Summary

Analisi della sintesi lipidica neutra in Saccharomyces cerevisiae mediante etichettatura metabolica e cromatografia su strato sottile

Published: February 02, 2021
doi:

Summary

Qui viene presentato un protocollo per l’etichettatura metabolica del lievito con acido 14C-acetico, che è accoppiato con cromatografia a strato sottile per la separazione dei lipidi neutri.

Abstract

I lipidi neutri (NL) sono una classe di biomolecole idrofobiche e senza carica che svolgono un ruolo chiave nell’omeostasi energetica e lipidica. I NT sono sintetizzati de novo dall’acetil-CoA e sono presenti principalmente negli eucarioti sotto forma di trigliceridi (TG) e esteri di sterolo (SE). Gli enzimi responsabili della sintesi dei NL sono altamente conservati da Saccharomyces cerevisiae (lievito) all’uomo, rendendo il lievito un organismo modello utile per sezionare la funzione e la regolazione degli enzimi del metabolismo NL. Mentre si sa molto su come l’acetil-CoA viene convertito in un insieme diversificato di specie NL, i meccanismi per regolare gli enzimi del metabolismo NL e come la cattiva regolazione può contribuire alle patologie cellulari, sono ancora in fase di scoperta. Numerosi metodi per l’isolamento e la caratterizzazione delle specie NL sono stati sviluppati e utilizzati nel corso di decenni di ricerca; tuttavia, non è stato discusso un protocollo quantitativo e semplice per la caratterizzazione completa delle principali specie nl. Qui viene presentato un metodo semplice e adattabile per quantificare la sintesi de novo delle principali specie di NL nel lievito. Applichiamo l’etichettatura metabolica dell’acido C-acetico 14accoppiata con la cromatografia a strato sottile per separare e quantificare una vasta gamma di NL fisiologicamente importanti. Inoltre, questo metodo può essere facilmente applicato per studiare i tassi di reazione in vivo degli enzimi NL o la degradazione delle specie NL nel tempo.

Introduction

L’acetil-CoA è l’elemento fondamentale di diverse biomolecole, compresi i lipidi neutri (NL), che fungono da valuta biomolecolare versatile per la costruzione di membrane, la generazione di ATP e la regolazione della segnalazione cellulare1,2. La disponibilità di NL da deviare in uno qualsiasi di questi rispettivi percorsi è, in parte, regolata dal loro stoccaggio. Le goccioline lipidiche (LD), organelli citoplasmatici composti da nuclei idrofobici di trigliceridi (TG) ed esteri di sterolo (SE), sono i principali compartimenti di stoccaggio della maggior parte dei NL cellulari. Come tali, i LD sequestrano e regolano i NL, che possono essere degradati e successivamente utilizzati per processi biochimici e metabolici3,4. È noto che l’errata regolazione delle proteine associate a NL e LD è correlata con l’insorgenza di patologie tra cui la lipodistrofia e le sindromi metaboliche5,6. Per questo motivo, l’attuale ricerca LD è intensamente focalizzata su come la sintesi nl è regolata spazialmente, temporalmente e attraverso tessuti distinti di organismi multicellulari. A causa dei ruoli cellulari onnipresenti per i NL, molti enzimi responsabili della sintesi e della regolazione dei NL sono conservati in tutti gli eucarioti7. In effetti, anche alcuni procarioti memorizzano NL in LDs8. Pertanto, organismi modello geneticamente trattabili come Saccharomyces cerevisiae (lievito in erba) sono stati utili per lo studio della sintesi e della regolazione della NL.

La separazione e la quantificazione dei NL dagli estratti cellulari può essere realizzata in una miriade di modi, tra cui gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e cromatografia liquida ultra-performante-spettrometria di massa (UPLC-MS)9,10,11. Forse il metodo più semplice per separare i NL è tramite cromatografia a strato sottile (TLC), che consente la successiva quantificazione densitometrica da una curva standard12,13. Sebbene TLC fornisca solo una separazione granulare dei NL, rimane una tecnica potente perché è poco costosa e consente la rapida separazione dei NL da più campioni contemporaneamente. Due delle sfide più considerevoli che lo studio delle NL tramite TLC devono affrontare sono: 1) l’ampia gamma di abbondanze cellulari delle specie NL e dei loro intermedi e 2) la gamma di idrofilia / idrofobicità degli intermedi lipidici all’interno delle vie di sintesi NL. Di conseguenza, la quantificazione delle specie NL tramite TLC è tipicamente limitata alle specie più abbondanti; tuttavia, l’introduzione di una radiomarcatore di acido C-acetico 14può migliorare significativamente l’individuazione di intermedi a bassa abbondanza all’interno delle vie NL. L’acido acetico viene rapidamente convertito in acetil-CoA dall’acetil-CoA sintetasi ACS214, che rende l’acido 14C-acetico un substrato di radioetichettatura adatto nel lievito15. Inoltre, la separazione sia dei NL idrofobici che degli intermedi idrofili dei NL può essere ottenuta mediante TLC attraverso l’uso di sistemi a solvente multipli16. Qui, viene presentato un metodo per la separazione dei NL utilizzando l’etichettatura metabolica dell’acido C-acetico 14nel lievito. I lipidi marcati durante il periodo di impulso vengono successivamente isolati da un protocollo di isolamento lipidico totale ben consolidato17, seguito dalla separazione delle specie NL mediante TLC. Lo sviluppo di piastre TLC sia mediante autoradiografia per visualizzare i lipidi marcati, sia uno spray chimico per visualizzare i lipidi totali, consente molteplici metodi di quantificazione. Le singole bande lipidiche possono anche essere facilmente estratte dalla piastra TLC usando una lama di rasoio e il conteggio della scintillazione può essere utilizzato per quantificare la quantità di materiale radiomarcato all’interno della banda.

Protocol

1. Crescita ed etichettatura delle cellule di lievito con acido 14C-acetico Inoculare una coltura di lievito raccogliendo una colonia da un piatto ed erogandola in 20 ml di mezzi sintetici completi (SC) contenenti il 2% di destrosio (vedere File supplementare per la ricetta dei mezzi SC). Incubare a 30 °C per la notte con agitazione a 200 giri/min.NOTA: le condizioni di crescita, il volume del campione e il trattamento differiranno in base ai lipidi di interesse. Prima di esegui…

Representative Results

In questo protocollo, abbiamo dimostrato che l’etichettatura, il rilevamento e la quantificazione delle specie NL possono essere realizzati mediante l’etichettatura metabolica dell’acido C-acetico 14. Le principali specie di NL possono essere separate in un sistema solvente di 50:40:10:1 (v/v/v/v%) Esano:Etere di petrolio:Etere etilico:Acido acetico (Figura 1A,B). L’imaging al fosforo consente la visualizzazione di acidi grassi liberi etichettati (FFA), triacilgli…

Discussion

Qui viene presentato un versatile protocollo di radioelabazione per monitorare quantitativamente la sintesi delle specie NL nel lievito. Questo protocollo è molto modulare, il che consente di terminare la procedura entro 3-6 giorni. Inoltre, esiste una vasta letteratura sull’uso di TLC per separare specie lipidiche e metaboliti, che dovrebbe consentire all’utente di rilevare diverse specie lipidiche di interesse con un semplice cambiamento dei sistemi solventi TLC16,1…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Henne per l’aiuto e la consulenza concettuale nel completamento di questo studio. W.M.H. è sostenuta da fondi della Welch Foundation (I-1873), del NIH NIGMS (GM119768), dell’Ara Paresghian Medical Research Fund e dell’UT Southwestern Endowed Scholars Program. S.R è stata supportata da una sovvenzione del programma T32 (5T32GM008297).

Materials

[1-C14] Acetic acid sodium salt specific activity: 45-60mCi PerkinElmer NEC084H001MC
18:1 1,2 dioleoyl-sn-glycerol Avanti 800811O
200 proof absolute ethanol Sigma 459836
Acid washed glass beads 425-600um Sigma G8772
Amber bulbs for Pastuer pipettes Fisher 03-448-24
Ammonium Sulfate >99% Sigma A4418
Beckman LS6500 scintillation counter PerkinElmer A481000
Chloroform (HPLC grade) Fisher C607SK
Cholesterol >99% Sigma C8667
Cholesteryl-linoleate >98% Sigma C0289
Concentrated sulfuric acid Sigma 339741
Corning 50mL conical tubes, polypropylene with centristar cap Sigma CLS430829
Dextrose, anhydrous grade Sigma D9434
Diethyl ether anhydrous grade Sigma 296082
Drying oven Fisher 11-475-155
EcoLume scintillation liquid VWR IC88247001
Eppendorf 5424R centrifuge Fisher 05-401-205
GE Storage phosphor screen Sigma GE28-9564-75
GE Typhoon FLA9500 imager
Glacial acetic acid, ACS grade Sigma 695092
Glass 6mL scintillation vials Sigma M1901
Glass centrifuge tube caps Fisher 14-595-36A
Glass centrifuge tubes Fisher 14-595-35A
Glass Pasteur pipette Fisher 13-678-20C
Hexane, anhydrous grade Sigma 296090
L-Adenine >99% Sigma A8626
L-Alanine >98% Sigma A7627
L-Arginine >99% Sigma A1270000
L-Asparagine >98% Sigma A0884
L-Aspartate >98% Sigma A9256
L-Cysteine >97% Sigma W326305
L-Glutamic acid monosodium salt monohydrate >98% Sigma 49621
L-Glutamine >99% Sigma G3126
L-Glycine >99% Sigma G8898
L-Histidine >99% Sigma H8000
L-Isoleucine >98% Sigma I2752
L-Leucine >98% Sigma L8000
L-Lysine >98% Sigma L5501
L-Methionine, HPLC grade Sigma M9625
L-Phenylalanine, reagent grade Sigma P2126
L-Proline >99% Sigma P0380
L-Serine >99% Sigma S4500
L-Theronine, reagent grade Sigma T8625
L-Tryptophan >98% Sigma T0254
L-Tyrosine >98% Sigma T3754
L-Uracil >99% Sigma U0750
L-Valine >98% Sigma V0500
Methanol, ACS grade Fisher A412
Oleic acid >99% Sigma O1008
p-anisaldehyde Sigma A88107
Petroleum ether, ACS grade Sigma 184519
Phosphatidylcholine, dipalmitoyl >99% Sigma P1652
Pipettes Eppendorf 2231000713
Potassium chloride, ACS grade Sigma P3911
Sodium Hydroxide pellets, certified ACS Fisher S318-100
Squalene >98% Sigma S3626
Succinic Acid crystalline/certified Fisher 110-15-6
TLC saturation pad Sigma Z265225
TLC silica gel 60G glass channeled plate Fisher NC9825743 No fluorescent indicators
Transparency plastic film Apollo 829903
Tricine Sigma T0377
Triolein >99% Sigma T7140
Vortex mixer Fisher 02-215-414
Whatman exposure cassette Sigma WHA29175523
Yeast nitrogen base without ammonium sulfate and amino acids Sigma Y1251

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Rogers, S., Henne, W. M. Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography. J. Vis. Exp. (168), e62201, doi:10.3791/62201 (2021).

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