Summary
在这里，我们提出一种方法来表达使用遗传密码膨胀和组装重组核体体外的自负型高石蛋白。
Abstract
雌二甲酸高石蛋白可以很容易地在 大肠杆菌 编码突变体中表达， Nε- 乙酰赖氨酸 （AcK） 特异性 甲基甲基苯丙胺 -辛泰酶 （MmAcKRS1） 及其同位素 tRNA （tRNAPyl）组装与站点特定乙酰化组蛋白的重组单核体。MmAcKRS1和tRNAPyl 在 埃舍里希亚大肠杆菌翻译过程中，在首选的mRNA的琥珀突变部位提供AcK。该技术已广泛应用于 H3 lysine 站点的 AcK。皮罗利锡-tRNA合成酶（PylRS）也可以很容易地进化，以纳入其他非卡诺氨基酸（ncAAs），用于现场特定的蛋白质修饰或功能化。在这里，我们详细介绍了一种方法，将使用 MmAcKRS1 系统的 AcK 集成到高石 H3 中，并将乙酰化 H3 蛋白质集成到重组后的单核糖体中。Acetylat重组的单核糖体可用于生化和结合测定、结构测定等。获得经过修改的单核糖体对于设计与发现新的相互作用和理解表观遗传学相关的实验至关重要。
Introduction
我们利用 PylRS 和 tRNAPyl合成和组装具有特定选型组式的重组单核体。PylRS 作为一种基因密码扩展工具，通过转化后修饰 （PTMs） 生产蛋白质，已被证明是无价的，并且经过基因进化，整合了大约 200 种不同的 ncAAs。PylRS 在琥珀色停止胶子中加入，在翻译过程中消除了其他氨基酸的竞争。PylRS首次在甲基古生物中发现，并自此被用于化学生物学，将新型反应化学组纳入蛋白质1、2。
MmAcKRS1是由甲烷甲基苯丙胺酸盐进化而来，并经常用于我们的实验室合成乙酰化蛋白质3，4，5，6。MmAcKRS1 在埃斯切里西亚大肠杆菌翻译过程中，在首选 mRNA 的琥珀突变站点提供 AcK 。该技术以前曾用于将K4、K9、K14、K18、K23、K27、K36、K56、K64和K79希斯通H3赖氨酸位点的交流电，用于研究Sirtuin 1、2、6和7对乙酰单核体4、5、6的活性。在这里，我们详细介绍了这种表达自体组分子和重组自负核糖体的方法。
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Protocol
1. 质粒结构
- 首先决定哪种高石蛋白将被选中，在哪个赖氨酸部位。使用现场定向突变将网站变异到琥珀色停止胶子 （TAG）。
注：有四个以前设计的质粒用于表达高石蛋白。所有四种高石蛋白都克隆到带有N端结石丁标签的ptDuet-1载体中。Histone H4 还包括一个 SUMO 标签、复制 colE1 的来源，其拷贝编号约为 40，具有抗安眠药和 T7 促进剂。- 设计前向和反向引物，在所需的部位包含 TAG 突变（用琥珀色停止胶子替换现有的 lysine codon）在四个 Histone 蛋白质粒之一。
- 使用全质PCR放大包含质粒的标签。确定引号的适当退化温度。一般来说，引体的熔化温度（Tm）为零下5°C就足够了。如果获得 PCR 产品遇到困难，则可以使用 Tm - 5 °C 周围的温度梯度来优化退化温度以进行放大。
注意：在此实验中，内部表示的 PFU 聚合酶用于 30 个周期，条件如下：30 秒 94 °C（变性），30 秒的退化温度，6 分钟 72 °C（或每千基对 1 分钟）。有关此类型的 PCR 方法的更多详细信息，请参阅刘和奈史密斯7。 - 通过遵循制造商的协议，使用 PCR 清理套件清理 PCR 产品。通过凝胶电泳和随后的溴化钠染色分析 PCR 产品。
- 在 16 °C 的夜间用 T4 韧带孵育，从而对质粒进行石灰。
- 首先将含有质粒（ampR）的标签转换为化学上称职 的大肠杆菌。从转化中挑选至少 4 个菌落并净化质粒。使用标准方法使每个细胞储存甘油，储存在-80°C。 发送测序以确认所需的 TAG 突变。
- 一旦序列被确认，使用热冲击法将含标签的质粒 （AmpR）与 pEVOL-AckRS （ChlR）共同转换为具有化学能力的 CobB（ 大肠杆菌中唯一已知的希石裂解乙酰酶）删除 BL21 细胞。pEVOL 是一种质粒，具有中拷贝编号到低拷贝编号 p15A 源。
注：pEVOL系列的质粒是根据先前的研究表明正交aaRS/tRNATyr对的表达增加，有效地减少蛋白质截断和增加突变蛋白8的整体产量。如果 CobB 删除细胞无法访问，则继续使用具有化学能力的 BL21 细胞。CobB是一种类似锡尔图因的石解氨酸脱乙酰酶，在希斯通蛋白表达过程中，可在5mM的最终浓度下添加尼古丁酰胺，以抑制CobB作为替代方法9。 - 制作细胞库存，并存储在-80°C。
2. 甲基基石蛋白表达
- 在文化烧瓶中准备 1 L 的自动切割 2YT 介质（或选择量）。
- 接种 20 mL 的 2YT 介质，其中含有适当的抗生素，并具有含 TAG 的质粒 （AmpR）和 pEVOL-AckRS （ChlR），并在 37 °C 至 OD = 0.6 （4-6 h） 中生长。
- 将适当的抗生素添加到 1 L 的自动切割 2YT 介质中，并接种 20 mL 启动器培养物。生长在 37 °C 到 OD = 0.6-0.8 （2-3 小时）。
- 将诱导剂和乙酰氨基苯丙胺 （AcK） 添加到 IPTG 1 mM、0.2% 阿拉比诺酶和 AcK 5 mM 的最终浓度中。
- 在 37 °C 的 6-8 小时内培养文化。
- 15分钟2，700 x g 的颗粒细胞。
- 将细胞颗粒存放在-80°C过夜。
- 从这一步开始，将样品一直放在冰上。每 1 升培养培养基将细胞颗粒溶解在 50 mL 的希斯通裂解缓冲器中。
- 声波根据以下周期：1 s开，1 s关闭，总时间：3分钟在60%振幅。
- 颗粒内含体在 41，600 x g 45 分钟。
- 丢弃超自然体，并重新将内含物置入 30 mL 的希斯通裂解缓冲器中。颗粒内含物的预兆为 41，600 x g 30 分钟。
- 丢弃超自然物，并重新将内含物置入 30 mL 的颗粒清洗缓冲区中。颗粒内含体在 41，600 x g 30 分钟。
- 丢弃超自然物，溶解6M盐酸瓜尼丁（GuHCl）缓冲液25mL中的内含体。在 37 °C 的搅拌下孵化 1 小时。
注意：如果需要，包容性机构可以在4°C的夜间与搅拌一起孵育。 - 颗粒内含物的预兆为 41，600 x g， 为 45 分钟。用 1 mL 的 Ni-NTA 树脂与 6 M GuHCl 缓冲器平衡 2 小时孵化超自然物。
- 在变性条件下进行 Ni-NTA 净化。用 3 列卷的柱洗缓冲器清洗柱。Elute 用 10 mL 的洗脱缓冲器来分型的希石蛋白。
注意：试图在这里浓缩蛋白质是一种选择，但自体酮是非常不可预知的，很容易沉淀。不建议将总容量集中在 2 mL 以上。 - 广泛地将乙酰基石蛋白与 5% 醋酸缓冲液对比，以去除盐分。在 4 °C 下一次透析 3 小时，至少换 6 次新鲜缓冲。
注意：为了提高蛋白质纯度，可以选择对纯净水进行透析。然而，这会导致大量降水和产量下降，这可能不利于低产的酸性高蛋白。 - 将蛋白质引用并合二为一，并无限期地储存在-80°C。 野生型高石蛋白一般产生10-50毫克/升，而自负的基石蛋白产量低于10毫克/升，具体取决于赖氨酸部位。例如，H3K79Ac 平均为 5 毫克/升。
3. 野生型石蛋白表达
- 要组装全核糖体，表达所有4个组蛋白。当表达和净化野生类型的石酮时，协议与自体酮相同，但以下除外：
- 不要执行共同转换。不要使用pEVOL-AcKRS进行野生类型的高石表达。相应地调整抗生素。
- 在细胞表达的诱导过程中，不要使用CobB删除细胞系或添加尼古丁胺、AcK或阿拉比诺酶。
4. 准备601个DNA
注：以前设计的优化DNA序列，以指导核糖体定位组装与高石八度组件，以产生单核体的高效率。此序列称为 601 DNA 或维多姆序列。这个序列已成为核体体外研究的标准DNA序列，从染色质改造检测到单分子测量10。
- 要为核糖体组装准备大量 601 DNA，将 pGEM-3z/601 转化为前 10 个细胞，并培养 10 mL 的质粒放大和提取。使用质粒提取套件，并遵循制造商的建议。
- 使用内部表达的 PFU 聚合酶（更高效）用于此放大协议。设置 PCR 反应：对于 250 μL 反应， 使用 207.5 μL 自动切割 MQ H2O， 25 μL 10x PFU 缓冲区， 5 μL 前进引号： ctggagtggg， 5 μL 反向引言： 阿卡加塔特加卡奇格， 5 μL dNTP 混合， 2.5 μL PFU 酶。我们通常同时运行60个反应，以获得足够的DNA来组装。
- 如果使用 PFU 聚合酶，使用 30s 的退化温度为 52 °C，延长时间为 30s。否则按照厂家推荐的条件。
- 完成 PCR 后，使用选择的 PCR 清理套件来净化 PCR 产品。
5. 希斯通八角形的组装
- 溶解 H2A、H2B、H3 和 H4 中的基石蛋白颗粒，使 GuHCl 缓冲区中每个组蛋白的单独库存量达到 100 μL。
- 通过测量 A280 吸收量来计算每个高石蛋白的浓度。
- 如果任何蛋白质的吸收大于 1，则用 GuHCl 缓冲器稀释以获得更准确的浓度。
- 将 H2A 和 H2B 蛋白质以 1：1 摩尔的比例组合，稀释为总蛋白质浓度为 4 μg/μL。
- 隔夜在 4 °C 对 2 M TE 缓冲器时按顺序进行对 1 M TE 缓冲，2 小时以 1 M TE 缓冲，在 5 小时内以 0.5 M TE 缓冲器进行对比。
注：透析的第二步和第三步导致蛋白质的不稳定构象沉淀出来。预计这些步骤将看到强降水。 - 在 4 °C 时，在 16，800 x g 时通过离心去除沉淀物。
- 再次计算测量A280 吸收度的高石二音量（H2A/H2B混合物）和四合器（H3/H4混合物）的浓度。
- 将调光器和四重奏混合在 1：1 摩尔比率中，并通过添加固体 NaCl 将 NaCl 调整为 2 M。
- 希斯通八度棉被可存储在4°C，比二十铃和四重奏更稳定。永远不要冻结希斯通八角形，因为这可能导致拆解。
- 如果用自体色素组装，只需在程序中用自体蛋白代替野生型蛋白质即可。
6. 核体组装
- 使用 100 倍 TE 缓冲器和固体 NaCl 将 601 DNA 调整为 2M TE 缓冲。将 601 DNA 添加到 2M TE 缓冲器中，以 0.85：1 与 0.90：1 的摩尔比加入希斯通八度。如果凝胶移位分析中存在自由DNA，则可以添加较低的脱氧核糖核酸比率。
- 将DNA-histone混合物转移到透析袋中，放入约200mL的2M TE缓冲器（或更多，如果组装多个样品），并在4°C时非常轻轻搅拌。
- 设置一个永久泵清除，以慢慢滴在没有盐TE缓冲。当音量大约翻倍时，倒出一半的体积。这样做总共至少4次。有了泵，这可能需要4-8小时，这取决于起始体积。当盐浓度降低到150米（用盐度计测量）时，核糖体就会形成。
- 盐浓度降低到 150 mM 后，隔夜对 20 mM TE 缓冲器进行透析。
- 通过离心去除沉淀物，用读盘器A260 读数测量核糖体的浓度。
- 添加他的TEV蛋白酶（TEV：核体1：30，w：w），并在4°C孵育过夜，以去除所有的组胺标签。通过 Ni-NTA 树脂向下拉，从核糖体溶液中去除组胺标签杂质。
- 要定位核体并使样品均质化，在 60 °C 孵育 1 小时。
注意：对于特别不稳定的自有网站，此步骤可能不可取。 - 将核糖体储存在 4 °C 的短期（几周）。
- 对于长期存储，对存储缓冲区进行透析核糖体，并存储在 -80 °C。
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Representative Results
通过运行 12% SDS PAGE 凝胶（图 1 和图 2），可以评估调光机、四合器和八角形。在这里你可以看到，一些酸性四合器的产量低于其他（图1）。事实上，离核心区域越近，观察到的产量越低。这很可能是由于乙酰化干扰四聚酯的组装，你离核心区域越近。组装八角形后也观察到类似的影响（图2）。在用601 DNA序列组装八角形后，可以使用5%1x TBE原生PAGE凝胶对核糖体进行评估，然后用溴化钠（图3）染色。在 TEV 消化之前，在 10k 基对标记附近观察核体带。TEV 消化后，核体带相对于梯子向下移动。在热定位之前，观测到的核体带将非常宽，并可能条纹（图4）。
图1：希斯通调光机和四合院。 代表 12% SDS PAGE 凝胶的野生类型高石二音泽 （车道 2） 和 H3 乙酰四合器 （车道 3-9）. 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：希斯通八角形。 代表 12% Sds PAGE 凝胶 H3 乙酰化希斯通八角形 （车道 2 - 11） 。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：组装他标记的H3K64Ac核体复合体。代表 1x TBE 原生 PAGE 凝胶 H3K64Ac 核体复合物 （车道 2） 相比， 免费 601 DNA （Lane 4） 可视化溴化钠。车道 3 显示 H3K64Ac 核体在 60 °C 孵育一小时后。在3号巷观察到所有核体都已经分解。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：组装的TEV消化核体复合物。 代表 1x TBE 原生 PAGE 凝胶的野生类型 TEV 消化核体复合物， 和自由 601 DNA.核体热定位前后的比较。请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在实验期间，必须遵循此协议的每一个细节。核糖体不是很稳定，在确定这个协议时经历了太多的反复试验。关键在于在每一步（或观察到时）清除沉淀物，因为颗粒物很容易干扰组装过程。始终将高石样品保存在冰上。如果核糖体在4°C中储存的时间过长，它们可以自发地拆卸。在任何实验中使用之前，如果在 4 °C 中存储超过 2 周，请务必检查本地 PAGE 的任何样本。避免漩涡八度和核体，因为这也可能导致它们分解。如果遇到组装二毛钱机、四合器或八角形器的问题，这通常表明蛋白质质量差。检查蛋白质质量15%SDS-PAGE。如果蛋白质纯度低，一个选择是将蛋白质与纯净水进行透析。这将导致强降水，并大大降低蛋白质产量，但将产生一个更纯净的样品。每个高石乙酰化部位点的结合和核细胞稳定性差异很大。一般来说，该站点离 N 端域越近，在高石蛋白表达过程中的产量越低。为了核糖体的稳定性，乙酰化位点离核糖核或DNA结合位点越近，组装的核体就越不稳定。如果遇到稳定性问题，必须始终将核体样本保存在冰上。可能需要在 60 °C 时忽略核体定位步骤，因为这可能导致拆解或降水。王牌核糖体的一个主要限制是它们的不稳定性。在37°C等较高温度下，如果不引起核苷酸降水，就不可能进行预制检测。如果实验程序允许，在4°C下执行，以防止丙型核体降水。
这种产生核糖体的方法特别适用于生产用于结合实验和结构测定的改性核体。这种方法产生纯度更高、已知核DNA序列的核糖体，从而消除混淆变量，从而产生更好的控制实验和更高的分辨率图像。对于结构确定核体样本与已知的DNA序列是同质的至关重要的，否则几乎不可能获得高分辨率图像。
这种方法有很多潜在的应用。具体来说，在表观遗传学领域。获得改良后的蛋白质可能非常困难。获得改性蛋白质对于探索许多认识不足的表观遗传途径中作者、读者和橡皮擦的结构和功能至关重要。我们以前曾利用这项技术，通过用含有Pst1消化位点的经过修改的601 DNA序列组装每个突变八胺，探测核糖核DNA对Pst1消化的可访问性。此技术可以进一步修改，以纳入 AcK 以外的 NCA。 PylRS 可以设计为合并许多其他 NCAA。我们还在埃舍里希亚大肠杆菌中加入Nε-（7-阿齐多赫普塔诺尔）-L-赖氨酸（AzHeK），用于重组几种含有AzHeK的希斯通H3蛋白的表达，以调查SILT7在几个乙酰化点的基石脱酸活性。这种方法表明，SIRT7对H3K36的脱酸具有很高的活动性，并且对H3K37的脱乙酰化也具有催化活性。H3K36脱氧核糖核酸化进一步证明是核糖体依赖，可以通过添加短的双链DNA到乙基核糖体基板，模仿在原生染色质6核糖体之间的桥梁DNA显著增强。
此方法也可以修改，以产生野生类型的核体，无需修改，可以在各种情况下使用。我们小组最近与李平伟博士的小组合作发表了一个结构，显示循环GMP-AMP合成酶（cGAS）与由希斯通H2A和H2B通过其第二个DNA结合点11形成的负电荷酸性贴片紧密结合。cGAS 是一种 dsDNA 传感器，可催化循环二氯化物 cGAMP 的合成，通过 STING-TBK1-IRF3 信号轴12、13、14、15、16来调解 I 型干扰素的诱导。
使用完全组装的核糖体的好处是它更类似于核糖体的原生状态，作为探索任何数量的表观遗传相关蛋白质的活动或结合能力的更好模型。有许多例子，有限的或完全不存在的酶活性对裸DNA或高石肽基板，当探测与核糖体基板急剧改变结果。与上述示例一样，使用本来未知的核体基板为 SIRT7 发现了一个新的脱酸位点。在探测这些类型的系统时，使用原生基材至关重要。该技术可用于探测任何修改的读数、书写和擦除活性或绑定能力，这些修改可以由苯丙氨酸遗传密码扩展技术合并。苯丙胺-tRNA合成酶已经是原生混杂的，并且已经为许多其他基材进行了设计，这些基材已经为在任意数量的系统中使用这种技术打开了大门，使主要限制因素成为研究人员的创造力。
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Disclosures
任何作者都没有相互竞争的经济利益可以申报。
Acknowledgments
我们要感谢王卫斯理博士为这项议定书和他宝贵的指导奠定了基础。这项工作得到了国家卫生研究院（授予R01GM127575和R01GM121584）和韦尔奇基金会（授予A-1715）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
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