Summary
이 프로토콜은 임상적으로 이용가능한 플랫폼으로 생체내에서 키메라 항원 수용체를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포를 비침습적으로 추적하는 방법론을 기술한다.
Abstract
키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 유전자 조작된 T 세포는 B 세포 악성 종양 또는 다발성 골수종 (MM) 환자에 대한 중추적 인 임상 시험에서 전례없는 결과를 보여주었습니다. 그러나, 수많은 장애물들이 효능을 제한하고, 생체 내에서의 지속성의 부족뿐만 아니라 종양 부위로의 불량한 밀매 및 침윤으로 인해 CAR T 세포 요법의 광범위한 사용을 금지한다. 또한, 사이토카인 방출 증후군이나 신경 독성과 같은 생명을 위협하는 독성이 주요 관심사입니다. CAR T 세포의 효율적이고 민감한 이미징 및 추적은 T 세포 밀매, 확장 및 생체내 특성화의 평가를 가능하게 하고, CAR T 세포 요법의 현재 한계를 극복하기 위한 전략의 개발을 가능하게 한다. 이 논문은 CAR T 세포에 요오드화 나트륨 교감 (NIS)을 통합하고 전임상 모델에서 [18F]테트라플루오로보레이트-양전자 방출 단층 촬영 ([18F]TFB-PET)을 사용하는 CAR T 세포 이미징에 대한 방법론을 설명합니다. 이 프로토콜에 기재된 방법은 본 연구에 사용된 것들 이외에 다른 CAR 구축물 및 표적 유전자에 적용될 수 있다.
Introduction
키메라 항원 수용체 T (CAR T) 세포 요법은 혈액학적 악성 종양 1,2,3,4,5,6에서 빠르게 출현하고 잠재적으로 치유적인 접근법이다. CD19-지시된 CAR T (CART19) 또는 B 세포 성숙 항원 (BCMA) CART 세포 요법2 후에 특별한 임상 결과가 보고되었다. 이로 인해 미국 식품의약국(FDA)은 공격적인 B 세포 림프종(axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 및 lisocabtagene maraleucel)7, 급성 림프모구성 백혈병(Tisa-Cel)5,8, 맨틀 세포 림프종(brexucabtagene autoleuce)9 및 여포 림프종(Axi-Cel)10에 대한 CART19 세포의 승인을 받았다. . 가장 최근에, FDA는 다발성 골수종 (MM) (idecabtagene vicleucel)11 환자에서 BCMA 지시 CAR T 세포 요법을 승인했다. 또한, 만성 림프구성 백혈병(CLL)에 대한 CAR T 세포 치료제는 후기 단계의 임상 개발 단계에 있으며 향후 3년 이내에 FDA 승인을 받을 것으로 예상됩니다1.
CAR T 세포 요법의 전례 없는 결과에도 불구하고, 그것의 광범위한 사용은 1) 생체내 CAR T 세포 확장이 불충분하거나 종양 부위로의 불량한 밀매에 의해 제한되며, 이는 내구성 있는 반응의 낮은 비율로 이어진다.12,13 및 2) 사이토카인 방출 증후군(CRS)14,15을 포함한 생명을 위협하는 유해 사례의 발달 . CRS의 특징은 염증성 사이토카인/케모카인의 상승된 수준을 초래하는 면역 활성화뿐만 아니라 CAR T 세포 주입 후 대규모 T 세포 증식을 포함한다15,16. 따라서, 생체내에서 CAR T 세포를 이미지화하기 위한 검증된, 임상적 등급 전략의 개발은 1) CAR T 세포 추적이 생체내에서 실시간으로 추적되어 종양 부위로의 그들의 인신매매를 모니터링하고, 내성의 잠재적 메카니즘을 밝혀내고, 2) CAR T 세포 확장의 모니터링과 CRS의 발달과 같은 잠재적으로 그들의 독성을 예측하는 것을 허용할 것이다.
경미한 CRS의 임상 적 특징은 고열, 피로, 두통, 발진, 설사, 관절통, 근육통 및 불쾌감입니다. 더 심한 CRS에서 환자는 빈맥 / 저혈압, 모세관 누출, 심장 기능 장애, 신장 / 간 기능 부전 및 전파 된 혈관 내 응고를 일으킬 수 있습니다17,18. 일반적으로, 인터페론-감마, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자, 인터루킨(IL)-10, 및 IL-6을 포함하는 사이토카인의 상승 정도는 임상 증상의 중증도와 상관관계가 있는 것으로 나타났다17,19. 그러나, CRS를 예측하기 위한 "실시간" 혈청 사이토카인 모니터링의 광범위한 적용은 높은 비용 및 제한된 가용성으로 인해 어렵다. CAR T 세포 요법의 유익한 특성을 이용하기 위해, 입양 T 세포의 비침습적 영상화는 CAR T 세포 주입 후 효능, 독성 및 재발을 예측하는데 잠재적으로 이용될 수 있다.
몇몇 연구자들은 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)을 사용하여 방사성 핵종 기반 이미징을 사용하는 전략을 개발했으며, 이는 고해상도 및 고감도를 제공합니다.20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 CAR T 세포 트래피킹의 생체내 시각화 및 모니터링. 이러한 방사성 핵종 기반 이미징 전략 중에서 요오드화 나트륨 심포터 (NIS)는 PET 스캔31,32을 사용하여 이미지 세포 및 바이러스에 민감한 양식으로 개발되었습니다. [18F]TFB-PET를 사용한 NIS+CAR T 세포 이미징은 CAR T 세포 확장, 트래피킹 및 독성을 평가하고 진단하는 민감하고 효율적이며 편리한 기술입니다30. 이 프로토콜은 1) 높은 효능을 갖는 이중 형질도입을 통한 NIS+CAR T 세포의 발달 및 2) [18F]TFB-PET 스캔으로 NIS+CAR T 세포를 이미징하기 위한 방법론을 기술한다. MM용 BCMA-CAR T 세포는 CAR T 세포 이미징을 위한 리포터로서 NIS를 설명하기 위한 개념 증명 모델로서 사용된다. 그러나, 이들 방법론은 임의의 다른 CAR T 세포 요법에 적용될 수 있다.
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Protocol
이 프로토콜은 Mayo Clinic의 기관 검토위원회, 기관 생물 안전위원회 및 Mayo Clinic의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침을 따릅니다.
1. NIS+ BCMA-CAR T 세포 생산
참고: 이 프로토콜은 Mayo Clinic의 기관 검토 위원회(IRB 17-008762) 및 기관 생물안전위원회(IBC Bios00000006.04)의 지침을 따릅니다.
- BCMA-CAR, NIS, 및 루시페라제-녹색 형광 단백질 (GFP)-코딩 렌티바이러스의 생산.
참고: 2세대 BCMA-CAR 구축물을 데노보(물질표 참조)를 합성하고, 신장인자-1알파(EF-1α) 전구모터의 제어 하에 3세대 렌티바이러스 벡터로 클로닝하였다. BCMA-CAR 구축물 (C11D5.3-41BBz)은 4-1BB 공동자극 및 항인간 BCMA 항체 클론 C11D5.333,34로부터 유래된 단쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하였다. NIS는 EF-1α 프로모터의 제어 하에 있으며 자가절단펩타이드(P2A)를 통해 퓨로마이신 내성 유전자에 결합한다. 루시페라아제-GFP를 코딩하는 렌티바이러스 벡터(물질의 표 참조)는 종양 세포를 형질도입하는데 사용되며, 그 후 GFP 및 루시페라제를 발현한다.- 렌티바이러스 벡터 플라스미드를 준비한다: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg), 및 pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
참고: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro 및 pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro는 퓨로마이신 내성 유전자를 함유하고 있습니다. 따라서, NIS- 또는 루시페라제-GFP-형질도입된 세포는 앞서 기술된 바와 같이, 1 μg/mL 또는 2 μg/mL의 퓨로마이신 디하이드로클로라이드로 선택될 수 있다(14,35). - 20 × 293T 세포의 106개를 T175 플라스크에 시드하고, 5% CO2와 함께 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 293T 세포가 현미경으로 직접 시각화하여 70-90% 합류로 플라스크에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
- 15 μg의 발현 벡터 (예를 들어, CAR, NIS, 또는 루시페라아제-GFP 선형 DNA), 7 μg의 엔벨로프 벡터 (VSV-G), 및 18 μg의 패키징 벡터 (gag, pol, rev, 및 tat)의 마스터 믹스를 제조하였다. DNA 마스터 믹스를 트랜스펙션 배지 4.5 mL에 희석하고, 이어서 111 μL의 프리콤플렉스 시약 (혼합물 A)을 첨가한다.
- 새로운 튜브를 준비하고, 129 μL의 리포좀 형질감염 시약을 트랜스펙션 배지 4.5 mL에 희석하였다(혼합물 B).
- 혼합물 A와 B를 결합하고 튜브를 흔들어 내용물을 혼합하십시오. 실온(RT)에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 인큐베이션 후, 세포를 분리하지 않고 세포 상청액을 간단히 흡인하고, 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-글루타민을 함유하는 성장 배지 16 mL를 첨가한다. 이어서, 혼합물 A 및 B의 혼합물을 293T 세포 상에 적가한다. 마지막으로, 형질감염된 세포를 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
- 형질감염 후 1일째 및 2일에, 293T의 상청액을 수확하고, 900× g 에서 10분 동안 스핀다운하고, 0.45μm 나일론 필터를 통해 여과한다. 여액을 2시간 동안 112,700 × g 에서 초원심분리하여 24 및 48 h에서 농축하고, -80°C에서 동결시켰다.
- 렌티바이러스 벡터 플라스미드를 준비한다: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg), 및 pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
- 생체 외 T 세포 분리 (그림 1)
참고 : 무균 기술과 개인 보호 장비를 사용하여 층류 캐비닛에서 모든 세포 배양 작업을 수행하십시오. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 apheresis 동안 수집 된 건강한 자원 봉사자 기증자 혈액에서 수확됩니다36. 본 연구에 사용된 인간 세포에 대해 병원체 스크리닝을 수행하였다.- 표준 밀도 구배 기술을 사용하여 PBMC를 분리합니다.
- 15 mL의 밀도 구배 배지 (밀도 1.077 g / mL) (알파-D-글루코피라노시드, 베타-D-프룩토푸라노실 단독중합체 및 3-(아세틸아미노)-5-(아세틸메틸아미노)-2,4,6-트리오도벤조산 모노나트륨 염)를 기포를 만들지 않고 50 mL 밀도 구배 분리관에 부드럽게 첨가 하십시오 (물표 참조).
- 세포 포획을 방지하려면 1:1 부피비로 2% FBS를 포함하는 인산염 완충 식염수(PBS, 염화칼륨 0.2g/L, 인산칼륨 단염기성 칼륨 0.2g/L, 염화나트륨 8g/L, 인산나트륨 이염기성 1.15g/L)로 혈액 샘플을 희석하십시오. 희석 된 혈액을 밀도 구배 매질의 꼭대기에 부드럽게 옮기고 둘 사이의 계면을 깨뜨리지 마십시오. RT에서 10분 동안 1,200 × g 에서 회전합니다.
참고: 50 mL 밀도 구배 분리관은 혈액 샘플 4-17 mL의 분리에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜에 사용된 50 mL 밀도 구배 분리 튜브( 표 참조)는 원심분리 동안 "브레이크 오프"를 필요로 하지 않는다. 그러나 표준 50mL 튜브를 사용하는 경우 브레이크를 꺼야 하며 30분 동안 원심분리가 필요합니다. - 상청액을 새로운 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고, 최대 50 mL를 채워서 PBS + 2% FBS로 세척한 다음, RT에서 8분 동안 300 × g 에서 스핀다운한다.
- 상청액을 흡인하고, 펠릿화된 세포를 50 mL의 PBS + 2% FBS에 재현탁시켰다. 세포 수를 세고 RT에서 8분 동안 300× g 으로 스핀다운합니다. 이전 단계를 반복하여 총 2회 세척합니다.
- 상청액을 흡인하고, 펠렛화된 세포를 PBS + 2% FBS로 50 × 106 cells/mL의 농도로 재현탁시켰다.
- 음성 선택 마그네틱 비드 키트를 사용하여 PBMC로부터 T 세포 분리를 수행한다.
참고: 이상적인 음성 선택 키트에는 T 세포 이외의 세포에서 발현되는 항원에 대한 항체에 부착된 자기 비드가 포함되어 있습니다. 일반적으로 사용되는 키트에는 CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 및 CD16에 대한 자기 비드에 접합된 항체가 들어 있습니다(표 참조).- PBMC를 14mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 이어서, PBMCs 및 음성 선택 항체 칵테일을 완전 자동화된 세포 분리기에 넣고, 제조자의 프로토콜에 따라 T 세포 단리를 수행한다.
- 표준 밀도 구배 기술을 사용하여 PBMC를 분리합니다.
- T 세포 자극 및 T 세포 확장 (도 1)
- 분리된 T 세포를 배양하기 위해, 10% 인간 혈청 알부민과 1% 페니실린-스트렙토마이신-글루타민이 보충된 무혈청 조혈 세포 배지로 만든 T 세포 확장 배지(TCM)를 준비한다14. T 세포 분리 후, 세포를 계수하고 TCM으로 2 × 106 세포/mL의 농도로 배양하였다.
- T 세포로 배양하기 전에 항-CD3/CD28 비드를 TCM으로 3회 세척하십시오.
- 소용돌이에 의해 비드가 들어있는 바이알을 혼합한다. 이어서, 필요한 부피의 비드(3:1 비드:세포)를 피펫(예를 들어, T 세포의 1.0× 106개 세포를 자극할 때, 3.0 × 106개의 항-CD3/CD28 비드를 사용하여)을 멸균 마이크로원심분리 튜브(1.5 mL) 내로 피펫하고, 1 mL의 TCM에 재현탁시킨다.
- 비드가 있는 마이크로원심분리 튜브를 자석 상에 1분 동안 놓고, 상청액을 흡인시킨다. 튜브를 자석으로부터 제거하고, 세척된 비드를 1 mL의 TCM에 재현탁시켰다. 이전 두 단계를 반복하여 총 3번의 세척을 수행합니다.
- 비드를 1 mL의 TCM에 재현탁시키고 이를 T 세포로 옮긴다. 그런 다음 T 세포를 TCM으로 1.0 × 106 cells/mL의 최종 농도로 희석하십시오. T-세포/비드 현탁액을 조직 배양으로 처리된 6-웰 플레이트로 옮기고 배양기(37°C, 5% CO2)에 넣습니다.
- 렌티바이러스의 적정(그림 2)
- 적정 분석을 위해 T 세포를 준비한다. 약 1.0 x 106 세포가 한 종류의 바이러스를 적정할 수 있는지 확인하십시오.
- 섹션 1.3.2에 기재된 바와 같이 T 세포를 자극한다.
- 플레이트 1.0 × 자극된 T 세포의 105 세포를 96-웰 플레이트 (역가 플레이트)에서 24시간 동안 37°C, 5% CO2 에서 인큐베이션한다 (도 2A). 섹션 1.2에 기재된 바와 같이 T 세포를 단리하고 자극한다.
- 100 μL의 TCM을 지정된 컬럼 및 형질도입되지 않은 제어 웰의 웰에 첨가하여 희석 플레이트(96-웰 플레이트)를 제조하였다(도 2B).
- 렌티바이러스 입자 한 병을 얼음 위에 녹이고 부드럽게 위아래로 피펫을 올려 잘 섞는다. 50 μL의 바이러스 상청액을 96-웰 플레이트의 컬럼 6의 웰 내로 옮긴다(희석 3). 피펫을 위아래로 잘 섞습니다.
- 연속 희석 수행 (2배 연속 희석): 웰 A6에서 웰 B6로 50 μL를 옮긴 다음 웰 B6에서 웰 C6으로 50 μL를 옮기고; G6까지 반복하십시오. 이어서, 희석된 바이러스 50 μL를 역가 플레이트에 첨가한다(도 2B).
- 역가 플레이트를 37°C, 5% CO2 에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 유세포 분석기에 의해 CAR-, NIS-, 또는 GFP 양성 세포의 백분율을 결정한다(도 2C).
- 역가 플레이트를 4°C에서 3분 동안 650 × g 에서 두 번 아래로 방사하여 웰을 세척한다.
- 형질도입된 T 세포를 단계 1.5.3 내지 1.5.9에 기재된 바와 같이 착색시킨다.
- 화학식 1을 사용하여 CAR-, NIS-, 또는 GFP 양성 세포의 백분율에 기초하여 역가를 결정한다:
역가 = 특이적 희석/부피에 ×한 형질도입시 BCMA-CAR+ 또는 NIS+ T 세포 × T 세포 계수의 백분율 (1)
- 렌티바이러스 및 NIS의 형질도입+BCMA-CAR T 세포 확장
- T 세포 자극 후 스물네 내지 48 h는, 자극된 T 세포에 대해 렌티바이러스 형질도입을 수행한다 (T 세포는 클러스터를 형성해야 한다).
- CAR 또는 NIS를 코딩하는 냉동 렌티바이러스를 4°C에서 해동시킨다.
- 자극된 T 세포를 잘 섞어 클러스터를 부수고, 5.0의 감염 다중도(MOI)에서 갓 해동된 바이러스를 추가하기만 하면 됩니다(1.0 × 106 T 세포를 형질도입할 때, 렌티비론의 5.0 × 106을 사용). 형질도입된 세포를 37°C, 5% CO2에서 인큐베이션한다.
- 3일, 4일, 5일에는 혈소세포계(hematocytometer)37 또는 완전 자동화된 세포 계수기(38)를 사용하여 형질도입된 T 세포를 계수하고, 신선하고 미리 가온된 TCM을 첨가하여 세포 농도를 1.0 × 106 세포/mL로 조정한다. 퓨로마이신 내성 유전자를 운반하는 NIS 형질도입된 T 세포의 경우, 3일, 4일, 5일에 1μg/mL의 퓨로마이신 디하이드로클로라이드로 세포를 치료한다.
- 6일째에, T 세포 클러스터를 분해하기 위해 잘 혼합함으로써 형질도입된 T 세포로부터 항-CD3/CD28 비드를 제거하고(단계 1.3.4로부터) 이를 1분 동안 자석에 넣었다. 이어서, 수집된 형질도입된 T 세포를 1.0 내지 106 세포/mL의 농도로 배양물에 다시 넣× 한다. T 세포로부터 비드를 제거한 후, 유세포 분석기에 의해 CAR 및 NIS의 발현을 평가하였다.
참고: BCMA-CAR의 단쇄 가변 단편은 마우스로부터 유래되므로, 알렉사 플루오르 647과 접합된 염소 항-마우스 IgG (H+L)로 염색될 수 있다. NIS는 항-인간 ETNL [aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQQETNL)에 상응하는 합성 펩티드]을 사용하여 검출될 수 있다. 이 항체는 NIS의 세포질 C-말단을 인식한다. 따라서, T 세포는 항-인간 NIS 항체와 함께 인큐베이션하기 전에 투과화되어야 한다. - 염소 항-마우스 IgG (H+L)를 사용하여 BCMA-CAR의 표면 염색을 수행한다.
- 배양물의 분취량을 취하고(예를 들어, 50,000 T 세포) 유동 완충액(PBS, 1% FBS, 및 1% 나트륨 아지드)으로 세척한다. 다음에, 세포를 50 μL의 유동 완충액으로 재현탁시키고, 세포를 CAR 발현을 검출하기 위한 1 μL의 염소 항-마우스 항체 및 죽은 세포를 배제하는 0.3 μL의 살아있는 죽은 아쿠아로 염색한다.
- RT에서 어둠 속에서 15분 동안 인큐베이션하고, 150 μL의 유동 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 세포를 4°C에서 3분 동안 650 × g 에서 원심분리한다.
- 표면 CAR 염색 후, 100 μL의 고정 배지 (4.21% 포름알데히드를 갖는 PBS)를 첨가하여 세포를 고정시키고 투과시키고, 4°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 세포를 사포닌과 같은 세포 투과화제 (4°C에서 3분 동안 650 × g )를 함유하는 완충액 100 μL로 두 번 세척한다.
- 고정된/투과된 세포를 50μL의 투과성 완충액에 재현탁시킨다. 이어서, 0.3 ng의 항-인간 ETNL NIS 항체를 50 μL의 유동 완충액에 첨가하고, 4°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
- 150 μL의 유동 완충액을 첨가하고, 세포를 4°C에서 3분 동안 650 × g 에서 원심분리한다. 세포를 4°C에서 30분 동안 50 μL의 유동 완충액 중 2.5 μL의 항토끼 이차 항체로 인큐베이션하고, 150 μL의 유동 완충액을 첨가하여 세포를 세척하고, 4°C에서 3분 동안 650 × g 에서 원심분리한다.
- 마지막으로, 200μL의 유동 완충액에 재현탁하고 유세포 분석을 수행하여 형질도입 효율을 결정한다(도 3A,B).
- 8일째에, T 세포를 4°C에서 8분 동안 300 × g 에서 카운트하고 스핀다운시킨다. T 세포를 10 × 106/mL의 농도로 동결 배지 (90% FBS + 10% 디메틸설폭사이드[DMSO])로 재현탁시킨 다음, 각각 1 mL를 라벨링된 cryovials로 옮긴다.
- 바이알을 48시간 동안 -80°C 냉동고에 넣는다. 48시간 후(및 10일째까지), T 세포를 액체 질소로 옮긴다.
참고: NIS+ CAR T 세포 생산의 개요는 도 1을 참조하십시오. 도 3D는 3개의 상이한 공여자로부터의 생체외 T 세포 확장의 예를 나타낸다.
- T 세포 자극 후 스물네 내지 48 h는, 자극된 T 세포에 대해 렌티바이러스 형질도입을 수행한다 (T 세포는 클러스터를 형성해야 한다).
2. [18F]TFB-PET 스캔을 통한 NIS+ BCMA-CAR T 세포 이미징
참고: 이 프로토콜은 Mayo Clinic의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC A00001767-16), IRB 및 IBC(Bios00000006.04)의 지침을 따릅니다. OPM-2는 BCMA+ MM 세포주이며, 이는 종종 BCMA-CAR T 세포39,40의 표적 세포주로서 사용된다.
- 루시페라아제+ BCMA+ OPM-2 세포를 확립한다.
- 500,000개의 OPM-2 세포를 조직 배양-처리된 24-웰 플레이트에 시드한다. 루시페라아제-GFP를 코딩하는 렌티바이러스를 4°C에서 해동시킨다.
- OPM-2 세포에 3.0의 MOI에서 갓 해동된 바이러스를 추가하고 피펫팅으로 잘 섞는다. 플레이트를 인큐베이터 (37°C, 5% CO2)에 놓는다.
- 형질도입 후 마흔여덟 시간 후, 퓨로마이신 2μg/mL를 첨가하여 형질도입된 세포를 선택한다. 형질도입 나흘 후, GFP 양성 세포(루시페라아제-양성)를 유세포 분석기로 평가하였다(도 3E).
- BCMA+ OPM-2 이종이식편 마우스 모델을 확립한다(그림 4).
- 루시페라아제+ OPM-2 세포를 계수하고 이를 두 번 스핀다운하여 모든 세포 배양 배지를 제거한다. OPM-2 세포를 PBS로 10 × 106 세포/mL의 농도로 재현탁시킨다.
- -21일째에, 루시페라아제+ OPM-2 세포의 100 μL(1.0 × 106 세포)를 8-12주령의 면역저하된 NOD-scid IL2rγnull(NSG) 마우스의 꼬리에 주입한다(도 4).
- OPM-2 세포 주사 후 20일째(CAR T 세포 주사의 -1일째)에, 생체발광 영상화(BLI)를 통해 종양 부담을 확인하였다(도 4).
참고 : OPM-2 세포는 느리게 성장하는 종양을 형성하며, 이는 일반적으로 생착에 2-3 주가 걸립니다. - 복강내 (IP) 주사를 통해 OPM-2 이종이식편 마우스에 10μL/g의 D-루시페린을 투여한다. 10분 후, 2% 이소플루란 가스 하에서 마우스에 대해 BLI를 수행한다(도 5A). 종양 생착을 확인한 후, 종양 부담에 따라 마우스를 무작위화한다.
- CAR T 세포 주입의 -1일째에, NIS+BCMA-CAR T 세포를 해동시키고, 원심분리(300 × g, 8분, 4°C)에 의해 동결 배지를 제거하였다. 이어서, 세포를 2.0 × 106 세포/mL에서 TCM으로 재현탁시키고 밤새 인큐베이션한다(37°C, 5% CO2).
- 0일째에, NIS+BCMA-CAR T 세포를 계수하고 원심분리한다(300 × g, 8분, 4°C). NIS+BCMA-CAR T 세포를 PBS로 50 × 106 세포/mL로 재현탁시킨다.
- OPM-2 이종이식편 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 NIS+BCMA-CAR T 세포의 100 μL(5.0 × 106 세포)를 투여한다. 7일째 및 15일에, PET 스캔을 이용하여 마우스를 이미지화한다.
- NIS+BCMA-CAR T 세포 BCMA+OPM-2 이종이식편 마우스 모델을 이용한 생체내 영상화.
- 이미징 전에 마우스의 무게를 측정하고 금속 귀 태그를 제거하여 금속 관련 아티팩트를 제거하십시오.
- 앞서 설명된 바와 같이 [18F]TFB를 준비한다41.
참고 : [18F] TFB는 사용 당일에 생산되어야합니다. 방사성 화학 순도는 >99 %이고 몰 활성>5 GBq / mmol이어야합니다. - 꼬리 정맥 주사를 통해 9.25 MBq [18F]TFB를 정맥 주사하십시오. 방사선 추적기가 신체에 분포하고 혈액을 맑게하는 데 ~ 40 분의 흡수 기간을 허용하십시오.
- 이소플루란 흡입을 사용하여 마우스를 마취하십시오 (2 %).
참고: 이소플루란은 신속하고 신뢰할 수 있는 발병 및 회복을 갖기 때문에 선호되는 흡입 마취제입니다. - 마우스를 마취하기 전에 소독제 클리너로 마취기의 모든 표면을 청소하십시오.
- 마우스를 유도 챔버 안에 넣습니다. 기화기 다이얼을 2 %로 돌리고 마우스가 1-2 분 이내에 재발하고 응답하지 않을 때까지 기다리십시오.
- 불충분 한 마취 또는 호흡 기능의 과도한 우울증을 피하기 위해 마우스를 모니터링하십시오. 간단히 말해서, 불충분 한 마취를 확인하기 위해 발가락을 꼬집습니다.
참고 : 정상적인 호흡률은 최대 180 / min이며 허용 가능한 강하율은 50 %입니다. - 각막 건조와 외상을 피하기 위해 안과 연고를 바르십시오.
- 마이크로 PET/CT 이미징 워크스테이션에서 마취된 마우스로 주사 후 45분 후에 PET/CT 이미지를 획득 합니다(자료 표 참조). 그런 다음 15분 동안 정적 PET 이미지를 획득한 후 360° 회전으로 5분 동안 CT 이미지를 획득하고 500μA, 80keV 및 200ms 노출에서 180개의 프로젝션을 촬영합니다.
- 획득한 이미징 데이터 분석
- PET 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다(그림 5B 및 보조 비디오 S1).
- 관심 볼륨(VOI)을 정의합니다.
- 수식 (2)를 사용하여 표준화 된 흡수 값 (SUV)을 계산하십시오.
VOI에서의 SUV = VOI (MBq/mL) × 체중(g) / 투여 용량(MBq)에서의 활동 농도 (2)
- 유세포 분석기를 통한 종양 부위로의 NIS+BCMA-CAR T 세포 밀매의 확인
- [18F]TFB-PET 이미징 후 마우스를 케이지에 다시 넣습니다. 마취를 중단 한 후 동물이 의도적 인 움직임을 할 수있을 때까지 동물을 모니터링하고 음식과 물에 접근 할 수 있는지 확인하십시오.
- 주사된 [18F]TFB가 붕괴될 때까지 마우스를 모니터링한다. 방사성 동위원소가 검출되지 않으면 마우스를 CO2로 안락사시킵니다.
- 안락사시키려면 마우스를 케이지 (케이지 당 5 마리 이하의 마우스)에 넣으십시오.
- 약 5-10 분 안에 호흡이 완전히 중단 될 때까지 마우스를 CO2 에 노출시킵니다.
참고: 이 안락사 방법은 동물 안락사에 대한 AVMA 지침(2020 에디션)과 일치해야 합니다. - 생쥐의 죽음을 보장하려면 동물의 머리 뒤쪽과 꼬리 바닥을 움켜 잡은 다음 손을 서로 떼어 내거나 떼어 내어 자궁 경부 탈구를 수행하십시오.
- 골수를 수확하여 NIS+BCMA-CAR T 세포가 종양 부위로 효율적으로 소통하는지 확인합니다.
- 수확된 대퇴골 및 경골을 5 mL의 세포 배양 배지를 함유하는 6-웰 플레이트로 옮긴다. 대퇴골과 경골에서 근육과 힘줄을 제거하고 대퇴골과 경골의 양쪽 끝 (관절 위)을 자르십시오.
- 인슐린 주사기를 세포 배양 배지로 채우고 골수를 6-웰 플레이트 상에 플러시한다. 대퇴골의 경우 대퇴골 직경이 경골보다 크기 때문에 22G 바늘과 5 mL 주사기를 사용하십시오.
- 플런저의 평평한 끝을 사용하여 골수를 갈아냅니다. 멸균된 50 mL 원뿔형 튜브 상에 70 μm 세포 스트레이너를 놓고, 분쇄된 골수를 여과한다. 이어서, 튜브를 유동 완충액으로 채우고, 튜브를 4°C에서 8분 동안 300 × g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 흡인하고, 골수를 5 mL의 유동 완충액으로 재현탁시킨다. 200μL의 골수를 96웰 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 300 × g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리한다. 상청액을 데칸트하고, 세포를 50 μL의 유동 완충액으로 재현탁시켰다.
- 0.25 μg의 마우스 CD45, 0.03 μg의 인간 CD45, 0.06 μg의 인간 CD3, 0.24 μg의 인간 BCMA 및 0.3 μL의 살/죽은 아쿠아에 대한 유동 항체로 골수를 얼룩지게 한다. 플레이트를 어둠 속에서 RT에서 15분 동안 인큐베이션한다.
- 플레이트를 300 × g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리한다. 이어서, 200 μL의 유동 완충액을 첨가하고, 유동 세포계에서 실행한다(도 5C).
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Representative Results
도 1은 NIS+BCMA-CAR T 세포를 생성하는 단계를 나타낸다. 0일째에, PBMCs를 분리한 다음, 음성 선택에 의해 T 세포를 분리한다. 이어서, T 세포를 항-CD3/CD28 비드로 자극한다. 1일째에, T 세포를 NIS 및 BCMA-CAR 렌티바이러스 둘 다로 형질도입한다. 3일, 4일, 5일째에 T 세포를 계수하고 배지로 사료를 공급하여 농도를 1.0 × 106/mL로 조정한다. NIS 형질도입된 T 세포의 경우, 퓨로마이신 1μg/mL를 첨가하여 NIS+ 세포를 선택하십시오. 6일째에, 세포를 자석에 잠시 동안 위치시켜 비드를 제거하였다. 이어서, 튜브로부터 비드화된 세포를 새로운 플라스크에 넣는다. 세포 (예를 들어, 50,000 세포)의 분취량을 취하고, 항체로 염색하여 유세포 분석기를 사용하여 T 세포의 표면에서 NIS 및 CAR의 발현을 확인한다. 8일째에, T 세포를 계수하고 10 × 106/mL의 농도로 동결 배지로 동결보존한다.
도 2는 렌티바이러스를 적정하는 윤곽을 나타낸다. 0일째에, T 세포를 TCM에서 1.0 × 106/mL의 농도로 재현탁시킨다. 이어서, 1:3 세포:비드 비율로 항-CD3/CD28 비드로 T 세포를 자극한다. 도 2A에 표시된 바와 같이 100 μL(100,000 세포)의 T 세포를 착색된 웰에 첨가한다. 이 플레이트를 "역가 플레이트"라고 합니다. 역가 플레이트를 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 1일째에, 희석 플레이트를 준비한다. 그림 2B에 표시된 대로 100μL의 TCM을 착색된 웰에 첨가한다. 이어서, 50 μL의 갓 해동된 렌티바이러스를 첫 번째 행에 첨가한다(예를 들어, 도 2B에 묘사된 바와 같이 A6, A7, 또는 A8). A6에서 B6으로 50μL를 옮긴 다음 B6에서 C6으로 50μL를 옮기고 G6까지 반복하여 직렬 희석을 수행합니다. A7 및 A8에 대해서도 직렬 희석을 수행하십시오. 그 후 희석된 바이러스 50 μL를 역가 플레이트로 옮긴다. 이십사 시간 후에 희석 플레이트로부터 역가 플레이트로 바이러스를 옮긴 후, 세포에 100 μL의 TCM을 공급한다. 3일째에, 세포를 항체로 염색하고, 유세포 분석기를 통해 T 세포 상에서 NIS 및 BCMA의 발현을 분석한다.
도 3A,B는 BCMA-CAR T 또는 NIS+BCMA-CAR T 세포의 대표적인 유동 플롯을 보여준다. T 세포는 FSC / SSC에 게이팅되고 일중항 및 라이브 셀 차별이 뒤 따른다. 세포의 90% 이상이 NIS+ 세포이다(도 3B). 도 3C는 NIS+BCMA-CAR T 세포의 조성에 대한 대표적인 유동 플롯을 도시한다. 도 3A,B와 유사하게, T 셀은 FSC/SSC에 게이팅되고, 이어서 일중항 및 라이브 셀 차별이 뒤따른다. 도 3D는 0일에서 8일까지의 T 세포 확장 곡선을 나타낸다. UTD, BCMA-CAR T 또는 NIS+BCMA-CAR T 셀 간에는 접이식 확장 차이가 없습니다. 도 3E는 GFP 및 루시퍼라아제를 인코딩하는 렌티바이러스의 형질도입 후 퓨로마이신 선택에 이어 OPM-2 세포에서의 GFP 발현을 묘사한다.
도 4는 [18F]TFB-PET로 생체 내에서 NIS+BCMA-CAR T 세포를 영상화하는 개요이다. 6 ~ 8 주령의 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 1.0 × 106 세포의 루시페라제 + OPM-2 세포를 -21 일째에 접종하십시오. 제-1일에 BLI에 의한 종양 부담을 평가한다. 0일째에, 꼬리 정맥 주사를 통해 NIS+BCMA-CAR T 세포로 치료될 종양 부담에 따라 마우스를 무작위화하거나 어떠한 치료도 없이 모니터링한다(처리되지 않은 이종이식편). 6 일째에 BLI로 마우스를 이미지화하십시오. 7일째에 [18F]TFB-PET 를 수행하여 NIS+BCMA-CAR T 세포를 이미지화합니다.
도 5A는 NSG 마우스에 루시페라아제+OPM-2 세포를 접종한 지 20일 후의 대표적인 BLI를 나타낸다. 도 5B는 NIS+BCMA-CAR T 세포의 투여 후 일주일 후의 대표적인 PET 이미징을 나타낸다. [18F] TFB 흡수는 흉골, 척추, 골반 및 대퇴골에서 관찰됩니다. 또한, [18F]TFB의 생리적 흡수는 갑상선과 위장에서 볼 수 있습니다. 도 5C는 처리되지 않은 이종이식편 또는 NIS+BCMA-CAR T 세포 처리된 마우스로부터 수확된 대퇴골 유래 골수의 대표적인 흐름 플롯을 도시한다. 골수 샘플은 마우스 CD45, 인간 CD45, 인간 CD3, 및 인간 BCMA로 염색된다. 세포는 FSC / SSC에 게이팅되고 싱글 트, 라이브 및 인간 세포 차별이 뒤 따릅니다. 처리되지 않은 이종이식편에서 유래된 골수 샘플은 BCMA+ 세포를 보여주는 반면, NIS+BCMA-CART 세포 처리된 마우스는 [18F]TFB-PET 발견을 뒷받침하는 CD3+ 세포를 보여준다.
그림 1: NIS+BCMA-CAR T 세포 생산 회로도. 음성 비드 선택을 사용하는 정상 공여자 CD3 T 세포 (말초 혈액 단핵 세포로부터 분리됨). T 세포를 1.0 × 106/mL로 플레이팅하고, 배양 0일째에 첨가된 항-CD3/CD28 비드를 사용하여 TCM에서 확장시키고 6일째에 제거한다. T 세포는 1일째에 NIS 또는 BCMA-CAR을 코딩하는 렌티바이러스로 이중 형질도입된다(MOI=5.0). NIS+BCMA-CAR T 세포는 3일, 4일, 5일에 1 μg/mL의 퓨로마이신으로 처리된다. T 세포는 8일 동안 배양물에서 확장된다. T 세포는 향후 실험을 위해 FBS에서 10% DMSO로 동결보존된다. T 세포는 해동되고 모든 실험 전에 37°C에서 하룻밤 동안 휴식한다. 약어: CD = 분화의 클러스터; TCM = T 세포 확장 배지; BCMA = B 세포 성숙 항원; CAR = 키메라 항원 수용체; NIS = 요오드화 나트륨 심포터; GFP = 녹색 형광 단백질; PBMCs = 말초혈액 단핵구; MOI = 감염의 다중성; FBS = 소 태아 혈청; DMSO = 디메틸설폭사이드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 렌티바이러스 적정. (A) 0일째에, 3:1 비드:세포 비율로 항-CD3/CD28 비드로 T 세포를 자극한다. 만화에 표시된 대로 1.0 × 106/mL의 자극된 T 세포 100 μL를 착색된 웰에 첨가한다. 이어서, 역가 플레이트를 37°C, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션한다. (B) 카툰에 표시된 바와 같이 착색된 웰에 100 μL의 TCM을 첨가하여 희석 플레이트를 제조하였다. 갓 해동된 바이러스 50 μL를 A6, A7 또는 A8에 첨가한다(예를 들어, BCMA-CAR을 A6에, NIS를 A7에, 루시페라아제-GFP를 A8에 첨가한다). 이어서, 50 μL를 A6에서 B6로 옮긴 다음, B6에서 C6으로 50 μL를 전달하고, G6까지 반복함으로써 바이러스를 연속적으로 희석한다. A7 및 A8에 대해서도 직렬 희석을 수행하십시오. 희석된 바이러스 50 μL를 역가 플레이트로 옮긴다. (c) 3일째에, 세포를 상응하는 항체로 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 역가 플레이트를 분석한다. 약어: CD = 분화의 클러스터; TCM = T 세포 확장 배지; BCMA = B 세포 성숙 항원; CAR = 키메라 항원 수용체; NIS = 요오드화 나트륨 심포터; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: NIS+BCMA-CAR T 세포 및 루시페라아제-GFP 양성 OPM-2 세포의 생성. (A 및 B) 세포는 FSC / SSC에 게이팅되고 일중항 및 라이브 셀 차별이 뒤 따릅니다. (A) 형질도입되지 않은 T 및 BCMA-CAR T 세포 및 (B) UTD 및 NIS+BCMA-CAR T의 대표적인 유동 플롯이 도시되어 있다. NIS+BCMA-CAR T 세포는 도 2에 기재된 바와 같이, T 세포 확장의 1일째에 2개의 바이러스의 공동-형질도입에 의해 생성된다. 6일째에, 세포는 CAR 및 NIS에 대해 염색된다. (C) NIS+BCMA-CAR T의 표현형 분석. NIS+BCMA-CAR T 세포의 대표적인 유동 플롯이 도시되어 있다. (D) UTD, BCMA-CAR T 또는 NIS+BCMA-CAR T 세포 성장 동역학의 요약. BCMA-CAR 및/또는 NIS의 혼입은 T 세포 확장에 영향을 미치지 않는다(양방향 ANOVA, n=3 생물학적 반복실험, 평균 ± SD). (e) 루시페라아제-GFP-형질도입된 OPM-2의 유세포 분석. OPM-2 세포는 퓨로마이신 내성을 갖는 루시페라제-GFP를 코딩하는 렌티바이러스로 형질도입된다. 형질도입 후 마흔여덟 시간 후, OPM-2 세포는 2 μg/mL의 퓨로마이신으로 처리된다. 세포는 이틀 더 확장되고, GFP의 발현은 유세포 분석기를 통해 분석된다. 약어: CD = 분화의 클러스터; BCMA = B 세포 성숙 항원; CAR = 키메라 항원 수용체; NIS = 요오드화 나트륨 심포터; GFP = 녹색 형광 단백질; UTD = 형질도입되지 않은; FSC/SSC = 순방향 산란/측면 산란; ANOVA = 분산의 분석; n.s.= 유의하지 않음; SD = 표준 편차; FL-1-A = 형광단의 면적 1; FITC-A = 플루오레세인 이소티오시아네이트의 면적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 전신 OPM2 이종이식편 모델에서 in 생체내 인신매매 분석을 위한 반응식. 6 내지 8주령의 NSG 마우스에 1.0 × 106개의 루시페라아제 양성 OPM-2 세포를 -21일째에 꼬리 정맥을 통해 주사한다. -1일째에, OPM-2 세포의 생착을 확인하기 위해 마우스에 대한 생체발광 이미징을 수행한다. 0일째에, 마우스에 NIS+BCMA-CAR T 세포의 5.0 × 106을 주사한다. 7일째에 [18F]TFB-PET/CT 를 사용한 마우스를 이미지화하여 NIS+BCMA-CAR T 세포의 밀매를 평가하였다. 약어: BCMA = B 세포 성숙 항원; CAR = 키메라 항원 수용체; NIS = 요오드화 나트륨 심포터; BLI = 생체발광 영상화; NSG = 면역저하된 NOD-scid IL2rγnull; luc = 루시페라제; [18F] TFB-PET/CT = [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층 촬영. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 전신 OPM2 이종이식편 모델에서의 생체내 인신매매 분석. (A 및 B) BCMA+루시페라아제+OPM2 세포는 NSG 마우스에 정맥내 주사된다. 마우스는 OPM-2 세포의 접종 후 3주 후에 NIS+BCMA CAR T 세포를 투여받는다. (a) BLI는 OPM-2 세포의 생착을 확인한다. (B) [18F]TFB-PET 는 골수에 대한 NIS+BCMA-CAR T 세포 밀매를 밝혀낸다. (c) OPM-2 세포가 골수에 이식되고 NIS+BCMA-CAR T 세포가 종양 부위로 소통하는 것을 확인하기 위해, 마우스를 영상화 후 안락사시키고, 골수를 수확한다. 유세포 분석 결과 OPM-2 세포는 골수에 이식되어 있고(왼쪽), NIS+BCMA-CAR T 세포는 골수에 존재하는 것으로 나타났다(오른쪽). 약어: BCMA = B 세포 성숙 항원; CAR = 키메라 항원 수용체; NIS = 요오드화 나트륨 심포터; BLI = 생체발광 영상화; NSG = 면역저하된 NOD-scid IL2rγnull; [18F] TFB-PET/CT = [18F]테트라플루오로보레이트 양전자 방출 단층촬영/컴퓨터 단층 촬영; IVIS = 생체내 영상화 시스템; CD = 분화의 클러스터; SUV = 표준화 된 흡수 가치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 비디오 S1: 갑상선, 위 및 골수에서 [18F]TFB의 생체 내 분포를 보여주는 PET/CT 데이터의 3차원(3D) 렌더링. 약어: BCMA = B 세포 성숙 항원; CAR = 키메라 항원 수용체; NIS = 요오드화 나트륨 심포터; PET/CT = 양전자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 논문은 NIS를 CAR T 세포에 통합하고 [18F]TFB-PET 를 통해 생체 내에서 주입된 CAR T 세포를 이미징하는 방법론을 설명한다. 개념 증명으로서, NIS+BCMA-CAR T 세포는 이중 형질도입을 통해 생성되었다. 우리는 최근 NIS를 CAR T 세포에 혼입하는 것이 생체 내에서 CAR T 세포 기능 및 효능을 손상시키지 않으며 CAR T 세포 밀매 및 확장을 허용한다는 보고30을 보고하였다. CAR T 세포 요법이 현재의 B 세포 악성 종양을 넘어 CLL에서의 응용으로 계속 확장됨에 따라, 주입된 입양 T 세포의 비침습적 생체내 이미징 및 모니터링을 허용하는 도구에 대한 필요성이 더욱 커질 것이다. T 세포의 동적 이미징은 입양 T 세포 밀매의 검증을 가능하게 하고 잠재적으로 효능 및 독성의 조기 검출을 허용한다.
NIS는 임상 시험에서 세포 및 바이러스를 이미지화하는 민감한 양식으로 조사되고 검증되었습니다32,42. NIS에 대한 추적기의 생리적 축적은 주로 갑상선 / 타액선, 위 및 방광에서 볼 수 있으며, 이는 액체 종양에 의해 영향을받는 일반적인 기관이 아닙니다44. 특히 MM에서, 악성 혈장 세포는 종종 골수 또는 뼈에 분포하며, NIS에 대한 추적기의 생리적 축적이 발생하는 병변의 골수 외 혈장 세포종은 드문 현상입니다44,45. 또한, NIS는 비면역원성이므로 종방향 영상 연구에 적합46. NIS는 요오드화물을 시토졸로 운반하는 내재적 막 단백질로, 세포외 아미노 말단 부위와 세포질 카르복시 말단47을 갖는 13개의 추정적 막횡단 세그먼트를 함유한다.
NIS는 테크네튬-99m(99mTc) 퍼테크네테이트, 요오드화물-123(123I), 131I, 124I 및 [18F]TFB43과 같은 감마- 또는 양전자 방출 방사성 동위원소로 시각화될 수 있다. 최근에, [18F]TFB는 유사한 생화학적 특성을 가지며 방사성합성되기 때문에 NIS 기반 PET 이미징을 위한 유망한 요오드화물 유사체로 부상하고 있다48. TFB의 한 가지 장점은 갑상선 세포에서 조직화를 거치지 않으므로 정상 갑상선 조직에서 비교적 가벼운 흡수를 갖는다는 것입니다48. TFB의 또 다른 장점은 109.8 분의 짧은 반감기이며, 다른 추적기의 반감기는 12 시간에서 8 일 사이이며, 이는 임상 적용에 대한 안전성 문제를 나타낼 수 있습니다49. NIS 기반 CAR T 세포 영상화의 주요 한계는 TFB를 포함한 트레이서가 혈액-뇌 장벽(BBB)에 침투하지 않아 CAR T 세포 처리 후 신경독성을 평가하기 어렵다는 것입니다50,51,52,53.
신경독성은 중추 신경계에서 T 세포의 침윤 및 골수성 세포의 활성화와 관련이 있습니다. 그러나, CAR T 세포 요법 후 신경독성의 대부분의 경우, BBB의 완전성이 파괴된다50,54. 따라서 추적자가 이 손상된 환경에서 BBB를 통과할 수 없는지 여부는 명확하지 않습니다. CAR T 세포 치료 후 신경 독성이 [18F]TFB-PET 로 이미징 될 수 있는지 여부를 검증하기 위해 추가 연구가 수행되어야합니다. [18F] TFB의 짧은 반감기는 환자와 직원에게 안전하지만 병원의 조달을 어렵게 만듭니다. 따라서 연구소는 사이클로트론을 갖추거나 지역 시설에 접근 할 수 있어야합니다. 여기에 기술된 프로토콜에 기술된 방법론은 잠재적으로 [18F]TFB-PET 스캔을 사용하여 생체내에서 CAR T 세포를 시각화하고 평가하기 위해 이중 형질도입을 통해 다양한 다른 CAR T 세포에 적용될 수 있다.
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Disclosures
SSK는 노바티스 (Mayo Clinic, University of Pennsylvania 및 Novartis 간의 계약을 통해)와 Mettaforge (Mayo Clinic을 통해)에게 허가 된 CAR 면역 요법의 특허에 대한 발명가입니다. RS, MJC 및 SSK는 Humanigen에 허가 된 CAR 면역 요법 분야의 특허에 대한 발명가입니다. SSK는 Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs 및 Lentigen으로부터 연구 자금을 지원받습니다. 수치는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Acknowledgments
이 작업은 Mayo Clinic K2R 파이프 라인 (SSK), Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) 및 Predolin Foundation (RS)을 통해 부분적으로 지원되었습니다. 그림 1, 2 및 4는 BioRender.com 로 작성되었습니다.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
22 Gauge needle | Covidien | 8881250206 | |
28 gauge insulin syringe | BD | 329461 | |
96 well plate | Corning | 3595 | |
Anti-human (ETNL) NIS | Imanis | REA009 | ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS |
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 | BioLegend | 357507 | Flow antibody |
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 | BioLegend | 304032 | Flow antibody |
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 | BioLegend | 103116 | Flow antibody |
Anti-rabbit IgG | R&D | F0110 | Secondary antibody for NIS staining |
BCMA-CAR construct, second generation | IDT, Coralville, IA | ||
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | |
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience | Invitrogen | 12-0037-42 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Gibco | 40203D | |
CytoFLEX System B5-R3-V5 | Beckman Coulter | C04652 | flow cytometer |
Dimethyl sulfoxide | Millipore Sigma | D2650-100ML | |
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips | BD | 309646 | |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) | Gibco | 14190-144 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) | Applied Biosystems | A13346 | |
Easy 50 EasySep Magnet | STEMCELL Technologies | 18002 | |
EasySep Human T Cell Isolation Kit | STEMCELL Technologies | 17951 | negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer |
Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21235 | |
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner | Siemens Medical Solutions USA, Inc. | 10506989 VFT 000 03 | |
Isoflurane liquid | Piramal Critical Care | 66794-017-10 | |
IVIS Lumina S5 Imaging System | PerkinElmer | CLS148588 | |
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000075 | |
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
Lymphoprep | STEMCELL Technologies | 07851 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0020 | |
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile | Thermo Scientific | 450-0045 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson laboratory | 05557 | |
OPM-2 | DSMZ | CRL-3273 | multiple myeloma cell line |
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) | Addgene | 80389 | lentiviral vector encoding luciferase-GFP |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
PMOD software | PMOD | PBAS and P3D | |
Pooled Human AB Serum Plasma Derived | Innovative Research | IPLA-SERAB-H-100ML | |
Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals, Inc. | 0210055210 | |
RoboSep-S | STEMCELL Technologies | 21000 | Fully Automated Cell Separator |
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) | Gibco | 21870-076 | |
SepMate-50 (IVD) | STEMCELL Technologies | 85450 | density gradient separation tubes |
Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
T175 flask | Corning | 353112 | |
Terrell (isoflurane, USP) | Piramal Critical Care Inc | 66794-019-10 | |
Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
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