Summary
We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.
Abstract
Subconjunctivale injectie is een aantrekkelijke route om oculaire geneesmiddelen toe te dienen vanwege de gemakkelijke transsclerale toegang die anterieure oculaire barrières omzeilt, zoals het hoornvlies en het bindvlies. Hoewel therapeutische effecten en farmacokinetiek van de geneesmiddelen bij subconjunctivale injectie in sommige studies zijn beschreven, beoordelen zeer weinigen de oculaire distributie van geneesmiddelen of medicijnafgiftesystemen (DDS). Dit laatste is van cruciaal belang voor de optimalisatie van het intraoculaire DDS-ontwerp en de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen om de gewenste oculaire lokalisatie en werkingsduur te bereiken (bijv. Acuut versus langdurig). Deze studie stelt het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) vast om de oculaire verdeling van fluorescerende liposomen in realtime in levende muizen na sub-conjunctivale injectie kwalitatief te bestuderen. Omdat dit is ontworpen voor in vivo visuele inspectie van weefsels op microscopisch niveau, is dit ook de eerste volledige beschrijving van de CLM-beeldvormingsmethode om de spatio-temporele verdeling van injectables in het oog na subconjunctivale injectie te bestuderen.
Introduction
De bloedklaring, weefselverdeling en doelbezetting van geneesmiddelen in levende systemen zijn pijlers voor het begrijpen van in vivo medicijndispositie. In preklinische diermodellen worden deze parameters meestal beoordeeld door frequente bloed- en weefselbemonstering op bepaalde tijdstippen na toediening van het geneesmiddel. Deze procedures zijn echter over het algemeen invasief, omvatten vaak niet-overlevingsmetingen en vereisen grote diercohorten voor statistische macht. Er kunnen extra kosten en tijd worden gemaakt, samen met ethische zorgen voor overmatig gebruik van dieren. Als gevolg hiervan is niet-invasieve beeldvorming hard op weg een integrale stap te worden in biodistributiestudies. Confocale lasermicro-endoscopie (CLM1,2) is zeer geschikt voor oculaire toepassingen om de spatio-temporele verdeling van therapeutica in de ogen van levende dieren met een hoge gevoeligheid en hoge resolutie niet-invasief in beeld te brengen1,3,4.
CLM heeft het potentieel om robuuste screening van oculaire medicijnafgiftesystemen (DDS), zoals liposomen, te vergemakkelijken voorafgaand aan uitgebreide kwantificering van de DDS en de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen. Liposomen zijn aantrekkelijk vanwege hun flexibiliteit bij het afstemmen van hun fysisch-chemische en biofysische eigenschappen5,6,7,8,9,10,11 om een grote verscheidenheid aan therapeutische lading in te kapselen en de weefselplaats van medicijnafgifte en werkingsduur te beheersen. Liposomen zijn gebruikt in oculaire toepassingen voor de afgifte van grote moleculen, zoals het monoklonale antilichaam bevacizumab12, en kleine moleculen zoals ciclosporine13 en ganciclovir14. Geneesmiddel-geladen liposomen hebben langere biologische halfwaardetijden en langdurige therapeutische effecten in vergelijking met niet-liposomale "vrije drug" formuleringen. De distributie van geneesmiddelen in oogweefsel wordt echter meestal geëxtrapoleerd uit geneesmiddelconcentraties in vloeibare componenten van het oog (d.w.z. bloed, waterige humor en glasvochthumor15,16,17). Aangezien het initiële in vivo lot van de geladen medicijnlading wordt bepaald door de eigenschappen van de nanodrager zelf, kan CLM-beeldvorming van de fluorescerende liposomen dienen als een surrogaat voor het medicijn om weefseltargeting en in situ weefselresidentietijden te onthullen. Bovendien kan visueel bewijs van toediening met CLM het herontwerp van DDS sturen, de therapeutische voordelen van het medicijn evalueren en misschien zelfs nadelige biologische gebeurtenissen voorspellen (bijv. Weefseltoxiciteit als gevolg van ongewenste lokalisatie van DDS gedurende langere tijd).
Hierin wordt een stapsgewijze procedure beschreven over het bestuderen van de oculaire biodistributie van liposomen in levende muizen met een dual-band CLM-systeem. Dit specifieke CLM-systeem kan tweekleurenfluorescentie (met groene en rode excitatielasers bij 488 nm en 660 nm) in realtime detecteren, met een frequentie van 8 frames / s. Door de detectiesonde fysiek op het oog te plaatsen, demonstreert het protocol beeldacquisitie en analyse van groen-fluorescerende liposomen bij subconjunctivale toediening bij muizen die intraveneus (IV) worden geïnjecteerd met 2% Evans Blue (EB) kleurstof. EB-kleurstof helpt bij het visualiseren van de gevasculariseerde structuren in het rode fluorescentiekanaal. We tonen representatieve resultaten van een studie ter beoordeling van 100 nm neutrale liposomen bestaande uit het fosfolipide POPC (d.w.z. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-fosfocholine) en gedopeerd met fluoresceïne-gelabeld fosfolipide Fl-DHPE (d.w.z. N-(fluoresceïne-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-fosfoethanolamine) in een verhouding van 95% POPC: 5% Fl-DHPE (figuur 1B ). CLM is in staat om de groene fluoresceïne-gelabelde liposomen te vangen bij 15 μm axiale en 3,30 μm laterale resolutie door afbakening van EB-gekleurde oculaire weefselgrenzen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van SingHealth (Singapore). Vrouwelijke C57BL/6 J-muizen (6- 8 weken oud; 18-20 g) werden verkregen uit InVivos, Singapore, en gehuisvest in een temperatuur- en lichtgestuurd vivarium van Duke-NUS Medical School, Singapore. Dieren werden behandeld volgens de richtlijnen van de Verklaring van de Vereniging voor Onderzoek in Visie en Oogheelkunde (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek.
OPMERKING: Een stroomdiagram met de belangrijkste procedures wordt weergegeven in figuur 2.
1. Bereiding van contrastmiddelen: Evans Blue (EB) en liposomen
- Los voor 2% EB-kleurstofoplossing 1 g EB op in 50 ml steriele zoutoplossing. Filtreer de oplossing met behulp van 0,22 μm filters in steriele buizen van 1,5 ml en bewaar ze bij kamertemperatuur voor later gebruik.
- Voeg voor groen fluorescerende liposomen POPC/Fl-DHPE (95:5), chloroform/methanol (2:1) toe aan een kolf met ronde bodem van 100 ml. Gebruik een roterende verdamper bij 150 tpm bij 40 °C gedurende 1 uur, met vacuüm gehandhaafd op 0 mbar1 om een dunne lipidefilm te creëren.
OPMERKING: Bij het vergelijken van effecten van liposomale eigenschappen (bijv. Grootte, lading, lipidenverzadiging, lipidenketenlengte) op distributie, handhaaf een vast percentage Fl-DHPE of andere fluorescerende lipiden om te bevestigen dat de waargenomen resultaten te wijten zijn aan het effect van de geteste eigenschappen, en niet aan de variabele belasting van grote hydrofobe kleurstoffen. - Hydrateer de lipidenfilm met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (om 26,3 mM fluorescerende liposomen te bereiken) bij 40 °C om multi-lamellaire blaasjes (MLV) te vormen. Laad de MLV's in een glazen spuit voor handmatige extrusie (30 keer met behulp van een polycarbonaatfilter van 0,08 μm poriegrootte) om de gewenste grootte van 100 nm te bereiken.
OPMERKING: De temperatuur voor hydratatie moet hoger zijn dan de overgangstemperatuur van de lipiden. - Filter de liposomen door ze door een steriel spuitfilter van 0,22 μm te laten gaan. Bevestig de hydrodynamische diameter (DH) van de liposomen met behulp van een dynamisch lichtverstrooiingssysteem.
2. Toediening van EB en liposomen bij levende muizen
- Injecteer de muis met EB IV (intraveneus) via de staartader (2,5 mg/kg), 2 uur vóór subconjunctivale injectie.
- Voor subconjunctivale injectie, eerst, verdoof de muis met behulp van 5% isofluraan via inhalatie in een inductiekamer om een adequaat niveau van anesthesie te bereiken. Breng de muis over naar een neuskegel en handhaaf de sedatie op 2% -2,5% isofluraan terwijl u gedurende de hele procedure op een verwarmingskussen zit.
- Trim de snorharen in de buurt van het oog om te worden geïnjecteerd en breng een druppel plaatselijke verdoving 0,5% proxymetacaine hydrochloride-oplossing direct op het oog.
- Laad een glazen spuit van 10 μL (met 32 G naald) met fluorescerende liposomen (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) en verwijder alle luchtbellen in de spuit voorafgaand aan de injectie.
OPMERKING: Tot 20 μL injectaat kan worden ondergebracht in de subconjunctivale ruimte van muizen18,19. - Til met een pincet het bindvlies iets op en injecteer langzaam in de subconjunctivale ruimte (figuur 1A). Trek de naald langzaam terug om terugstroming te voorkomen. Zorg ervoor dat er een zichtbare bleb gevuld met fluorescerende liposomen wordt gevormd (figuur 1C).
- Dien na de injectie een druppel antibioticum 1% fusidinezuur op het oog toe en controleer de muis totdat deze weer bij bewustzijn komt.
3. CLM opstelling
- Schakel het CLM-systeem in en zorg ervoor dat zowel de connector als de distale punt van de scansonde schoon zijn.
- Reinig de connector van de scansonde met behulp van een optische connectorreiniger door de instructies van de fabrikant te volgen.
- Druk op de haring (vaak gekleurd) van de optische connectorreiniger om een reinigingslint te onthullen.
- Plaats de connector in contact met het reinigingslint en schuif de connector langs het lint terwijl u contact houdt.
- Reinig de distale punt (ook bekend als de scanpunt) van de sonde door deze in de reinigingsoplossing te dompelen, gevolgd door de spoeloplossing die door de fabrikant is verstrekt. Een wattenstaafje-applicator kan ook worden gebruikt voor een grondigere reiniging als de punt erg vuil is.
- Sluit de sonde aan op het CLM-systeem. Kies op dit punt het gezichtsveld (FOV) en de locatie voor de acquisitiebestanden.
OPMERKING: Pas de laserintensiteit bij deze stap aan om ervoor te zorgen dat fluorescentiedetectie voor Fl-DHPE zich in het lineaire bereik bevindt. De laserintensiteit moet consistent worden gehouden voor vergelijking tussen beelden die op verschillende tijdstippen zijn gemaakt. - Laat het systeem 15 minuten opwarmen volgens de instructies en gebruik de kalibratiekit om het systeem te kalibreren volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: In de kalibratiekit zitten drie injectieflacons voor elke laser met de volgende oplossingen: reinigingsoplossing, spoeloplossing en fluorofoor 488/660 nm-oplossing voor interne kalibratie. De kalibratiestappen worden door het systeem gevraagd en moeten dienovereenkomstig worden gevolgd.- Dompel de punt onder in de reinigingsflacon gevolgd door de spoelflacon (5 s in elke injectieflacon). Laat het in de lucht voor achtergrondopname voor beide kanalen.
OPMERKING: Deze stap is zeer cruciaal omdat het de achtergrondwaarden van verschillende vezels van de sonde normaliseert en zorgt voor beelduniformiteit. - Dompel de punt onder in de reinigingsflacon gevolgd door de spoelflacon (5 s in elke injectieflacon). Dompel de tip gedurende 5 seconden onder in de injectieflacon met fluorofoor 488 nm om de signaalwaarden van verschillende vezels in de sonde te normaliseren.
- Dompel de punt onder in de reinigingsflacon gevolgd door de spoelflacon (5 s in elke injectieflacon). Dompel de punt onder in de spoelflacon tot het fluorescentiesignaal dat in punt 3.5.2 is geregistreerd. Verdwijnt. Dompel de tip onder in de injectieflacon met fluorofoor 660 nm om de signaalwaarden van verschillende vezels in de sonde te normaliseren.
OPMERKING: Volg alle kalibratiestappen om de juiste kalibratie en optimale beeldkwaliteit te bereiken.
- Dompel de punt onder in de reinigingsflacon gevolgd door de spoelflacon (5 s in elke injectieflacon). Laat het in de lucht voor achtergrondopname voor beide kanalen.
- Controleer na het kalibreren van de sonde of de achtergrondwaarden voor de sondes zo laag mogelijk zijn. Voor het gebruikte CLM-systeem houdt u de achtergrondwaarden onder de 100. Voer herhaalde reiniging van de sonde uit met een wattenstaafje en kalibratie als de waarden hoger zijn dan 100/gedefinieerde gebruikerswaarde of als de sonde vuil lijkt te zijn. Dit om ervoor te zorgen dat het achtergrondgeluid rond dezelfde waarde wordt gehouden.
OPMERKING: Het is belangrijk om de maximale achtergrondwaarde te definiëren (bijvoorbeeld 100 zoals vermeld in stap 3.6) om ervoor te zorgen dat de omstandigheden van de sonde vergelijkbaar zijn. Dit maakt een goede kwantitatieve vergelijking mogelijk tussen foto's die op verschillende tijdstippen zijn gemaakt. De waarde kan verschillen in verschillende systemen en sondeomstandigheden. - Schakel de dierlijke temperatuurregelaar (ATC) in. Stel de ATC in op 37 °C. Bedek het verwarmingskussen met een chirurgisch gordijn en bevestig de neuskegel op het verwarmingskussen.
OPMERKING: ATC met een bevestigd verwarmingskussen is vereist om ervoor te zorgen dat het dier warm wordt gehouden gedurende de hele beeldvormingsduur. - Klem de standaard van de ontleedmicroscoop vast aan het tafelblad om deze vast te zetten. Draai en pas het oculair van de microscoop aan om het muisoog ergonomisch door het oculair te bekijken wanneer de gebruiker zit (maak de aanpassingen na het plaatsen van het dier).
- Verdoof de muis met 5% isofluraan in een inductiekamer. Breng de muis over naar de neuskegel zodra het dier niet reageert en handhaaf de sedatie op 2% -2,5% isofluraan terwijl het gedurende de hele procedure op een verwarmingskussen zit.
- Trim de snorharen van de muis en breng een druppel verdovend 0,5% proxymetacaine hydrochloride-oplossing op het oog.
- Om ervoor te zorgen dat de ogen schoon zijn, laat u een paar druppels zoutoplossing vallen om het oogoppervlak te wassen.
- Stel de microscoop zo in dat het muisoog direct scherp is bij een vergroting van 0,67x.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de ogen smeert met zoutoplossing. Als de ogen tijdens de beeldvormingssessie niet worden gesmeerd, kunnen ze droog worden, waardoor de lens kristalliseert. Als gevolg hiervan kan de lens tijdens CLM-beeldvorming een achtergrondrode fluorescentie uitzenden.
4. Live beeldvorming van muisogen met CLM en acquisitie
- Schakel de laser in, plaats de sonde op het oog en begin met het registreren van acquisitie om de fluorescentie in het oog te observeren op de gebieden die zijn aangegeven op de oogkaart in figuur 3.
OPMERKING: Houd de sonde als een pen met het distale uiteinde van de sonde direct op het gebied dat moet worden afgebeeld. - Stop de opname wanneer alle regio's zijn gemarkeerd en gelabeld. De acquisitiebestanden worden automatisch opgeslagen op de bestandslocatie die is gekozen in stap 3.4.
OPMERKING: Het bestand wordt opgeslagen als een videobestand dat kan worden geëxporteerd naar afzonderlijke afbeeldingen. Label de vlag volgens de oogkaart om precies de locatie van de sonde te weten bij het exacte frame waarin de opname is gedaan.
5. Beeldanalyse
- Gebruik dezelfde CLM-acquisitiesoftware om de beeldacquisitiebestanden te exporteren voor verdere analyse. Klik op Bestand | Exporteer en kies de indeling waarnaar u wilt exporteren. Mkt-formaat bestanden maken aanpassingen van de opzoektabel (LUT) en verdere exports naar afbeeldingsbestandsindelingen mogelijk met behulp van de CLM-viewersoftware.
- Voor een nauwkeurige vergelijking van de fluorescentie-intensiteit gebruikt u dezelfde LUT die voor elk kanaal is aangepast bij het exporteren van alle afbeeldingsbestanden.
OPMERKING: Kies de minimale en maximale LUT-drempel ten opzichte van die van de controlemuis (zonder geïnjecteerde liposomen) om achtergrondfluorescentiemetingen te minimaliseren. - Open de afbeelding in een geschikt beeldverwerkingssoftware/freeware-programma (bijv. ImageJ). Teken de regio van belang (ROI).
OPMERKING: ROI verwijst hier naar de regio van belang in het verwerkingsprogramma. In de meeste gevallen zal ROI de hele afbeelding gescand zijn. In het geval van het afbeelden van de limbus kan de sonde echter niet zomaar het beeld van de limbus afzonderlijk krijgen. Daarom moet een ROI worden getrokken om de fluorescentie in het limbusgebied te 'kwantificeren', zoals weergegeven in figuur 4. Om de ROI consistent te houden, gebruikt u dezelfde ROI voor alle afbeeldingen. - Meet en noteer de ROI-waarden voor groene fluorescentie. Voer de waarden in een spreadsheet in. Tabelleer de gemiddelde en fluorescentie-intensiteit (a.u.) waarden van de ROI.
6. Histologische beoordeling
- Euthanaseer de muis met behulp van een methode die is goedgekeurd door de lokale IACUC.
- Enucleeer het oog en fixeer het oog in 1 ml 4% formaldehyde of 10% formaline-oplossing gedurende de nacht.
- Snijd overtollige vetten en sluit het oog in de optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en bewaar het bevroren in een vriezer van -80 °C gedurende ten minste één dag.
- Snijd secties van 5 μm dikte in de cryostaat met een snijtemperatuur van 20 °C. Breng de sectie over naar een poly-L-lysine-gecoat microscoopglaasje.
OPMERKING: Histologie kan dienen als aanvullende validatie van de distributie van DDS. Het vereist echter extra optimalisatie, technische expertise en opoffering van dieren die de studie wil verminderen door CLM te gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol toont het nut van CLM aan om de spatio-temporele oculaire verdeling van groene fluorescerende liposomen toegediend via subconjunctivale injectie te beoordelen. Om gebruik te maken van de dual-color capaciteit (488 nm en 660 nm excitatie golflengten) van het CLM-systeem, werden 100 nm neutrale POPC liposomen die moesten worden geïnjecteerd gedopeerd met 5% Fl-DHPE (samenstellings- en karakteriseringsgegevens zijn weergegeven in figuur 1B), en EB werd IV geïnjecteerd om oriëntatiepunten in het oog te identificeren. De aanwezigheid van een dunne laag episclera en het bindvlies, die beide sterk gevasculariseerd zijn, maakt het mogelijk om het sclera-gebied rood te kleuren met EB (figuur 4A, gelabeld als S), terwijl het hoornvlies dat geen vasculatuur bevat (figuur 4A, gelabeld als C), niet gekleurd raakt en zwart lijkt. Dit maakt een duidelijk onderscheid tussen beide regio's mogelijk tijdens fluorescentiebeeldvorming.
De representatieve resultaten zijn afkomstig van een distributiestudie van meer dan 7 dagen (n = 4 muizen). Omdat de fluorescentie-intensiteiten in de beelden voor dag 1 en dag 3 hoog waren (figuur 5B), werden de pixelintensiteiten verlaagd voor een betere visualisatie. Werkelijke waarden van de fluorescentie-intensiteit worden weergegeven in de grafieken (figuur 6). Om ervoor te zorgen dat waarnemingen van de beelden te wijten waren aan fluorescentie van de liposomen en niet aan vrije kleurstof, die mogelijk van de liposomen was losgekomen, werden controlemuizen geïnjecteerd met fluoresceïne (Fl) kleurstof opgenomen (figuur 5A).
Een vermindering van de liposomen (bij proxy van de afname van het groene fluorescerende signaal) werd waargenomen in zowel de limbus- als de scleraregio's in de loop van de tijd. Omdat de liposomen werden geïnjecteerd van het temporale naar het superieure gebied van de subconjunctivale ruimte (figuur 3), werden ze op natuurlijke wijze recht op de temporale en superieure sclera geplaatst (figuur 4B) voordat ze andere regio's van de subconjunctivale ruimte bereikten. Op dag 1 na de injectie was de in de sclera gedetecteerde fluorescentie tot 6 keer hoger dan de limbus voor zowel temporale als superieure regio's (figuur 6). Op dag 3 en dag 7 werd een significante vermindering van liposomen waargenomen in de sclera (60% van dag 1 tot dag 3 (dag 1→3) en 88% van dag 3 tot dag 7 (dag 3→7)) in het temporele gebied, met een vermindering van 66% en 93% voor dag 1→3 en dag3→7 in de superieure regio's, respectievelijk p < 0,001) (figuur 6). Deze vermindering werd toegeschreven aan de oculaire klaringsmechanismen door bloed en/of lymfevaten gevonden bij het bindvlies en episclera. De liposomen kunnen ook door de sclera zijn verspreid en worden opgeruimd door het vaatvlies, dat ook sterk gevasculariseerd is.
De liposomen bleken langzamer te zijn verdwenen in de limbus. Voor temporale limbus en superieure limbus waren de veranderingen in fluorescentiesignalen van dag 1 tot dag 3 na injectie niet significant, wat aangeeft dat neutrale liposomen een voorkeur hebben voor het limbusgebied, met name de cornea-periferie (figuur 5B). Liposomen in het limbusgebied begonnen te klaren vanaf dag 3 (d3→7: -89% voor temporale (p < 0,01) en -53% voor superior (p < 0,05)). Op dag 7 was meer dan 90% van de liposomen verdwenen uit alle limbusregio's (p < 0,05), behalve voor superieure limbus 1S, waar 50% van de liposomen nog steeds kon worden gedetecteerd (p > 0,05). Dit is een indicatie dat de verblijftijd voor neutrale liposomen veel hoger is aan de superieure limbus/hoornvliesrand (figuur 5 en figuur 6) in vergelijking met andere regio's. De laagste hoeveelheid fluorescentie werd gedetecteerd in de nasale en inferieure regio's op alle tijdstippen vanwege hun afstand tot de injectieplaats (figuur 6A,B).
In meer uitgebreide studies naar de klaring van liposomen in het oog die eerder zijn gemeld1, hebben we een paar routes besproken waarin liposomen na subconjunctivale injectie uit oculaire weefsels kunnen worden verwijderd. Hoewel liposomen kunnen worden geklaard door systemische circulatie en lymfatische klaring door het bindvlies, episclera en vaatvlies, die sterk gevasculariseerd zijn, kunnen ze ook diepere intraoculaire weefsels bereiken door passieve diffusie door de sclera. Vloeistofstroom kan de liposomen ook transporteren door het trabeculaire meshwork of uveosclera-uitstroom, wat de liposomen terug naar de sclera kan brengen. Eliminatie door scheuren is ook mogelijk en kleine lekkages in de injectieplaats kunnen cornea-penetratie door passieve diffusie mogelijk maken.
Figuur 1: Subconjunctivale injectie van liposomen in het oog. (A) Grafische weergave van groen-fluorescerende liposomen en subconjunctivale injectie. (B) Samenstelling en eigenschappen van FL-DHPE gedopeerde liposomale formulering voor oculaire CLM Imaging. (C) Groen-fluorescerende liposomen die een bleb vormen bij subconjunctivale injectie. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Chaw S.Y. et al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Tijdlijn van de oculaire CLM-procedure. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Oogkaart voor CLM-scans. Gebied 1 verwijst naar het limbusgebied, terwijl gebied 2 verwijst naar het sclera-gebied. Video's en afbeeldingen werden genomen van 1T in een tegen de klok in richting, gevolgd door 2T in een vergelijkbare tegen de klok in. Omdat de naald werd ingebracht voor injectie van 2T naar 2S, zijn interessegebieden voornamelijk 1T, 1S, 2T en 2S. Insert toont de grootte van de sonde ten opzichte van het muisoog. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Chaw S.Y. et al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Beeldanalyse. (A) BeeldJ-analyse van fluorescerend-gelabelde liposomen werd uitgevoerd met behulp van interessegebieden (ROI) gedefinieerd voor de limbus (L) en sclera (S) (B) Oculaire regio's gekwantificeerd in het limbusgebied voor liposoomaanwezigheid. Mogelijke locaties van liposomen gedetecteerd in de limbus zijn 1) cornea-periferie, 2) limbus of 3) sclera-periferie. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Chaw S.Y. et al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Contrastverdelingen bij de limbus en sclera. Contrastverdeling bij de limbus (1S: Superior, 1N: Nasaal, 1I: Inferieur, 1T: Temporal) en sclera (2S: Superior, 2N: Nasaal, 2I: Inferior, 2T: Temporal) regio's van één representatieve muis uit elk cohort (n = 4) gedurende 7 dagen voor (A) Fluoresceïne (Fl) controle, (B) 100 nm neutrale liposomen (POPC-100). Rode kleur duidt op EB-kleuring. Schaalbalk = 50 μm. (C) Gemaakte afbeeldingen worden op de oogkaart geassembleerd voor een beter begrip. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Chaw S.Y. et al.1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Klaringskinetiek van 100 nm neutrale POPC-liposomen in de sclera (A) en limbus (B) regio's gedurende 7 dagen (n=4 muizen per groep). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit werd vergeleken met 2-weg ANOVA met meerdere vergelijkingen ten opzichte van het vorige tijdstip; d1→3 en d3→7; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Representatieve histologische beelden van dwarsdoorsneden (5 μm) van het muisoog één dag na injectie van Fl-DHPE liposomen. Stippellijnen geven aan waar de liposomen kunnen worden waargenomen, aangegeven door groene kleur. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zoals blijkt uit de resultaten, biedt CLM een eenvoudige en haalbare methode om de oculaire verdeling van liposomen in het oog in beeld te brengen. We hebben eerder het gebruik van CLM aangetoond om de lokalisatie van verschillende liposomale formuleringen in het muisoog in de loop van de tijd te karakteriseren1. Voor niet-invasieve toepassingen maakt CLM real-time beeldvorming van het voorste oculaire oppervlak mogelijk voor inzichten in hoe liposomen in het oog worden verdeeld van hetzelfde dier. Dit maakt CLM geschikt om nanocarrier/DDS vooraf te screenen voordat een uitgebreidere kwantificering plaatsvindt. Gezien de unieke fysiochemische eigenschappen van diverse DDS, is het nogal een uitdaging om de subcompartimentverdeling te karakteriseren door conventionele histologie. Dit laatste zou een uitputtende sectie van het hele oog en individuele beeldvormingssecties vereisen door fluorescentiemicroscopie voor een algemeen gevoel van de DDS-klaring.
In overeenstemming met CLM-beelden (figuur 5B, C), konden we groene fluorescerende signalen waarnemen door histologie bij het hoornvlies, limbus en sclera-gebieden van het oog verzameld op dag 1 na injectie van de liposomen (figuur 7). Met name CLM vertoonde een betere gevoeligheid dan fluorescerende microscopie - liposomen aan de sclera konden duidelijk worden gedetecteerd met BEHULP VAN CLM (figuur 5), maar nauwelijks gedetecteerd door de fluorescentiemicroscoop (figuur 7). Het signaalverlies kan te wijten zijn aan de was- en sectieprocedures die de retentie van liposomen in weefselsecties hebben beïnvloed. Hoewel CLM beperkt is in het lokaliseren van de exacte weefsellaag waarin de liposomen zich ophopen, is het zeker een haalbare en relatief eenvoudige methode om kandidaat-oculaire therapieën niet-invasief in realtime te screenen en te beoordelen.
Hoewel andere beeldvormingssystemen zoals in vivo beeldvormingssystemen en fluorometers ook live beeldvorming of live kwantificering van fluorescentie in het oog mogelijk maken, zijn ze niet zo geschikt voor het doel van deze studie. In vivo beeldvormingssystemen bieden niet de ruimtelijke resolutie die nodig is om te bepalen waar de therapeutica zich in de oculaire ruimte bevinden. Men kan alleen een idee krijgen of de therapeutica nog steeds aanwezig zijn in de oculaire ruimte en hun biodistributie bij gebruik van in vivo beeldvormingssysteem20. Een fluorometer maakt het mogelijk om fluorescentie langs de optische as van het oog te meten en wordt veel gebruikt om fysiologische veranderingen in het oog te bestuderen. Omdat het moeilijk is om op elk tijdstip exact dezelfde optische as te laten scannen, kan een consistente beeldplek niet worden gehandhaafd. Dit is zeer cruciaal, vooral bij het bestuderen van de distributie van medicijnafgiftesystemen waarbij hun verblijftijd en klaringspercentage van de injectieplaats totaal onbekend zijn. Bovendien liggen de injectieplaats en de verwachte verdeling voor subconjunctivale injectie ook niet binnen het bereik van de optische as.
Kritieke stappen in het protocol omvatten het strikt volgen van een beeldvormingskaart die vergelijkbaar is met de oogkaart in figuur 3 en het nauwkeurig labelen van de locaties. Verkeerde etikettering of afwijking van de beeldvormingslocatie zou leiden tot inconsistentie van de resultaten. Omdat de laserintensiteit voor elke scan kan worden aangepast, is het belangrijk dat de intensiteit consistent is om de kwantificering van verschillende tijdspunten vergelijkbaar te maken. Het is ook belangrijk dat de sonde tijdens het beeldvormingsproces vrij van vuil wordt gehouden. Omdat oogslijm tijdens het afbeelden op de sonde kan vast komen te zitten, wordt aanbevolen de sonde in zoutoplossing te spoelen als de achtergrondwaarden boven de door de gebruiker gedefinieerde waarde uitkomen.
Anders dan subconjunctivale injectie, heeft dit CLM-systeem ook het potentieel om te worden gebruikt om andere oculaire toedieningsroutes te bestuderen, zoals toediening van oogdruppels en intravitreale injectie (IVT). Vanwege de beperking in beelddiepte is het echter mogelijk niet zo nuttig voor IVT als de injectieplaats en diepere oculaire weefsels de belangrijkste interessegebieden zijn. CLM kan ook worden gebruikt als een vorm van intravitale beeldvorming om de distributie van DDS in andere organen of weefsels te bestuderen. Hoewel het zelden is gebruikt om DDS-distributie te bestuderen, is endoscopische confocale microscopie gebruikt om ontstekingen veroorzaakt door parodontitis21 in beeld te brengen, longontsteking en infecties22,23 en het effect van geneesmiddelen op angiogenese in tumoren24 te controleren, wat wijst op een reeks andere mogelijke toepassingen voor dit CLM-systeem.
Over het algemeen kan dit protocol dienen als een screeningstap om erachter te komen hoe wijzigingen in DDS-formuleringen van invloed zijn op waar ze zich bevinden of zich ophopen, wat van cruciaal belang kan zijn bij het ontwerp van een DDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) subsidie toegekend (aan SV) en gedeeltelijk door Singapore National Research Foundation Grant AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013/2 en Singapore's Health and Biomedical Sciences (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) subsidie H18/01/a0/018 beheerd door het Agentschap voor Wetenschap, Technologie en Onderzoek (A * STAR) (aan AMC). Met dank aan leden van Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) voor het faciliteren van de logistiek en uitvoering van de studies en training op apparatuur. Speciale dank aan mevrouw Wisna Novera voor haar redactionele hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G.
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
