Summary
Subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki lipozomların mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde incelemek için fiberoptik konfokal lazer miksanoskopi (CLM) kullanımı için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Subkonjonktival enjeksiyon, kornea ve konjonktiva gibi ön oküler bariyerleri atlayan kolay trans-skleral erişim nedeniyle oküler ilaçları uygulamak için çekici bir yoldur. Subkonjonktival enjeksiyon üzerine ilaçların terapötik etkileri ve farmakokinetiği bazı çalışmalarda tanımlanmış olmakla birlikte, çok azı ilaçların veya ilaç dağıtım sistemlerinin (DDS) oküler dağılımını değerlendirmemektedir. İkincisi, istenen oküler lokalizasyonu ve etki süresini (örneğin, akut ve uzun süreli) elde etmek için göz içi DDS tasarımının ve ilaç biyoyararlanımının optimizasyonu için kritik öneme sahiptir. Bu çalışma, floresan lipozomların konjonktival enjeksiyondan sonra canlı farelerde gerçek zamanlı olarak oküler dağılımını niteliksel olarak incelemek için fiberoptik konfokal lazer mikroendoskopi (CLM) kullanımını ortaya çıkarmaktadır. Mikroskobik düzeyde dokuların in vivo görsel muayenesi için tasarlanan bu, aynı zamanda subkonjonktival enjeksiyondan sonra gözdeki enjekte edilebilirlerin mekano-zamansal dağılımını incelemek için CLM görüntüleme yönteminin ilk tam açıklamasıdır.
Introduction
Canlı sistemlerde ilaçların kan klirensi, doku dağılımı ve hedef doluluğu in vivo ilaç eğilimini anlamanın temel direğidir. Preklinik hayvan modellerinde, bu parametreler tipik olarak ilaç uygulama sonrası belirli zaman noktalarında sık kan ve doku örneklemesi ile değerlendirilir. Bununla birlikte, bu prosedürler genellikle istilacıdır, genellikle hayatta kalma dışı ölçümleri içerir ve istatistiksel güçlenme için büyük hayvan kohortları gerektirir. Hayvanların aşırı kullanımı için etik kaygıların yanı sıra ekstra maliyet ve zaman olabilir. Sonuç olarak, non-invaziv görüntüleme hızla biyodistributions çalışmalarında ayrılmaz bir adım haline gelmektedir. Konfokal lazer miksoskopi (CLM1,2), yüksek hassasiyetli ve yüksek çözünürlüklü canlı hayvanların gözünde terapötiklerin mekansal-zamansal dağılımını invaziv olmayan bir şekilde görüntüleyen oküler uygulamalar için çok uygundur1,3,4.
CLM, DDS'nin kapsamlı ölçülmesi ve ilaç biyoyararlanımdan önce lipozomlar gibi oküler ilaç dağıtım sistemlerinin (DDS) sağlam taramasını kolaylaştırma potansiyeline sahiptir. Lipozomlar, çok çeşitli terapötik kargoları kapsüllemek ve ilaç salınımının doku bölgesini ve etki süresini kontrol etmek için fizikokimyasal ve biyofiziksel özelliklerini ayarlamadaki esneklikleri için çekicidir. Lipozomlar, monoklonal antikor bevacizumab12 gibi büyük moleküllerin ve siklosporin13 ve ganciclovir14 gibi küçük moleküllerin teslimi için oküler uygulamalarda kullanılmıştır. İlaç yüklü lipozomlar, lipozomal olmayan "serbest ilaç" formülasyonlarına kıyasla daha uzun biyolojik yarı ömürlere ve uzun süreli terapötik etkilere sahiptir. Bununla birlikte, oküler dokudaki ilaç dağılımı tipik olarak gözün sıvı bileşenlerindeki ilaç konsantrasyonlarından (yani kan, sulu mizah ve vitreus mizahı15,16,17) tahmin edilir. Yüklü ilaç kargosunun ilk in vivo kaderi nanokarrierin özellikleri ile tanımlandığı için, floresan lipozomların CLM görüntülemesi, ilacın doku hedeflemesini ve yerinde doku ikamet sürelerini ortaya çıkarmak için bir taşıyıcı görevi görebilirsiniz. Ayrıca, CLM ile doğumun görsel kanıtları DDS'nin yeniden tasarlanmasını yönlendirebilir, ilacın terapötik faydalarını değerlendirebilir ve hatta belki de olumsuz biyolojik olayları tahmin edebilir (örneğin, DDS'nin uzun süre istenmeyen lokalizasyonuna bağlı doku toksisitesi).
Burada, çift bantlı CLM sistemine sahip canlı farelerde lipozomların oküler biyodistribasyonunun nasıl incelenerek incelenerek adım adım bir prosedür detaylandırılır. Bu özel CLM sistemi, iki renkli floresanları (488 nm ve 660 nm'de yeşil ve kırmızı heyecan lazerleri ile) gerçek zamanlı olarak, 8 kare /s frekansta algılayabilir. Algılama probunun göze fiziksel olarak yerleştirilmesiyle protokol, %2 Evans Blue (EB) boyası ile intravenöz (IV) önceden enjekte edilen farelerde subkonjonktival uygulama üzerine yeşil floresan lipozomların görüntü alımını ve analizini göstermektedir. EB boyası kırmızı floresan kanalındaki damarlı yapıların görselleştirilmesine yardımcı olur. Fosfolipid POPC'den (yani, 1-palmitoyl-2-oleoyl-glisero-3-fosfokolin) oluşan ve floresan etiketli fosfolipid Fl-DHPE (örneğin, N-(floresan-5-tiyokarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glisero-3-fosfotianolamin) % 95 POPC: % 5 Fl-DHPE (Şekil 1B) ). CLM, EB lekeli oküler doku sınırlarının tanımlaması ile yeşil floresan etiketli lipozomları 15 μm eksenel ve 3,30 μm yanal çözünürlükte yakalayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler SingHealth'teki (Singapur) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Dişi C57BL/6 J fareler (6- 8 haftalık; 18-20 g) InVivos, Singapur'dan elde edildi ve Singapur Duke-NUS Tıp Fakültesi'nin sıcaklık ve ışık kontrollü vivariumunda barındırıldı. Hayvanlar, oftalmik ve görme araştırmalarında hayvanların kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği (ARVO) açıklamasından alınan kılavuza uygun olarak tedavi edildi.
NOT: Şekil 2'de ana yordamları vurgulayan bir akış şeması gösterilmiştir.
1. Kontrast ajanların hazırlanması: Evans Blue (EB) ve lipozomlar
- % 2 EB boya çözeltisi için, 50 mL steril salin içinde 1 g EB çözün. Çözeltiyi 0,22 μm filtre kullanarak 1,5 mL steril tüplere filtreleyin ve daha sonra kullanmak üzere oda sıcaklığında saklayın.
- Yeşil floresan lipozomlar için 100 mL yuvarlak alt şişeye POPC/Fl-DHPE (95:5), kloroform/metanol (2:1) ekleyin. İnce bir lipit filmi oluşturmak için 0 mbar1'de vakumla 1 saat boyunca 40 °C'de 150 rpm'de bir döner evaporatör kullanın.
NOT: Lipozomal özelliklerin (örneğin, boyut, yük, lipid doygunluğu, lipid zinciri uzunluğu) dağıtım üzerindeki etkilerini karşılaştırırken, gözlemlenen sonuçların büyük hidrofobik boyaların değişken yükünden değil, test edilen özelliklerin etkisinden kaynaklandığını doğrulamak için Fl-DHPE veya diğer floresan lipitlerin sabit bir yüzdesini koruyun. - Lipid filmini fosfat tamponlu salinle (26,3 mM floresan lipozom elde etmek için) 40 °C'de çok lameller veziklin (MLV) oluşturmak için nemlendirin. İstenilen 100 nm boyutuna ulaşmak için MLV'leri manuel ekstrüzyon için bir cam şırınna (0,08 μm gözenek boyutu polikarbonat filtre kullanarak 30 kez) yükleyin.
NOT: Hidrasyon sıcaklığı lipitlerin geçiş sıcaklığından daha yüksek olmalıdır. - Lipozomları 0,22 μm steril şırıng filtresinden geçirerek filtreleyin. Dinamik bir ışık saçılma sistemi kullanarak lipozomların hidrodinamik çapını (DH) onaylayın.
2. Canlı farelerde EB ve lipozomların yönetimi
- Fareye kuyruk damarı (2,5 mg/kg), subkonjonktival enjeksiyondan önce 2 saat EB IV (intravenöz) enjekte edin.
- Subkonjonktival enjeksiyon için, ilk olarak, yeterli bir anestezi düzlemi elde etmek için bir indüksiyon odasında soluma yoluyla% 5 izofluran kullanarak fareyi yatıştırın. Fareyi bir burun konisine aktarın ve işlem boyunca bir ısıtma yastığındayken izofluranların% 2-2.5'inde sedasyon sağlayın.
- Enjekte edilecek gözün yakınındaki bıyıkları kırpın ve bir damla topikal anestezik% 0.5 proxymetacaine hidroklorür çözeltisini doğrudan göze aşılayın.
- Floresan lipozomlarla (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) 10 μL cam şırınga (32 G iğne ile) yükleyin ve enjeksiyondan önce şırıngadaki tüm hava kabarcıklarını dağıtın.
NOT: Farelerin altjonktival alanında 20 μL'ye kadar enjekte edilebilir18,19. - Cımbız kullanarak konjonktivayı hafifçe kaldırın ve altjonktival alana yavaşça enjekte edin (Şekil 1A). Geri akışı önlemek için iğneyi yavaşça çekin. Floresan lipozomlarla dolu görünür bir bleb oluştuğundan emin olun (Şekil 1C).
- Enjeksiyondan sonra göze bir damla antibiyotik% 1 fusidik asit sürün ve fareyi kendine gelene kadar izleyin.
3. CLM kurulumu
- CLM sistemini kapatın ve tarama probunun hem konektörünün hem de distal ucunun temiz olduğundan emin olun.
- Tarama probunun konektörünü, üreticinin yönergelerini izleyerek optik konektör temizleyicisi kullanarak temizleyin.
- Temizleme şeridini ortaya çıkarmak için optik konektör temizleyicisinin tırmıklarına (genellikle renkli) basın.
- Bağlayıcıyı temizleme şeridiyle temas halinde konumlandırın ve bağlantıyı korurken bağlayıcıyı şerit boyunca kaydırın.
- Probun distal ucunu (tarama ucu olarak da bilinir) temizleme çözeltisine ve ardından üretici tarafından sağlanan durulama çözeltisine batırarak temizleyin. Uç çok kirliyse daha kapsamlı temizlik için pamuklu uç aplikatörü de kullanılabilir.
- Sondayı CLM sistemine bağlayın. Bu noktada görüş alanını (FOV) ve edinme dosyalarının konumunu seçin.
NOT: Fl-DHPE için floresan algılamanın doğrusal aralıkta olduğundan emin olmak için bu adımda lazer yoğunluğunu ayarlayın. Lazer yoğunluğu, farklı zaman noktalarında çekilen görüntüler arasında karşılaştırma için tutarlı tutulmalıdır. - Sistemin söylendiği gibi 15 dakika ısınmasına izin verin ve kalibrasyon kitini kullanarak sistemi üreticinin talimatlarına göre kalibre edin.
NOT: Kalibrasyon kitinde, her lazer için aşağıdaki çözümleri içeren üç şişe vardır: temizleme çözeltisi, durulama çözeltisi ve dahili kalibrasyon için florofor 488/660 nm çözeltisi. Kalibrasyon adımları sistem tarafından istenir ve buna göre takip edilmelidir.- Ucu temizleme şişesinin içine daldır ve ardından durulama şişesini (her şişede 5 sn). Her iki kanal için arka plan kaydı için havada bırakın.
NOT: Bu adım, probun farklı liflerinden arka plan değerlerini normalleştirdiği ve görüntü homojenliğini sağladığı için çok önemlidir. - Ucu temizleme şişesinin içine daldır ve ardından durulama şişesini (her şişede 5 sn). Probdaki farklı liflerden gelen sinyal değerlerini normalleştirmek için ucu 5 saniye boyunca florofor 488 nm şişeye daldırın.
- Ucu temizleme şişesinin içine daldır ve ardından durulama şişesini (her şişede 5 sn). Ucu durulama şişesinin içine 3.5.2'de kaydedilen floresan sinyaline kadar daldırin. Kaybolur. Probdaki farklı liflerden gelen sinyal değerlerini normalleştirmek için ucu florofor 660 nm şişeye daldırın.
NOT: Uygun kalibrasyon ve optimum görüntü kalitesi elde etmek için tüm kalibrasyon adımlarını izleyin.
- Ucu temizleme şişesinin içine daldır ve ardından durulama şişesini (her şişede 5 sn). Her iki kanal için arka plan kaydı için havada bırakın.
- Probu kalibre ettikten sonra, probların arka plan değerlerinin mümkün olduğunca düşük olduğundan emin olun. Kullanılan CLM sistemi için arka plan değerlerini 100'ün altında tutun. Değerler 100/tanımlı kullanıcı değerinin üzerindeyse veya prob kirli görünüyorsa, probun pamuk ucu aplikatörü ve kalibrasyon ile tekrarlanan temizliğini gerçekleştirin. Bu, arka plan gürültüsünün aynı değer etrafında tutulmasını sağlamaktır.
NOT: Araştırma koşullarının benzer olduğundan emin olmak için maksimum arka plan değerini (örneğin, adım 3.6'da belirtildiği gibi 100) tanımlamak önemlidir. Bu, farklı zaman noktalarında çekilen görüntüler arasında uygun nicel karşılaştırmaya izin verecektir. Değer farklı sistemlerde ve prob koşullarında farklılık gösterebilir. - Hayvan sıcaklığı kontrol cihazını (ATC) kapatın. ATC'yi 37 °C'ye ayarlayın. Isıtma yastığını cerrahi bir örtü ile örtün ve burun konisini ısıtma yastığına sabitleyin.
NOT: Hayvanın görüntüleme süresi boyunca sıcak tutulmasını sağlamak için ekli bir ısıtma yastığına sahip ATC gereklidir. - Parçalama mikroskopunun standını sabitlemek için masanın tepesine sıkıştırın. Kullanıcı oturduğunda fare gözünü göz merceğinden ergonomik olarak görüntülemek için mikroskobun göz merceğini döndürün ve ayarlayın (hayvanı yerleştirdikten sonra ayarlamaları yapın).
- Bir indüksiyon odasında% 5 izofluran kullanarak fareyi yatıştırın. Hayvan yanıt vermiyorsa fareyi burun konisine aktarın ve işlem boyunca bir ısıtma yastığındayken sedasyonu% 2-% 2.5 izofluranda tutun.
- Farenin bıyıklarını kırpın ve göze bir damla anestezik% 0.5 proxymetacaine hidroklorür çözeltisi aşılayın.
- Gözlerin temiz olduğundan emin olmak için, oküler yüzeyi yıkamak için birkaç damla salin bırakın.
- Mikroskobu, fare gözünün 0,67x büyütmede doğrudan odakta olacak şekilde ayarlayın.
NOT: Gözleri tuzlu suyla yağlamayı unutmayın. Gözler görüntüleme seansı boyunca yağlanmazsa, kuruyarak lensin kristalleşmesine neden olabilirler. Sonuç olarak, CLM görüntüleme sırasında lens arka plan kırmızı floresan yayabilir.
4. CLM ve edinim ile fare gözlerinin canlı görüntülenmesi
- Lazeri açın, probu göze yerleştirin ve Şekil 3'te göz haritasında belirtilen bölgelerde gözdeki floresanları gözlemlemek için kazanımı kaydetmeye başlayın.
NOT: Probu, probun distal ucuyla birlikte bir kalem gibi doğrudan görüntülenecek bölgeye tutun. - Tüm bölgeler işaretlendiğinde ve etiketlendiğinde kaydı durdurun. Edinme dosyaları, adım 3.4'te seçilen dosya konumuna otomatik olarak kaydedilir.
NOT: Dosya, tek tek görüntülere dışa aktarılabilen bir video dosyası olarak kaydedilecektir. Kaydın yapıldığı çerçevede sondanın tam olarak yerini bilmek için bayrağı göz haritasına göre etiketleyin.
5. Görüntü analizi
- Aynı CLM alma yazılımını kullanarak, daha fazla analiz için görüntü alma dosyalarını dışa aktarın. Dosya | tıklayın Dışa aktar ve dışa aktarılacak biçimi seçin. Mkt biçimli dosyalar, arama tablosunun (LUT) ayarlanmasında ve CLM görüntüleyici yazılımını kullanarak görüntü dosyası biçimlerine daha fazla dışa aktarmaya izin verecektir.
- Floresan yoğunluğunun doğru karşılaştırması için, tüm görüntü dosyalarını dışa aktarırken her kanal için ayarlanmış aynı LUT'i kullanın.
NOT: Arka plan floresan okumalarını en aza indirmek için kontrol faresininkilerle ilgili minimum ve maksimum LUT eşiğini (lipozom enjekte etmeden) seçin. - Görüntüyü uygun bir görüntü işleme yazılımında/ücretsiz programında açın (ör. ImageJ). İlgi alanı çizin (yatırım getirisi).
NOT: Buradaki yatırım getirisi, işleme programına ilgi alanı anlamına gelir. Çoğu durumda, yatırım getirisi taranan görüntünün tamamı olacaktır. Bununla birlikte, limbüsün görüntülenmesi durumunda, prob sadece limbüsün görüntüsünü ayrı ayrı alamaz. Bu nedenle, Şekil 4'te çizildiği gibi limbus bölgesindeki floresan 'ölçmek' için bir yatırım getirisi çizilmelidir. Yatırım getirisini tutarlı tutmak için tüm görüntülerde aynı yatırım getirisini kullanın. - Yeşil floresan için yatırım getirisi değerlerini ölçün ve kaydedin. Değerleri elektronik tabloya girin. Yatırım getirisinin ortalama ve floresan yoğunluğu (a.u.) değerlerini tablola.
6. Histoloji değerlendirmesi
- Yerel IACUC tarafından onaylanan bir yöntem kullanarak fareyi ötenazi.
- Gözü enükle edin ve gözü bir gecede% 4 formaldehit veya% 10 formalin çözeltisinin 1 mL'sinde sabitle.
- Fazla yağları kesin ve gözü Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün ve en az bir gün boyunca -80 °C dondurucuda donmuş halde tutun.
- Kriyostattaki 5 μm kalınlığındaki kesme bölümleri ve kesme sıcaklığı 20 °C'de tutulur. Bölümü Poli-L-Lizin kaplı mikroskop kaydırağı ile aktarın.
NOT: Histoloji, DDS dağıtımının ek doğrulaması olarak hizmet edebilir. Bununla birlikte, çalışmanın CLM kullanarak azaltmayı amaçladığı ek optimizasyon, teknik uzmanlık ve hayvanların kurban edilmesi gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol, subkonjonktival enjeksiyon yoluyla uygulanan yeşil floresan lipozomların mekano-zamansal oküler dağılımını değerlendirmek için CLM'nin yararını göstermektedir. CLM sisteminin çift renkli yeteneğinden (488 nm ve 660 nm ekscitasyon dalga boyları) yararlanmak için, enjekte edilecek 100 nm nötr POPC lipozomlarına% 5 Fl-DHPE (kompozisyon ve karakterizasyon verileri Şekil 1B'de gösterilmiştir) ve EB'ye gözdeki yer işaretlerini tanımlamak için IV enjekte edildi. Her ikisi de yüksek oranda damarlı olan ince bir episklera tabakasının ve konjonktivanın varlığı, sklera bölgesinin EB ile kırmızıya boyanmasını sağlar (Şekil 4A, S olarak etiketlenir), herhangi bir vaskülat içermeyen kornea ise (Şekil 4A, C olarak etiketlenmiştir) leke almaz ve siyah görünür. Bu, floresan görüntüleme sırasında her iki bölge arasında belirgin bir farklılaşma sağlar.
Temsili sonuçlar 7 güne yayılan bir dağıtım çalışmasından elde edilir (n = 4 fare). 1. gün ve 3. gün için görüntülerdeki floresan yoğunlukları yüksek olduğu için (Şekil 5B), daha iyi görselleştirme için piksel yoğunlukları azaltıldı. Floresan yoğunluğunun gerçek değerleri grafiklere yansıtılır (Şekil 6). Görüntülerden gözlemlerin lipozomlardan kaynaklanan floresanlardan kaynaklandığından ve lipozomlardan yerinden fırlamış olabilecek serbest boyadan kaynaklanmamasını sağlamak için floresan (Fl) boyası enjekte edilen kontrol fareleri dahil edilmiştir (Şekil 5A).
Zamanla hem limbus hem de sklera bölgelerinde lipozomlarda (yeşil floresan sinyaldeki azalmanın vekili olarak) bir azalma gözlendi. Lipozomlar zamansaldan subkonjonktival uzayın üstün bölgesine enjekte edildiği için (Şekil 3), subkonjonktival uzayın diğer bölgelerine ulaşmadan önce doğal olarak temporal ve üstün skleranın (Şekil 4B) tam üstüne yerleştirilmiştir. Enjeksiyon sonrası 1. günde sklerada saptanan floresan hem zamansal hem de üstün bölgeler için limbustan 6 kat daha yüksekti (Şekil 6). 3. gün ve 7. sklerada (1. günden 3. güne (gün1→3) önemli bir lipozom azalması ve temporal bölgede 3. günden 7. güne (gün3→7)) %88 azalma gözlenirken, üstün bölgelerde gün1→3 ve gün3→7 için %66 ve %93 azalma gözlendi. sırasıyla, s < 0.001) (Şekil 6). Bu azalma konjonktiva ve episklerada bulunan kan ve/veya lenfatik damarlar yoluyla oküler boşluk mekanizmalarına bağlanmıştı. Lipozomlar da sklera boyunca yayılmış ve aynı zamanda oldukça damarlı olan koroid tarafından temizlenmiş olabilir.
Lipozomların uzuvlarda daha yavaş bir şekilde temizlenmiş olduğu bulunmuştur. Zamansal limbus ve üstün limbus için, enjeksiyon sonrası 1. günden 3. güne kadar floresan sinyallerindeki değişiklikler önemli değildi, bu da nötr lipozomların limbüs bölgesini, özellikle kornea çevresini tercih ettiğini gösteriyor (Şekil 5B). Limbus bölgesindeki lipozomlar 3. günden itibaren temize başladı (d3→7: zamansal için %-89 (p < 0.01) ve üstün için %-53 (p < 0.05)). 7. güne gelindiğinde, lipozomların% 50'sinin hala tespit edilebildiği üstün limbus 1S hariç tüm limbus bölgelerinden (p < 0.05) %90'dan fazlası temizlendi (p > 0.05). Bu, nötr lipozomlar için ikamet süresinin diğer bölgelere kıyasla üstün limbus/kornea periferinde (Şekil 5 ve Şekil 6) çok daha yüksek olduğunun bir göstergesidir. En düşük floresan miktarı burun ve alt bölgelerde enjeksiyon bölgesinden uzaklıkları nedeniyle tüm zaman noktalarında saptanmıştır (Şekil 6A,B).
Daha önce bildirilen gözdeki lipozomların temizlenmesi ile ilgili daha kapsamlı çalışmalarda1, lipozomların subkonjonktival enjeksiyondan sonra oküler dokulardan temizlenebileceği birkaç rotayı tartıştık. Lipozomlar, yüksek oranda damarsallaştırılmış konjonktiva, episklera ve koroid yoluyla sistemik dolaşım ve lenfatik boşluk ile temizlenebilirken, sklera yoluyla pasif difüzyon ile daha derin göz içi dokulara da ulaşabilirler. Sıvı akışı ayrıca lipozomları trabeküler meshwork veya uveosclera çıkışından taşıyabilir, bu da lipozomları skleraya geri getirebilir. Yırtıklarla eliminasyon da mümkündür ve enjeksiyon bölgesinde küçük sızıntılar pasif difüzyon yoluyla kornea penetrasyonuna izin verebilir.
Şekil 1: Göze lipozomların subkonjonktival enjeksiyonu. (A) Yeşil floresan lipozomların grafiksel gösterimi ve subkonjonktival enjeksiyon. (B) Oküler CLM Görüntüleme için FL-DHPE doped liposomal formülasyonunun bileşimi ve özellikleri. (C) Subkonjonktival enjeksiyon üzerine bleb oluşturan yeşil floresan lipozomlar. Bu rakam Chaw S.Y. ve ark.1'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Oküler CLM prosedürünün zaman çizelgesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CLM taramaları için göz haritası. Alan 1 limbus bölgesini, bölge 2 ise sklera bölgesini ifade eder. Videolar ve görüntüler 1T'den saat yönünün tersine, ardından 2T de saat yönünün tersine benzer bir yönde çekildi. İğne 2T'den 2S'ye enjeksiyon için sokulduğundan, ilgi alanları esas olarak 1T, 1S, 2T ve 2S'dir. Ekleme, sondanın fare gözüne göre boyutunu gösterir. Bu rakam Chaw S.Y. ve ark.1'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Görüntü Analizi. (A) Floresan etiketli lipozomların ImageJ analizi, lipozom varlığı için limbüs bölgesinde ölçülen limbus (L) ve sklera (S) (B) Oküler bölgeler için tanımlanan ilgi çekici bölgeler (ROI) kullanılarak yapılmıştır. Limbüste tespit edilen lipozomların olası yerleri 1) kornea çevresi, 2) limbus veya 3) sklera çevresidir. Bu rakam Chaw S.Y. ve ark.1'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Limbüs ve skleradaki kontrast dağılımları. Limbüste kontrast dağılımı (1S: Üstün, 1N: Burun, 1I: Alt, 1T: Temporal) ve sklera (2S: Superior, 2N: Nasal, 2I: Inferior, 2T: Temporal) bölgeleri her kohorttan bir temsili farenin (n=4) 7 gün boyunca (A) Floresan (Fl) kontrolü, (B) 100 nm nötr lipozomlar (POPC-100). Kırmızı renk EB boyama gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Çekilen görüntüler daha iyi anlaşılması için göz haritasında birleştirilir. Bu rakam Chaw S.Y. ve ark.1'in izniyle uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Sklera (A) ve limbus (B) bölgelerinde 7 gün boyunca 100 nm nötr POPC lipozomlarının temizleme kinetiği (grup başına n=4 fare). Ortalama floresan yoğunluğu, 2 yönlü ANOVA ile önceki zaman noktasına göre birden fazla karşılaştırma ile karşılaştırıldı; d1→3 ve d3→7; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Fl-DHPE lipozomlarının enjeksiyonundan bir gün sonra enine bölümlerin (5 μm) fare gözünün temsili histoloji görüntüleri. Noktalı çizgiler, yeşil renkle gösterilen lipozomların nerede gözlemlenebileceğini gösterir. Ölçek çubuğu = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sonuçlardan da anlaşılır gibi CLM, gözdeki lipozomların oküler dağılımını görüntüleyen basit ve uygulanabilir bir yöntem sağlar. Daha önce clm'nin fare gözü içindeki çeşitli lipozomal formülasyonların zaman içinde lokalizasyonunu karakterize etmek için kullanıldığını göstermiştik1. İstilacı olmayan uygulamalar için CLM, lipozomların aynı hayvandan göze nasıl dağıtıldığı hakkında bilgi için ön oküler yüzeyin gerçek zamanlı görüntülenmesini izin eder. Bu, CLM'yi daha kapsamlı nicelemeden önce nanokarrier/DDS ön taramaya uygun hale getirir. Çeşitli DDS'lerin benzersiz fizyokimyasal özellikleri göz önüne alındığında, alt bölme dağılımını geleneksel histoloji ile karakterize etmek oldukça zordur. İkincisi, DDS boşluğunun genel bir hissi için tüm gözün ve bireysel görüntüleme bölümlerinin floresan mikroskopi ile kapsamlı bir şekilde bölümlenilmesini gerektirir.
CLM görüntüleri ile anlaşmalı olarak (Şekil 5B,C), lipozomların enjeksiyonundan sonraki 1. günde toplanan gözün kornea, limbus ve sklera bölgelerinde histoloji tarafından yeşil floresan sinyaller gözlemleyebiliyorduk (Şekil 7). Özellikle, CLM floresan mikroskopiden daha iyi hassasiyet gösterdi - skleradaki lipozomlar CLM kullanılarak açıkça tespit edilebilirdi (Şekil 5) ancak floresan mikroskobu tarafından zar zor tespit edildi (Şekil 7). Sinyal kaybı, lipozomların doku bölümlerinde tutulmasını etkileyen yıkama ve bölümleme işlemlerinden kaynaklanabilir. CLM, lipozomların biriktiği tam doku tabakasını belirlemekle sınırlı olsa da, aday oküler terapötikleri gerçek zamanlı olarak invaziv olmayan bir şekilde taramak ve değerlendirmek kesinlikle uygulanabilir ve nispeten basit bir yöntemdir.
In vivo görüntüleme sistemleri ve florometreler gibi diğer görüntüleme sistemleri de gözdeki floresanların canlı görüntülenmesini veya canlı nicelleştirilmesini sağlarken, bu çalışmanın amacına uygun değildir. In vivo görüntüleme sistemleri, terapötiklerin oküler alanda nerede olduğunu tanımlamak için gereken mekansal çözünürlüğü sunmaz. Sadece in vivo görüntüleme sistemini kullanırken terapötiklerin oküler alanda hala bulunup bulunmadığı ve biyodistributionları hakkında bir fikir edinilebilir20. Bir florometre, gözün optik ekseni boyunca floresan ölçümüne izin verir ve gözdeki fizyolojik değişiklikleri incelemek için yaygın olarak kullanılır. Her zaman noktasında aynı optik eksenin taranmada zorluk yaşandığından, tutarlı bir görüntüleme noktası korunamaz. Bu, özellikle ikamet sürelerinin ve enjeksiyon bölgesinden temizleme oranının tamamen bilinmediği ilaç dağıtım sistemlerinin dağılımını incelerken çok önemlidir. Ayrıca, enjeksiyon bölgesi ve subkonjonktival enjeksiyon için beklenen dağılım da optik eksen aralığında değildir.
Protokoldeki kritik adımlar arasında Şekil 3'te gösterilen göz haritasına benzer bir görüntüleme haritasının kesinlikle takip edilmesi ve konumların doğru bir şekilde etiketlenerek etiketlenerek yer almaktadır. Yanlış etiketleme veya görüntüleme konumundan sapma, sonuçların tutarsızlığına neden olur. Lazer yoğunluğu her tarama için ayarlanabildiğinden, farklı zaman noktalarının karşılaştırılabilir olması için yoğunluğun tutarlı olması önemlidir. Sondanın görüntüleme işlemi sırasında enkazdan uzak tutulması da önemlidir. Görüntüleme sırasında göz mukusu probda yakalanabileceğinden, arka plan değerleri kullanıcı tanımlı değerin üzerine çıkarsa probun salin içinde durulabilmesi önerilir.
Subkonjonktival enjeksiyon dışında, bu CLM sistemi göz damlası uygulama ve intravitreal enjeksiyon (IVT) gibi diğer oküler doğum yollarını incelemek için de kullanılma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, görüntüleme derinliğindeki sınırlama nedeniyle, enjeksiyon bölgesi ve daha derin oküler dokular ana ilgi alanları ise IVT için yararlı olmayabilir. CLM, DDS'nin diğer organlarda veya dokularda dağılımını incelemek için bir intravital görüntüleme şekli olarak da kullanılabilir. DDS dağılımını incelemek için nadiren kullanılsa da, endoskopik konfokal mikroskopi periodontitis21'in neden olduğu iltihabı görüntülemek, pulmoner iltihabı ve enfeksiyonları izlemek22,23 ve tümörlerde ilaçların anjiogenez üzerindeki etkisini izlemek için kullanılmıştır24, bu clm sistemi için bir dizi olası uygulamayı gösterir.
Genel olarak, bu protokol, DDS formülasyonlarındaki değişikliklerin ikamet ettikleri veya birikdikleri yeri nasıl etkilediğini ve bunun bir DDS tasarımında kritik olabileceğini bulmak için bir tarama adımı olarak hizmet edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma, NTU-Northwestern Nanomedicine Enstitüsü (NNIN) hibesi tarafından (SV'ye) ve kısmen Singapur Ulusal Araştırma Vakfı Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/201 tarafından finanse edildi. 3/2 ve Singapur Sağlık ve Biyomedikal Bilimler (HBMS) Endüstri Uyum Fonu Ön Konumlandırma (IAF-PP) bilim ajansı tarafından yönetilen H18/01/a0/018 hibesi, Teknoloji ve Araştırma (A*STAR) (AMC'ye). Duke-NUS Çeviri ve Moleküler Görüntüleme Laboratuvarı (LTMI) üyelerine, çalışmaların ve ekipmanların lojistiğini ve yürütülmesini kolaylaştıran üyelere teşekkür ederiz. Bayan Wisna Novera'ya editöryal yardımı için özel teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G.
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
