell'aumentare le rese complessive delle proteine^{mutanti 8}. Se le cellule di cancellazione cobb non sono accessibili, procedere con cellule BL21 chimicamente competenti. La cobB è una deacetilasi istonina sirtuina simile a sirtuina e la nicotinammide può essere aggiunta a una concentrazione finale di 5 mM durante l'espressione della proteina istonina per inibire cobB come approccio alternativo⁹.
4. Fare un magazzino cellulare e conservare a -80 °C.

2. Espressione acetilata della proteina istotone

1. Preparare 1 L di supporti 2YT autoclavati (o volume di scelta) in un pallone da coltura.
2. Inoculare 20 mL di mezzi 2YT contenenti gli antibiotici appropriati con il patrimonio cellulare co-trasformato che ha il plasmide contenente TAG (Amp^R) e pEVOL-AckRS (Chl^R)e crescere a 37 °C in OD = 0,6 (4-6 h).
3. Aggiungere gli antibiotici appropriati all'1 L dei mezzi 2YT autoclavati e inoculare con la coltura iniziale di 20 mL. Crescere a 37 °C fino a OD = 0,6-0,8 (2-3 h).
4. Aggiungere agenti induttori e acetillysina (AcK) alle concentrazioni finali di IPTG 1 mM, 0,2% arabinosi e AcK 5 mM.
5. Far crescere la cultura a 37 °C per 6-8 ore.
6. Celle a pellet a 2.700 x g per 15 min.
7. Conservare il pellet di cella a -80 °C durante la notte.
8. Da questo passo in poi mantenere il campione sul ghiaccio tutti i tempi. Sciogliere il pellet cellulare in 50 mL di tampone di lisi istonale per 1 L di coltura.
9. Sonicare secondo il seguente ciclo: 1 s on, 1 s off, totale in tempo: 3 min al 60% di ampiezza.
10. Corpi di inclusione del pellet a 41.600 x g per 45 min.
11. Scartare i corpi di inclusione supernatanti e resopensi in 30 mL del tampone di lisi istonale. L'inclusione del pellet promette 41.600 x g per 30 min.
12. Scartare i corpi di inclusione supernatanti e resuspend in 30 mL di tampone di lavaggio pellet. Corpi di inclusione del pellet a 41.600 x g per 30 min.
13. Scartare i corpi supernatanti e sciogliere i corpi di inclusione in 25 mL di tampone di cloridrato di guanidina (GuHCl) da 6 M. Incubare con agitazione a 37 °C per 1 h.
    NOTA: Se necessario, i corpi di inclusione possono essere incubati con agitazione durante la notte a 4 °C.
14. L'inclusione del pellet promette 41.600 x g per 45 min. Incubare il supernatante con 1 mL di resina Ni-NTA equilibrata con tampone GuHCl da 6 M per 2 h.
15. Procedere con la purificazione Ni-NTA in condizioni denaturate. Lavare la colonna con 3 volumi di colonne di buffer di lavaggio delle colonne. Proteina istolata acetilata elute con 10 mL di tampone di eluizione.
    NOTA: Tentare di concentrare la proteina qui è un'opzione, ma gli istoni acetilati sono molto imprevedibili e possono facilmente precipitare. Non è consigliabile concentrarsi oltre i 2 mL in volume totale.
16. Dializzare estensivamente la proteina acetilata dell'istono contro il 5% di tampone di acido acetico per rimuovere i sali. Dializzare per 3 ore alla volta a 4 °C, scambiando con tampone fresco un minimo di 6 volte.
    NOTA: Per una migliore purezza delle proteine, c'è un'opzione per dializzare contro l'acqua pura. Tuttavia, ciò causa precipitazioni significative e riduzione della resa che può essere indesiderabile per le proteine acetilate istono a basso rendimento.
17. Aliquota e licofilia proteine, e conservare a tempo indeterminato a -80 °C. Le proteine istono di tipo selvatico producono generalmente 10-50 mg/L, mentre le proteine acetilate dell'istone producono meno di 10 mg/L a seconda del sito specifico di lisina. Ad esempio, H3K79Ac ha una media di 5 mg/L.

3. Espressione di proteine istono di tipo selvatico

1. Per assemblare nucleosomi completi, esprimere tutte e 4 le proteine istono. Quando si esprimono e purificano gli istoni di tipo jolly, il protocollo è lo stesso degli istoni acetilati tranne quanto segue:
   1. Non eseguire la co-trasformazione. Non utilizzare pEVOL-AcKRS per l'espressione istono di tipo jolly. Regolare gli antibiotici di conseguenza.
   2. Non utilizzare una linea cellulare di cancellazione CobB o aggiungere Nicotinammide, AcK o arabinosi durante l'induzione dell'espressione cellulare.

4. Preparazione del DNA 601

NOTA: Una sequenza di DNA ottimizzata precedentemente progettata per dirigere il posizionamento nucleosoma è assemblata con ottameri istoni per produrre mononucleosoma ad alta efficienza. Questa sequenza è indicata come DNA 601 o sequenza di Widom. Questa sequenza è diventata la sequenza standard del DNA per gli studi in vitro sui nucleosomi, dai test di rimodellamento della cromatina alle misurazioni a singola molecola¹⁰.

1. Per preparare quantità significative di 601 DNA per l'assemblaggio nucleosoma, trasforma pGEM-3z/601 in Top 10 cellule e coltiva 10 mL di coltura per l'amplificazione e l'estrazione plasmide. Utilizzare un kit di estrazione plasmide e seguire la raccomandazione del produttore.
2. Utilizzare una PFU polimerasi espressa internamente (più efficiente) per questo protocollo di amplificazione. Impostare una reazione PCR: per una reazione di 250 μL, utilizzare 207,5 μL autoclavato MQ H₂O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2.5 μL PFU enzima. In genere eseguiamo 60 reazioni contemporaneamente per ottenere abbastanza DNA da assemblare.
3. Utilizzare una temperatura di ricottura di 52 °C per 30 s e un tempo di estensione di 30 s se si utilizza la polimerasi PFU. Altrimenti seguire le condizioni consigliate dai produttori.
4. Una volta effettuata la PCR, utilizzare un kit di pulizia PCR preferito per purificare il prodotto PCR.

5. Assemblaggio dell'ottagono istone

1. Sciogliere le aliquote delle pellet di proteine istone H2A, H2B, H3 e H4 in modo che vi sia uno stock separato di ciascuna proteina istonica nel Tampone GuHCl con un volume totale di 100 μL.
2. Calcolare la concentrazione di ogni proteina istona misurando_l'assorbanza A 280.
3. Se l'assorbanza è maggiore di 1 per qualsiasi proteina, diluire con il tampone GuHCl per ottenere una concentrazione più accurata.
4. Unire le proteine H2A e H2B in un rapporto molare 1:1 e diluire a una concentrazione proteica totale di 4 μg/μL. Ripetere per H3 e H4.
5. Dializzare in sequenza a 4 °C rispetto a 2 M TE buffer overnight, 1 M TE buffer per 2 h e 0,5 M TE buffer per 5 h.
   NOTA: Il secondo e il terzo passo della dialisi causano il precipitare delle conformazioni instabili delle proteine. Si prevede che vedrà forti precipitazioni in questi passaggi.
6. Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione a 16.800 x g a 4 °C.
7. Anche in questo caso, calcolare la concentrazione di dimeri istono (miscela H2A/H2B) e tetrameri (miscela H3/H4) che misurano_{l'assorbanza A 280.}
8. Mescolare dimeri e tetrameri in un rapporto molare 1:1 e regolare NaCl a 2 M con l'aggiunta di NaCl solido.
9. L'ottagono istono può essere conservato a 4 °C ed è più stabile dei dimeri e dei tetrameri. Non congelare mai l'ottagono istone in quanto ciò può causare lo smontaggio.
10. Se si assembla con istoni acetilati, è sufficiente sostituire la proteina di tipo selvatico con la proteina acetilata nella procedura.

6. Assemblaggio nucleosoma

1. Usa un buffer TE 100x e un NaCl solido per regolare il BUFFER da 601 DNA a 2M TE. Aggiungere il DNA 601 in tampone TE 2M all'ottamero istono in un rapporto molare da 0,85:1 a 0,90:1. Un rapporto inferiore di DNA può essere aggiunto se il DNA libero è presente nell'analisi dello spostamento del gel.
2. Trasferire la miscela DNA-istone in un sacchetto di dialisi e mettere in circa 200 mL di tampone 2M TE (o più se si assemblano più campioni) e mescolare molto delicatamente a 4 °C.
3. Impostare una pompa peristaltica da spurgo per gocciolare lentamente in nessun tampone TE sale. Quando il volume è approssimativamente raddoppiato, versare metà del volume. Fallo almeno 4 volte in totale. Con una pompa questo può richiedere 4-8 ore a seconda del volume iniziale. I nucleosomi si formano quando la concentrazione di sale è ridotta a 150 mM (misurata dal misuratore di salinità).
4. Dopo che la concentrazione di sale è stata ridotta a 150 mM, dializzare contro un tampone TE da 20 mM durante la notte.
5. Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione e misurare la concentrazione dei nucleosomi mediante lettura A₂₆₀ utilizzando un lettore di piastre.
6. Aggiungere la proteasi His-TEV (TEV: nucleosoma 1:30, w:w ) e incubare durante la notte a 4 °C per rimuovere tutti i tag di istidina. Rimuovere le impurità dell'etichetta istidina dalla soluzione nucleosoma con la resina Ni-NTA tirare verso il basso.
7. Per posizionare il nucleosoma e omogeneizzare il campione, incubare a 60 °C per 1 h.
   NOTA: Per i siti acetilati particolarmente instabili, questo passaggio potrebbe non essere consigliabile.
8. Conservare i nucleosomi a breve termine (alcune settimane) a 4 °C.
9. Per la conservazione a lungo termine, dializzare i nucleosomi contro il buffer di stoccaggio e conservare a -80 °C.

Results

Dimeri, tetrameri e ottameri possono essere valutati eseguendo un gel SDS PAGE del 12% (Figura 1 e Figura 2). Qui potete vedere che alcuni dei tetrameri acetilati hanno una resa inferiore rispetto ad altri (Figura 1). Infatti, più vicino alla regione centrale, minore è la resa osservata. Ciò è molto probabilmente dovuto all'acetilazione che interferisce con l'assemblaggio del tetramero più ci si avvi...

Discussion

È essenziale seguire questo protocollo in ogni dettaglio durante un esperimento. I nucleosomi non sono molto stabili e molti tentativi ed errori sono andati a determinare questo protocollo. È fondamentale rimuovere i precipitati ad ogni fase (o quando osservato) perché il particolato può facilmente interferire con i processi di assemblaggio. Tieni sempre i campioni di istone sul ghiaccio. Se i nucleosomi vengono conservati a 4 °C per troppo tempo, possono smontare spontaneamente. Assicurarsi di controllare eventuali camp...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 M TE Tampone	NA	NA	0,5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
1 M TE Tampone	NA	NA	1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
100x TE Tampone	NA	NA
2 M TE Tampone	NA		2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
20 mM TE Tampone	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
6 M GuHCl			6M cloruro di guanidinio, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0
Acetillisina
Colonna Tampone di lavaggio	NA	NA 6	M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazolo pH 7,8
Tampone di eluizione	NA	NA
Fisherbrand  Pompa di trasferimento chimico a portata variabile	Fischer Scientific	15-077-67
His-TEV proteasi
istone Lisi Tampone	NA		NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0
Ni-NTA Resina			6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazolo, pH 7.8
PCR Clean-Up Kit	Epoch Life Sicences	2360050
Tampone di lavaggio per pellet	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Tampone di conservazione	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glicerolo, pH 7.8
Termociclatore