Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Induktion der Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) bei Mäusen. Diese Methode beschreibt die Schritte, um eine zuverlässige und robuste Augenentzündung im Mausmodellsystem zu erzeugen. Mit diesem Protokoll erzeugten wir uveitische Augen und entzündete Augengenossen von einzelnen Tieren zur weiteren Auswertung mit immunologischen, transkriptomischen und proteomischen Assays.
Abstract
Der Begriff "Uveitis" beschreibt eine heterogene Reihe von Erkrankungen, die alle eine intraokulare Entzündung aufweisen. Im Großen und Ganzen wird Uveitis durch Ätiologie definiert: Infektion oder Autoimmunität. Infektiöse Uveitis erfordert eine Behandlung mit den entsprechenden antimikrobiellen Wirkstoffen, während Autoimmun-Uveitis eine Behandlung mit Kortikosteroiden oder anderen Immunsuppressiva erfordert. Postinfektiöse Uveitis ist eine Form der chronischen Uveitis, die Kortikosteroide benötigt, um die Immunfolge nach der Erstinfektion zu kontrollieren. Uveitis im Zusammenhang mit Mycobacterium tuberculosis (Mtb) -Infektion ist eine bekannte Form der postinfektiösen Uveitis, aber die Mechanismen der Krankheit sind nicht vollständig verstanden. Um zu verstehen, welche Rolle mykobakterielle Antigene und angeborene Liganden bei der Stimulierung chronischer Augenentzündungen nach mTB-Infektion spielen, wurde das Modell Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) für den Einsatz bei Mäusen entwickelt. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Erzeugung von PMU und zur Überwachung des klinischen Entzündungsverlaufs mittels Farbfundus und optischer Kohärenztomographie (OCT). PMU wird durch Immunisierung mit hitzeabgetötetem Mykobakterienextrakt induziert, gefolgt von einer intravitrealen Injektion desselben Extrakts in ein Auge sieben Tage später. Die Augenentzündung wird longitudinal mittels In-vivo-Bildgebung überwacht und anschließend für eine Vielzahl von Assays entnommen, einschließlich Histologie, Durchflusszytometrie, Zytokinanalyse, qPCR oder mRNA-Sequenzierung. Das Mausmodell der PMU ist ein nützliches neues Werkzeug für die Untersuchung der okulären Reaktionen auf mTB, den Mechanismus der chronischen Uveitis und für präklinische Wirksamkeitstests neuer entzündungshemmender Therapien.
Introduction
Der Begriff "Uveitis" beschreibt eine heterogene Reihe von Erkrankungen, die alle eine intraokulare Entzündung aufweisen1. Tiermodelle der Uveitis sind wichtig für das Verständnis von Krankheitsmechanismen und für die präklinische Erprobung neuer Therapien. Eine Reihe von Tiermodellen der Uveitis wurde etabliert2. Die beiden, die am ausführlichsten untersucht wurden, sind experimentelle Autoimmun-Uveitis (oder Uveoretinitis; EAU) und Endotoxin-induzierte Uveitis (EIU). EAU wird typischerweise durch Immunisierung mit okulären Antigenen erzeugt oder kann spontan auftreten, wenn die zentrale Toleranz in Abwesenheit des AIRE-Gens 3,4 gestört ist. Andere Varianten des Modells wurden seitdem entwickelt 5,6,7, um verschiedene uveitogene Peptide einzuschließen; Diese wurden ausführlich überprüft 8,9,10. EAU ist das primäre Modell für Formen der T-Zell-abhängigen autoimmunen Uveitis wie Vogt-Koyanagi-Harada-Krankheit und Vogelschrot-Chorioretinitis beim Menschen. EIU wird durch systemische oder lokale Injektion von bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS)10,11 erzeugt. EIU wurde als Modell für akute Uveitis verwendet, die durch Aktivierung angeborener Immunsignalwege erzeugtwird 12. Beide Modelle waren entscheidend für das aktuelle Verständnis der okulären Immunologie, aber beide sind keine wirksamen Modelle für postinfektiöse chronische Uveitis. Das kürzlich an Mäusen etablierte Modell der Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) bietet nun einen Ansatz, um klinische und zelluläre Aspekte dieser Form der Uveitis zu untersuchen undzu bewerten 13.
Weltweit gibt es eine hohe Prävalenz von mykobakteriellen Infektionen, mit über 10 Millionen neuen Fällen und mehr als 1,4 Millionen Todesfällen, die von der Weltgesundheitsorganisation im Jahr 2019 gemeldet wurden14. Die extrapulmonale Manifestation der aktiven Tuberkulose (TB) -Infektion umfasst Uveitis und ist eine bekannte Ursache für infektiöse Uveitis15,16. Die Manifestationen der TB-assoziierten Uveitis sind protean, was wahrscheinlich mehrere unterschiedliche Krankheitsmechanismen widerspiegelt, einschließlich einer direkten Augeninfektion sowie einer weniger gut verstandenen immunvermittelten Entzündung17,18,19. Die vorgeschlagenen Mechanismen für diese postinfektiösen Folgeerkrankungen umfassen eine chronische Entzündungsreaktion, die durch die Persistenz einer pauci-bazillären Infektion im retinalen Pigmentepithel (RPE) stimuliert wird, eine chronische Entzündungsreaktion, die durch das Vorhandensein von verbleibenden pathogenassoziierten molekularen Mustern (PAMPs) aus einer erfolgreich beseitigten Augeninfektion stimuliert wird, und eine unangemessene Aktivierung der adaptiven Immunantwort gegen okuläre Antigene durch einen Prozess der molekularen Mimikry oder des Antigens. Ausbreitung durch systemische TB-Infektion20,21,22,23.
Um ein besseres mechanistisches Verständnis der chronischen postinfektiösen Uveitis zu erlangen und die Rolle von mykobakteriellen Antigenen bei der Entstehung von Krankheiten zu untersuchen, wurde das PMU-Modell für den Einsatz bei Mäusenentwickelt 13,24. Um eine Entzündung auszulösen, erhält die Maus zunächst eine subkutane Injektion von Antigen aus dem hitzeabgetöteten Mycobacterium tuberculosis H37Ra-Stamm, um eine systemische Infektion nachzuahmen, gefolgt von einer intravitrealen Injektion desselben Antigens, das dem linken oder rechten Auge verabreicht wird, um eine lokale Augeninfektion nachzuahmen. Intensität und Dauer der anschließenden Uveitis werden durch longitudinale in vivo optische Kohärenztomographie (OCT) und Fundalbildgebung des Auges überwacht25. PMU ist gekennzeichnet durch eine akute, myeloid-dominante Panuveitis, die sich zu einer chronischen T-Zell-dominanten posterioren Uveitis mit Vitritis, perivaskulärer Netzhautentzündung und fokalen Bereichen der äußeren Netzhautschädigung entwickelt26. Das Vorhandensein einer granulomatösen Entzündung im hinteren Augensegment legt nahe, dass das PMU-Modell verwendet werden kann, um einige Formen der anterioren (granulomatösen und nicht-granulomatösen) und intermediären Uveitis zu untersuchen, die bei Patienten mit immunologischen Hinweisen auf eine frühere Mtb-Infektion beobachtetwerden 27. Darüber hinaus wurde vorgeschlagen, dass die Komponenten des wärmeabgetöteten Mtb, die im PMU-Modell verwendet werden, Immunantworten auslösen, die den Aspekten der rezidivierenden Uveitis bei Patienten mit Augentuberkulose zugrunde liegen, die auf eine antituberkulöse Therapie (ATT) ansprechen28. Aufgrund der Unterschiede in Krankheitsbeginn und Entzündungsverlauf im Vergleich zu EAU und EIU stellt PMU ein neues Tiermodell der Uveitis dar, das nicht von der Immunisierung mit okulären Antigenen abhängig ist und helfen kann, Krankheitsmechanismen bei Patienten mit chronischer Uveitis aufzuklären. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Erzeugung von PMU, zur Überwachung des klinischen Entzündungsverlaufs und zur Entnahme von Augenproben für die Post-Mortem-Analyse mit Durchflusszytometrie.
Protocol
Alle durchgeführten Verfahren wurden vor Ort vom Animal Care and Use Committee der University of Washington (Tierstudienprotokoll # 4481-02) oder in Übereinstimmung mit der Lizenz des britischen Innenministeriums (PPL 30/3281) und der University of Bristol Ethical Review Group genehmigt. Die an beiden Institutionen durchgeführten Experimente stimmten mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der ophthalmologischen und visuellen Forschung überein. PMU wurde in 6-10 Wochen alten C57BL/6J-Mäusen erzeugt; Alle Mäuse wogen zum Zeitpunkt der Uveitis-Induktion mindestens 18 g und wurden negativ für die RD8-Mutation des Crb1-Gensbestätigt 29. Die Mäuse wurden mit Standard-Chow und medizinischem Wasser (Paracetamol 200-300 mg/kg/Tag) ad libitum unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Die Tiereuthanasie wurde mit einer Standard-Kohlendioxid-Inhalationsmethode30 durchgeführt.
1. Antigenpräparat zur subkutanen Injektion
- Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt in einem chemischen Abzug durch, um das Einatmen oder den Hautkontakt mit dem Mtb H37Ra-Pulver zu verhindern. Behandeln Sie gemäß Ihren institutionellen Richtlinien für Complete Freund's Adjuvant (typischerweise BSL-1). Dazu gehört die Verwendung von chemikalienbeständigen Handschuhen, Schutzbrillen und Arbeitsschutzkleidung (Laborkittel).
- Verwenden Sie eine gute sterile Technik, um eine Kontamination von Reagenzien zu verhindern, die in Versuchstiere eingeführt werden.
- Stellen Sie die Mtb-Suspension in PBS her, indem Sie 5 mg lyophilisiertes, hitzegetötetes M. tuberculosis H37Ra-Pulver mit 2,5 ml kaltem PBS in einem 5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mischen. Vortex einmal für 30 s und dann auf Eis legen.
- Um eine feine Aufhängung des H37Ra in PBS zu erzeugen, beschallen Sie die Suspension 5 Minuten lang auf Eis.
- Spannen Sie den Körper der Konvertereinheit ab und reinigen Sie die Sonde mit einem 70% (v/v) Alkoholtupfer.
- Schalten Sie den Sonicator ein, stellen Sie die Leistungseinstellung durch Drehen des Power-Drehknopfes auf 4 ein und tauchen Sie die Spitze der Sonde in das PBS-haltige Mykobakterienpulver. Stellen Sie sicher, dass die Sondenspitze mindestens bis zur Hälfte der Tiefe der Probe eingetaucht ist und dass die Sondenspitze die Wand des Mikrozentrifugenröhrchens nicht berührt.
- Die Mischung 30 s auf Eis beschallen, 30 s pausieren und insgesamt 5 min wiederholen, um das Pulver vollständig in eine gleichmäßige Suspension zu dispergieren, ohne die Flüssigkeit zu erhitzen.
- Fügen Sie 2,5 ml Freund's Incomplete Adjuvant zu der Mischung hinzu und wiederholen Sie den Ultraschallvorgang auf Eis, bis die Emulsion eine zahnpastaähnliche Konsistenz bildet.
- Stellen Sie die Stromversorgung mit dem Bedienknopf auf 0 ein und schalten Sie das Gerät aus, um die Beschallung zu beenden. Entfernen Sie die Spitze von der Suspension und wischen Sie die Sonde mit einem Alkoholtupfer ab.
- Lagern Sie die Antigenemulsion bei 4 °C. Die Herstellung von Chargen der Emulsion trägt dazu bei, die Konsistenz über Experimente hinweg sicherzustellen. Die Emulsion kann bis zu 3 Monate bei 4 °C gelagert werden.
2. Subkutane Injektion
- Führen Sie die subkutane Injektion eine Woche vor der intravitrealen Injektion durch (bezeichnet als Tag -7).
- Laden Sie eine 1-ml-Spritze (keine Nadel) mit der mykobakteriellen Emulsion. Aufgrund der Viskosität und Trübung der Emulsion können schwer sichtbare Luftblasen die Spritze füllen.
- Um Luftblasen in der Spritze zu vermeiden, drehen Sie nach dem Laden von 0,2-0,3 ml Emulsion die Spritze (Spitze nach oben) und klopfen Sie die Spritze wiederholt vorsichtig auf den Rand einer Theke, um die Blasen an die Oberfläche zu bringen.
- Stoßen Sie die Luft aus der Spritze aus und füllen Sie die Spritze weiter. Invertieren und zeitweise klopfen, bis es gefüllt ist.
- Legen Sie eine 25-G-Nadel auf die Spritze und schieben Sie die Emulsion vor, um die Nadel zu füllen. Bewahren Sie die Spritze bis zum Gebrauch auf Eis auf.
- Um die subkutane Injektion sicher durchzuführen, ist entweder die Maus zu betäuben oder humane Rückhaltemethoden anzuwenden, die einen einfachen Zugang zur Hinterhand des Tieresermöglichen 31.
- Zur Betäubung für die subkutane Injektion wird das Tier in eine Isofluran-Induktionskammer gegeben (3%-4% für Induktion und 1%-3% für Erhaltung). Stellen Sie nach der Narkose sicher, dass die Maus eine langsame Atemfrequenz hat und keine Anzeichen von Atemnot aufweist.
- Platzieren Sie die subkutanen Injektionen entweder auf der dorsalen Oberfläche der Hüften oder auf der ventralen Oberfläche der Beine in der Nähe des Bereichs der Leistenlymphknoten.
- Führen Sie die Nadel vorsichtig ein, um eine Injektion in den Muskel zu verhindern. Injizieren Sie 0,05 ml der Mtb-Emulsion in den subkutanen Raum. Entfernen Sie die Nadel nicht sofort, damit die dicke Emulsion vollständig injiziert werden kann.
- Wiederholen Sie die Injektion auf der linken und rechten Seite für insgesamt 0,1 ml pro Tier.
- Wenn betäubt, legen Sie die Maus auf ein warmes Heizkissen, bis sie vollständig genesen ist. Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
- Bringen Sie die Maus nach vollständiger Genesung in ihren Käfig zurück und beschriften Sie die Käfigkarte mit dem Datum der subkutanen Injektion.
- Bieten Sie Analgesie mit oralem Paracetamol (200 mg / kg / Tag), aber nicht NSAIDs, da entzündungshemmende Mittel die Induktion von Uveitis beeinflussen können.
3. Antigenpräparation zur intravitrealen Injektion
- Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter geeigneten sterilen Bedingungen durch, um eine Kontamination der intravitrealen Mtb-Suspension zu vermeiden.
- Machen Sie die intravitrealen Suspensionen.
- Zur Induktion einer leichten bis mittelschweren Panuveitis wird die intravitreale Suspension in einer Konzentration von 5 mg/ml hergestellt, indem 5 mg des Mykobakterienextrakts zu 1 ml 1x PBS gegeben werden.
- Zur Induktion einer mittelschweren bis schweren Panuveitis wird die intravitreale Suspension in einer Konzentration von 10 mg/ml hergestellt, indem 10 mg des Mykobakterienextrakts zu 1 ml 1x PBS gegeben werden.
- Vortex einmal für 30 s und dann auf Eis legen.
- Um eine feine Suspension des H37Ra in PBS zu erzeugen, beschallen Sie die Suspension auf Eis für 10 Minuten, wie in Schritt 1.4 beschrieben. Diese Stammlösung in 100 μL Volumen aliquotisieren und bei -20 °C lagern.
- Vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen und 1 min hoch wirbeln. Bewahren Sie die Aliquots während des Transports zur Tierhaltung auf Eis auf.
4. Intravitreales Injektionsverfahren an Tag 0
- Tierpräparation
- Tragen Sie angepasste Untersuchungshandschuhe, legen Sie die Maus auf eine Waage, um ihr Gewicht in Gramm zu erhalten.
- Eine intraperitoneale Injektion von 0,02 ml/g Körpergewicht einer Lösung, die 100 mg/ml Ketamin und 20 mg/ml Xylazin enthält, gemischt mit sterilem Wasser, um das Tier zu betäuben. Ein alternativer Ansatz umfasst die Induktion mit ~ 1,5% Isofluran (inhaliert).
- Warten Sie ca. 2 Minuten, bis die Maus eingeschlafen ist, legen Sie die Maus dann in eine Wärmebox und decken Sie den Deckel ab. Führen Sie Schmerzreflextests wie Ohr, Zehe und Schwanzklemme durch, um die Tiefe der Anästhesie für das Verfahrenzu beurteilen 32.
- Nach dem Einschlafen die Hornhaut mit 1 Tropfen 0,5% (v / v) Tetracain anästhesieren. Vermeiden Sie es, Tetracain in der Nähe der Nase oder des Mundes der Maus zu bekommen. Nach 10 s die überschüssige Flüssigkeit abtupfen.
HINWEIS: Es wurde beobachtet, dass die Iriserweiterung und die Visualisierung der Vorderkammer (AC) verbessert werden, wenn eine topische Anästhesie verabreicht wird, möglicherweise aufgrund einer verbesserten Hornhautreflexunterdrückung mit der kombinierten systemischen und topischen Anästhesie. Dieser Schritt könnte jedoch auf Wunsch entfallen. - Erweitern Sie die Pupille mit 1 Tropfen 2,5% (v/v) Phenylephrin. Seien Sie vorsichtig, um überschüssige Tröpfchen zu vermeiden, die in die Nase oder den Mund gelangen könnten. Nach 2-3 min die überschüssige Flüssigkeit abtupfen.
- Um das Risiko einer Endophthalmitis zu verringern, fügen Sie 1 Tropfen 5% Betadin auf die Augenoberfläche und das umgebende Haar hinzu. Lassen Sie das Auge für 2-3 min.
HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren in diesem Abschnitt unter geeigneten sterilen Bedingungen durch, um eine Endophthalmitis zu verhindern. - Entfernen Sie Betadin und bedecken Sie das Auge mit Hypromellose (0,3%) oder Carbomer-Augengel 0,2% w/w), um Trockenheit unter Narkose zu verhindern. Dies wird auch dazu beitragen, Kataraktbildung zu verhindern.
- Einrichten des Mikroinjektionssystems
- Führen Sie die intravitreale Injektion mit einer Mikropumpe durch, die an eine Mikrospritzenpumpensteuerung und eine Injektionsspritze angeschlossen ist (Abbildung 1A-C). Alternativ kann eine 33-G-Nadel injiziert werden, die an einer Hamilton-Spritze befestigt ist, wie in Unterabschnitt 4.4 beschrieben.
- Schließen Sie eine 34-G-Nadel an den Injektionshalter an, um den Injektor zusammenzubauen. Lösen Sie den silbernen Schraubverschluss am vorderen Ende des Injektionshalters und schieben Sie die Nadel etwa zur Hälfte in den Körper des Halters. Ziehen Sie den silbernen Schraubverschlussfinger fest an.
- Schließen Sie den Schlauch wie in den Schritten 4.2.4-4.2.5 beschrieben an den Injektionshalter an.
- Um den Schlauch in den Injektionshalter einzuführen, lösen Sie die Kunststoffschraube am hinteren Ende des Halters, schieben Sie den Schlauch durch die Dichtung im Inneren und ziehen Sie die Schraube fest.
- Halten Sie einen leichten Abstand zum Ende des Schlauchs, um Schlauchschäden während der Injektion zu vermeiden. Siehe Abbildung 1C.
- Auftauen einer 100 μL aliquoten der Mycobacterium-Stammsuspension.
- Fügen Sie 3 μL einer 1% igen Fluorescein-Natrium (AK-Fluor) -Lösung hinzu und wirbeln Sie gut.
- Laden Sie eine 10-μL-Spritze mit der Antigen- und Fluoreszenzmischung ohne Luftblasen.
- Entfernen Sie die Ladenadel von der Spritze, und schieben Sie den Schlauch durch die silberne Schraubkappendichtung, bis die Spitze die Nullmarkierung im Spritzenkörper erreicht.
- Sobald die Spitze des Schlauchs korrekt auf die gewünschte Position ausgerichtet ist, ziehen Sie den Schraubverschlussfinger fest.
- Spülen Sie die Lösung in der Spritze durch den Injektionsschlauch, um das System vollständig zu beladen. Wiederholen Sie dann die Schritte 4.2.8-4.2.11, um die Spritze für die Injektion neu zu laden.
- Um die geladene Spritze an der Mikropumpe zu installieren, drücken Sie den Klemmentriegelungsknopf am Ende der Mikropumpe, um die Spritzenklemmen zu öffnen.
- Positionieren Sie die Kappe des Kolbens in den Kolbenkappenhalter am hinteren Ende der Mikropumpe.
- Schieben Sie dann den Spritzenkragen auf den Kragenanschlag und den Spritzenkörper in die Spritzenklemme.
- Lassen Sie den Klemmknopf los und ziehen Sie die Kolbenhalteschraube fest. Siehe Abbildung 1D.
- Schieben Sie den Injektionshalter und die Nadel durch die O-Klemme am stereotaktischen Injektionsgerät. Dies ist eine benutzerdefinierte Plattform; Alternativ kann die Spritze manuell gehalten und positioniert werden.
- Stellen Sie das Infusionsvolumen und die Infusionsgeschwindigkeit auf der Mikrospritzenpumpensteuerung so ein, dass 500 nL pro Zyklus mit einer Rate von 40 nL/s injiziert werden.
HINWEIS: Schnellere Injektionsraten können verwendet werden, jedoch kann mehr Rückfluss auftreten, bevor eine Nadelrepositionierung erreicht werden kann. - Testen Sie das System, um die korrekte Funktion sicherzustellen, bevor Sie eine intravitreale Injektion durchführen.
HINWEIS: Wenn das Injektionssystem ordnungsgemäß funktioniert, erzeugt die Aktivierung eines Injektionszyklus mit dem Fußpedal oder dem Steuerkreuz eine sichtbare Bewegung des Kolbenkappenhalters und ein kleiner Tropfen grünlicher Flüssigkeit ist an der Nadelspitze zu sehen. Falls keine Flüssigkeit produziert wird, aktivieren Sie zusätzliche Zyklen oder spülen und laden Sie die Spritze neu. - Wischen Sie die Nadel vor der Injektion des Auges vorsichtig mit einem 95% Ethanol-Pad ab.
- Intravitreales Injektionsverfahren
- Die Maus wird auf ein stereotaktisches Gerät gelegt, um den Injektionsvorgang durchzuführen.
- Halten Sie die Bühne/Plattform, auf der die Maus ruht, warm, indem Sie 2-3 Papiertücher auf ihrer Oberfläche befestigen.
- Platzieren Sie die Maus in Bauchlage auf der Plattform. Verwenden Sie die rechten und linken Ohrbügel, um den Kopf des Tieres sanft zu fixieren. Siehe Abbildung 1E.
- Positionieren Sie die Maus und orientieren Sie sich unter dem Zielfernrohr, so dass der obere nasale Aspekt des rechten Auges sichtbar ist.
- Verwenden Sie eine 30 G Nadel, um die Wimpern zu verschieben und die Sklera freizulegen. Visualisieren Sie den Limbus und das radiale Blutgefäß.
- Verwenden Sie eine sterile 30 G Nadel, um ein Führungsloch in der Sklera 1-2 mm hinter dem Limbus zu machen.
- Führen Sie die am Injektionshalter befestigte 34-G-Nadel durch das Führungsloch in einem Winkel in das Auge ein, der die Linse vermeidet, aber legen Sie die Nadelspitze in die Glaskörperhöhle.
- Injizieren Sie mit der Mikrospritzenpumpensteuerung vorsichtig 1 μL des Mtb-Extrakts in die Glaskörperhöhle. Bei gleichmäßigem Reflux ist das Injektionsvolumen auf 1,5 μl zu erhöhen, um eine ausreichende Dosisabgabe zu gewährleisten.
HINWEIS: Bei Scheinkontrollen 1 μL PBS in das Auge des Tieres injizieren. - Überprüfen Sie die intravitreale Platzierung durch Visualisierung eines grünlichen Reflexes im Auge. Siehe Abbildung 1F.
- Nach 10 s ziehen Sie die Nadel aus dem Auge. Notieren Sie sich jeden Reflux.
- Entfernen Sie die Maus von der Plattform, legen Sie 0,3% Hypromellose oder 0,2% w/w Carbomer-Augensalbe auf beide Augen zum Schutz der Hornhaut und gehen Sie zur Erholungswärmebox.
- Lassen Sie die Maus nicht unbeaufsichtigt, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten. Kehren Sie nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis Sie sich vollständig erholt haben.
- Wenn die Maus vollständig wach ist, kehren Sie in den Käfig zurück und fügen Sie Paracetamol (200-300 mg / kg / Tag) medizinische Wasserflasche hinzu. Beschriften Sie die Käfigkarte mit dem Datum der IVT-Injektion.
- Intravitreale Injektionen werden im Allgemeinen gut vertragen. Klinische Anzeichen, die auf Schmerzen und die Notwendigkeit einer Entfernung aus der Studie hinweisen können, sind periokulare Alopezie (Hinweis auf ein Selbsttrauma), Hornhautulzerationen, Gewichtsverlust und gebeugte Körperhaltung.
- Alternative Methode zur intravitrealen Injektion
HINWEIS: Dieses Verfahren wird mit einem Operationsmikroskop und einer 33 G Nadel auf einer Mikrospritze durchgeführt.- Stützen Sie das Auge und halten Sie es mit einer Pinzette in Position.
- Dann Carbomer-Augengel 0,2 % w/w oder 0,3% Hypromellose-Augengel auftragen und ein rundes Deckglas (7 mm Durchmesser) über das Auge legen.
- Montieren Sie eine 33 G Injektionsnadel auf eine 5 μL Hamilton-Spritze und führen Sie sie ca. 2 mm Umfang in den Hornhautlimbus mit einem Injektionswinkel von ~45° ein.
- Führen Sie die Nadelfase in den Glaskörper, stoppen Sie zwischen der Linse und der Sehscheibe (aus relativer Sicht des Chirurgen ist dies über / Abdeckung der Sehscheibe - etwa 1,5 mm von der Einführungsstelle) und injizieren Sie 2 μL Mtb (bei 2,5 ug / μL in PBS) langsam.
- Halten Sie die Nadel kurz an Ort und Stelle (um den Rückfluss von Injektion zu reduzieren) und entfernen Sie sie dann.
- Nach der Injektion den Globus ablegen, indem Sie die Pinzette loslassen. Ein Tropfen von 1% w/w Chloramphenicol Salbe kann zu diesem Zeitpunkt dem Auge verabreicht werden, um zusätzlichen Schutz vor Endophthalmitis nach der Injektion zu bieten.
- Gehen Sie nach der Injektion wie in den Schritten 4.3.11-4.3.13 beschrieben in die Rückgewinnungswärmebox.
5. OCT-Bildgebung zur Erkennung und Quantifizierung von Uveitis
- Tierpräparation
- Betäuben Sie die Maus wie in den Schritten 4.1.2-4.1.4 beschrieben.
- Erweitern Sie die Pupille mit 1 Tropfen 2,5% Phenylephrin. Seien Sie vorsichtig, um überschüssige Tröpfchen zu vermeiden, die in die Nase oder den Mund gelangen könnten. Nach 2-3 Minuten die überschüssige Flüssigkeit abtupfen.
- Geben Sie 0,3% Hypromellose oder 0,2% w / w Carbomergel auf das Auge, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Dies wird auch dazu beitragen, Kataraktbildung zu verhindern.
- Wickeln Sie die Maus in eine Schicht chirurgischer Gaze, um die Körperwärme zu erhalten, und legen Sie sie auf die Tierkassette. Positionieren Sie den Kopf mit der Bissleiste.
- Erfassen Sie die OCT-Bilder der vorderen und hinteren Kammer.
HINWEIS: Wenn Sie Bilder der Vorder- und Hinterkammer erhalten, erhalten Sie zuerst die Bilder der hinteren Kammer (PC), um eine Bildverschlechterung nach Kataraktbildung zu verhindern. Die Kataraktbildung kann durch häufiges Gleiten und Auftragen von 0,3% Hypromellose oder 0,2% w/w Carbomer-Augengel verhindert werden. Für eine erweiterte Bildgebung (>10 min) hilft es auch, die Maus warm zu halten (durch die Verwendung eines Wärmekissens).- Sichern Sie nach dem Einschalten des OCT-Bildgebungssystems das richtige Bildobjektiv, und passen Sie die Position des Referenzarms nach Bedarf an.
- Öffnen Sie die Imaging-Software, erstellen Sie die eindeutige Maus-ID, und beginnen Sie mit der Bildgebung gemäß dem Protokoll des OAT-Herstellers.
- Mit der Free Run-Option mit dem Fast-Scan-Protokoll positionieren Sie das Auge mit dem Sehnerv zentriert auf Bildern der hinteren Kammer oder die Spitze der Hornhaut auf Bildern der Vorderkammer.
HINWEIS: Tabelle 1 enthält Bildgebungsprotokollparameter für zwei kommerziell erhältliche Kleintier-Bildgebungssysteme. Produktspezifikationen finden Sie in der Materialtabelle . - Für die Hinterkammerbildgebung bringen Sie das OCT nahe an die Oberfläche des Auges. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, dass die Oberfläche der Linse mit dem Auge in Kontakt kommt.
- Sobald das Auge richtig positioniert ist, stoppen Sie den Schnellscan, wählen Sie das Volume-Scan-Protokoll aus und aktivieren Sie den Scan mit der Option Zielen .
- Passen Sie bei Bildern des hinteren Segments an, bis der Sehnerv im Bild der horizontalen B-Scan-Ausrichtung zentriert ist und die Netzhaut mit der vertikalen Ausrichtungsachse ausgerichtet ist.
- Passen Sie bei Bildern des vorderen Segments die Position so an, dass die Spitze der Hornhaut sowohl im Bild "Horizontale B-Scan-Ausrichtung" als auch im Bild "B-Scan-Ausrichtung vertikale Ausrichtung" zentriert wird. Das Vorhandensein eines Reflexionsartefakts in beiden Bildern bestätigt die korrekte Ausrichtung. Verschieben Sie dann das horizontale Bild so weit, dass das Reflexionsartefakt entfernt wird. Siehe Abbildung 2.
- Klicken Sie auf Snapshot , um das Volume-Scan-Image aufzunehmen, und klicken Sie dann auf Speichern.
- Als nächstes erhalten Sie den gemittelten zentralen Zeilenscan. Öffnen Sie das Scanprotokoll und klicken Sie auf Ziel , gefolgt von Schnappschuss. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf dasselbe Bedienfeld und dann auf Durchschnitt.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1-5.2.9 für jedes Auge mit beiden Linsen.
- Nachdem alle Bilder gesammelt wurden, entfernen Sie die Maus von der Kassette und sorgen Sie für einen Hornhautschutz während der Wiederherstellung, wie in den Schritten 4.3.11-4.3.13 aufgeführt.
6. Scoring Entzündung durch OCT
- Bewerten Sie die OCT-Bilder mit Hilfe von Gradern, die für den Behandlungszustand maskiert sind.
HINWEIS: Für PMU im Mausmodell wird das in Tabelle 2 angegebene Bewertungssystem empfohlen. - Wenn sowohl Vorderkammer- (AC) als auch Hinterkammerbilder (PC) erhalten wurden, kombinieren Sie diese Ergebnisse, um die endgültige Punktzahl für jedes Auge zu erhalten.
HINWEIS: Die Vorderkammerentzündung löst sich vor der Entzündung der Hinterkammer auf.
7. Bewertung der Entzündung durch postmortale Histologie
- Am Ende des Experiments sammeln Sie einzelne Augen durch Enukleation, fixieren 4% Formaldehyd über Nacht und fahren mit der Paraffineinbettung, dem Schneiden und der H & E-Färbung fort33.
HINWEIS: Mehrere 4-8 μm Abschnitte entlang der Pupillen-Sehnervenachse werden empfohlen.
HINWEIS: Drei Abschnitte pro Auge werden von einem maskierten Grader unter Verwendung des in Tabelle 3 angegebenen Bewertungssystems bewertet, und die Durchschnittspunktzahl der drei Abschnitte wird als endgültige histologische Entzündungsbewertung angegeben.
Representative Results
Dieses Protokoll demonstriert die Induktion der Uveitis bei Mäusen unter Verwendung des präparierten mykobakteriellen Uveitis-Modells (PMU). Die Sicherstellung der Konsistenz bei der subkutanen Injektion und die Genauigkeit der intravitrealen Injektion sind wichtige Schritte bei der Entwicklung des primed mycobacterial Uveitis-Modells (PMU). Abbildung 1 zeigt das intravitreale Injektionsverfahren der Maus mit einem stereotaktischen Gerät. Ohrbügel helfen, den Kopf vorsichtig an der gleichen Stelle unter dem Mikroskop zu positionieren (Abbildung 1E). Sie halten auch den Kopf während der intravitrealen Injektion stabil, was das Risiko eines Injektionstraumas verringert. Nach einer erfolgreichen Injektion erzeugt Fluorescein in der Injektionslösung eine grünliche Reflexion aus dem Inneren des Auges, die unter dem Mikroskop oder aus einer Seitenansicht zu sehen ist, wie in Abbildung 1F dargestellt.
Wenn das Protokoll wie beschrieben durchgeführt wird, erzeugt es eine robuste akute Uveitis, die bereits 10 h nach intravitrealer Injektion mittels OCT und Fundusbildgebung nachgewiesen werden kann. Abbildung 2 zeigt die korrekte Ausrichtung des Auges für die OCT-Bildgebung. In Tabelle 1A sind die im OAT-Protokoll verwendeten Parameter aufgeführt. Ein systematischer Ansatz zur Gewinnung von Bildern liefert qualitativ hochwertige Bilder, die im Laufe der Zeit verglichen werden können. Die Vorderkammerbilder werden auf der Spitze der Hornhaut zentriert, wobei das SLO-Bild (Abbildung 2A) verwendet wird, wobei die Iris parallel zur horizontalen und vertikalen Ebene ausgerichtet ist (Abbildung 2B, C). Volumen- und Zeilenscans werden vertikal ausgerichtet, so dass untere und übergeordnete Bereiche gleichzeitig betrachtet werden können. Die hinteren Segmentbilder werden unter Verwendung des SLO-Bildes (Abbildung 2D) auf den Sehnerv zentriert, und das helle Band des RPE wird verwendet, um die Netzhaut parallel zur horizontalen und vertikalen Ebene auszurichten (Abbildung 2E, F).
Abbildung 3 zeigt typische Befunde einer PMU-Augenentzündung mittels OCT-Bildgebung. Vierundzwanzig Stunden nach der intravitrealen Injektion werden Entzündungszellen im wässrigen und glasigen Bereich gesehen (Abbildung 3B). Bei mäßiger oder schwerer Entzündung wird ein Hypopyon im unteren Winkel im AC gesehen. Der Grad der Augenentzündung kann auf diesen OCT-Bildern anhand der in Tabelle 2 aufgeführten Kriterien bewertet werden. Repräsentative Beispiele für Bilder, die die für jeden Score typischen entzündlichen Merkmale zeigen, sind in Abbildung 4 dargestellt. AC- und PC-Kammer-Scores können addiert werden, um den kombinierten OCT-Score zu generieren. Kombinierte Werte >0, aber ≤2,5 stellen eine leichte Entzündung dar. Eine moderate Entzündung wird durch Werte >2,5, aber ≤4,5 bestimmt. Werte >4,5 identifizieren schwere Entzündungen. Die Entzündung erreicht typischerweise 48 Stunden nach intravitrealer Injektion ihren Höhepunkt mit OCT-Werten im AC und PC zwischen 1 und 3 (kombinierte Werte zwischen 2 und 6). AC- und PC-Werte von 0,5 oder 4 sind seltener. Für den Fall, dass Werte außerhalb des typischen Bereichs häufig auftreten, kann eine Fehlerbehebung erforderlich sein, um die Faktoren zu identifizieren, die zu Ausreißerwerten beitragen (siehe Diskussionsabschnitt). Die Entzündungswerte in der Vorderkammer neigen dazu, innerhalb einer Woche nach intravitrealer Injektion auf Null zurückzukehren. Im Gegensatz dazu kehren die posterioren Werte nicht auf Null zurück; Stattdessen bleibt eine chronische Entzündung auf niedrigem Niveau in Form von Vitritis bestehen, und perivaskuläre Lymphozyten infiltrieren 1-2 Monate nach intravitrealer Injektion in die Netzhaut.
Der Entzündungsscore bei PMU kann auch mit Hilfe der Histologie bestimmt werden. Abbildung 5 zeigt repräsentative H&E-Abschnitte zur Bewertung des Schweregrads der PMU durch Histologie. Die Anzahl der Entzündungszellen im wässrigen und glasigen Bereich wird gezählt und verwendet, um den Schweregrad anhand der in Tabelle 3 aufgeführten Score-Kriterien zu bestimmen. Entzündliche Zellinfiltration des Ziliarkörpers wird häufig auf einer Seite des histologischen Abschnitts (einseitige Beteiligung) bei leichten oder mittelschweren Entzündungen beobachtet. Wenn die Entzündung schwerwiegend ist, spiegelt sich dies durch das Vorhandensein eines entzündlichen Zellinfiltrats im Ziliarkörper auf beiden Seiten der Linse wider (als bilaterale Beteiligung bezeichnet). Zu späteren Zeitpunkten nach intravitrealer Injektion können auch chronische Entzündungsmanifestationen, einschließlich des Vorhandenseins perivaskulärer und intraretinaler Leukozyten und äußerer Netzhautfalten, identifiziert werden. Histologie kann auch hilfreich sein, um Augen zu identifizieren, die von schlechten Injektionstechniken betroffen sind. Ein Trauma der Linse während der intravitrealen Injektion kann durch das Vorhandensein von amorphen Eosin-gefärbten (rosa) Linsenproteinen außerhalb der Linsenkapsel neben dem Traumabereich identifiziert werden. Der Reflux der intravitrealen mTB in den subkonjunktivalen Raum erzeugt eine Entzündung außerhalb des Auges, die durch eine sorgfältige Überprüfung der auf den Abschnitten vorhandenen periokularen Strukturen identifiziert werden kann. Aufgrund des Versagens, mTB-Extrakt in den Augen zurückzuhalten, haben diese Augen typischerweise niedrige OCT-Entzündungswerte.
Die Hellfeld-Fundusbildgebung kann auch verwendet werden, um klinisch relevante Aspekte der PMU zu identifizieren, einschließlich der Entwicklung eines Hypopyons, Vitritis und retinaler oder perivaskulärer entzündlicher Zellinfiltration. Abbildung 6 zeigt zwei Beispiele, bei denen retinale und perivaskuläre Entzündungen auf Fundusbildern zu sehen sind. Diese beiden Augen zeigen auch den Bereich der Entzündung, der im PMU-Modell üblich ist. Tabelle 1B listet die Parameter auf, die im Fundus-/Netzhaut-OCT-Bildgebungssystem verwendet werden. Beachten Sie die Auswirkungen einer schweren Entzündung auf die Bildqualität (Abbildung 6, Tag 2, OCT- und Fundusbilder in der oberen Reihe) und das Ausmaß der Erkrankung an Tag 21. Hornhautödeme können auch die Bildqualität bei akuten Entzündungen beeinträchtigen; Es ist jedoch ungewöhnlich, dass Hornhautödeme allein durch Entzündungen schwerwiegend sind. Häufiger wird die Bildqualität durch Epithelschäden verschlechtert, die durch unvollständigen Oberflächenschutz während Bildgebungs- und Anästhesieereignissen entstehen.
Das PMU-Modell kann verwendet werden, um Uveitis bei jeder Mausrasse oder jedem Genotyp zu induzieren. In Albinoaugen kann OCT immer noch verwendet werden, um Entzündungen zu bewerten, aber das Fehlen von Funduspigment macht die Visualisierung von Entzündungen durch Hellfeld-Bildgebung schwierig13,34. Post-mortem-Studien können an Augengeweben, regionalen Lymphknoten oder der Milz durchgeführt werden. Einige Beispiele umfassen Assays für das Vorhandensein von Immunzellen wie Durchflusszytometrie und Immunhistochemie und Messung von entzündlichen Zytokinen. Zu allen Zeitpunkten, die nach Beginn der Entzündung mit PMU getestet wurden (Tag 1 bis Tag 56), sind genügend CD45+ Entzündungszellen in einzelnen Augen vorhanden, um viele wichtige Leukozytenpopulationen im Auge durch Multiparameter-Flussanalyse zu erkennen12,35. Wässriger (2-5 μL) und Glaskörper (5-10 μL) Humor können aus entzündeten Augen zur Bestimmung der Proteinkonzentration, proteomischen Studien oder zur Bestimmung der Zytokinkonzentration gesammelt werden36.
Abbildung 1: Einrichtung der intravitrealen Injektion der Maus. Die intravitreale Injektion wird am Mausauge mit (A) einer Mikrospritzenpumpensteuerung, die mit der (B) Mikropumpe verbunden ist, und (C) einer Injektionsspritze durchgeführt. Die Spritze wird geladen und auf die (D) Micropump montiert. Der Mauskopf wird mit (E) Ohrbügeln positioniert, um Stabilität und Konsistenz während des intravitrealen Injektionsvorgangs zu gewährleisten. (F) Fluorescein in der Injektionslösung erzeugt nach einem erfolgreichen Eingriff eine grünliche Reflexion aus dem Inneren des Auges. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Korrekte Ausrichtung des Auges für die OCT-Bildgebung . (A) Unter Verwendung des Laserophthalmoskops (SLO) wird das Auge für die Vorderkammerbildgebung zentriert. Die grüne Linie zeigt die Position des horizontalen Linienscans an, der im Bereich (B) angezeigt wird. Beachten Sie, dass die zentrale Hornhaut vermieden wird, um das Reflexionsartefakt zu verringern. (C) Vertikaler B-Scan durch die parazentrale Vorderkammer. Dieser Scan wird bei 90° vom horizontalen Scan erhalten. Beachten Sie, dass die Ausrichtung der Blendenabschnitte auf jeder Seite des Objektivs im horizontalen Scan (Panel B) eben und im vertikalen Scan (Panel C) übereinander angeordnet ist. (D) Bei Verwendung des SLO-Bildes wird das hintere Kammerbild auf den Sehnerv zentriert. (e) horizontale B-Scan-Ausrichtung, (f) vertikale B-Scan-Ausrichtung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Die Induktion der PMU erzeugt eine Panuveitis, die durch longitudinale OCT-Bildgebung überwacht werden kann. Die obere Reihe zeigt die Vorderkammer (AC); Die untere Reihe zeigt OCT-Bilder der hinteren Kammer (PC), um pathologische Veränderungen im Krankheitsverlauf hervorzuheben. (A) OCT-Basisbild des AC (oben) und PC (unten) vor der Induktion der Uveitis, beide Wert 0. (B) Tag 1 nach intravitrealer Injektion, die das Vorhandensein von Hornhautödemen (schwarzer Pfeil), einem Hypopyon (*) mehreren frei schwebenden Entzündungszellen im AC (weiße Pfeile) und Vitritis (weiße Pfeilspitzen) im PC zeigt. (C) Tag 7 nach intravitrealer Injektion mit wenigen AC-Zellen auf der vorderen Linsenkapsel (weißer Pfeil) und verminderter Vitritis (weiße Pfeilspitze). (D) Tag 28 nach intravitrealer Injektion Vorderkammer mit gelöster AC-Entzündung und leichter Vitritis. Abkürzungen: C- Hornhaut, L - Linse, I - Iris, Aq - wässrig, V Glaskörper, RGC - retinale Ganglienzellen, PR - Photorezeptoren, Ch- Aderhaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Beispiele für die OCT-Punktzahl. Jedem AC-Abbild und PC-Abbild wird mithilfe des in Tabelle 2 dargestellten kategorialen Systems eine OAT-Bewertung zwischen 0 und 4 zugewiesen. Die AC- und PC-Werte werden für die endgültige OCT-Punktzahl für das Auge kombiniert. (A,D) Beispiele für eine Punktzahl von Null. (B,E) Beispiele für eine Punktzahl von 0,5. (C,F) Beispiele für eine Punktzahl von 1. (G,J) Beispiele für eine Punktzahl von 2. (H,K) Beispiele für eine Punktzahl von 3. (I,L) Beispiele für eine Punktzahl von 4 sind in den Tafeln I und L dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Beispiele für Histologie-Scores. Der Histologie-Score wird anhand von fünf Merkmalen bestimmt, die in H & E-Abschnitten sichtbar sind: Vorderkammerproteindichte, Vorderkammerzellzahl, Immunzellinfiltration des Ziliarkörpers, Glaskörperzelldichte, retinale Gefäßentzündung und strukturelle Netzhautveränderungen. Für jedes Merkmal wird eine Punktzahl von 0-2 vergeben. Die Beschreibung der einzelnen Punkte ist in Tabelle 3 enthalten. In dieser Abbildung ist ein repräsentativer Beispielwert von 0-2 für jedes Merkmal dargestellt. Die linke Spalte zeigt die Punktzahl Null an. Die mittlere Spalte zeigt Beispiele für die Punktzahl 1. Die rechte Spalte zeigt Beispiele für die Punktzahl 2. Eine Punktzahl von 2 für den Ziliarkörper-Score wird vergeben, wenn der Ziliarkörper auf beiden Seiten der Linse im selben Abschnitt eine Zellentzündung aufweist. Der endgültige Histologiewert ist die Summe der Punktzahl für jedes der fünf Kriterien (maximale Punktzahl 10). Der Pfeil unten rechts zeigt perivaskuläre Leukozyten an, die mit einem oberflächlichen Netzhautgefäß assoziiert sind. Schwarzer Maßstabsbalken zeigt 500 μm an. Ziliarskalenbalken zeigen 100 μm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Longitudinale Fundusbildgebung in PMU identifizierte eine Reihe von Krankheitsschweregraden . (A) Stark entzündete Augen zeigen mehrere weiße Infiltrate in der Netzhaut und vaskuläre Tortuosität auf Farbfundusbildgebung (obere Reihe) sowie dichte Vitritis und Netzhautödem auf OCT (untere Reihe) an Tag 2. Die Progression der Anzahl der Netzhautläsionen kann im Laufe der Zeit beobachtet werden, während sich die Vitritis verbessert. Die grüne Linie zeigt die Position des OAT-Bilds an. (B) Leicht entzündete Augen zeigen weniger und diskretere lineare Läsionen im Fundus und eine Anzahl von infiltrierenden Zellen im Glaskörperraum. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| Ein | |||
| Maus Vorderkammer | Schneller Scan | Volume-Scan | Linearer Scan |
| Länge x Breite | 4,0 mm x 4,0 mm | 3,6 mm x 3,6 mm | 3,6 mm |
| Winkel | 0 | 90 | 90 |
| A-Scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-Scans | 50 | 400 | 1 |
| Rahmen/ B-Scan | 1 | 3 | 20 |
| Maus-Hinterkammer | Schneller Scan | Volume-Scan | Linearer Scan |
| Länge x Breite | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm x 1,6 mm | 1,6 mm |
| Winkel | 0 | 0 | 0 |
| A-Scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-Scans | 50 | 200 | 1 |
| Rahmen/ B-Scan | 1 | 3 | 20 |
| B | |||
| Maus-Hinterkammer | Volume-Scan | Linearer Scan | |
| Länge x Breite | 0,9 mm x 0,9 mm | 1,8 mm | |
| Winkel | 0 | Beliebig (normalerweise 0 oder 90) | |
| A-Scan/B-Scan | 1024 | 1024 | |
| # B-Scans | 512 | 1 | |
| Rahmen/ B-Scan | 1 | 30 |
Tabelle 1: Scan-Parameter. (A) OGT-Scanparameter. (B) Fundus-/Netzhaut-OCT-Scan-Parameter
| OCT Score Beschreibungen | ||||||
| Punktzahl | Vordere Augenkammer | Hintere Augenkammer | ||||
| NA | Kein Blick über die vordere Hornhaut hinaus | Keine Ansicht des hinteren Segments | ||||
| 0 | Keine Entzündung | Keine Entzündung | ||||
| 0.5 | 1–5 Zellen in der wässrigen | Wenige Zellen, die weniger als 10% der Glasfläche einnehmen | ||||
| ODER Hornhautödem | Keine subretinalen oder intraretinalen Infiltrate oder Störungen der Netzhautarchitektur | |||||
| 1 | 6–20 Zellen in der wässrigen | Diffuse Zellen (keine dichten Klumpen), die zwischen 10 und 50% der Glasfläche einnehmen. | ||||
| ODER eine einzelne Zellschicht auf der vorderen Linsenkapsel | Keine subretinalen oder intraretinalen Infiltrate oder Störungen der Netzhautarchitektur | |||||
| 2 | 20–100 Zellen im wässrigen | Diffuse Zellen (keine dichten Klumpen), die > 50% der Glasfläche einnehmen | ||||
| ODER weniger als 20 Zellen und ein Hypopyon vorhanden | Keine subretinalen oder intraretinalen Infiltrate oder Störungen der Netzhautarchitektur | |||||
| 3 | 20–100 Zellen im wässrigen | Diffuse Zellen gleich Grad 2 und 1 | ||||
| UND ein Hypopyon ODER eine Pupillenmembran | UND mindestens eine dichte Glaskörpertrübung, die 10%–20% der Glasfläche einnimmt ODER das Vorhandensein von Glaskörperzellen gleich Grad 2 und seltene (≤ 2) subretinale oder ntraretinale Trübungen | |||||
| 4 | Beliebig viele wässrige Zellen | Dichte Glaskörpertrübung nimmt > 20% der Glasfläche ein. | ||||
| UND ein großes Hypopyon und Pupillenmembran ODER vorderer Strukturverlust aufgrund einer schweren Entzündung | ODER diffuse Glaskörperzellen mit großen subretinalen oder intraretinalen Trübungen | |||||
Tabelle 2: PMU OCT Score-Kriterien: OAT-Bilder werden nach den in der Tabelle aufgeführten Kriterien bewertet. AC- und PC-Scores werden hinzugefügt, um die Endnote des Auges zu erhalten. In Fällen, in denen keine klare Sicht auf das Auge erreicht wurde, wurde den Bildern eine Punktzahl von NA zugewiesen, und diese wurden von der Studie ausgeschlossen.
| Histology Score Beschreibung | |||
| Charakteristisch | 0 | 1 | 2 |
| Vorderkammer (AC) Protein | Geringe azelluläre Partikelfärbung mit Eosin im AC | Moderate, aber nicht konfluierende, extrazelluläre Eosinfärbung irgendwo im AC | Konfluente oder nahezu konfluente extrazelluläre Eosinfärbung im gesamten AC |
| Vorderkammer (AC) Zelle | Keine Zellen | 1–100 Zellen, aber keine dichten Zellaggregationen | >100 Zellen oder dichte Aggregationen von Zellen |
| Ziliarkörperentzündung | Keine Leukozyteninfiltration des Ziliarkörpers oder des umgebenden Glaskörpers | Einseitige Anwesenheit von Leukozyten, die in den Ziliarkörper und/oder den umgebenden Glaskörper eindringen. | Bilaterales Vorhandensein von Leukozyten, die den Ziliarkörper und/oder den umgebenden Glaskörper infiltrieren. |
| Netzhaut-Gefäßentzündung | Keine Netzhautgefäße mit perivaskulären Leukozyten | Ein Gefäß pro Abschnitt mit perivaskulären Leukozyten | >1 Gefäß pro Abschnitt mit perivaskulären Leukozyten |
| Netzhautfalte oder -schädigung | Keine Netzhautschädigung | 1–3 Netzhautfalten pro Abschnitt | >3 Netzhautfalten pro Abschnitt oder jede andere Netzhautschichtzerstörung oder intraretinale Blutung |
Tabelle 3: PMU-Histologie-Score-Kriterien: H&E-Abschnitte des Auges wurden anhand der in der Tabelle aufgeführten Kriterien bewertet. Drei Abschnitte desselben Auges wurden bewertet und gemittelt, um den endgültigen histologischen Wert des Auges zu erhalten.
Discussion
Tiermodelle der Uveitis waren maßgeblich am Verständnis der Mechanismen der Augenentzündung und Homöostase beteiligt und ermöglichten die präklinische Bewertung medizinischer und chirurgischer Therapien für Patienten mit Uveitis37. Sowohl Kaninchen- als auch Rattenvarianten des PMU-Modells haben ihren Wert in der präklinischen Therapie durch Proof-of-Concept-Studien38,39,40 nachgewiesen. Aufgrund der Verfügbarkeit einer Vielzahl transgener Stämme in Mäusen ermöglicht die Etablierung des Maus-PMU-Modellsystems nun detailliertere mechanistische Studien, um spezifische Zelltypen, Signalwege und Gene zu identifizieren, die zur Pathologie dieser Krankheit beitragen.
Tiermodelle der Uveitis können Tier-zu-Tier-Variabilität in der Inzidenz und Intensität von Entzündungen nachweisen41. Im C57BL/6-Mausstamm wird PMU zuverlässig mit dem hier beschriebenen Protokoll erzeugt. Stammspezifische Variationen des Uveitisverlaufs und der Intensität wurden sowohl für EAU als auch für EIU42,43 berichtet. Während stammspezifische Auswirkungen auf Schweregrad und Verlauf der PMU nicht experimentell gemessen wurden, wurde dieses Modell sowohl beim Wildtyp C57BL/6J als auch bei Albinomäusen (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) verwendet und erzeugte ähnliche Entzündungsreaktionen. Bei der Erstellung des PMU-Modells kann die Kontrolle der unten aufgeführten Überlegungen neuen Forschern helfen, die Variabilität zu begrenzen und die konsistenteste und reproduzierbare Uveitis zu erzeugen.
Stellen Sie die Konsistenz der subkutanen Injektionen sicher:
Um eine konsistente subkutane Injektion zu gewährleisten, stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus der Emulsion entfernt werden. Zu den Überlegungen gehört eine kurze Zentrifuge (30 s bei 400 x g) der vorgefertigten Emulsion vor dem Beladen der Spritze. Dadurch wird die in der Emulsion eingeschlossene Luft entfernt. Wenn Sie die Spritze laden, kehren Sie sie regelmäßig um (Tip-up) und klopfen Sie auf die Spritze, um Luftblasen zu entfernen. Legen Sie die Spritze während der Injektion nicht zu tief, um eine intramuskuläre Injektion zu vermeiden. Umgekehrt kann eine flache (intradermale) Injektion zu einer Erosion der Emulsion durch die Haut führen. Denken Sie daran, kurz zu pausieren, bevor Sie die Spritze von der Injektionsstelle entfernen, um eine vollständige Injektion der dickviskosen Emulsion sicherzustellen und Rückfluss aus der Haut zu verhindern.
Bestätigen Sie sieben Tage nach der subkutanen Injektion das Vorhandensein tastbarer Knötchen auf beiden Seiten der Hinterbeine. Wenn keine Knötchen identifiziert werden können, ist es möglich, dass Luft anstelle von Emulsion injiziert wurde. In diesem Fall ist eine akute Entzündung möglicherweise nicht so robust und eine chronische Entzündung kann sich nicht entwickeln.
Verhindern Sie die Entwicklung einer infektiösen Endophthalmitis:
Bakterielle oder pilzliche Endophthalmitis erzeugt eine Störvariable, wenn sie nicht verhindertwird 44. Um eine bakterielle Endophthalmitis zu verhindern, sollten Sie bei der Herstellung der intravitrealen Suspension, Handhabung und Reinigung aller wiederverwendbaren Werkzeuge, die mit dem Auge in Berührung kommen, immer eine gute aseptische Technik anwenden. Die Verwendung steriler Einwegartikel, Autoklavieren oder Reinigen mit 95% Alkoholwäschen oder -tüchern ist wichtig. Die angemessene Anwendung von Betadin, das auf die Augenoberfläche, die Lider und das periokulare Fell aufgetragen wird, hilft auch, Endophthalmitiszu verhindern 45. Es ist einfach, ein Auge mit einer Infektion zu erkennen, da die Augenstrukturen während des Verlaufs nach der Injektion durch extreme Entzündungen ausgelöscht werden. Das ist nicht typisch für PMU. Das Vorhandensein von intraokularen Blutungen kann auch auf eine Endophthalmitis oder ein Trauma der Injektion hindeuten. In solchen Fällen schließen Sie diese Tiere von der Studie aus.
Sicherstellung der Konsistenz bei der intravitrealen Injektion:
Die intravitreale Injektion ist ein kritischer Schritt bei der Induktion einer zuverlässigen und reproduzierbaren Entzündung bei PMU. Die Bereitstellung einer konsistenten Menge an Mtb-Suspension bei jeder Injektion, die Vermeidung von Traumata und die Verhinderung des Rückflusses der Suspension sind alles Faktoren, die bei der Durchführung der Injektionen berücksichtigt werden sollten. Um eine gleichmäßige Suspension zu gewährleisten, wirbeln Sie die Stoffsuspension beim Auftauen und vor dem Einlegen in die Spritze gründlich ab. Da dieser verwendete Mtb-Extrakt keine Lösung bildet, kann die Suspension im Laufe der Zeit sedimentiert werden. Um eine gleichmäßige Konzentration des Mtb-Extrakts bei jeder Injektion zu gewährleisten, verwenden oder stoßen Sie die Spritze aus und laden Sie sie innerhalb von 15 Minuten nach dem Laden wieder auf. Phenylephrin wird zur Erweiterung verwendet, um dem hinteren Auge ein größeres Sichtfeld zu verleihen und das Risiko eines Traumas für das Auge während der Injektion zu verringern. Dieser Tropfen erzeugt eine natürliche Lidretraktion und eine leichte Stützung des Globus, was eine gute Visualisierung des Bereichs 1-2 mm hinter dem Limbus ermöglicht, ohne dass das Auge mit einer Pinzette gegriffen werden muss. Die Verwendung einer Pinzette zur Fixierung des Auges könnte zu einem potenziellen Trauma führen und den Augeninnendruck und das Risiko eines Rückflusses der Mtb-Suspension vorübergehend erhöhen. Ein Trauma kann auch durch den Versuch verursacht werden, zu viel Volumen in das Auge zu injizieren. Das Injektionsvolumen ist auf 2 μL begrenzt, um eine signifikante und längere Erhöhung des Augeninnendrucks und ein Trauma des Auges zu verhindern. Darüber hinaus haben jüngere Tiere Augen, die kleiner sind als erwachsene Mäuse. Typischerweise 6-8 Wochen Mäuse (20-25 g) bieten eine einheitliche Augengröße und sorgen für eine größere Konsistenz in der Entzündung nach Injektion von Mtb. Eine höhere Häufigkeit des Refluxes der mykobakteriellen Suspension nach der Injektion wurde bei kleineren Mäusen beobachtet. Dies wiederum führt zu einer weniger als erwarteten akuten Entzündung. Eine verdünnte Fluoresceinlösung wird verwendet, um dem Anfängerinjektor ein visuelles Feedback über den Erfolg seiner Injektionstechnik zu geben. Die Dilatation zum Zeitpunkt der Injektion ermöglicht eine direkte Visualisierung des injizierten Materials in der Glaskörperhöhle und die Möglichkeit, Anzeichen eines Linsentraumas zu bemerken. Im Falle eines Linsentraumas kann es zu einer Veränderung der Linsenklarheit kommen, die einen Katarakt verursacht, der auf OCT visualisiert werden kann. Im Falle eines Augentraumas müssen die Augen aufgrund der Möglichkeit einer linseninduzierten Uveitis von der Studie ausgeschlossen werden46. Wir empfehlen, eine Pause von 10 s einzulegen, bevor die Spritze aus dem Auge entfernt wird, um die Verteilung der Mtb-Suspension im Auge zu ermöglichen und den Reflux zu verringern.
Das PMU-Modell kann modifiziert werden, um die Intensität der akuten Entzündung zu ändern, indem die Konzentration des Mtb in der intravitrealen Injektion variiert wird. Verschiedene Dosierungen von 2,5 μg/μL bis 15 μg/μL wurden zuvor in unserem Labor getestet. Es wurde jedoch festgestellt, dass Dosen von mehr als 10 μg / μL schwere Augenschäden verursachen, einschließlich spontaner Linsenruptur, schwerer Hornhautödeme und Narbenbildung sowie Hyphema. Dieser Schweregrad ist bei menschlichen Patienten mit postinfektiöser Uveitis nicht typisch, weshalb diese Konzentrationen nicht empfohlen werden. Es wurde festgestellt, dass eine Dosis von 5 μg / μL zuverlässig leichte bis mittelschwere akute Entzündungen und leichte chronische Uveitis hervorruft; Die Dosis von 10 μg/μL führt zu einer zuverlässig mittelschweren bis schweren akuten Erkrankung und einer bemerkenswerteren chronischen Erkrankung. Daher kann die Variation der intravitrealen Konzentration alternative Krankheitsschweregrade liefern, die je nach Bedarf basierend auf der experimentellen Frage verwendet werden können. Die Kontrollen sollten ausgewählt werden, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse auf das Ansprechen auf mTB und nicht auf ein Trauma im Zusammenhang mit den subkutanen oder intravitrealen Injektionen zurückzuführen sind. In den Scheininjektionskontrollen kann PBS anstelle des mTB-Extrakts verwendet werden. Für Vergleiche mit nicht exponierten Tieren sollten echte naive Proben berücksichtigt werden, da andere Augen nicht immer gleichwertig sind.
Aufgrund der geringen Größe des Mausauges kann OCT ein empfindlicherer Test zum Nachweis von Entzündungen in der Vorderkammer sein als direkte Visualisierung oder mikroskopische Hellfeldfotografie. Frühere Arbeiten mit PMU an Ratten25 ergaben, dass mehr Zellen durch Histologie als durch OCT nachgewiesen werden können, aber dass es eine gute Korrelation zwischen den beiden Modalitäten gibt. OCT hat den zusätzlichen Vorteil, dass es verwendet werden kann, um die Entzündung längs im selben Tier zu überwachen. Andere große Mausmodelle der Uveitis, wie EAU und EIU, haben OCT auch für die quantitative Analyse verwendet 12,47,48. Im PMU-Modell von Mäusen sind Vorderkammerzellen nur auf OCT sichtbar und können bei klinischen Untersuchungen nicht gesehen werden, es sei denn, ein großes Hypopyon ist vorhanden. Glaskörperentzündungen (Vitritis) können mit Farbfundusbildgebung beobachtet werden, aber der Nachweis quantitativer Veränderungen ist nur mit OCT-Bildgebung möglich. Andere Aspekte des Modells, wie retinale Gefäßentzündungen und Netzhautschäden, können leicht mit OCT und mikroskopischer Hellfeld-Fundusfotografie identifiziert werden.
Bei der Verwendung von OCT ist es wichtig zu berücksichtigen, wie die lokalisierte Bildgebung durch regionale Unterschiede im Grad der Entzündung beeinflusst werden kann. Frühere Berichte haben eine ungleichmäßige Verteilung von Zellen in der Vorderkammer des Menschen festgestellt, wobei mehr Zellen schlechter lokalisiertsind 49. Bei Mäusen ist eine ähnliche Veranlagung üblich. So tragen vertikale oder radiale Scans durch die Klimaanlage dazu bei, Bilder zu erhalten, die den Bereich der Entzündung erfassen. Darüber hinaus wird die Durchführung von Bildgebung an derselben Stelle auch die Konsistenz von Bildern gewährleisten, die im selben Auge längs aufgenommen wurden. Um Bilder im selben Teil des Auges zu erhalten, verwenden Sie stabile Orientierungspunkte und einen systematischen Ansatz. Bei Vorderkammerbildern wird das Bild unmittelbar neben der Hornhautspitze zentriert und vertikal ausgerichtet, so dass das Vorhandensein eines Hypopyons im unteren Winkel erkannt werden kann. Bei Bildern des hinteren Segments ist das Bild auf den Sehnerv zentriert. Es wird empfohlen, mindestens 3 Zeilenscans für die Bewertung zu verwenden, um sicherzustellen, dass regionale Variabilität erfasst wird. In Fällen, in denen die Entzündung auf periphere Stellen beschränkt ist, kann die Erfassung von Volumenscans hilfreich sein. Die Sammlung von Volume-Scans kann auch dazu beitragen, regionale Abweichungen zu erfassen, erhöht jedoch die Anforderungen an die Datenspeicherung.
Andere In-vivo-Assays, die zur Charakterisierung von Entzündungen im PMU-Mausmodell verwendet werden können, umfassen Biolumineszenz-Bildgebung13,35. Post-mortem-Assays wie die multiparameter-Durchflusszytometrie können durchgeführt werden, um infiltrierende Immunzelltyppopulationen in der wässrigen und hinteren Augenkammer zu identifizieren und zu quantifizieren12,26. Im PMU-Modell ist die akute Entzündung durch eine angeborene Reaktion mit einem vorherrschenden neutrophilen Infiltrat gekennzeichnet, gefolgt von einer chronischen und anhaltenden adaptiven T-Zell-dominanten Reaktion, die über einen Monat anhält35. Andere Tests der Immunfunktion, die an postmortalem Gewebe durchgeführt werden können, umfassen die Zytokinanalyse der Augenflüssigkeit. Darüber hinaus können andere nachgeschaltete Assays wie mRNA-Sequenzierung und Immunfluoreszenzbildgebung verwendet werden, um Gen- und Proteinexpressionsmuster von retinalen Immunzellpopulationen in Uveitis50,51 zu beurteilen.
Das PMU-Modell kann in anderen Nagetiersystemen repliziert werden, indem Anpassungen verwendet werden, die für die verschiedenen Arten geeignet sind. Das PMU-Modell wurde zuvor bei Ratten und Kaninchen38,39,40 verwendet. Bei Ratten entwickelt sich eine akute Panuveitis nach intravitrealer Injektion, die sich spontan über 14 Tage auflöst, ohne Anzeichen einer chronischen Entzündung durch Histologie zu entwickeln24. Bei Kaninchen verwendet die Induktion der Uveitis zwei Runden subkutane Injektion vor der intravitrealen Injektion, erzeugt aber auch eine robuste Panuveitis. Einer der Vorteile der Verwendung des Mausmodells ist die Verfügbarkeit zahlreicher transgener und Knockout-Stämme, die helfen können, den grundlegenden Mechanismus der Uveitis52 zu verstehen. Alle Nagetiermodelle können für präklinische Therapietests verwendet werden, wenn das Mittel systemisch oder als topischer Tropfen verabreicht wird. Aufgrund ihrer größeren Größe sind Ratten- und Kaninchenaugen jedoch bessere Modelle für den Einsatz in präklinischen Studien mit implantierbaren oder lokalen Injektionsbehandlungsoptionen für Uveitis.
Zusammenfassend bietet dieses Protokoll Forschern, die daran interessiert sind, die Mechanismen der chronischen Augenentzündung zu untersuchen, ein neues Werkzeug, das nicht von einer vorherigen Immunisierung mit Augenantigenen abhängig ist.
Disclosures
Die Autoren haben keine finanziellen Konflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wird unterstützt durch Mittel der National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW Vision Research Core Grant (NEI P30EY01730), Geschenke von Mark Daily, MD Research Fund und Christopher and Alida Latham Research Fund, ein uneingeschränkter Abteilungszuschuss von Research to Prevent Blindness und ein Karriereentwicklungspreis von Research to Prevent Blindness (KP). Die in Bristol durchgeführten Arbeiten wurden durch zusätzliche Mittel von Sight Research UK und The Underwood Trust unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial | |
| AnaSed | Akorn Animal Health, IL, USA | NDC 59399-110-20 | Xylazine 20 mg/mL |
| Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution | Alcon, TX, USA | 8007-1 | |
| B-D Precision Glide Needles -25 G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305122 | |
| B-D Precision Glide needle -30-G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305106 | |
| Bond MAX, Bond Rx | Leica Biosystems, IL,USA | Automated IHC staining system | |
| Chloramphenicol ointment | Martindale Pharma, Romford, UK | 1% w/w Chloramphenicol | |
| EG1150H | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Embedding | |
| Envisu R2300 | Bioptigen/Leica | OCT Machine | |
| Freund's Incomplete Adjuvant | BD Difco, NJ, USA | 263910 | |
| GenTeal lubricant eye ointment | Alcon, TX, USA | --- | |
| GenTeal lubricant eye gel | Alcon, TX, USA | --- | |
| H37Ra lyophilized Mycobacteria extract | BD Difco, NJ, USA | 231141 | |
| Hamilton RN Needle (33/12/2)S | Hamilton, Reno, NV | 7803-05(33/12/2) | 33 G |
| Hamilton syringe | Hamilton, Reno, NV | CAL7633-01 | 5 µL |
| Insulin needle | Exel International, USA | 26029 | 1 mL |
| Isoflurane | |||
| Ketaset | Zoetis, USA | 377341 | Ketamine HCL 100 mg/mL |
| Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller | World Precision Instruments, FL, USA | UMP3 | |
| Micron IV | Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA | Alternative Imaging/OCT Machine | |
| Nanofil 10 µL syringe | World Precision Instruments, FL, USA | NANOFIL | |
| Nanofil Intraocular Injection Kit | World Precision Instruments, FL, USA | IO-KIT | |
| Olympus SZX10 | Olympus | Dissection scope | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 17478020115 | |
| RM2255 | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Sectioning | |
| TB Syringe | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 309602 | 1 mL |
| Tetracaine 0.5% | Alcon, TX, USA | 1041544 | |
| Tissue Tek VIP series | Sakura Finetek USA, Inc.,CA. | Histology Tissue Processing | |
| Tropicamide 1% | Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK | Minims | |
| Tylenol | Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA | NDC 50580-614-01 | Acetaminophen |
| Viscotears | Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK | Carbomer eye gel 0.2% w/w |
References
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