Summary
Vi presenterer en protokoll for bruk av fiberoptisk konfokal lasermikroendoskopi (CLM) for ikke-invasivt å studere den romlige-temporale fordelingen av liposomer i øyet etter subkonjunktiv injeksjon.
Abstract
Subkonjunktival injeksjon er en attraktiv rute for å administrere okulære legemidler på grunn av enkel trans-scleral tilgang som omgår fremre okulære barrierer, som hornhinnen og konjunktivene. Mens terapeutiske effekter og farmakokinetikk av legemidler ved subkonjunktival injeksjon har blitt beskrevet i noen studier, svært få vurdere okulær distribusjon av narkotika eller narkotika levering systemer (DDS). Sistnevnte er kritisk for optimalisering av intraokulær DDS-design og legemiddelbiotilgjengelighet for å oppnå ønsket okulær lokalisering og virkningsvarighet (f.eks. akutt versus langvarig). Denne studien fastslår bruken av fiberoptisk konfomisk lasermikroendoskopi (CLM) for å kvalitativt studere okulær fordeling av fluorescerende liposomer i sanntid hos levende mus etter subkonjunktiv injeksjon. Å være designet for in vivo visuell inspeksjon av vev på mikroskopisk nivå, er dette også den første fullstendige beskrivelsen av CLM-avbildningsmetoden for å studere romlig-temporal fordeling av injeksjoner i øyet etter subkonjunktival injeksjon.
Introduction
Blodklarering, vevsfordeling og målbelegg for legemidler i levende systemer er pilarer for å forstå in vivo narkotika disposisjon. I prekliniske dyremodeller vurderes disse parametrene vanligvis ved hyppig blod- og vevsprøvetaking på bestemte tidspunkter etter legemiddeladministrasjon. Imidlertid er disse prosedyrene generelt invasive, inkluderer ofte ikke-overlevelsesmålinger, og nødvendiggjør store dyrekohorter for statistisk kraft. Det kan være ekstra kostnader og tid påløpt, sammen med etiske bekymringer for overdreven bruk av dyr. Som et resultat blir ikke-invasiv avbildning raskt et integrert skritt i biodistribusjonsstudier. Confocal lasermikroendoskopi (CLM1,2) er velegnet for okulære applikasjoner for ikke-invasivt bilde den romlige-temporale fordelingen av terapeutiske stoffer i øynene til levende dyr med høy følsomhet og høy oppløsning1,3,4.
CLM har potensial til å legge til rette for robust screening av okulære legemiddelleveringssystemer (DDS), som liposomer, før omfattende kvantifisering av DDS og legemiddelbiotilgjengelighet. Liposomer er attraktive for deres fleksibilitet i å justere sine fysisk-kjemiske og biofysiske egenskaper5,6,7,8,9,10,11 for å innkapsle et stort utvalg av terapeutisk last og kontrollere vevsstedet for legemiddelfrigjøring og virkningsvarighet. Liposomer har blitt brukt i okulære applikasjoner for levering av store molekyler, som det monoklonale antistoffet bevacizumab12, og små molekyler som ciklosporin13 og ganciclovir14. Legemiddelbelastede liposomer har lengre biologiske halveringstider og langvarige terapeutiske effekter sammenlignet med ikke-liposomale "frie legemiddel" formuleringer. Imidlertid er narkotikafordeling i okulært vev vanligvis ekstrapolert fra legemiddelkonsentrasjoner i flytende komponenter i øyet (dvs. blod, vandig humor og glasslegemet humor15,16,17). Som den første in vivo skjebnen til den ladde narkotika lasten er definert av egenskapene til nanocarrier selv, CLM avbildning av fluorescerende liposomer kan tjene som en surrogat for stoffet for å avsløre vev målretting og in situ vev oppholdstider. Videre kan visuelle bevis på levering med CLM styre DDS-re-design, evaluere terapeutiske fordeler ved stoffet, og kanskje til og med forutsi negative biologiske hendelser (f.eks. vevstoksisitet på grunn av uønsket lokalisering av DDS i lengre perioder).
Heri er en trinnvis prosedyre detaljert om hvordan du studerer okulær biodistribusjon av liposomer hos levende mus med et dual-band CLM-system. Dette spesifikke CLM-systemet kan oppdage tofarget fluorescens (med grønne og røde eksitasjonslasere på 488 nm og 660 nm) i sanntid, med en frekvens på 8 bilder/s. Ved å fysisk plassere deteksjonssonden på øyet, demonstrerer protokollen bildeanskaffelse og analyse av grønn-fluorescerende liposomer ved underleverandøradministrasjon hos mus pre-injisert intravenøst (IV) med 2% Evans Blue (EB) fargestoff. EB-fargestoff bidrar til å visualisere de vaskulære strukturene i den røde fluorescenskanalen. Vi viser representative resultater fra en studie som vurderer 100 nm nøytrale liposomer sammensatt av fosfolipid POPC (dvs. 1-palmitoyl-2-oleoyl-glysero-3-fosfocholine) og dopet med fluoresceinmerket fosfolipid Fl-DHPE (dvs. N-(fluorescein-5-tiocarbamoyl)-1,2-dihexa-decanoylsn-glysero-3-fosfoetanolamin) med et forhold på 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Figur 1B ). CLM er i stand til å fange de grønne fluorescein-taggede liposomene ved 15 μm aksial og 3,30 μm lateral oppløsning ved avgrensning av EB-farget okulære vevsgrenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved SingHealth (Singapore). Kvinnelige C57BL/6 J-mus (6-8 uker gamle; 18-20 g) ble hentet fra InVivos, Singapore, og ligger i en temperatur og lyskontrollert vivarium av Duke-NUS Medical School, Singapore. Dyr ble behandlet i henhold til retningslinjene fra Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalelse for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.
MERK: Et flytskjema som fremhever hovedprosedyrene, vises i figur 2.
1. Forberedelse av kontrastmidler: Evans Blue (EB) og liposomer
- For 2% EB fargestoffoppløsning, oppløs 1 g EB i 50 ml steril saltvann. Filtrer oppløsningen ved hjelp av 0,22 μm filtre i 1,5 ml sterile rør og oppbevar dem ved romtemperatur for senere bruk.
- For grønn-fluorescerende liposomer, tilsett POPC/Fl-DHPE (95:5), kloroform/metanol (2:1) i en 100 ml rund bunnflaske. Bruk en roterende fordamper ved 150 o/min ved 40 °C i 1 time, med vakuum opprettholdt ved 0 mbar1 for å lage en tynn lipidfilm.
MERK: Når du sammenligner effekter av liposomale egenskaper (f.eks. størrelse, ladning, lipidmetning, lipidkjedelengde) på distribusjon, opprettholde en fast prosentandel av Fl-DHPE eller andre fluorescerende lipider for å bekrefte at de observerte resultatene skyldes effekten av egenskapene som er testet, og ikke til den variable belastningen av store hydrofobe fargestoffer. - Hydrater lipidfilmen med fosfatbufret saltvann (for å oppnå 26,3 mM fluorescerende liposomer) ved 40 °C for å danne multi-lamellar vesicles (MLV). Legg MLVene i en glasssprøyte for manuell ekstrudering (30 ganger ved hjelp av et polykarbonatfilter av 0,08 μm porestørrelse) for å oppnå ønsket størrelse på 100 nm.
MERK: Temperaturen for hydrering må være høyere enn overgangstemperaturen til lipidene. - Filtrer liposomene ved å sende dem gjennom et sterilt sprøytefilter på 0,22 μm. Bekreft liposomenes hydrodynamiske diameter (DH) ved hjelp av et dynamisk lysspredningssystem.
2. Administrering av EB og liposomer hos levende mus
- Injiser musen med EB IV (intravenøs) via halevenen (2,5 mg/kg), 2 timer før subkonjunktiv injeksjon.
- For subkonjunktival injeksjon, først, sedate musen ved hjelp av 5% isofluran via innånding i et induksjonskammer for å oppnå et tilstrekkelig plan av anestesi. Overfør musen til en nesekjegle og opprettholde sedasjon ved 2%-2,5% isofluran mens du er på en varmepute gjennom hele prosedyren.
- Trim whiskers nær øyet som skal injiseres og innpode en dråpe aktuell bedøvelse 0,5% proxymetacaine hydrokloridoppløsning direkte på øyet.
- Legg en 10 μL glasssprøyte (med 32 G nål) med fluorescerende liposomer (Fl-DHPE: 0,78 mg/kg) og avstøt alle luftbobler i sprøyten før injeksjon.
MERK: Opptil 20 μL injektat kan innkvarteres i underleverandørrommet til mus18,19. - Bruk en pinsett til å løfte konjunktivene litt og injiser sakte i underleverandørrommet (figur 1A). Trekk kanylen langsomt ut for å hindre tilbakestrømning. Påse at det dannes en synlig bleb fylt med fluorescerende liposomer (figur 1C).
- Administrer en dråpe antibiotika 1% fusidisk syre på øyet etter injeksjonen og overvåk musen til den gjenvinner bevisstheten.
3. CLM-oppsett
- Slå på CLM-systemet og kontroller at både kontakten og den distale spissen på skannesonden er rene.
- Rengjør kontakten på skannesonden ved hjelp av en optisk kontaktrenser ved å følge produsentens anvisninger.
- Trykk på rachet (ofte farget) på den optiske kontaktrenseren for å vise et rengjøringsbånd.
- Plasser koblingen i kontakt med rengjøringsbåndet, og skyv koblingen langs båndet samtidig som du opprettholder kontakten.
- Rengjør probens distale spiss (også kjent som skannespissen) ved å dyppe den i renseløsningen, etterfulgt av skylleløsningen fra produsenten. En bomullsspissapplikator kan også brukes til grundigere rengjøring hvis spissen er veldig skitten.
- Koble sonden til CLM-systemet. Velg synsfelt (FOV) og plasseringen for anskaffelsesfilene på dette tidspunktet.
MERK: Juster laserintensiteten på dette trinnet for å sikre at fluorescensdeteksjon for Fl-DHPE er i det lineære området. Laserintensiteten skal holdes konsistent for sammenligning mellom bilder tatt på forskjellige tidspunkter. - La systemet varmes opp i 15 minutter som instruert, og bruk kalibreringssettet til å kalibrere systemet i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: I kalibreringssettet er det tre hetteglass for hver laser som inneholder følgende løsninger: renseløsning, skylleløsning og fluorofor 488/660 nm løsning for intern kalibrering. Kalibreringstrinnene blir bedt om av systemet og skal følges deretter.- Senk spissen ned i hetteglasset med rensing etterfulgt av skylle hetteglasset (5 s i hvert hetteglass). La det stå i luften for bakgrunnsopptak for begge kanaler.
MERK: Dette trinnet er veldig avgjørende da det normaliserer bakgrunnsverdiene fra forskjellige fibre i sonden og sikrer bildeuniformitet. - Senk spissen ned i hetteglasset med rensing etterfulgt av skylle hetteglasset (5 s i hvert hetteglass). Senk spissen ned i fluorofor 488 nm hetteglass i 5 sekunder for å normalisere signalverdier fra forskjellige fibre i sonden.
- Senk spissen ned i hetteglasset med rensing etterfulgt av skylle hetteglasset (5 s i hvert hetteglass). Senk spissen ned i skyllehette hetteglasset til fluorescenssignalet som er registrert i 3.5.2. Forsvinner. Senk spissen ned i fluorofor 660 nm hetteglass for å normalisere signalverdier fra forskjellige fibre i sonden.
MERK: Følg alle kalibreringstrinnene for å oppnå riktig kalibrering og optimal bildekvalitet.
- Senk spissen ned i hetteglasset med rensing etterfulgt av skylle hetteglasset (5 s i hvert hetteglass). La det stå i luften for bakgrunnsopptak for begge kanaler.
- Når proben er kalibrert, må du kontrollere at bakgrunnsverdiene for sondene er så lave som mulig. Hold bakgrunnsverdiene under 100 for CLM-systemet som brukes. Utfør gjentatt rengjøring av sonden med en bomullsspissapplikator og kalibrering hvis verdiene er over 100/definert brukerverdi, eller hvis sonden ser ut til å være skitten. Dette for å sikre at bakgrunnsstøyen holdes rundt samme verdi.
MERK: Det er viktig å definere den maksimale bakgrunnsverdien (for eksempel 100 som angitt i trinn 3.6) for å sikre at probeforholdene er like. Dette vil tillate riktig kvantitativ sammenligning mellom bilder tatt på forskjellige tidspunkter. Verdien kan variere i forskjellige systemer og sondeforhold. - Slå på dyretemperaturregulatoren (ATC). Juster ATC til 37 °C. Dekk varmeputen med en kirurgisk gardin og fest nesekjeglen på varmeputen.
MERK: ATC med en vedlagt varmepute er nødvendig for å sikre at dyret holdes varmt gjennom bildebehandlingsvarigheten. - Klem stativet på dissekeringsmikroskopet til bordplaten for å feste det. Roter og juster mikroskopets okular for å se museøyet ergonomisk gjennom okularet når brukeren sitter (gjør justeringene etter at du har plassert dyret).
- Sedate musen ved hjelp av 5% isofluran i et induksjonskammer. Overfør musen til nesekjeglen når dyret ikke er responsivt og opprettholde sedasjon ved 2%-2,5% isofluran mens du er på en varmepute gjennom hele prosedyren.
- Trim musens whiskers og innpod en dråpe bedøvelse 0,5% proxymetacaine hydrokloridoppløsning på øyet.
- For å sikre at øynene er rene, slipp noen dråper saltvann for å vaske okulær overflate.
- Juster mikroskopet slik at museøyet er i direkte fokus ved 0,67x forstørrelse.
MERK: Sørg for å smøre øynene med saltvann. Hvis øynene ikke smøres gjennom bildebehandlingsøkten, kan de bli tørre, noe som får linsen til å krystallisere seg. Som et resultat, under CLM-avbildning, kan linsen avgi en bakgrunnsrød fluorescens.
4. Live bildebehandling av museøyne med CLM og oppkjøp
- Slå på laseren, plasser sonden på øyet og begynn å registrere oppkjøp for å observere fluorescensen i øyet i områdene som er angitt på øyekartet i figur 3.
MERK: Hold sonden som en penn med den distale enden av sonden direkte på regionen som skal avbildes. - Stopp innspillingen når alle områder er flagget og merket. Anskaffelsesfilene lagres automatisk på filplasseringen som ble valgt i trinn 3.4.
MERK: Filen lagres som en videofil som kan eksporteres til individuelle bilder. Merk flagget i henhold til øyekartet for å vite nøyaktig plasseringen av sonden på den nøyaktige rammen opptaket ble gjort.
5. Bildeanalyse
- Bruk den samme CLM-anskaffelsesprogramvaren til å eksportere bildeanskaffelsesfilene for videre analyse. Klikk på Fil | Eksporter og velg formatet det skal eksporteres til. Mkt-formatfiler vil tillate justeringer av oppslagstabell (LUT) og videre eksport til bildefilformater ved hjelp av CLM-visningsprogrammet.
- For nøyaktig sammenligning av fluorescensintensitet, bruk samme LUT justert for hver kanal når du eksporterer alle bildefiler.
MERK: Velg minimum og maksimum LUT-terskel med hensyn til kontrollmusens (uten liposomer injisert) for å minimere bakgrunnsfluorescensavlesninger. - Åpne bildet i et passende bildebehandlingsprogram/freeware-program (f.eks. Tegn interesseområdet (ROI).
MERK: Avkastningen her refererer til regionen av interesse for behandlingsprogrammet. I de fleste tilfeller vil avkastningen være hele bildet skannet. Men når det gjelder avbildning av limbusen, kan sonden ikke bare få bildet av limbusen separat. Derfor må en avkastning trekkes for å "kvantifisere" fluorescensen i limbussområdet, som trukket i figur 4. For å holde avkastningen konsistent, bruk den samme avkastningen på tvers av alle bilder. - Mål og registrer avkastningsverdiene for grønn fluorescens. Skriv inn verdiene i et regneark. Tabuler gjennomsnitts- og fluorescensintensitetsverdiene (a.u.) for avkastningen.
6. Histologi vurdering
- Euthanize musen ved hjelp av en metode godkjent av den lokale IACUC.
- Enucleate øyet og fikse øyet i 1 ml av 4% formaldehyd eller 10% formalin løsning over natten.
- Trim overflødig fett og legg inn øyet i optimal skjæretemperatur (OCT) sammensatte og hold det frosset i en -80 ° C fryser i minst en dag.
- Klipp seksjoner på 5 μm tykkelse i kryostaten med skjæretemperatur opprettholdt ved 20 °C. Overfør delen til et Poly-L-Lysine-belagt mikroskopsklie.
MERK: Histologi kan tjene som ytterligere validering av distribusjonen av DDS. Det krever imidlertid ytterligere optimalisering, teknisk ekspertise og offer av dyr som studien tar sikte på å redusere ved å bruke CLM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen demonstrerer nytten av CLM for å vurdere den romlige-temporale okulære fordelingen av grønne fluorescerende liposomer administrert gjennom subkonjunktival injeksjon. For å benytte seg av den doble fargekapasiteten (488 nm og 660 nm eksitasjonsbølgelengder) av CLM-systemet, ble 100 nm nøytrale POPC-liposomer som skulle injiseres dopet med 5% Fl-DHPE (komposisjons- og karakteriseringsdata vises i figur 1B), og EB ble injisert IV for å identifisere landemerker i øyet. Tilstedeværelsen av et tynt lag episclera og konjunktivene, som begge er svært vaskulære, gjør at sclera-regionen kan farges rødt med EB (figur 4A, merket som S), mens hornhinnen som ikke inneholder vaskulatur (figur 4A, merket som C), ikke blir farget og vises svart. Dette muliggjør en tydelig differensiering mellom begge regionene under fluorescensavbildning.
De representative resultatene er fra en distribusjonsstudie som strekker seg over 7 dager (n = 4 mus). Ettersom fluorescensintensitetene i bildene for dag 1 og dag 3 var høye (figur 5B), ble pikselintensitetene redusert for bedre visualisering. Faktiske verdier av fluorescensintensiteten gjenspeiles i grafene (figur 6). For å sikre at observasjoner fra bildene skyldtes fluorescens fra liposomene og ikke fri fargestoff, som kan ha løsnet fra liposomene, ble kontrollmus injisert med fluorescein (Fl) fargestoff inkludert (figur 5A).
En reduksjon i liposomer (ved proxy av nedgangen i grønt fluorescerende signal) ble observert i både limbuss- og sclera-regionene over tid. Da liposomene ble injisert fra det tidsmessige til det overordnede området i underleverandørrommet (figur 3), ble de naturlig plassert rett på toppen av den tidsmessige og overlegne scleraen (figur 4B) før de nådde andre regioner i underleveranserommet. På dag 1 etter injeksjon var fluorescens påvist i sclera opptil 6 ganger høyere enn limbussen for både tidsmessige og overlegne regioner (figur 6). Ved dag 3 og dag 7 ble det observert en betydelig reduksjon av liposomer i sclera (60% fra dag 1 til dag 3 (dag1→3) og 88% fra dag 3 til dag 7 (dag3→7)) i den tidsmessige regionen, med en reduksjon på 66% og 93% for dag1→3 og dag3→7 i de overlegne områdene, henholdsvis p < 0,001) (figur 6). Denne reduksjonen ble tilskrevet okulære klaringsmekanismer gjennom blod og/ eller lymfatiske kar som finnes ved konjunktivene og episcleraen. Liposomene kunne også ha diffusert gjennom scleraen og blitt ryddet av choroiden, som også er svært vaskulær.
Liposomene ble funnet å ha ryddet på en langsommere måte i limbusen. For temporal limbuss og overlegen limbuss var endringene i fluorescenssignaler fra dag 1 til dag 3 etter injeksjon ikke signifikante, noe som indikerer at nøytrale liposomer har en preferanse til limbusområdet, spesielt hornhinnen periferi (figur 5B). Liposomer i limbussområdet begynte å rydde fra dag 3 (d3→7: -89% for temporal (p < 0,01) og -53% for overlegen (p < 0,05)). Ved dag 7 ble mer enn 90% av liposomer fjernet fra alle limbussregioner (p < 0,05) bortsett fra overlegen limbus 1S, hvor 50% av liposomer fortsatt kunne oppdages (p > 0,05). Dette er en indikasjon på at oppholdstiden for nøytrale liposomer er mye høyere ved den overlegne limbus/ hornhinnen periferi (figur 5 og figur 6) sammenlignet med andre regioner. Den laveste mengden fluorescens ble påvist i nese- og dårligere områder til enhver tid på grunn av avstanden fra injeksjonsstedet (figur 6A,B).
I mer omfattende studier av clearance av liposomer i øyet tidligere rapportert1, har vi diskutert noen få ruter der liposomer kan fjernes fra okulært vev etter subkonjunktiv injeksjon. Mens liposomer kan ryddes ved systemisk sirkulasjon og lymfatisk klaring gjennom konjunktivene, episclera og choroid, som er svært vaskulære, kan de også nå dypere intraokulært vev ved passiv diffusjon gjennom sclera. Væskestrøm kan også transportere liposomene gjennom trabecular meshwork eller uveosclera utstrømning, som kan bringe liposomene tilbake til sclera. Eliminering gjennom tårer er også mulig, og mindre lekkasjer på injeksjonsstedet kan tillate hornhinnen penetrasjon gjennom passiv diffusjon.
Figur 1: Subkonjunktiv injeksjon av liposomer i øyet. (A) Grafisk fremstilling av grønn-fluorescerende liposomer og subkonjunktiv injeksjon. (B) Sammensetning og egenskaper av FL-DHPE doped liposomal formulering for okulær CLM Imaging. (C) Grønn-fluorescerende liposomer danner en bleb ved subkonjunktival injeksjon. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Chaw S.Y. et al.1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tidslinje for okulær CLM-prosedyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Øyekart for CLM-skanninger. Område 1 refererer til limbusområdet, mens område 2 refererer til sclera-regionen. Videoer og bilder ble tatt fra 1T i retning mot klokken, etterfulgt av 2T i en lignende retning mot klokken. Ettersom nålen ble satt inn for injeksjon fra 2T mot 2S, er interesseområder hovedsakelig 1T, 1S, 2T og 2S. Sett inn viser størrelsen på sonden i forhold til museøyet. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Chaw S.Y. et al.1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bildeanalyse. (A) ImageJ-analyse av fluorescerende taggede liposomer ble gjort ved hjelp av interesseområder (ROI) definert for limbus (L) og sclera (S) (B) Okulære regioner kvantifisert ved limbusområdet for liposom tilstedeværelse. Mulige steder av liposomer oppdaget i limbus er 1) hornhinnen periferi, 2) limbus eller 3) sclera periferi. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Chaw S.Y. et al.1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kontrastfordelinger ved limbussen og sclera. Kontrastfordeling på limbussen (1S: Superior, 1N: Nasal, 1I: Inferior, 1T: Temporal) og sclera (2S: Superior, 2N: Nasal, 2I: Inferior, 2T: Temporal) regioner av en representativ mus fra hver kohort (n = 4) over 7 dager for (A) Fluorescein (Fl) kontroll, (B) 100 nm nøytrale liposomer (POPC-10). Rød farge indikerer EB-flekker. Skalalinje = 50 μm. (C) Bilder tatt er montert på øyekartet for bedre forståelse. Dette tallet er tilpasset med tillatelse fra Chaw S.Y. et al.1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Clearance kinetikk på 100 nm nøytrale POPC liposomer ved sclera(A) og limbus (B) regioner over 7 dager (n = 4 mus per gruppe). Gjennomsnittlig fluorescensintensitet ble sammenlignet med 2-veis ANOVA med flere sammenligninger med hensyn til forrige tidspunkt; d1→3 og d3→7; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Representative histologibilder av tverrgående seksjoner (5 μm) av museøyet en dag etter injeksjon av Fl-DHPE liposomer. Stiplede linjer angir hvor liposomene kan observeres, indikert med grønn farge. Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som vist fra resultatene, gir CLM en enkel og gjennomførbar metode for å avbilde okulær fordeling av liposomer i øyet. Vi har tidligere demonstrert bruken av CLM for å karakterisere lokaliseringen av ulike liposomale formuleringer i museøyet over tid1. For ikke-invasive applikasjoner tillater CLM sanntidsavbildning av den fremre okulære overflaten for innsikt i hvordan liposomer fordeles i øyet fra samme dyr. Dette gjør CLM egnet for pre-screen nanocarrier /DDS før mer omfattende kvantifisering. Gitt de unike fysiokjemiske egenskapene til mangfoldig DDS, er det ganske utfordrende å karakterisere sin underromsfordeling ved konvensjonell histologi. Sistnevnte ville kreve uttømmende seksjonering av hele øyet og individuelle bildeseksjoner ved fluorescensmikroskopi for en generell følelse av DDS-clearance.
I samsvar med CLM-bilder (figur 5B,C) kunne vi observere grønne fluorescerende signaler ved histologi ved hornhinnen, limbus- og sclera-områdene i øyet samlet på dag 1 etter injeksjon av liposomene (figur 7). Spesielt viste CLM bedre følsomhet enn fluorescerende mikroskopi - liposomer på sclera kunne tydelig oppdages ved hjelp av CLM (figur 5), men knapt oppdaget av fluorescensmikroskopet (figur 7). Signaltapet kan skyldes vaske- og seksjonsprosedyrene som påvirket oppbevaringen av liposomer i vevsseksjoner. Selv om CLM er begrenset til å finne det eksakte vevslaget der liposomene akkumuleres, er det definitivt en gjennomførbar og relativt grei metode for å screene og vurdere kandidaten okulære terapeutiske stoffer ikke-invasivt i sanntid.
Mens andre bildesystemer som in vivo-bildesystemer og fluorometre også muliggjør levende avbildning eller levende kvantifisering av fluorescens i øyet, er de ikke like egnet for formålet med denne studien. In vivo bildesystemer tilbyr ikke den romlige oppløsningen som kreves for å definere hvor terapeutiske er i det okulære rommet. Man kan bare få en ide om terapeutiske er fortsatt til stede i okulært rom og deres biodistribusjon ved bruk av in vivo bildebehandlingssystem20. Et fluorometer tillater måling av fluorescens langs øyets optiske akse og er mye brukt til å studere fysiologiske endringer i øyet. Siden det er vanskeligheter med å skanne nøyaktig samme optiske akse på hvert tidspunkt, kan ikke et konsekvent bildepunkt opprettholdes. Dette er svært avgjørende, spesielt når man studerer distribusjonen av legemiddelleveringssystemer der deres oppholdstid og clearance rate fra injeksjonsstedet er helt ukjent. Videre er injeksjonsstedet og fordelingen som forventes for subkonjunktival injeksjon heller ikke innenfor rekkevidden til den optiske aksen.
Kritiske trinn i protokollen inkluderer strengt å følge et bildekart som ligner på øyekartet som vises i figur 3 og merke stedene nøyaktig. Feilmerking eller avvik fra bildeplassering vil føre til inkonsekvens i resultatene. Siden laserintensiteten kan justeres for hver skanning, er det viktig at intensiteten er konsistent for at kvantifiseringen av ulike tidspunkter skal være sammenlignbar. Det er også viktig at sonden holdes fri for rusk under bildebehandlingsprosessen. Siden øyeslim kan bli fanget på sonden under avbildning, anbefales det å skylle sonden i saltvann hvis bakgrunnsverdiene stiger over den brukerdefinerte verdien.
Bortsett fra subkonjunktival injeksjon, har dette CLM-systemet også potensial til å bli brukt til å studere andre okulære leveringsruter som øyedråpeadministrasjon og intravitreal injeksjon (IVT). På grunn av begrensningen i bildedybden kan det imidlertid ikke være like nyttig for IVT hvis injeksjonsstedet og dypere okulært vev er de viktigste interesseområdene. CLM kan også brukes som en form for intravital avbildning for å studere fordelingen av DDS i andre organer eller vev. Selv om det sjelden har vært brukt til å studere DDS-distribusjon, har endoskopisk konfokal mikroskopi blitt brukt til å avbilde betennelse forårsaket av periodontitt21, overvåke lungebetennelse og infeksjoner22,23 og effekt av legemidler på angiogenese i svulster24, noe som indikerer en rekke andre mulige applikasjoner for dette CLM-systemet.
Totalt sett kan denne protokollen fungere som et screeningtrinn for å finne ut hvordan endringer i DDS-formuleringer påvirker hvor de bor eller akkumuleres, noe som kan være kritisk i utformingen av et DDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) stipend tildelt (til SV) og delvis av Singapore National Research Foundation Grant AG/CIV/GC70-C/NRF/2013 /2 og Singapores helse- og biomedisinske vitenskap (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) gir H18/01/a0/018 administrert av Agency for Science, Teknologi og forskning (A*STAR) (til AMC). Takk til medlemmer fra Duke-NUS Laboratory for Translational and Molecular Imaging (LTMI) for å legge til rette for logistikk og gjennomføring av studier og opplæring på utstyr. Spesiell takk til Ms. Wisna Novera for hennes redaksjonelle hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G.
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
