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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Imagem dinâmica das células T do receptor de antígeno quimérico com [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Tomografia Computadorizada

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/62334
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4,5, 1,2, 3, 3, 3, 3, 1,2, 1,2,5,6
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Summary

Este protocolo descreve a metodologia para rastreamento não invasivamente de células T geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico in vivo com uma plataforma clinicamente disponível.

Abstract

Células T geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico (CAR) mostraram resultados sem precedentes em ensaios clínicos cruciais para pacientes com malignidades celulares B ou mieloma múltiplo (MM). No entanto, inúmeros obstáculos limitam a eficácia e proíbem o uso generalizado de terapias celulares CAR T devido ao mau tráfico e infiltração em locais tumorais, bem como à falta de persistência in vivo. Além disso, toxicidades que ameaçam a vida, como síndrome de liberação de citocinas ou neurotoxicidade, são grandes preocupações. Imagens eficientes e sensíveis e o rastreamento de células CAR T permitem a avaliação do tráfico de células T, expansão e caracterização in vivo e permite o desenvolvimento de estratégias para superar as limitações atuais da terapia celular CAR T. Este artigo descreve a metodologia de incorporação do isíndote de sódio (NIS) em células CAR T e para a imagem celular CAR T usando a tomografia de emissão de tetrafluoroborato-pósitron ([18F]TFB-PET) em modelos pré-clínicos. Os métodos descritos neste protocolo podem ser aplicados a outras construções car e genes-alvo, além dos utilizados neste estudo.

Introduction

A terapia celular do receptor de antígeno quimérico T (CAR T) é uma abordagem rapidamente emergente e potencialmente curativa em malignidades hematológicas1,2,3,4,5,6. Desfechos clínicos extraordinários foram relatados após a terapia celular CAR T (CART19) ou B (BCMA) de maturação celular B (BCMA). Isso levou à aprovação da Food and Drug Administration (FDA) dos EUA das células CART19 para linfoma agressivo de células B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3, e lisocabtagene maraleucel)7, leucemia linfoblástica aguda (Tisa-Cel)5,8, linfoma de células de manto (brexucabtagene autoleuce)9, e linfoma folicular (Axi-Cel)10 . Mais recentemente, a FDA aprovou a terapia celular CAR T dirigida pelo BCMA em pacientes com mieloma múltiplo (MM) (idecabtagene vicleucel)11. Além disso, a terapia celular CAR T para leucemia linfocítica crônica (LLC) está em desenvolvimento clínico em estágio final e deverá receber aprovação da FDA nos próximos três anos11.

Apesar dos resultados inéditos da terapia celular CAR T, seu uso generalizado é limitado por 1) insuficiente na expansão celular CAR T ou mau tráfico para locais tumorais, o que leva a menores taxas de resposta durável12,13 e 2) o desenvolvimento de eventos adversos com risco de vida, incluindo síndrome de liberação de citocinas (CRS)14,15 . As marcas do CRS incluem não apenas ativação imunológica resultando em níveis elevados de citocinas inflamatórias/quimioterapias, mas também proliferação maciça de células T após infusão de células CAR T15,16. Assim, o desenvolvimento de uma estratégia validada de grau clínico para imagem de células CAR T in vivo permitiria 1) O rastreamento de células CAR T em tempo real in vivo monitoraria seu tráfico para locais tumorais e descobriria mecanismos potenciais de resistência, e 2) monitoramento da expansão de células CAR T e potencialmente prever suas toxicidades, como o desenvolvimento de CRS.

As características clínicas de SS leve são febre alta, fadiga, dor de cabeça, erupção cutânea, diarreia, artalgia, mialgia e mal-estar. Em CRS mais grave, os pacientes podem desenvolver taquicardia/hipotensão, vazamento capilar, disfunção cardíaca, insuficiência renal/hepática e coagulação intravascular disseminada17,18. Em geral, o grau de elevação das citocinas, incluindo interferon-gama, fator estimulante da colônia granulocito-macrófago, interleucina (IL)-10 e IL-6, mostrou-se correlacionar com a gravidade dos sintomas clínicos17,19. No entanto, a ampla aplicação do monitoramento de citocinas séricos "em tempo real" para prever o CRS é difícil devido ao alto custo e disponibilidade limitada. Para explorar as características benéficas da terapia celular CAR T, imagens não invasivas de células T adotivas podem ser potencialmente utilizadas para prever a eficácia, toxicidades e recaídas após a infusão de células CAR T.

Vários pesquisadores desenvolveram estratégias para usar imagens baseadas em radionuclídeos com tomografia de emissão de pósitrons (PET) ou tomografia computadorizada por emissão de fótons (SPECT), que fornece alta resolução e alta sensibilidade20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 para o visualização in vivo e monitoramento do tráfico de células CAR T. Entre essas estratégias de imagem baseadas em radionuclídeos, o isíndonte de iodeto de sódio (NIS) foi desenvolvido como uma modalidade sensível às células de imagem e vírus usando pet scans31,32. A imagem celular NIS+CAR T com [18F]TFB-PET é uma tecnologia sensível, eficiente e conveniente para avaliar e diagnosticar a expansão, o tráfico e a toxicidade das células CAR T. Este protocolo descreve 1) o desenvolvimento de células NIS+CAR T através de transdução dupla com alta eficácia e 2) uma metodologia para imagens de células NIS+CAR T com [18F]TFB-PET scan. BCMA-CAR T células para MM são usadas como um modelo de prova de conceito para descrever NIS como repórter para imagens de células CAR T. No entanto, essas metodologias podem ser aplicadas a qualquer outra terapia celular CAR T.

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Protocol

O protocolo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional da Mayo Clinic, do Comitê de Biossegurança Institucional e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Mayo Clinic.

1. Produção de células NIS+ BCMA-CAR T

NOTA: Este protocolo segue as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional da Clínica Mayo (IRB 17-008762) e do Comitê de Biossegurança Institucional (IBC Bios000000006.04).

  1. Produção de lentivírus de codificação BCMA-CAR, NIS e luciferase-green (GFP).
    NOTA: Uma construção BCMA-CAR de segunda geração foi sintetizada de novo (ver a Tabela de Materiais) e clonada em um vetor lentiviral de terceira geração sob o controle de um fator de alongamento-1 alfa (EF-1α) promotor. A construção BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) incluiu a costimulação de 4-1BB e um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado de um clone de anticorpos BCMA anti-humano C11D5.333,34. O NIS está sob o controle do promotor EF-1α e se liga ao gene de resistência à puramicina através de peptídeos auto-cleaving (P2A). A codificação do vetor lentiviral luciferase-GFP (ver a Tabela de Materiais) é usada para transdutar células tumorais, que então expressam GFP e luciferase.
    1. Prepare plasmídeos vetoriais lentivirais: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      NOTA: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro e pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro contêm o gene de resistência à puramicina. Portanto, as células transduzidas NIS ou luciferase-GFP podem ser selecionadas com 1 μg/mL ou 2 μg/mL de dihidrocloreto de ideomicina, conforme descrito anteriormente14,35.
    2. Semente 20 × 106 de células 293T em um frasco T175 e incubar por 24 h a 37 °C com 5% de CO2. Confirme que as células 293T são distribuídas uniformemente no frasco a 70-90% de confluência por visualização direta sob o microscópio.
    3. Prepare uma mistura mestre de 15 μg do vetor de expressão (por exemplo, CAR, NIS ou DNA linear luciferase-GFP), 7 μg do vetor envelope (VSV-G) e 18 μg do vetor da embalagem (mordaça, pol, rev e tat). Diluir a mistura mestre de DNA em 4,5 mL do meio de transfecção e, em seguida, adicionar 111 μL do reagente pré-complexo (Mistura A).
    4. Prepare um novo tubo e dilua 129 μL do reagente de transfecção liposômica em 4,5 mL do meio de transfecção (Mistura B).
    5. Misture as misturas A e B e misture o tubo para misturar o conteúdo. Incubar por 30 min em temperatura ambiente (RT).
    6. Após a incubação, basta aspirar a célula sobrenante sem desprender as células e adicionar 16 mL de um meio de crescimento contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina-estreptomicina-glutamina. Em seguida, adicione a mistura de misturas A e B em células 293T dropwise. Por fim, incubar as células transfeinadas a 37 °C, 5% de CO2 por 24 h.
    7. Nos dias 1 e 2 pós-transfecção, colher o supernasal de 293T, girar a 900 × g por 10 minutos e filtrar através de um filtro de nylon de 0,45 μm. Concentre o filtrado em 24 e 48 h por ultracentrifugação a 112.700 × g por 2h e congele a -80 °C.
  2. Ex-vivo Isolamento de células T (Figura 1)
    NOTA: Realize todo o trabalho de cultura celular em um armário de fluxo laminar usando técnica asséptica e equipamento de proteção individual. As células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) são colhidas a partir de sangue saudável de doadores voluntários coletados durante aferese36. A triagem de patógenos foi realizada em células humanas utilizadas neste estudo.
    1. Use a técnica de gradiente de densidade padrão para isolar os PBMCs.
      1. Adicione suavemente 15 mL de gradiente de densidade (densidade de 1,077 g/mL) (contendo alfa-D-glucopyranoside, beta-D-frutosuctofuranosyl homopolímero, e, 3-(acetylamino)-5-(acetylimetilaamino)-2,4,6-6-monosodium ácido monossódico de 50 mL sem criar bolhas de ar (ver a Tabela dos Materiais).
      2. Para evitar armadilhas de células, diluir a amostra de sangue com soro salino tamponado de fosfato (PBS, 0,2 g/L de cloreto de potássio, 0,2 g/L de monobásico fosfato de potássio, 8 g/L de cloreto de sódio e 1,15 g/L de dibásico fosfato de sódio) contendo 2% de FBS em uma proporção de 1:1. Transfira suavemente o sangue diluído em cima do meio de gradiente de densidade sem quebrar a interface entre os dois. Gire a 1.200 × g por 10 min na RT.
        NOTA: Um tubo de separação gradiente de densidade de 50 mL pode ser usado para o isolamento de 4-17 mL de uma amostra de sangue. O tubo de separação de gradiente de densidade de 50 mL (ver a Tabela de Materiais) utilizado neste protocolo não requer o "freio desligado" durante a centrifugação. No entanto, quando os tubos padrão de 50 mL são usados, o freio precisa estar desligado e requer centrifugação de 30 min.
      3. Transfira o supernante para um novo tubo cônico de 50 mL, lave com PBS + 2% FBS preenchendo até 50 mL e, em seguida, gire a 300 × g por 8 min na RT.
      4. Aspire o supernasce, e resuspenda as células pelotas em 50 mL de PBS + 2% FBS. Conte o número de células e, em seguida, gire para baixo a 300 × g por 8 min no RT. Repita a etapa anterior para um total de 2 lavagens.
    2. Aspire o supernasce, e resuspenme as células pelotas a uma concentração de 50 × 106 células/mL com PBS + 2% FBS.
    3. Realize o isolamento de células T de PBMCs usando um kit de contas magnéticas de seleção negativa.
      NOTA: Um kit de seleção negativo ideal inclui contas magnéticas ligadas a anticorpos contra antígenos expressos em células diferentes das células T. Um kit comumente usado contém anticorpos conjugados a contas magnéticas contra CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD23a, CD19 e CD16 (ver Tabela de Materiais).
      1. Transfira PBMCs para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 14 mL. Em seguida, coloque os PBMCs e o coquetel de anticorpos de seleção negativa em um separador de células totalmente automatizado, e realize o isolamento de células T de acordo com o protocolo do fabricante.
  3. Estimulação celular T e expansão de células T (Figura 1)
    1. Para cultivar as células T isoladas, prepare o meio de expansão celular T (TCM) feito com célula hematopoiética livre de soro complementada com 10% de albumina de soro humano e 1% penicilina-estreptomicina-glutamina14. Após o isolamento das células T, conte as células e a cultura em uma concentração de 2 × 106 células/mL com TCM.
    2. Lave as contas anti-CD3/CD28 três vezes com TCM antes de cultivadas com células T.
      1. Misture o frasco contendo as contas girando. Em seguida, pipeta o volume necessário de contas (3:1 contas:célula) (por exemplo, ao estimular 1,0 × 106 células de células T, use 3,0 × 106 de contas anti-CD3/CD28) em um tubo de microcentrifusidade estéril (1,5 mL) e resuspendam em 1 mL de TCM.
    3. Coloque o tubo de microcentrifuuge com as contas em um ímã por 1 min, e aspire o supernatante. Remova o tubo do ímã e resuspense as contas lavadas em 1 mL de TCM. Repita as duas etapas anteriores para um total de 3 lavagens.
    4. Resuspenda as contas em 1 mL de TCM e transfira-as para as células T. Em seguida, diluir as células T para uma concentração final de 1,0 × 106 células/mL com TCM. Transfira a suspensão t-cell/bead para uma placa de 6 poços tratada com cultura tecidual e coloque-a na incubadora (37 °C, 5% DE CO2).
  4. Titulação de lentivírus (Figura 2)
    1. Prepare células T para ensaio de titulação. Certifique-se de que aproximadamente 1,0 x 106 células estão disponíveis para titular um tipo de vírus.
    2. Estimule as células T como descrito na seção 1.3.2.
    3. Placa 1.0 × 105 células de células T estimuladas em uma placa de 96 poços (placa de titer) e incubar a 37 °C, 5% de CO2 por 24 h (Figura 2A). Isole e estimule as células T como descrito na seção 1.2.
    4. Prepare uma placa de diluição (placa de 96 poços) adicionando 100 μL de TCM nos poços das colunas designadas e nos poços de controle não traduzidos (Figura 2B).
    5. Descongele um frasco de partículas lentivirais no gelo e gentilmente pipeta para cima e para baixo para misturar bem. Transfira 50 μL do vírus sobrenante para os poços da Coluna 6 da placa de 96 poços (diluição 3) (Figura 2B). Pipeta para cima e para baixo para misturar bem.
    6. Realizar diluições seriais (diluição serial de 2 vezes): transferir 50 μL do bem A6 para o bem B6 e, em seguida, 50 μL do bem B6 para o bem C6; repetir até G6. Em seguida, adicione 50 μL do vírus diluído à placa de titer (Figura 2B).
    7. Incubar a placa de titer a 37 °C, 5% de CO2 por 48 h e determinar as porcentagens de células CAR-, NIS-ou GFP positivo por citometria de fluxo (Figura 2C).
      1. Lave os poços girando a placa de titer duas vezes a 650 × g a 4 °C por 3 min.
      2. Colorir as células T transduzidas como descrito nas etapas 1.5.3 a 1.5.9.
      3. Determine os títulos com base nas porcentagens de células CAR-, NIS ou GFP-positive usando fórmula (1):
        Titers = Percentual de células BCMA-CAR+ ou NIS+ T × contagem de células T na transdução × diluição / volume específico (1)
  5. Transdução de lentivírus e NIS+Expansão de células BCMA-CAR T
    1. Vinte e quatro a 48 horas após a estimulação celular T, realizam transdução lentiviral em células T estimuladas (as células T devem formar aglomerados).
      1. Descongele os lentivírus congelados codificando CAR ou NIS a 4 °C.
      2. Misture bem as células T estimuladas para quebrar os aglomerados, e simplesmente adicione o vírus recém-descongelado a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5.0 (ao transdudir 1,0 × 106 células T, use 5,0 × 106 de lentírones). Incubar as células transduzidas a 37 °C, 5% de CO2.
      3. Nos dias 3, 4 e 5, conte as células T transduzidas usando um hematócitometro37 ou um contador de células totalmente automatizado38 e ajuste a concentração celular para 1,0 × 106 células/mL adicionando TCM fresco e pré-aquecido. Para células T transduzidas pelo NIS que carregam o gene de resistência à puramicina, trate as células com 1 μg/mL de dihidrocloida de diocrina de puramicina nos dias 3, 4 e 5.
    2. No dia 6, remova as contas anti-CD3/CD28 das células T transduzidas (a partir da etapa 1.3.4) misturando bem para quebrar os aglomerados de células T e colocando-os em um ímã por 1 min. Em seguida, basta colocar as células T transduzidas coletadas de volta à cultura em uma concentração de 1,0 × 106 células/mL. Após remover as contas das células T, avalie a expressão de CAR e NIS por citometria de fluxo.
      NOTA: Como o fragmento variável de cadeia única do BCMA-CAR é derivado do mouse, ele pode ser manchado com IgG anti-rato de cabra (H+L) conjugado com Alexa Fluor 647. O NIS pode ser detectado usando ETNL anti-humano [peptídeo sintético correspondente ao aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQETNL)]. Este anticorpo reconhece o citosolico C-terminus do NIS. Portanto, as células T devem ser permeabilizadas antes da incubação com um anticorpo anti-humano NIS.
    3. Realizar a coloração superficial do BCMA-CAR usando igG anti-rato de cabra (H+L).
      1. Pegue uma alíquota da cultura (por exemplo, 50.000 células T) e lave com tampão de fluxo (PBS, 1% FBS e 1% azida de sódio). Em seguida, resuspenque as células com 50 μL de tampão de fluxo e colora as células com 1 μL de anticorpo anti-rato de cabra para detectar expressão CAR e 0,3 μL de aqua viva morta para excluir células mortas.
      2. Incubar por 15 minutos no escuro em RT, lavar as células adicionando 150 μL de tampão de fluxo e centrifugar as células a 650 × g por 3 min a 4 °C.
    4. Após a coloração superficial do CAR, fixe e permeabiliize as células adicionando 100 μL de meio de fixação (PBS com 4,21% de formaldeído) e incubar por 20 min a 4 °C. Lave as células duas vezes com 100 μL de um buffer que contenha um agente permeabilizante celular como a saponina (650 × g por 3 min a 4 °C).
    5. Resuspengem as células fixas/permeabilizadas em 50 μL de um buffer permeabilizante. Em seguida, adicione 0,3 ng de anticorpo ETNL NIS anti-humano em 50 μL de tampão de fluxo e incubar por 1 h a 4 °C.
    6. Adicione 150 μL de tampão de fluxo e centrifugar as células a 650 × g por 3 min a 4 °C. Incubar as células com 2,5 μL de anticorpo secundário anti rabbit em 50 μL de tampão de fluxo por 30 min a 4 °C, lavar as células adicionando 150 μL de tampão de fluxo e centrífuga a 650 × g por 3 min a 4 °C.
    7. Finalmente, resuspenque em 200 μL de tampão de fluxo e realize a citometria de fluxo para determinar a eficiência da transdução (Figura 3A,B).
    8. No dia 8, conte e gire as células T a 300 × g por 8 min a 4 °C. Resuspengue as células T com meio de congelamento (90% FBS + 10% dimetilsulfoxida [DMSO]) a uma concentração de 10 × 106/mL, depois transfira 1 mL cada para criovávias rotuladas.
    9. Coloque os frascos em um congelador de -80 °C por 48 h. Após 48 h (e até o dia 10), transfira as células T para nitrogênio líquido.
      NOTA: Consulte a Figura 1 para obter a visão geral da produção de células CAR T NIS+. A Figura 3D representa exemplos de expansão celular ex vivo T de três doadores diferentes.

2. NIS+ BCMA-CAR T imagens celular com [ 18F]TFB-PET scan

NOTA: Este protocolo segue as diretrizes do Comitê Institucional de Atenção e Uso de Animais da Mayo Clinic (IACUC A00001767-16), IRB e IBC (Bios00000006.04). OPM-2 é uma linha de células BCMA+ MM, que é frequentemente usada como uma linha de células-alvo para células BCMA-CAR T39,40.

  1. Estabeleça células luciferase+ BCMA+ OPM-2.
    1. Sementes 500.000 células OPM-2 em uma placa de 24 poços tratadas pela cultura tecidual. Degelo lentivírus codificando luciferase-GFP a 4 °C.
    2. Adicione o vírus recém-descongelado em um MOI de células 3.0 a OPM-2 e misture bem por pipetação. Coloque a placa na incubadora (37 °C, 5% DE CO2).
    3. Quarenta e oito horas após a transdução, adicione 2 μg/mL de puramicina para selecionar as células transduzidas. Quatro dias após a transdução, avalie as células GFP-positivas (luciferase-positiva) por citometria de fluxo (Figura 3E).
  2. Estabeleça modelos de mouse de xenoenxerto BCMA+ OPM-2 (Figura 4).
    1. Conte as células OPM-2 de luciferase+ e gire-as duas vezes para remover todo o meio de cultura celular. Resuspend as células OPM-2 a uma concentração de 10 × 106 células/mL com PBS.
    2. No dia -21, injete 100 μL (1,0 × 106 células) de células de luciferase+ OPM-2 nas caudas de camundongos imunocomprometidos de 8 a 12 semanas de idade NOD-scid IL2rγnull (NSG) (Figura 4).
    3. No dia 20 após a injeção celular OPM-2 (dia -1 de injeção de células CAR T), verifique a carga tumoral via bioluminescência por imagem (BLI) (Figura 4).
      NOTA: As células OPM-2 formam um tumor de crescimento lento, que geralmente leva de 2 a 3 semanas para engrafar.
    4. Administre 10 μL/g de D-luciferin em camundongos xenoenxertos OPM-2 através de injeção intraperitoneal (IP). Após 10 min, realize bli nos camundongos abaixo de 2% de gás isoflurane (Figura 5A). Após a confirmação do enxerto tumoral, randomize os camundongos de acordo com a carga tumoral.
    5. No dia -1 da injeção de células CAR T, descongele as células NIS+BCMA-CAR T e remova o meio de congelamento por centrifugação (300 × g, 8 min, 4 °C). Em seguida, as células resusgasuspendas com TCM a 2,0 × 106 células/mL e incubam durante a noite (37 °C, 5% de CO2).
    6. No dia 0, conte e centrifufique as células NIS+BCMA-CAR T (300 × g, 8 min, 4 °C). Resuspende as células NIS+BCMA-CAR T a 50 × 106 células/mL com PBS.
    7. Administre 100 μL (5,0 × 106 células) de células NIS+BCMA-CAR T via injeção de veia traseira para os camundongos xenoenxertos OPM-2. Nos dias 7 e 15, imagem os ratos usando uma tomografia PET.
  3. NIS+BCMA-CAR T célula in vivo imagem usando bcma+OPM-2 modelo de mouse de xenerto xenoenxerto.
    1. Pesar os ratos antes da imagem e remover quaisquer etiquetas de ouvido de metal para eliminar artefatos relacionados ao metal.
    2. Prepare [18F]TFB como descrito anteriormente41.
      NOTA: [18F]TFB deve ser produzido no dia de seu uso. A pureza radioquímica deve ser >99% e a atividade molar >5 GBq/mmol.
    3. Injete 9,25 MBq [18F]TFB por via intravenosa por injeção de veia traseira. Permita que um período de absorção de ~40 min para o radiotracer seja distribuído no corpo e limpe o sangue.
    4. Anestesiar o rato usando inalação de isoflurano (2%).
      NOTA: Isoflurane é o anestésico inalado preferido, pois tem início e recuperação rápidos e confiáveis.
    5. Antes de anestesiar o mouse, limpe todas as superfícies da máquina de anestesia com produtos desinfetantes.
    6. Coloque o mouse dentro da câmara de indução. Gire o mostrador vaporizador para 2% e espere que o mouse se torne reclinável e não responsivo dentro de 1-2 min.
    7. Monitore o camundongo para evitar anestesia insuficiente ou depressão excessiva das funções respiratórias. Resumindo, belisque o dedo do dedo para confirmar a anestesia insuficiente.
      NOTA: A taxa respiratória normal é de até 180/min, e a taxa de queda aceitável é de 50%.
    8. Aplique pomada oftálmica para evitar secagem e trauma na córnea.
    9. Adquira imagens PET/CT 45 min pós-injeção com o rato anestesiado em uma estação de trabalho de imagem micro PET/CT (veja a Tabela de Materiais). Em seguida, adquira imagens estáticas pet por 15 min seguidas de aquisição de imagem CT para 5 min com rotação de 360° e projeções de 180 a 500 μA, 80 keV e exposição de 200 ms.
  4. Analisando dados de imagem adquiridos
    1. Analise as imagens usando o software de processamento de imagens PET (Figura 5B e Vídeo Suplementar S1).
    2. Defina o volume de juros (VOI).
    3. Calcule o valor de absorção padronizado (SUV) utilizando fórmula (2).
      SUV em VOI = Concentração de atividade em VOI (MBq/mL) × peso corporal (g) / dose administrada (MBq) (2)
  5. Confirmação do tráfico celular NIS+BCMA-CAR T aos locais tumorais com a citometria de fluxo
    1. Depois de [18F]Imagem TFB-PET, coloque o mouse de volta na gaiola. Após a cessação da anestesia, monitore os animais até que sejam capazes de movimento proposital e garantam que tenham acesso a alimentos e água.
    2. Monitore os camundongos até a decomposição do TFB injetado [18F]. Uma vez que o radioisótopo não é detectável, eutanize os ratos com CO2.
    3. Para eutanásia, coloque os ratos na gaiola (não mais do que 5 ratos por gaiola).
    4. Exponha os camundongos ao CO2 até a cessação completa da respiração em aproximadamente 5-10 min.
      NOTA: Este método de eutanásia deve ser consistente com as Diretrizes avma para a eutanásia de animais (Edição 2020).
    5. Para garantir a morte dos camundongos, realize a luxação cervical segurando a parte de trás da cabeça e a base da cauda do animal, em seguida, puxando as mãos separadas/longe umas das outras.
    6. Colher a medula óssea para confirmar que as células NIS+BCMA-CAR T trafegam eficientemente para o local do tumor.
    7. Transfira os fêmures e a tíbia colhidos para uma placa de 6 poços contendo 5 mL de meio de cultura celular. Remova os músculos e tendões dos fêmures e tíbia, e simplesmente corte ambas as extremidades (acima das articulações) dos fêmures e tíbia.
    8. Encha uma seringa de insulina com o meio de cultura celular, e lave a medula óssea na placa de 6 poços. Para fêmures, use agulhas de 22 G e seringas de 5 mL porque o diâmetro do fêmur é maior que o da tíbia.
    9. Use a extremidade plana do êmbolo para moer a medula óssea. Coloque um coador de células de 70 μm em um tubo cônico estéril de 50 mL e filtre a medula óssea moída. Em seguida, encha o tubo com o tampão de fluxo e centrifule o tubo a 300 × g por 8 min a 4 °C.
    10. Aspire o supernascer e resuspense a medula óssea com 5 mL de tampão de fluxo. Transfira 200 μL de medula óssea para uma placa de 96 poços. Centrifugar a placa a 300 × g por 3 min a 4 °C. Decante o supernasciente, e resuspense as células com 50 μL de tampão de fluxo.
    11. Manche a medula óssea com anticorpos de fluxo contra 0,25 μg de camundongo CD45, 0,03 μg de CD45 humano, 0,06 μg de CD3 humano, 0,24 μg de BCMA humano e 0,3 μL de aqua vivo/morto. Incubar a placa por 15 minutos no RT no escuro.
    12. Centrifugar a placa a 300 × g por 3 min a 4 °C. Em seguida, adicione 200 μL de tampão de fluxo e execute no citômetro de fluxo (Figura 5C).

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Representative Results

A Figura 1 representa os passos de geração de células NIS+BCMA-CAR T. No dia 0, isole os PBMCs e isole as células T por seleção negativa. Em seguida, estimule as células T com contas anti-CD3/CD28. No primeiro dia, transduem células T com lentivírus NIS e BCMA-CAR. Nos dias 3, 4 e 5, conte células T e alimente com mídia para ajustar a concentração a 1,0 × 106/mL. Para células T transduzidas pelo NIS, adicione 1 μg/mL de puramicina para selecionar células NIS+ . No dia 6, remova as contas colocando as células no ímã por um minuto. Então, coloque as células desagravadas do tubo em um novo frasco. Pegue uma alíquota de células (por exemplo, 50.000 células) e colora com anticorpos para verificar a expressão de NIS e CAR na superfície das células T usando citometria de fluxo. No dia 8, conte as células T e criopreserve com mídia congelante na concentração de 10 × 106/mL.

A Figura 2 representa o esboço da titulação dos lentivírus. No dia 0, resuspend células T na concentração de 1,0 × 106/mL em TCM. Em seguida, estimule as células T com contas anti-CD3/CD28 em uma proporção de células 1:3:contas. Adicione 100 μL (100.000 células) de células T aos poços coloridos como indicado na Figura 2A. Esta placa é chamada de "placa de titer". Incubar a placa de titer a 37 °C, 5% de CO2 por 24 h. No primeiro dia, prepare a placa de diluição. Adicione 100 μL de TCM aos poços coloridos conforme indicado na Figura 2B. Em seguida, adicione 50 μL de lentivírus recém-descongelados na primeira linha (por exemplo, A6, A7 ou A8 como descrito na Figura 2B). Realize a diluição serial transferindo 50 μL de A6 para B6 e, em seguida, 50 μL de B6 para C6, repetindo até G6. Realize diluição serial para A7 e A8 também. Em seguida, transfira 50 μL do vírus diluído para a placa de titer. Vinte e quatro horas após a transferência do vírus da placa de diluição para a placa de titer, alimente as células com 100 μL de TCM. No dia 3, colore células com anticorpos e analise a expressão de NIS e BCMA nas células T via citometria de fluxo.

Figura 3A,B mostram as parcelas de fluxo representativas das células BCMA-CAR T ou NIS+BCMA-CAR T. As células T são fechadas no FSC/SSC, seguidas por discriminação singlet e células vivas. Mais de 90% das células são células NIS+ (Figura 3B). A Figura 3C mostra o gráfico de fluxo representativo para a composição de células NIS+BCMA-CAR T. Semelhante à Figura 3A,B, as células T são fechadas no FSC/SSC, seguidas por discriminação singlet e células vivas. A Figura 3D mostra a curva de expansão da célula T dos dias 0 a 8. Não há diferenças de expansão de dobras entre células UTD, BCMA-CAR T ou NIS+BCMA-CAR T. A Figura 3E retrata a expressão GFP em células OPM-2 após a transdução de lentivírus que codifica GFP e luciferase seguida de seleção de puramicina.

Figura 4 é o esboço de imagens células NIS+BCMA-CAR T in vivo com [18F]TFB-PET. Inocular camundongos de seis a oito semanas de idade com 1,0 × 106 células de luciferase+ células OPM-2 por injeção de veia traseira no dia -21. Avalie a carga tumoral pela BLI no dia -1. No dia 0, randomize os camundongos de acordo com a carga tumoral a ser tratada com células NIS+BCMA-CAR T através da injeção da veia da cauda ou monitoradas sem qualquer tratamento (xenoenxerto não tratado). Imagem dos ratos com BLI no dia 6. Execute [18F]TFB-PET no dia 7 para imagem de células NIS+BCMA-CAR T.

A Figura 5A mostra o representante BLI 20 dias após a inoculação de células luciferase+OPM-2 nos camundongos NSG. A Figura 5B mostra o representante de imagens PET uma semana após a administração de células NIS+BCMA-CAR T. [18F] A absorção de TFB é observada no esterno, colunas, pélvis e fêmures. Além disso, a absorção fisiológica de [18F]TFB é vista na tireoide e estômago. A Figura 5C mostra as parcelas representativas de fluxo de medula óssea derivada do fêmur colhidas a partir do xenoenxerto não tratado ou camundongos tratados com células NIS+BCMA-CAR T. As amostras de medula óssea são manchadas com CD45 do rato, CD45 humano, CD3 humano e BCMA humano. As células são fechadas no FSC/SSC, seguidas por discriminação singlet, viva e células humanas. Amostras de medula óssea derivadas de xenoenxerto não tratado mostram células BCMA+ , enquanto o rato tratado com células NIS+BCMA-CAR T mostra células CD3+ , que suportam a descoberta de TFB-PET [18F].

Figure 1
Figura 1: Esquema de produção de células NIS+BCMA-CAR T. Células CD3 T doadoras normais (isoladas de células mononucleares de sangue periféricos) utilizando seleção negativa de contas. As células T são banhadas a 1,0 × 106/mL e expandidas em TCM usando contas anti-CD3/CD28 adicionadas no dia 0 da cultura e removidas no dia 6. As células T são duplamente transduzidas com lentivírus codificando NIS ou BCMA-CAR no dia 1 (MOI=5.0). As células NIS+BCMA-CAR T são tratadas com 1 μg/mL de puramicina nos dias 3, 4 e 5. As células T são expandidas na cultura por 8 dias. As células T são criopreservadas na FBS com 10% de DMSO para experimentos futuros. As células T são descongeladas e descansadas durante a noite a 37 °C antes de todos os experimentos. Abreviaturas: CD = cluster de diferenciação; TCM = Meio de expansão celular T; BCMA = Antígeno de maturação celular B; CAR = receptor de antígeno quimérico; NIS = isomiporter de iodeto de sódio; GFP = proteína fluorescente verde; PBMCs = células mononucleares de sangue periféricos; MOI = multiplicidade de infecção; FBS = soro bovino fetal; DMSO = dimetilsulfoxida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Titulação de lentivírus. (A) No dia 0, estimule as células T com contas anti-CD3/CD28 a uma proporção de 3:1 contas:células. Adicione 100 μL de 1,0 × 106/mL de células T estimuladas aos poços coloridos como indicado no desenho animado. Em seguida, incubar a placa de titer a 37 °C, 5% de CO2 para 24 h. (B) Prepare uma placa de diluição adicionando 100 μL de TCM aos poços coloridos como indicado no desenho animado. Adicione 50 μL de vírus recém-descongelado ao A6, A7 ou A8 (por exemplo, BCMA-CAR a A6, NIS a A7 e luciferase-GFP à A8). Em seguida, dilui o vírus em série transferindo 50 μL de A6 para B6, e depois 50 μL de B6 para C6, repetindo até G6. Realize diluição serial para A7 e A8 também. Transfira 50 μL do vírus diluído para a placa de titer. (C) No dia 3, colorigue as células com anticorpos correspondentes e analise a placa de titer por citometria de fluxo. Abreviaturas: CD = cluster de diferenciação; TCM = Meio de expansão celular T; BCMA = Antígeno de maturação celular B; CAR = receptor de antígeno quimérico; NIS = isomiporter de iodeto de sódio; GFP = proteína fluorescente verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: A geração de células NIS+BCMA-CAR T e células OPM-2 positivas da luciferase-GFP. (A e B) As células são fechadas no FSC/SSC, seguidas por discriminação singlet e células vivas. São mostrados gráficos de fluxo representativos de (A) células T e BCMA-CAR T nãoduzidas e (B) UTD e NIS+BCMA-CAR T. As células NIS+BCMA-CAR T são geradas pela co-transdução de dois vírus no primeiro dia de expansão celular T, conforme descrito na Figura 2. No dia 6, as células são manchadas para CARs e NIS. (C) A análise fenotípica do NIS+BCMA-CAR T. O gráfico de fluxo representativo das células NIS+BCMA-CAR T é mostrado. (D) Resumo da cinética de crescimento celular UTD, BCMA-CAR T ou NIS+BCMA-CAR T. A incorporação do BCMA-CAR e/ou NIS não afeta a expansão celular T (réplicas biológicas de ANOVA bidirecional, n=3, média ± SD). (E) Análise citométrica de fluxo de OPM-2 transduzida pela luciferase-GFP. As células OPM-2 são transduzidas com lentivírus codificando luciferase-GFP com resistência à puramicina. Quarenta e oito horas após a transdução, as células OPM-2 são tratadas com 2 μg/mL de puramicina. As células são expandidas por mais dois dias, e a expressão de GFP é analisada através da citometria de fluxo. Abreviaturas: CD = cluster de diferenciação; BCMA = Antígeno de maturação celular B; CAR = receptor de antígeno quimérico; NIS = isomiporter de iodeto de sódio; GFP = proteína fluorescente verde; UTD = não traduzido; FSC/SSC = dispersão dianteira/dispersão lateral; ANOVA = análise de variância; n.s.= não significativo; SD = desvio padrão; FL-1-A = área de fluoróforo 1; FITC-A = área de isocinato de fluoresceína. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Esquema para ensaio de tráfico in vivo em um modelo sistêmico de xenoenxerto OPM2. Injete camundongos NSG de seis a oito semanas de idade com 1,0 × 106 de células OPM-2 positivas da luciferase através da veia da cauda no dia -21. No dia -1, realize imagens bioluminescentes nos camundongos para confirmar o engrafamento das células OPM-2. No dia 0, injete camundongos com 5,0 × 106 das células NIS+BCMA-CAR T. Camundongos de imagem com [18F]TFB-PET/CT no dia 7 para avaliar o tráfico de células NIS+BCMA-CAR T. Abreviaturas: BCMA = antígeno de maturação celular B; CAR = receptor de antígeno quimérico; NIS = isomiporter de iodeto de sódio; BLI = imagem bioluminescente; NSG = NOD-scid IMUNOCOMusico-scid IL2rγnull; luc = luciferase; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafluoroborato emissão de pósitrons tomografia/tomografia computadorizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Ensaio de tráfico in vivo em um modelo sistêmico de xenoenxerto OPM2. (A e B) As células BCMA+luciferase+OPM2 são injetadas por via intravenosa em camundongos NSG. Os camundongos recebem células NIS+BCMA CAR T três semanas após a inoculação de células OPM-2. (A) A BLI confirma o engrafamento das células OPM-2. (B) [18F]TFB-PET revela o tráfico de células NIS+BCMA-CAR T à medula óssea. (C) Para confirmar que as células OPM-2 engrafam na medula óssea e as células NIS+BCMA-CAR T traficam para o local do tumor, os camundongos são eutanizados após a imagem, e a medula óssea é colhida. A análise citométrica do fluxo revelou que as células OPM-2 são engrafadas na medula óssea (esquerda), e as células NIS+BCMA-CAR T estão presentes na medula óssea (direita). Abreviaturas: BCMA = antígeno de maturação celular B; CAR = receptor de antígeno quimérico; NIS = isomiporter de iodeto de sódio; BLI = imagem bioluminescente; NSG = NOD-scid IMUNOCOMusico-scid IL2rγnull; [18F] Tomografia/tomografia computadorizada de TFB-PET/CT = [18F]tetrafluoroborato/ tomografia computadorizada; IVIS = sistema de imagem in vivo ; CD = cluster de diferenciação; SUV = valor de captação padronizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo suplementar S1: Renderização tridimensional (3D) de dados PET/CT mostrando a distribuição in vivo de [18F]TFB na tireoide, estômago e medula óssea. Abreviaturas: BCMA = antígeno de maturação celular B; CAR = receptor de antígeno quimérico; NIS = isomiporter de iodeto de sódio; PET/CT = tomografia de emissão de pósitrons/tomografia computadorizada. Clique aqui para baixar este vídeo.

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Discussion

Este artigo descreve uma metodologia para incorporar NIS em células CAR T e imagens infundidas células CAR T in vivo através de [18F]TFB-PET. Como prova de conceito, as células NIS+BCMA-CAR T foram geradas por meio de dupla transdução. Recentemente, relatamos que a incorporação do NIS nas células CAR T não prejudica as funções e a eficácia das células CAR T in vivo e permite o tráfico e expansão de células CAR T. À medida que as terapias celulares CAR T continuam a expandir-se para além das atuais malignidades celulares B para aplicações em LLC, haverá uma necessidade maior de ferramentas que permitam imagens in vivo não invasivas e monitoramento de células T adotivas infundidas. A imagem dinâmica das células T permitirá a validação do tráfico de células T adotivas e potencialmente permitirá a detecção precoce de eficácia e toxicidade.

O NIS tem sido investigado e validado como uma modalidade sensível às células de imagem e vírus em ensaios clínicos32,42. O acúmulo fisiológico de rastreadores para NIS é visto principalmente nas glândulas tireoide/salivar, estômago e bexiga, que não são órgãos comuns afetados por tumores líquidos44. Especialmente em MM, células plasmáticas malignas são frequentemente distribuídas na medula óssea ou ossos, e um plasmacitoma extramedular nas lesões, onde ocorre o acúmulo fisiológico de rastreadores para NIS, é um fenômeno raro44,45. Além disso, o NIS é não imunogênico e, portanto, adequado para estudos de imagem longitudinal46. NIS é uma proteína de membrana intrínseca que transporta iodeto para o citosol e contém 13 segmentos transmembrano putativos com um sítio amino terminus extracelular e terminus carboxy citosomicos47.

O NIS pode ser visualizado com radioisótopos emissores de gama ou pósitrons, como pertechnetato tecnonetium-99m (99mTc), iodida-123 (123I), 131I, 124I e [18F]TFB43. Recentemente, a TFB surgiu como um promissor análogo de iodeto para imagens PET baseadas em NIS, pois tem propriedades bioquímicas semelhantes e é radiosintestada48. Uma vantagem da TFB é que ela não sofre organificação em células da tireoide e, portanto, tem uma absorção relativamente leve no tecido da tireoide normal48. Outra vantagem da TFB é sua meia-vida curta de 109,8 min, enquanto as meias-vidas de outros rastreadores variam de 12h a 8 dias, o que pode apresentar problemas de segurança para aplicações clínicas49. A principal limitação da imagem celular CAR T baseada em NIS é que os rastreadores, incluindo o TFB, não penetram na barreira hemencefálica (BBB), dificultando a avaliação da neurotoxicidade após o tratamento celular CAR T50,51,52,53.

A neurotoxicidade está associada à infiltração de células T e à ativação de células mielóides no sistema nervoso central. No entanto, na maioria dos casos de neurotoxicidade após a terapia celular CAR T, a integridade do BBB é interrompida50,54. Portanto, não está claro se o rastreador é incapaz de cruzar o BBB neste cenário comprometido. Outros estudos precisam ser realizados para validar se a neurotoxicidade após a terapia celular CAR T pode ser imageada com [18F]TFB-PET. Embora a curta meia-vida da TFB seja segura para pacientes e funcionários, isso dificulta sua aquisição para o hospital. Portanto, os institutos devem ser equipados com ciclotrons ou ter acesso a uma instalação regional. A metodologia descrita no protocolo aqui pode potencialmente ser aplicada a uma variedade de outras células CAR T via transdução dupla para visualizar e avaliar células CAR T in vivo usando [18F]TFB-PET scan.

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Disclosures

SSK é um inventor de patentes em imunoterapia CAR licenciada para Novartis (através de um acordo entre Mayo Clinic, University of Pennsylvania, e Novartis) e Mettaforge (através da Mayo Clinic). RS, MJC e SSK são inventores de patentes no campo da imunoterapia CAR que são licenciadas para a Humanigen. A SSK recebe financiamento de pesquisa de Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs e Lentigen. Figuras foram criadas com BioRender.com.

Acknowledgments

Este trabalho foi parcialmente apoiado através do gasoduto Mayo Clinic K2R (SSK), do Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) e da Fundação Predolin (RS). As figuras 1, 2 e 4 foram criadas com BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Pesquisa de Câncer Edição 180 Célula CAR T repórter do NIS [18F]TFB-PET imagem não invasiva
Imagem dinâmica das células T do receptor de antígeno quimérico com [<sup>18F</sup>]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Tomografia Computadorizada
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Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal,… More

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).

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