Summary
Nous présentons ici une méthode pour exprimer les protéines histones acétylées en utilisant l’expansion du code génétique et assembler des nucléosomes reconstitués in vitro.
Abstract
Les protéines histones acétylées peuvent être facilement exprimées dans Escherichia coli codant pour un mutant, Nε-acétyl-lysine (AcK)-methanosarcina mazi pyrrolysine ARNt-synthétase (MmAcKRS1) et son ARNt apparenté (ARNtPyl)pour assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. MmAcKRS1 et tRNAPyl délivrent AcK à un emplacement ambré de mutation dans l’ARNm de choix pendant la traduction dans Escherichia coli. Cette technique a été largement utilisée pour incorporer AcK aux sites de lysine H3. La pyrrolysyl-ARNt synthétase (PylRS) peut également être facilement évoluée pour incorporer d’autres acides aminés non canoniques (NCAAs) pour la modification ou la fonctionnalisation des protéines spécifiques au site. Ici, nous détaillons une méthode pour incorporer AcK en utilisant le système MmAcKRS1 dans l’histone H3 et intégrer les protéines H3 acétylées dans les mononucléosomes reconstitués. Les mononucléosomes reconstitués acétylés peuvent être utilisés dans les tests biochimiques et de liaison, la détermination de la structure, etc. L’obtention de mononucléosomes modifiés est cruciale pour concevoir des expériences liées à la découverte de nouvelles interactions et à la compréhension de l’épigénétique.
Introduction
Nous avons utilisé PylRS et tRNAPyl pour synthétiser et assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. PylRS s’est avéré inestimable en tant qu’outil d’expansion du code génétique pour produire des protéines avec des modifications post-traductionnelles (PTM) et a été génétiquement évolué pour incorporer environ 200 NCA différents. PylRS incorpore au codon ambré, éliminant la concurrence d’autres acides aminés pendant la traduction. PylRS a été découvert pour la première fois dans les archées méthanogènes, et a depuis été utilisé en biologie chimique pour incorporer de nouveaux groupes chimiques réactifs dans les protéines1,2.
MmAcKRS1 a été développé à partir de Methanosarcina mazei PylRS et fréquemment utilisé dans notre laboratoire pour la synthèse de protéines acétylées3,4,5,6. MmAcKRS1 délivre ack à un site de mutation ambrée dans l’ARNm de choix pendant la traduction dans Escherichia coli. Cette technique a été précédemment utilisée pour incorporer AcK aux sites de lysine K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 et K79 de l’histone H3 afin d’étudier l’activité de la sirtuine 1, 2, 6 et 7 sur les mononucléosomes acétylés4,5,6. Ici, nous détaillons cette méthode pour exprimer les histones acétylées et reconstituer les nucléosomes acétylés.
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Protocol
1. Construction du plasmide
- Commencez par décider quelle protéine d’histone sera acétylée et à quel site de lysine. Muter l’emplacement au codon ambrique (TAG) utilisant la mutagenèse dirigée par site.
REMARQUE: Il existe quatre plasmides précédemment conçus utilisés pour l’expression de protéines histones. Chacun des quatre protéines d’histone a été cloné dans le vecteur pETDuet-1 avec une étiquette N-terminale d’histidine. L’histone H4 comprend également une étiquette SUMO, l’origine de la réplication colE1 avec un numéro de copie d’environ 40, résistante à l’ampicilline et un promoteur T7.- Concevoir des amorces avant et arrière qui contiennent une mutation de TAG au site désiré (remplaçant un codon existant de lysine par le codon arrêt ambré) dans l’un des quatre plasmides de protéine d’histone.
- Utilisez la PCR à plasmide entier pour amplifier le plasmide contenant le TAG. Déterminez une température de recuit appropriée pour les amorces. En général, la température de fusion (Tm)des amorces moins 5 °C sera suffisante. Si des difficultés sont rencontrées pour obtenir un produit PCR, un gradient de température autour de Tm - 5 °C peut être utilisé pour optimiser la température de recuit pour l’amplification.
REMARQUE: Dans cette expérience, une PFU polymérase exprimée en interne a été utilisée pendant 30 cycles dans les conditions suivantes: 94 °C pour 30 s (dénaturation), température de recuit pendant 30 s et 72 °C pendant 6 min (ou 1 min par paires kilobase). Pour plus de détails sur ce type de méthode PCR, voir Liu et Naismith7. - Nettoyez le produit PCR avec un kit de nettoyage PCR en suivant le protocole du fabricant. Analyser le produit pcr par électrophorèse sur gel d’agarose et coloration subséquente au bromure d’éthidium.
- Ligater le plasmide en incubant avec de la T4 ligase pendant une nuit à 16 °C.
- Transformez d’abord le plasmide contenant tag (AmpR)en Escherichia colichimiquement compétent. Choisissez un minimum de 4 colonies de la transformation et purifiez le plasmide. Faites des stocks de cellules de chacun avec du glycérol en utilisant des méthodes standard et stockez à -80 °C. Envoyer pour le séquençage pour confirmer la mutation tag désirée.
- Une fois la séquence confirmée, co-transformer le plasmide contenant tag (AmpR)avec pEVOL-AckRS (ChlR)en CobB chimiquement compétent (la seule histone lysine désacétylase connue dans E. coli.) délétion BL21 cellules en utilisant la méthode de choc thermique. pEVOL est un plasmide dont le nombre de copies est moyen à faible nombre de copies p15A.
REMARQUE: La série pEVOL de plasmides a été construite sur la base d’études précédentes qui ont montré une expression accrue de la paire orthogonale aaRS / ARNtTyr était efficace pour diminuer la troncation des protéines et augmenter les rendements globaux des protéines mutantes8. Si les cellules de délétion cobB ne sont pas accessibles, procéder avec les cellules BL21 chimiquement compétentes. CobB est une histone de type sirtuine lysine désacétylase et nicotinamide peut être ajouté à une concentration finale de 5 mM au cours de l’expression de la protéine histone pour inhiber CobB comme une approche alternative9. - Faites un stock de cellules et conservez-le à -80 °C.
2. Expression de la protéine d’histone acétylée
- Préparer 1 L de milieu autoclavé 2YT (ou volume de choix) dans une fiole de culture.
- Inoculer 20 mL de milieu 2YT contenant les antibiotiques appropriés avec le stock cellulaire co-transformé qui a le plasmide contenant tag (AmpR)et pEVOL-AckRS (ChlR) et se développer à 37 °C à OD = 0,6 (4-6 h).
- Ajouter les antibiotiques appropriés aux 1 L de milieu autoclavé de 2YT et inoculer avec la culture de démarrage de 20 mL. Cultiver à 37 °C à DO = 0,6-0,8 (2-3 h).
- Ajouter des agents inducteurs et de l’acétyllysine (AcK) aux concentrations finales d’IPTG 1 mM, d’arabinose à 0,2% et d’AcK 5 mM.
- Cultiver la culture à 37 °C pendant 6-8 h.
- Cellules granulées à 2 700 x g pendant 15 min.
- Conservez la pastille cellulaire à -80 °C pendant la nuit.
- À partir de cette étape, gardez l’échantillon sur la glace en tout temps. Dissoudre le culot cellulaire dans 50 mL de tampon de lyse histone par 1 L de culture.
- Soniquer selon le cycle suivant: 1 s on, 1 s off, total sur le temps: 3 min à 60% d’amplitude.
- Corps d’inclusion de granulés à 41 600 x g pendant 45 min.
- Jeter les corps d’inclusion surnageants et ressusciter dans 30 mL de tampon de lyse histone. L’inclusion de granulés est de 41 600 x g pendant 30 min.
- Jeter les corps d’inclusion surnageants et remises en suspension dans 30 mL de tampon de lavage de granulés. Corps d’inclusion de granulés à 41 600 x g pendant 30 min.
- Jeter le surnageant et dissoudre les corps d’inclusion dans 25 mL de tampon de chlorhydrate de guanidine 6 M (GuHCl). Incuber avec agitation à 37 °C pendant 1 h.
REMARQUE: Si nécessaire, les corps d’inclusion peuvent être incubés avec agitation pendant la nuit à 4 ° C. - L’inclusion de granulés est de 41 600 x g pendant 45 min. Incuber le surnageant avec 1 mL de résine Ni-NTA équilibré avec un tampon GuHCl 6 M pendant 2 h.
- Procéder à la purification ni-NTA dans des conditions dénaturées. Lavez la colonne avec 3 volumes de colonne de tampon de lavage de colonne. Elute protéine acétylée d’histone avec 10 ml de tampon d’élution.
REMARQUE: Tenter de concentrer la protéine ici est une option, mais les histones acétylées sont très imprévisibles et peuvent facilement précipiter. Il n’est pas recommandé de se concentrer au-delà de 2 mL en volume total. - Dialysez abondamment la protéine d’histone acétylée contre 5% tampon d’acide acétique pour éliminer les sels. Dialyser pendant 3 h à la fois à 4 °C, en échangeant contre un tampon frais au moins 6 fois.
REMARQUE: Pour une meilleure pureté des protéines, il existe une option pour dialyser contre l’eau pure. Cependant, cela provoque une précipitation importante et une réduction du rendement qui peuvent être indésirables pour les protéines histones acétylées à faible rendement. - Aliquote et lyophiliser les protéines et conserver indéfiniment à -80 °C. Les protéines histones de type sauvage donnent généralement 10-50 mg/L tandis que les protéines histones acétylées donnent moins de 10 mg/L selon le site spécifique de lysine. Par exemple, le H3K79Ac est en moyenne de 5 mg/L.
3. Expression de la protéine histone de type sauvage
- Pour assembler des nucléosomes complets, exprimez les 4 protéines d’histones. Lors de l’expression et de la purification d’histones de type sauvage, le protocole est le même que les histones acétylées, sauf les suivantes:
- N’effectuez pas de co-transformation. N’utilisez pas pEVOL-AcKRS pour l’expression d’histones de type sauvage. Ajustez les antibiotiques en conséquence.
- N’utilisez pas de lignée cellulaire de délétion cobB et n’ajoutez pas de nicotinamide, d’acK ou d’arabinose pendant l’induction de l’expression cellulaire.
4. Préparation de l’ADN 601
REMARQUE: Une séquence d’ADN optimisée précédemment conçue pour diriger le positionnement des nucléosomes est assemblée avec des octamères d’histones pour produire un mononoyau à haute efficacité. Cette séquence est appelée ADN 601 ou séquence de Widom. Cette séquence est devenue la séquence d’ADN standard pour les études in vitro de nucléosomes, des essais de remodelage de la chromatine aux mesures d’une seule molécule10.
- Pour préparer des quantités importantes d’ADN 601 pour l’assemblage de nucléosomes, transformez pGEM-3z/601 en cellules Top 10 et cultivez 10 mL de culture pour l’amplification et l’extraction du plasmide. Utilisez une trousse d’extraction plasmidique et suivez les recommandations du fabricant.
- Utilisez une PFU polymérase exprimée interne (plus efficace) pour ce protocole d’amplification. Configurer une réaction PCR : Pour une réaction de 250 μL, utilisez 207,5 μL de MQ H2O autoclavé, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer : ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer : acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2,5 μL DFU enzyme. Nous exécutons généralement 60 réactions à la fois pour obtenir suffisamment d’ADN pour s’assembler.
- Utilisez une température de recuit de 52 °C pendant 30 s et un temps d’extension de 30 s si vous utilisez de la PFU polymérase. Sinon, suivez les conditions recommandées par les fabricants.
- Une fois la PCR terminée, utilisez une trousse de nettoyage par PCR de votre choix pour purifier le produit de PCR.
5. Assemblage de l’octamère des histones
- Dissoudre les aliquotes des pastilles de protéines histones H2A, H2B, H3 et H4 afin qu’il y ait un stock distinct de chaque protéine histone dans guHCl Buffer avec un volume total de 100 μL.
- Calculer la concentration de chaque protéine histone en mesurant l’absorbance A280.
- Si l’absorbance est supérieure à 1 pour n’importe quelle protéine, diluer avec le tampon GuHCl pour obtenir une concentration plus précise.
- Combiner les protéines H2A et H2B dans un rapport molaire de 1:1 et diluer pour atteindre une concentration totale en protéines de 4 μg/μL. Répéter pour H3 et H4.
- Dialyser séquentiellement à 4 °C contre un tampon 2 M TE pendant la nuit, un tampon 1 M TE pendant 2 h et un tampon TE 0,5 M pendant 5 h.
REMARQUE: Les deuxième et troisième étapes de la dialyse provoquent des conformations instables de protéines à précipiter. On s’attend à de fortes précipitations à ces étapes. - Éliminer les précipités par centrifugation à 16 800 x g à 4 °C.
- Encore une fois, calculer la concentration de dimères histones (mélange H2A/H2B) et de tétramères (mélange H3/H4) en mesurant l’absorbance A280.
- Mélanger les dimères et les tétramères dans un rapport molaire de 1:1 et ajuster NaCl à 2 M par l’ajout de NaCl solide.
- L’octamère histone peut être stocké à 4 °C et est plus stable que les dimères et les tétramères. Ne figez jamais l’octamère des histones car cela peut provoquer un démontage.
- Si vous assemblez avec des histones acétylées, remplacez simplement la protéine de type sauvage par la protéine acétylée dans la procédure.
6. Assemblage de nucléosomes
- Utilisez un tampon TE 100x et du NaCl solide pour ajuster l’ADN 601 au tampon 2M TE. Ajouter l’ADN 601 dans le tampon 2M TE à l’octamère des histones dans un rapport molaire de 0,85:1 à 0,90:1. Un rapport inférieur d’ADN peut être ajouté si l’ADN libre est présent dans l’analyse de gel shift.
- Transférer le mélange ADN-histone dans un sac de dialyse et placer dans environ 200 mL de tampon 2M TE (ou plus si l’assemblage de plusieurs échantillons) et remuer très doucement à 4 °C.
- Réglez une pompe péristaltique à purger pour qu’elle s’égoutte lentement dans aucun tampon de SEL TE. Lorsque le volume a à peu près doublé, versez la moitié du volume. Faites-le au moins 4 fois au total. Avec une pompe, cela peut prendre 4-8 h en fonction du volume de départ. Les nucléosomes se forment lorsque la concentration en sel est réduite à 150 mM (mesurée par salinitémètre).
- Une fois la concentration en sel réduite à 150 mM, dialysez-le contre un tampon TE de 20 mM pendant la nuit.
- Éliminer les précipités par centrifugation et mesurer la concentration des nucléosomes par lecture A260 à l’aide d’un lecteur de plaque.
- Ajouter la protéase His-TEV (TEV : nucléosome 1:30, w:w) et incuber pendant la nuit à 4 °C pour enlever toutes les étiquettes d’histidine. Éliminer les impuretés de l’étiquette histidine de la solution de nucléosome par la résine Ni-NTA tirer vers le bas.
- Pour positionner le nucléosome et homogénéiser l’échantillon, incuber à 60 °C pendant 1 h.
REMARQUE: Pour les sites acétylés qui sont particulièrement instables, cette étape peut ne pas être conseillée. - Conserver les nucléosomes à court terme (quelques semaines) à 4 °C.
- Pour le stockage à long terme, dialysez les nucléosomes contre le tampon de stockage et stockez-les à -80 °C.
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Representative Results
Les dimères, les tétramères et les octamères peuvent être évalués en exécutant un gel PAGE SDS à 12 %(figure 1 et figure 2). Ici, vous pouvez voir que certains des tétramères acétylés ont un rendement inférieur à d’autres (Figure 1). En fait, plus on se rapproche de la région centrale, plus le rendement observé est faible. Cela est probablement dû à l’acétylation interférant avec l’assemblage du tétramère plus vous vous rapprochez des régions centrales. Un effet similaire est observé après l’assemblage d’octamères(figure 2). Après avoir assemblé des octamères avec une séquence d’ADN 601, le nucléosome peut être évalué à l’aide d’un gel page natif TBE à 5% 1x suivi d’une coloration au bromure d’éthidium (Figure 3). Avant la digestion TEV, la bande nucléosome est observée près de la marque de paire de base 10k. Après les digestions TEV, la bande nucléosome se déplace vers le bas par rapport à l’échelle. Avant le positionnement thermique, les bandes nucléosomes observées seront très larges, et éventuellement striantes (Figure 4).
Figure 1: Dimères et tétramères histones. Gel représentatif 12% SDS PAGE de dimère d’histone de type sauvage (voie 2) et de tétramères acétylés H3 (voies 3-9). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Octamères histones. Gel représentatif 12% SDS PAGE d’octamères d’histones acétylées H3 (voies 2-11). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Assemblage de son complexe de nucléosomes H3K64Ac marqué. Gel 1x TBE Native PAGE représentatif du complexe nucléosome H3K64Ac (voie 2) par rapport à l’ADN 601 libre (voie 4) visualisé par le bromure d’éthidium. La voie 3 montre le nucléosome H3K64Ac après incubation à 60 °C pendant une heure. On observe dans la voie 3 que tout nucléosome s’est démonté. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Complexe de nucléosomes digérés par le VET assemblé. Représentant 1x TBE Native PAGE gel de type sauvage TEV digéré complexe nucléosome, et libre 601 ADN. Une comparaison du positionnement thermique avant et après le nucléosome. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Il est essentiel de suivre ce protocole dans les moindres détails lors d’une expérience. Les nucléosomes ne sont pas très stables et beaucoup d’essais et d’erreurs ont été consacrés à la détermination de ce protocole. Il est essentiel d’éliminer les précipités à chaque étape (ou chaque fois qu’elles sont observées), car les particules peuvent facilement interférer avec les processus d’assemblage. Gardez toujours les échantillons d’histones sur la glace. Si les nucléosomes sont stockés à 4 °C pendant trop longtemps, ils peuvent se désassembler spontanément. Assurez-vous de vérifier tous les échantillons par Native PAGE s’ils sont stockés à 4 ° C pendant plus de 2 semaines avant utilisation dans toute expérience. Évitez de faire tourbilloner les octamères et les nucléosomes, car cela peut également les faire se désassembler. Si des problèmes sont rencontrés lors de l’assemblage de dimères, de tétramères ou d’octamères, cela indique généralement une mauvaise qualité des protéines. Vérifiez la qualité des protéines de 15% SDS-PAGE. Une option si la pureté des protéines est faible est de dialyser la protéine contre de l’eau pure. Cela provoquera de fortes précipitations et réduira considérablement le rendement en protéines, mais produira un échantillon plus pur. L’incorporation et la stabilité nucléosomique de chaque emplacement d’acétylation d’histone varient considérablement. En général, plus le site est proche du domaine N-terminal, plus le rendement lors de l’expression des protéines histones est faible. Pour la stabilité du nucléosome, plus le site d’acétylation est proche du noyau du nucléosome ou des sites de liaison à l’ADN, moins le nucléosome assemblé est stable. Si des problèmes de stabilité sont rencontrés, il est crucial de toujours garder l’échantillon de nucléosome sur la glace. Il peut être nécessaire d’omettre l’étape de positionnement du nucléosome à 60 °C, car cela peut provoquer un désassemblage ou une précipitation. Une limitation majeure des nucléosomes acétylés est leur instabilité. Il peut être impossible de préformer des essais à des températures plus élevées telles que 37 °C sans provoquer de précipitation nucléosomique. Si les procédures expérimentales le permettent, les effectuer à 4 °C pour éviter la précipitation du nucléosome acétylé.
Cette méthode de production de nucléosomes est particulièrement utile pour produire des nucléosomes modifiés pour des expériences de liaison et des déterminations de structure. Cette méthode produit des nucléosomes avec une pureté plus élevée et une séquence d’ADN nucléosomique connue, qui élimine les variables confusionnelles résultant en des expériences mieux contrôlées et des images à plus haute résolution. Il est crucial pour la détermination de la structure que l’échantillon de nucléosome soit homogène avec une séquence d’ADN connue, sinon il sera pratiquement impossible d’obtenir des images à haute résolution.
Il existe une abondance d’applications potentielles de cette méthode. Plus précisément, dans le domaine de l’épigénétique. Il peut être incroyablement difficile d’obtenir des protéines modifiées. L’obtention de protéines modifiées est cruciale pour sonder la structure et la fonction des auteurs, des lecteurs et des gommes dans les nombreuses voies épigénétiques mal comprises. Nous avons précédemment utilisé cette technique pour sonder l’accessibilité de l’ADN nucléosomique à la digestion Pst1 aux sites d’acétylation H3 K18, K36 et K56 en assemblant chaque octamère mutant avec une séquence d’ADN 601 modifiée qui contient un site de digestion Pst1. Cette technique peut être modifiée pour incorporer des NCAAs autres que AcK. PylRS peut être conçu pour incorporer une foule d’autres NCAAs. Nous avons également incorporé Nε-(7-azidoheptanoyl)-L-lysine (AzHeK) par codon ambré dans Escherichia coli pour l’expression recombinante de plusieurs protéines AzHeK-contenant l’histone H3 pour étudier l’activité de désacylation des histones de SIRT7 à plusieurs sites d’acétylation. Cette approche a révélé que SIRT7 a une activité élevée vers la désaacylation de H3K36 et est également catalytiquement actif pour décacyler H3K37. La désacylation H3K36 s’est en outre avérée dépendante du nucléosome et peut être significativement améliorée en ajoutant un adn court double brin au substrat acyl-nucléosome qui imite l’ADN de pontage entre les nucléosomes dans la chromatine native6.
Cette méthode peut également être modifiée pour produire des nucléosomes de type sauvage sans modifications qui peuvent être utiles dans une variété de scénarios. Notre groupe a récemment publié une structure en collaboration avec le groupe du Dr Pingwei Li montrant la liaison étroite de la GMP-AMP synthase cyclique (cGAS) à un patch acide chargé négativement formé par l’histone H2A et H2B via son deuxième site de liaison à l’ADN11. cGAS est un capteur dsDNA qui catalyse la synthèse d’un cGAMP dinucléotide cyclique, qui négocie l’induction d’interférons de type I à travers l’axe de signalisation STING-TBK1-IRF312,13,14,15,16.
L’avantage d’utiliser des nucléosomes entièrement assemblés est qu’il ressemble plus étroitement à l’état natif des nucléosomes servant de meilleur modèle pour sonder les activités ou les capacités de liaison de n’importe quel nombre de protéines liées à l’épigénétique. Il existe de nombreux exemples d’activité enzymatique limitée ou totalement absente vers l’ADN nu ou les substrats peptidiques histones qui, lorsqu’ils sont sondés avec des substrats nucléosomes, modifient radicalement les résultats. Comme dans l’exemple mentionné ci-dessus, un nouveau site de désacylation a été découvert pour SIRT7 en utilisant un substrat nucléosome qui aurait autrement été inconnu. Il est crucial d’utiliser des substrats natifs lors du sondage de ces types de systèmes. Cette technique peut être utilisée pour sonder l’activité de lecture, d’écriture et d’effacement ou de liaison de toute modification qui peut être incorporée par la technique d’expansion du code génétique de la pyrrolysine. La pyrrolysyl-ARNt synthétase est déjà nativement promiscuité et a été conçue pour une foule d’autres substrats ouvrant déjà la porte à l’utilisation de cette technique dans un certain nombre de systèmes faisant le principal facteur limitant la créativité du chercheur.
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Disclosures
Aucun des auteurs n’a d’intérêts financiers concurrents à déclarer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Wesley Wang d’avoir jeté les bases de ce protocole et de son précieux mentorat. Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (subventions R01GM127575 et R01GM121584) et la Fondation Welch (subvention A-1715).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M TE Buffer | NA | NA | 0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 1 M TE Buffer | NA | NA | 1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 100x TE Buffer | NA | NA | |
| 2 M TE Buffer | NA | NA | 2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 20 mM TE Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8 |
| 6 M GuHCl | 6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0 | ||
| Acetyllysine | |||
| Column Wash Buffer | NA | NA | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8 |
| Elution Buffer | NA | NA | |
| Fisherbrand Variable-Flow Chemical Transfer Pump | Fischer Scientific | 15-077-67 | |
| His-TEV protease | |||
| Histone Lysis Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0 |
| Ni-NTA Resin | 6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8 | ||
| PCR Clean-Up Kit | Epoch Life Sicences | 2360050 | |
| Pellet Wash Buffer | NA | NA | 60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0 |
| petDUET-His-SUMO-TEV-H4 | |||
| petDUET-His-TEV-H2A | |||
| petDUET-His-TEV-H2B | |||
| petDUET-His-TEV-H3 | |||
| pEVOL-AckRS | Addgene | 137976 | |
| pGEM-3z/601 | Addgene | 26656 | |
| Storage Buffer | NA | NA | 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8 |
| Thermocycler |
References
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