Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Primed Mycobacterial Uveitt (PMU) som en modell for postinfeksiøs uveitt

Published: December 17, 2021 doi: 10.3791/62925
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Ophthalmology, University of Washington, 2Academic Unit of Ophthalmology, Translational Health Sciences, University of Bristol

Summary

Denne protokollen skisserer trinnene for å indusere primet mykobakteriell uveitt (PMU) hos mus. Denne metoden skisserer trinnene for å bidra til å produsere pålitelig og robust okulær betennelse i musemodellsystemet. Ved hjelp av denne protokollen genererte vi uveitiske øyne og uinflammede medøyne fra enkeltdyr for videre evaluering med immunologiske, transkriptomiske og proteomiske analyser.

Abstract

Begrepet 'uveitt' beskriver et heterogent sett med tilstander som alle har intraokulær betennelse. I stor grad er uveitt definert av etiologi: infeksjon eller autoimmunitet. Infeksiøs uveitt krever behandling med passende antimikrobielle midler, mens autoimmun uveitt krever behandling med kortikosteroider eller andre immunosuppressive midler. Postinfeksiøs uveitt er en form for kronisk uveitt som krever kortikosteroider for å kontrollere immunfølger etter den første infeksjonen. Uveitt assosiert med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infeksjon er en anerkjent form for postinfeksiøs uveitt, men sykdomsmekanismene er ikke fullt ut forstått. For å forstå hvilken rolle mykobakterielle antigener og medfødte ligander spiller for å stimulere kronisk okulær betennelse etter mTB-infeksjon, ble modellen Primed Mycobacterial Uveitt (PMU) utviklet for bruk hos mus. Dette manuskriptet skisserer metodene for å generere PMU og overvåke det kliniske forløpet av betennelse ved hjelp av fargefundus og optisk koherenstomografi (OCT) avbildning. PMU induseres ved immunisering med varmedrept mykobakterielt ekstrakt etterfulgt av intravitreal injeksjon av samme ekstrakt i ett øye syv dager senere. Okulær betennelse overvåkes i lengderetningen ved hjelp av in vivo-avbildning og etterfølges av prøvetaking for et bredt spekter av analyser, inkludert histologi, flowcytometri, cytokinanalyse, qPCR eller mRNA-sekvensering. Musemodellen til PMU er et nyttig nytt verktøy for å studere okulære responser på mTB, mekanismen for kronisk uveitt, og for prekliniske effektivitetstester av nye antiinflammatoriske terapier.

Introduction

Begrepet 'uveitt' beskriver et heterogent sett med tilstander som alle har intraokulær betennelse1. Dyremodeller av uveitt er viktige for å forstå sykdomsmekanismer og for preklinisk testing av nye terapier. En rekke dyremodeller av uveitt er etablert2. De to som har blitt studert mest omfattende er eksperimentell autoimmun uveitt (eller uveoretinitt; EAU) og endotoksinindusert uveitt (EIU). EAU genereres vanligvis ved immunisering med okulære antigener eller kan oppstå spontant når sentral toleranse forstyrres i fravær av AIRE-genet 3,4. Andre varianter av modellen har siden blitt utviklet 5,6,7 for å inkludere forskjellige uveitogene peptider; disse har blitt gjennomgått omfattende 8,9,10. EAU er den primære modellen for former for T-celleavhengig autoimmun uveitt som Vogt-Koyanagi-Harada sykdom og fugleskudd chorioretinitt hos mennesker. EIU genereres ved systemisk eller lokal injeksjon av bakteriell lipopolysakkarid (LPS)10,11. EIU har blitt brukt som en modell av akutt uveitt generert ved aktivering av medfødte immunsignalveier12. Begge modellene har vært medvirkende til dagens forståelse av okulær immunologi, men ingen av dem er effektive modeller for postinfeksiøs kronisk uveitt. Nylig etablert hos mus, gir Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) -modellen nå en tilnærming til å forhøre og evaluere kliniske og cellulære aspekter ved denne form for uveitt13.

Det er en høy forekomst av mykobakteriell infeksjon over hele verden, med over 10 millioner nye tilfeller og mer enn 1,4 millioner dødsfall rapportert av Verdens helseorganisasjon i 201914. Ekstrapulmonal manifestasjon av aktiv tuberkulose (TB) infeksjon inkluderer uveitt og er en anerkjent årsak til infeksiøs uveitt15,16. Manifestasjonene av TB-assosiert uveitt er protean, noe som sannsynligvis gjenspeiler flere forskjellige sykdomsmekanismer for å inkludere direkte okulær infeksjon, samt mindre godt forstått immunmediert betennelse17,18,19. De foreslåtte mekanismene for disse postinfeksiøse følgene inkluderer en kronisk inflammatorisk respons stimulert av persistensen av en pauci-bacillary infeksjon i retinalpigmentepitelet (RPE), en kronisk inflammatorisk respons stimulert av tilstedeværelsen av gjenværende patogenassosierte molekylære mønstre (PAMPs) fra en vellykket ryddet okulær infeksjon, og upassende aktivering av den adaptive immunresponsen mot okulære antigener gjennom en prosess med molekylær etterligning eller antigen. spredning forårsaket av systemisk TB-infeksjon20,21,22,23.

For å få en bedre mekanistisk forståelse av kronisk postinfeksiøs uveitt og studere rollen som mykobakterielle antigener i initiering av sykdom, ble PMU-modellen utviklet for bruk hos mus13,24. Følgelig, for å fremkalle betennelse, mottar musen først en subkutan injeksjon av antigen fra den varmedrepte Mycobacterium tuberculosis H37Ra-stammen for å etterligne systemisk infeksjon, etterfulgt syv dager senere av intravitreal injeksjon av det samme antigenet administrert til venstre eller høyre øye for å etterligne lokal okulær infeksjon. Intensiteten og varigheten av den påfølgende uveitten overvåkes av langsgående in vivo optisk koherenstomografi (OCT) og fundal avbildning av øyet25. PMU er preget av en akutt, myeloid-dominerende panuveitt som utvikler seg til en kronisk T-celle-dominerende bakre uveitt med vitritt, perivaskulær retinal betennelse og fokale områder av ytre retinal skade26. Tilstedeværelsen av granulomatøs betennelse i øyets bakre segment antyder at PMU-modellen kan brukes til å studere noen former for fremre (granulomatøs og ikke-granulomatøs) og intermediær uveitt, sett hos pasienter med immunologisk bevis på tidligere Mtb-infeksjon27. I tillegg har komponentene av varmedrept Mtb som brukes i PMU-modellen blitt foreslått å utløse immunresponser som ligger til grunn for aspektene av tilbakevendende uveitt hos pasienter med okulær tuberkulose som reagerer på anti-tuberkulær terapi (ATT)28. På grunn av forskjellene i sykdomsinitiering og inflammatorisk kurs sammenlignet med EAU og EIU, representerer PMU en ny dyremodell av uveitt som ikke er avhengig av immunisering med okulære antigener og kan bidra til å belyse sykdomsmekanismer hos pasienter med kronisk uveitt. Denne protokollen skisserer metodene for å generere PMU, overvåke det kliniske forløpet av inflammasjon og samle okulære prøver for post mortem-analyse med flowcytometri.

Protocol

Alle prosedyrer som ble utført ble godkjent lokalt av Animal Care and Use Committee ved University of Washington (dyrestudieprotokoll # 4481-02) eller i samsvar med Storbritannias hjemmekontorlisens (PPL 30/3281) og University of Bristol Ethical Review Group. Eksperimenter utført ved begge institusjonene var i samsvar med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Statement for bruk av dyr i oftalmisk og visuell forskning. PMU ble generert i 6-10 uker gamle C57BL/6J mus; alle musene veide minst 18 g ved tidspunktet for uveittinduksjon og ble bekreftet negative for rd8-mutasjonen av Crb1-genet29. Mus ble vedlikeholdt med standard chow og medisinert vann (paracetamol 200-300 mg / kg / dag) ad libitum under spesifikke patogenfrie forhold. Eutanasi fra dyr ble utført ved hjelp av en standard inhalasjonsmetodefor karbondioksid 30.

1. Antigenpreparat for subkutan injeksjon

  1. Utfør alle prosedyrene i denne delen inne i en kjemisk avtrekkshette for å forhindre innånding eller hudkontakt med Mtb H37Ra-pulveret. Håndter i henhold til dine institusjonelle retningslinjer for Complete Freund's Adjuvant (vanligvis BSL-1). Dette inkluderer bruk av kjemikaliebestandige hansker, vernebriller og beskyttende arbeidsklær (laboratoriefrakk).
  2. Bruk en god steril teknikk for å forhindre kontaminering av reagenser som vil bli introdusert i forsøksdyr.
  3. Lag Mtb-suspensjonen i PBS ved å blande 5 mg lyofilisert, varmedrept M. tuberculosis H37Ra-pulver med 2,5 ml kald PBS i et 5 ml mikrosentrifugerør. Vortex en gang i 30 s og legg deretter på is.
  4. For å generere en fin suspensjon av H37Ra i PBS, sonikerer suspensjonen på is i 5 minutter.
    1. Løsne kabinettet til omformerenheten og rengjør sonden med en 70 % (v/v) spritserviett.
    2. Slå på sonikatoren, juster strøminnstillingen til 4 ved å vri på strømkontrollknappen og senk sondens spiss i det PBS-holdige mykobakteriepulveret. Forsikre deg om at sondespissen er nedsenket til minst halvparten av prøvedybden, og at sondespissen ikke berører veggen på mikrosentrifugerøret.
  5. Sonicate blandingen på is i 30 s, pause 30 s og gjenta i totalt 5 minutter for å spre pulveret helt i en jevn suspensjon uten å varme opp væsken.
  6. Tilsett 2,5 ml Freunds ufullstendige adjuvans til blandingen og gjenta sonikeringsprosessen på is til emulsjonen danner en tannkremlignende konsistens.
  7. Sett strømmen til 0 ved hjelp av kontrollknappen og slå av enheten for å avslutte sonikeringen. Fjern spissen fra suspensjonen og tørk sonden med en spritserviett.
  8. Oppbevar antigenemulsjonen ved 4 °C. Å lage partier av emulsjonen vil bidra til å sikre konsistens på tvers av eksperimenter. Emulsjonen kan oppbevares ved 4 °C i inntil 3 måneder.

2. Subkutan injeksjon

  1. Utfør subkutan injeksjon en uke før den intravitreale injeksjonen (betegnet som dag -7).
  2. Legg i en 1 ml sprøyte (ingen nål festet) med mykobakterien emulsjon. På grunn av emulsjonens viskositet og opasitet kan luftbobler som er vanskelige å se fylle sprøyten.
    1. For å forhindre luftbobler i sprøyten, etter å ha lagt 0,2-0,3 ml emulsjon, snu sprøyten (spissen vendt opp) og bank forsiktig sprøyten gjentatte ganger på kanten av en teller for å bringe boblene til overflaten.
  3. Fjern luften fra sprøyten og fortsett å fylle sprøyten. Inverter og trykk periodisk til den er fylt.
  4. Plasser en 25 g kanyle på sprøyten og sett emulsjonen fremover for å fylle kanylen. Oppbevar sprøyten på is til den er brukt.
  5. For å utføre den subkutane injeksjonen trygt, må du enten bedøve musen eller bruke humane fastholdelsesmetoder som gir enkel tilgang til dyrets bakkropp31.
  6. For å bedøve for subkutan injeksjon, plasser dyret i et isofluran induksjonskammer (3% -4% for induksjon og 1% -3% for vedlikehold). Når bedøvet, sørg for at musen har en langsom respirasjonsfrekvens og viser ingen tegn på respiratorisk nød.
  7. Plasser subkutane injeksjoner på enten den dorsale overflaten av hoftene, eller på den ventrale overflaten av bena proksimalt til regionen av inguinal lymfeknuter.
    1. Stikk kanylen forsiktig inn for å unngå injeksjon i muskelen. Injiser 0,05 ml av Mtb-emulsjonen i det subkutane rommet. Ikke fjern nålen umiddelbart for å la den tykke emulsjonen bli fullstendig injisert.
    2. Gjenta injeksjonen på både venstre og høyre side i totalt 0,1 ml per dyr.
  8. Hvis bedøvet, legg musen på en varm varmepute til fullstendig gjenoppretting. Ikke la musen være uten tilsyn før den har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal tilbakeholdenhet.
  9. Returner musen til buret når den er fullstendig restituert og merk burkortet med datoen for subkutan injeksjon.
  10. Gi analgesi med oral paracetamol (200 mg / kg / dag), men ikke NSAIDs som antiinflammatoriske midler kan påvirke induksjonen av uveitt.

3. Antigen lager forberedelse til intravitreal injeksjon

  1. Utfør alle prosedyrer i dette avsnittet under passende sterile forhold for å forhindre kontaminering av den intravitreale Mtb-suspensjonen.
  2. Gjør de intravitreal suspensjoner.
    1. For induksjon av mild til moderat panuveitt, gjør den intravitreale suspensjonen ved en 5 mg / ml konsentrasjon ved å legge 5 mg av mykobakterieekstraktet til 1 ml 1x PBS.
    2. For induksjon av moderat til alvorlig panuveitt, gjør den intravitreale suspensjonen ved en 10 mg / ml konsentrasjon ved å tilsette 10 mg av mykobakterieekstraktet til 1 ml 1x PBS.
  3. Vortex en gang i 30 s og legg deretter på is.
  4. For å generere en fin suspensjon av H37Ra i PBS, sonikerer suspensjonen på is i 10 minutter som beskrevet i trinn 1.4. Aliquot denne lagerløsningen i 100 μL volumer og lagre ved -20 °C.
  5. Før bruk, tine ved romtemperatur og vortex på høy i 1 min. Hold aliquots på is under transport til dyreavdelingen.

4. Intravitreal injeksjonsprosedyre på dag 0

  1. Animal forberedelse
    1. Bruk vernehansker, plasser musen på en veiebalanse for å oppnå vekten i gram.
    2. Gi en intraperitoneal injeksjon på 0,02 ml/g kroppsvekt av en oppløsning som inneholder 100 mg/ml ketamin og 20 mg/ml xylazin blandet med sterilt vann for å bedøve dyret. En alternativ tilnærming inkluderer induksjon ved bruk av ~1,5 % isofluran (inhalert).
    3. Vent ca. 2 minutter til musen sovner, og legg deretter musen i en oppvarmingsboks og dekk lokket. Utfør smertereflekstester som øre, tå og haleklemme for å vurdere anestesidybden for prosedyren32.
    4. Når du sover, bedøv hornhinnen med 1 dråpe 0,5% (v / v) tetrakain. Unngå å få tetrakain nær nesen eller munnen av musen. Etter 10 s, dab av overflødig væske.
      MERK: Det er observert at irisdilatasjon og visualisering av fremre kammer (AC) forbedres når topikal anestesi administreres, muligens på grunn av forbedret hornhinnereflekssuppresjon med kombinert systemisk og aktuell anestesi. Dette trinnet kan imidlertid utelates hvis ønskelig.
    5. Dilate eleven med 1 dråpe 2,5% (v / v) fenylefrin. Vær forsiktig for å unngå overflødige dråper som kan komme inn i nesen eller munnen. Etter 2-3 min, dab av overflødig væske.
    6. For å redusere risikoen for endofthalmitis, legg til 1 dråpe 5% betadin til øyets overflate og omgivende hår. La på øyet i 2-3 min.
      MERK: Utfør alle prosedyrer i denne delen under passende sterile forhold for å forhindre endoftalmitt.
    7. Fjern betadin og dekk øyet med hypromellose (0,3%) eller carbomer eye gel 0,2% w / w) for å forhindre tørrhet under anestesi. Dette vil også bidra til å forhindre kataraktdannelse.
  2. Sette opp mikroinjeksjonssystemet
    1. Utfør den intravitreale injeksjonen ved hjelp av en mikropumpe koblet til en mikrosprøytepumpekontroller og en injeksjonssprøyte (figur 1A-C). Alternativt kan du injisere med en 33 G kanyle festet til en Hamilton-sprøyte som beskrevet i punkt 4.4.
    2. Koble en 34 G kanyle til injeksjonsholderen for å sette injektoren sammen. Løsne den sølvfargede skrukorken foran på injeksjonsholderen og skyv kanylen inn i holderens kropp omtrent halvveis. Stram den sølvfargede skrukorkfingeren stramt.
    3. Koble slangen til injeksjonsholderen som nevnt i trinn 4.2.4-4.2.5.
    4. For å sette slangen på injeksjonsholderen, løsne plastskruen på baksiden av holderen, skyv slangen gjennom pakningen på innsiden og stram skruen.
    5. Oppretthold en liten åpning med enden av slangen for å forhindre skade på slangen under injeksjonen. Se figur 1C.
    6. Tine en 100 μL aliquot av mycobacterium lager suspensjon.
    7. Tilsett 3 μL av en 1% fluoresceinnatrium (AK-Fluor) løsning og hvirvelbrønn.
    8. Last en 10 μL sprøyte med antigen- og fluoresceinblandingen uten å inkludere luftbobler.
    9. Fjern lastekanylen fra sprøyten, og skyv slangen gjennom den sølvfargede skrukorken til spissen når nullmerket i sprøytekroppen.
    10. Når tuppen av slangen er riktig justert til ønsket posisjon, strammer du skrukorkfingeren stramt.
    11. Skyll oppløsningen i sprøyten gjennom injeksjonsslangen for å laste systemet helt inn. Gjenta deretter trinn 4.2.8-4.2.11 for å fylle sprøyten til injeksjon.
    12. For å installere den lastede sprøyten på mikropumpen, trykk på klemmeutløsningsknappen på enden av mikropumpen for å åpne sprøyteklemmene.
    13. Plasser hetten på stempelet inn i stempellokkholderen i bakenden av mikropumpen.
    14. Skyv deretter sprøytekragen på kragestoppet og sprøytekroppen inn i sprøyteklemmen.
    15. Slipp klemknappen og stram stempelholderskruen. Se figur 1D.
    16. Skyv injeksjonsholderen og kanylen gjennom o-klemmen på det stereotaktiske injeksjonsapparatet. Dette er en tilpasset plattform; Alternativt kan sprøyten holdes og plasseres manuelt.
    17. Still inn infusjonsvolumet og infusjonsvolumet på mikrosprøytepumpekontrolleren til å injisere 500 nL per syklus med en hastighet på henholdsvis 40 nL/s.
      MERK: Raskere injeksjonshastigheter kan brukes, men mer refluks kan oppleves før nålreposisjonering kan oppnås.
    18. Test systemet for å sikre riktig funksjon før du utfører en intravitreal injeksjon.
      MERK: Når injeksjonssystemet fungerer som det skal, vil aktivering av en injeksjonssyklus ved hjelp av fotpedalen eller kontrollputen gi synlige bevegelser av stempellokkholderen, og en liten dråpe grønn væske vil bli sett på spissen av nålen. Hvis det ikke produseres væske, må du aktivere flere sykluser eller skylle sprøyten og fylle sprøyten på nytt.
    19. Før du injiserer øyet, tørk kanylen forsiktig med en 95 % etanolpute.
  3. Intravitreal injeksjon prosedyre
    1. Musen er plassert på et stereotaksisk apparat for å utføre injeksjonsprosedyren.
    2. Hold scenen / plattformen som musen hviler på varm ved å feste 2-3 papirhåndklær på overflaten.
    3. Plasser musen i en utsatt stilling på plattformen. Bruk høyre og venstre ørestenger for å fikse dyrets hode forsiktig. Se figur 1E.
    4. Plasser musen og orienter under rammen slik at det overlegne neseaspektet av høyre øye er synlig.
    5. Bruk en 30 G nål for å forskyve øyevippene og eksponere scleraen. Visualiser limbus og det radiale blodkaret.
    6. Bruk en steril 30 G nål for å lage et styrehull i sclera 1-2 mm bakre til limbus.
    7. Stikk 34 G kanylen som er festet til injeksjonsholderen inn i øyet gjennom styrehullet i en vinkel som vil unngå linsen, men plasser nålespissen inn i glasslegemet.
    8. Bruk mikrosprøytepumpekontrolleren til å injisere forsiktig 1 μL av Mtb-ekstraktet i glasslegemet. Ved konsekvent refluks, øk injeksjonsvolumet til 1,5 μL for å sikre tilstrekkelig dosetilførsel.
      MERK: For humbugkontroller, injiser 1 μL PBS i dyrets øye.
    9. Verifiser intravitreal plassering ved visualisering av en grønn refleks i øyet. Se figur 1F.
    10. Etter 10 s, trekk nålen ut av øyet. Legg merke til eventuell refluks.
    11. Fjern musen fra plattformen, plasser 0,3% hypromellose eller 0,2% w / w carbomer øyesalve på begge øynene for hornhindebeskyttelse, og flytt til gjenopprettingsoppvarmingsboksen.
    12. Ikke la musen være uten tilsyn før den har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal tilbakeholdenhet. Ikke gå tilbake til selskap med andre dyr før de er fullstendig gjenopprettet.
    13. Når musen er helt våken, gå tilbake til buret og tilsett paracetamol (200-300 mg / kg / dag) medisinert vannflaske. Merk burkortet med dato for IVT-injeksjon.
    14. Intravitreale injeksjoner tolereres generelt godt. Kliniske tegn som kan indikere smerte og behovet for fjerning fra studien inkluderer periokulær alopecia (indikativ for selvtrauma), hornhinnesår, vekttap og bøyd holdning.
  4. Alternativ metode for intravitreal injeksjon
    MERK: Denne prosedyren utføres ved hjelp av et operasjonsmikroskop og en 33 G nål på en mikrosprøyte.
    1. Proptose øyet og hold det på plass med et par tang.
    2. Påfør deretter carbomer eye gel 0,2 % w/w eller 0,3 % hypromellose øyegel og legg et sirkulært deksel (7 mm diameter) over øyet.
    3. Monter en 33 G hypodermisk nål på en 5 μL Hamilton sprøyte og sett den inn ca. 2 mm omkrets til hornhinnen limbus med en ~ 45 ° injeksjonsvinkel.
    4. Før nåleskråkanten inn i glassplaten, stopp mellom linsen og optisk plate (fra kirurgens relative synspunkt, dette er over / dekker optisk plate - ca. 1,5 mm fra innsettingsstedet), og injiser 2 μL Mtb (ved 2,5 ug / μL i PBS) sakte.
    5. Hold nålen på plass en kort stund (for å redusere mengden refluks av injeksjon) og fjern den deretter.
    6. Etter injeksjon, reposit kloden ved å frigjøre tangen. En dråpe på 1% w / w kloramfenikol salve kan administreres til øyet på dette tidspunktet for å gi ytterligere beskyttelse mot endoftalmitt etter injeksjon.
    7. Etter injeksjon, flytt til gjenopprettingsoppvarmingsboksen som nevnt i trinn 4.3.11-4.3.13.

5. OCT-avbildning for å oppdage og kvantifisere uveitt

  1. Animal forberedelse
    1. Bedøv musen som beskrevet i trinn 4.1.2-4.1.4
    2. Dilate eleven med 1 dråpe 2,5% fenylefrin. Vær forsiktig for å unngå overflødige dråper som kan komme inn i nesen eller munnen. Etter 2-3 minutter, dab av overflødig væske.
    3. Plasser 0,3% hypromellose eller 0,2% w / w carbomer gel på øyet for å forhindre tørrhet under anestesi. Dette vil også bidra til å forhindre kataraktdannelse.
    4. Pakk musen i et lag kirurgisk gasbind for å opprettholde kroppsvarmen og legg den på dyrekassetten. Plasser hodet med bitestangen.
  2. Skaff OCT-bildene av de fremre og bakre kamrene.
    MERK: Hvis du får fremre og bakre kammerbilder, må du først ta bilder av bakre kammer (PC) for å forhindre bildeforringelse etter kataraktdannelse. Kataraktdannelse kan forebygges med hyppig smøring og påføring av 0,3% hypromellose eller 0,2% w / w carbomer øyegel. For utvidet bildebehandling (>10 min) hjelper det også å holde musen varm (ved bruk av en varmepute).
    1. Når du har slått på OCT-bildesystemet, sikrer du riktig bildelinse og justerer referansearmens posisjon etter behov.
    2. Åpne bildebehandlingsprogramvaren, opprett den unike muse-ID-en og begynn avbildningen per OCT-produsentens protokoll.
    3. Bruk Free Run-alternativet med hurtigskanningsprotokollen, og plasser øyet med optisk nerve sentrert på bakre kammerbilder eller toppen av hornhinnen på fremre kammerbilder.
      MERK: Tabell 1 inneholder bildeprotokollparametere for to kommersielt tilgjengelige avbildningssystemer for små dyr. Se materialfortegnelsen for produktspesifikasjoner.
    4. For bakre kammeravbildning, bring OCT nær overflaten av øyet. Vær forsiktig for å unngå å bringe overflaten av linsen i kontakt med øyet.
    5. Når øyet er riktig plassert, stopper du hurtigskanningen og velger volumskanningsprotokollen, og aktiverer skanningen med Aim-alternativet .
    6. For bakre segmentbilder justerer du til synsnerven er sentrert i bildet for horisontal B-skannejustering og at netthinnen er justert med den vertikale justeringsaksen
    7. For fremre segmentbilder justerer du posisjonen for å midtstille toppen av hornhinnen i både bildet Vannrett justering av B-skanning og Loddrett justering B-skanning. Tilstedeværelsen av en refleksjonsartefakt i begge bildene vil bekrefte riktig justering. Skift deretter det horisontale bildet nok til å fjerne refleksjonsartefakten. Se figur 2.
    8. Klikk på Snapshot for å fange volumskanningsbildet, og klikk deretter på Lagre.
    9. Deretter får du den gjennomsnittlige sentrale linjeskanningen. Åpne skanneprotokollen og klikk på Sikt etterfulgt av Øyeblikksbilde. Høyreklikk på det samme panelet og klikk deretter på Gjennomsnitt.
    10. Gjenta trinn 5.2.1-5.2.9 for hvert øye med begge linsene.
    11. Når alle bildene er samlet inn, fjerner du musen fra kassetten og gir hornhinnebeskyttelse under gjenoppretting som oppført i trinn 4.3.11-4.3.13.

6. Scoring betennelse ved OCT

  1. Score OCT-bildene ved hjelp av gradere som er maskert til behandlingstilstanden.
    MERK: For PMU i musemodellen anbefales poengsystemet i tabell 2 .
  2. Hvis både fremre kammer (AC) og bakre kammer (PC) bilder ble oppnådd, kombiner disse poengene for å få den endelige poengsummen for hvert øye.
    MERK: Fremre kammerbetennelse løser seg før bakre kammerbetennelse.

7. Scoring betennelse ved post-mortem histologi

  1. På slutten av eksperimentet, samle individuelle øyne ved enukleasjon, fest i 4% formaldehyd over natten, og fortsett for parafininnbygging, seksjonering og H&E farging33.
    MERK: Flere 4-8 μm seksjoner langs pupillary-optisk nerveakse anbefales.
    MERK: Tre seksjoner per øye blir scoret av en maskert grader ved hjelp av poengsystemet gitt i tabell 3, og gjennomsnittlig poengsum for de tre seksjonene rapporteres som den endelige histologiske betennelsesscoren.

Representative Results

Denne protokollen demonstrerer induksjon av uveitt hos mus ved bruk av primet mykobakteriell uveittmodell (PMU). Å sikre konsistens i subkutan injeksjon og nøyaktighet av den intravitreale injeksjonen er viktige trinn i utviklingen av den primede mykobakterielle uveittmodellen (PMU). Figur 1 viser musens intravitreale injeksjonsprosedyre ved bruk av et stereotaksisk apparat. Ørestenger bidrar til å plassere hodet forsiktig på samme sted under mikroskopet (figur 1E). De holder også hodet stabilt under den intravitreale injeksjonsprosedyren, noe som reduserer risikoen for injeksjonstraumer. Etter en vellykket injeksjon gir fluorescein i injeksjonsoppløsningen en grønn refleksjon fra øyet som kan ses under mikroskopet eller fra sidevisning som vist i figur 1F.

Når den utføres som skissert, genererer protokollen robust akutt uveitt som kan oppdages ved hjelp av OCT og fundus-avbildning så tidlig som 10 timer etter intravitreal injeksjon. Figur 2 viser riktig justering av øyet for OCT-avbildning. Tabell 1A viser parametrene som brukes i OCT-protokollen. En systematisk tilnærming til å skaffe bilder vil gi bilder av høy kvalitet som kan sammenlignes over tid. Fremre kammerbilder er sentrert på toppen av hornhinnen ved hjelp av SLO bilde av en face (figur 2A) med iris justert parallelt med både horisontale og vertikale plan (figur 2B, C). Volum- og linjeskanninger registreres med en vertikal justering slik at underordnede og overlegne regioner kan vises samtidig. Bakre segmentbilder er sentrert på synsnerven ved hjelp av SLO en face-bildet (figur 2D), og det lyse båndet til RPE brukes til å justere netthinnen parallelt med både horisontale og vertikale plan (figur 2E, F).

Figur 3 viser typiske funn av PMU-øyebetennelse ved bruk av OCT-bildediagnostikk. Tjuefire timer etter intravitreal injeksjon ses inflammatoriske celler i vandig og glassaktig (figur 3B). I nærvær av moderat eller alvorlig betennelse, vil en hypopyon bli sett i dårligere vinkel i AC. Graden av okulær betennelse kan skåres på disse OCT-bildene ved hjelp av kriteriene i tabell 2. Representative eksempler på bilder som demonstrerer de inflammatoriske egenskapene som er typiske for hver poengsum, er vist i figur 4. AC- og PC-kammerpoeng kan legges sammen for å generere den kombinerte OCT-poengsummen. Kombinert score >0, men ≤2,5 representerer mild betennelse. Moderat betennelse bestemmes av score >2,5, men ≤4,5. Score >4,5 identifisere alvorlig betennelse. Betennelse topper vanligvis 48 timer etter intravitreal injeksjon med OCT-score i AC og PC mellom 1 og 3 (kombinert score mellom 2 og 6). AC- og PC-score på 0,5 eller 4 er mindre vanlige. I tilfelle score utenfor det typiske området oppstår ofte, kan feilsøking være nødvendig for å identifisere faktorene som bidrar til outlier score (se diskusjonsdelen). Inflammasjonsscore i fremre kammer har en tendens til å gå tilbake til null innen en uke etter intravitreal injeksjon. I motsetning til dette går ikke bakre score tilbake til null; I stedet vedvarer kronisk betennelse på lavt nivå i form av vitritt, og perivaskulære lymfocytter infiltrerer i netthinnen i 1-2 måneder etter intravitreal injeksjon.

Inflammasjonsscore i PMU kan også bestemmes ved hjelp av histologi. Figur 5 viser representative H&E-seksjoner til bruk for skåring av alvorlighetsgraden av PMU etter histologi. Antall inflammatoriske celler i vandig og glassaktig telles og brukes til å bestemme alvorlighetsgraden ved hjelp av scorekriteriene oppført i tabell 3. Inflammatorisk celleinfiltrasjon av ciliærlegemet ses ofte på den ene siden av histologisk seksjon (ensidig involvering) ved mild eller moderat betennelse. Når betennelse er alvorlig, reflekteres dette ved tilstedeværelsen av et inflammatorisk celleinfiltrat i ciliary kroppen på begge sider av linsen (betegnet bilateral involvering). Under senere tidspunkter etter intravitreal injeksjon kan kroniske betennelsesmanifestasjoner, inkludert tilstedeværelse av perivaskulære og intraretinale leukocytter og ytre retinale folder, også identifiseres. Histologi kan også være nyttig for å identifisere øyne påvirket av dårlige injeksjonsteknikker. Traumer til linsen under intravitreal injeksjon kan identifiseres ved tilstedeværelse av amorfe eosinfargede (rosa) linseproteiner utenfor linsekapselen ved siden av traumeområdet. Refluks av intravitreal mTB i subkonjunktivrommet vil generere betennelse utenfor øyet som kan identifiseres ved en nøye gjennomgang av periokulære strukturer tilstede på seksjonene. På grunn av manglende evne til å beholde mTB-ekstrakt i øynene, vil disse øynene vanligvis ha lave OCT-score av betennelse.

Brightfield fundus-avbildning kan også brukes til å identifisere klinisk relevante aspekter ved PMU, inkludert utvikling av hypopyon, vitritt og retinal eller perivaskulær inflammatorisk celleinfiltrasjon. Figur 6 viser to eksempler på at retinal og perivaskulær inflammasjon kan ses på fundusbilder. Disse to øynene viser også rekkevidden av betennelse som er vanlig i PMU-modellen. Tabell 1B viser parametrene som brukes i fundus/retinal OCT imaging system. Legg merke til hvilken innvirkning alvorlig betennelse har på bildekvaliteten (figur 6, dag 2, OCT og fundusbilder i øverste rad) og omfanget av sykdom som er tilstede på dag 21. Kornealødem kan også redusere bildekvaliteten under akutt betennelse; Det er imidlertid uvanlig at hornhinneødem er alvorlig fra betennelse alene. Mer vanlig vil bildekvaliteten bli forringet av epitelskader som følge av ufullstendig overflatebeskyttelse under bildebehandling og anestesihendelser.

PMU-modellen kan brukes til å indusere uveitt i en hvilken som helst muserase eller genotype. I albino øyne kan OCT fortsatt brukes til å score betennelse, men fraværet av fundus pigment gjør visualisering av betennelse utfordrende ved brightfield imaging13,34. Post mortem studier kan utføres på okulært vev, regionale lymfeknuter, eller milten. Noen eksempler inkluderer analyser for tilstedeværelse av immunceller som flowcytometri og immunhistokjemi og måling av inflammatoriske cytokiner. Ved alle tidspunkter testet etter initiering av betennelse med PMU (dag 1 til dag 56), er det tilstrekkelig med CD45+ inflammatoriske celler i individuelle øyne til å oppdage mange store leukocyttpopulasjoner i øyet ved multiparameterstrømningsanalyse12,35. Vandig (2-5 μL) og glassaktig (5-10 μL) humor kan hentes fra betente øyne for proteinkonsentrasjonsbestemmelse, proteomiske studier eller cytokinkonsentrasjonsbestemmelse36.

Figure 1
Figur 1: Intravitreal injeksjon med mus satt opp. Den intravitreale injeksjonen utføres på museøyet ved hjelp av (A) en mikrosprøytepumpekontroller koblet til (B) mikropumpen og (C) en injeksjonssprøyte. Sprøyten er lastet og montert på (D) Micropump. Musehodet er plassert ved hjelp av (E) ørestenger for å sikre stabilitet og konsistens under den intravitreale injeksjonsprosedyren. (F) Fluorescein i injeksjonsoppløsningen gir en grønn refleksjon fra øyet etter en vellykket prosedyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Riktig justering av øyet for OCT-avbildning . (A) Ved hjelp av SLO-bildet (en-face scanning laser ophthalmoscope) er øyet sentrert for fremre kammeravbildning. Den grønne linjen angir posisjonen til den horisontale linjeskanningen som vises i panel (B). Legg merke til at den sentrale hornhinnen unngås for å redusere refleksjonsartefakt. (C) Vertikal B-Scan gjennom det paracentrale fremre kammeret. Denne skanningen oppnås ved 90 ° fra den horisontale skanningen. Merk at justeringen av irisseksjonene på hver side av objektivet er jevn i den horisontale skanningen (panel B) og ordnet over hverandre i den vertikale skanningen (panel C). (D) Ved hjelp av SLO-bildet er det bakre kammerbildet sentrert på optisk nerve. (e) horisontal B-skannejustering, (f) vertikal B-skannejustering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Induksjon av PMU genererer panuveitt som kan overvåkes ved longitudinell OCT-avbildning. Den øverste raden viser fremre kammer (AC); den nederste raden viser OCT-bilder i bakre kammer (PC) for å markere patologiske forandringer i sykdomsforløpet. (A) OCT-bilde ved baseline av AC (øverst) og PC (nederst) før induksjon av uveitt, begge skår 0. (B) Dag 1 etter intravitreal injeksjon som viser tilstedeværelse av hornhinneødem (svart pil), en hypopyon (*) flere frittflytende inflammatoriske celler i AC (hvite piler) og vitritis (hvite pilspisser) i PCen. (C) Dag 7 etter intravitreal injeksjon med få AC-celler på den fremre linsekapselen (hvit pil) og redusert vitritis (hvit pilspiss). (D) Dag 28 etter intravitreal injeksjon fremre kammer med løst AC betennelse og mild vitritt. Forkortelser: C- hornhinnen, L - linse, I - iris, Aq - vandig, V glasslegeme, RGC - retinal ganglionceller, PR - fotoreceptorer, Ch- choroid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på OCT-poengsum. En OCT-score mellom 0 og 4 tilordnes hvert AC-bilde og PC-bilde ved hjelp av det kategoriske systemet vist i tabell 2. AC- og PC-poengene kombineres for den endelige OCT-poengsummen for øyet. (A,D) Eksempler på en poengsum på null. (B,E) Eksempler på en poengsum på 0,5. (C,F) Eksempler på en poengsum på 1. (G,J) Eksempler på en poengsum på 2. (H,K) Eksempler på en poengsum på 3. (I,L) Eksempler på en poengsum på 4 er vist i panel I og L. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Eksempler på histologiskår. Histologisk score bestemmes basert på fem egenskaper som er synlige i H&E-seksjoner: Fremre kammerproteintetthet, antall fremre kammerceller, immuncelleinfiltrasjon av ciliærlegemet, glasslegemets celletetthet, retinal vaskulær betennelse og strukturelle retinale forandringer. En poengsum på 0-2 tildeles for hver egenskap. Beskrivelsen av hver skår finnes i tabell 3. En representativ eksempelpoengsum på 0-2 for hver karakteristikk er vist i denne figuren. Den venstre kolonnen viser poengsummen null. Den midterste kolonnen viser eksempler på poengsum 1. Høyre kolonne viser eksempler på poengsum 2. En score på 2 for ciliary body score tildeles hvis ciliary kroppen på hver side av linsen i samme seksjon demonstrerer cellulær betennelse. Den endelige histologiske skåren er summen av skåren for hvert av de fem kriteriene (maks skår 10). Pilen i panelet nederst til høyre indikerer perivaskulære leukocytter assosiert med et overfladisk retinalfartøy. Svart skala bar indikerer 500 μm. Ciliary skala barer indikerer 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Longitudinell fundusavbildning i PMU identifiserte en rekke sykdomsalvorlighetsgrader . (A) Alvorlig betente øyne viser flere hvite infiltrater i netthinnen og vaskulær tortuositet på fargefundusavbildning (øverste rad) samt tett vitritt og retinalt ødem på OCT (nederste rad) på dag 2. Progresjon i antall retinale lesjoner kan ses over tid mens vitritt forbedres. Grønn linje angir posisjonen til OCT-bildet. (B) Mildt betente øyne viser færre og mer diskrete lineære lesjoner i fundus og en rekke infiltrerende celler i glassrommet. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

En
Mus fremre kammer Rask skanning Volum skanning Lineær skanning
Lengde x bredde 4,0 mm x 4,0 mm 3,6 mm x 3,6 mm 3,6 mm
Vinkel 0 90 90
A-skanning/B-skanning 800 1000 1000
# B-skanner 50 400 1
Rammer / B-skanning 1 3 20
Mus bakre kammer Rask skanning Volum skanning Lineær skanning
Lengde x bredde 1,6 mm x 1,6 mm 1,6 mm x 1,6 mm 1,6 mm
Vinkel 0 0 0
A-skanning/B-skanning 800 1000 1000
# B-skanner 50 200 1
Rammer / B-skanning 1 3 20
B
Mus bakre kammer Volum skanning Lineær skanning
Lengde x bredde 0,9 mm x 0,9 mm 1,8 mm
Vinkel 0 Hvilken som helst (vanligvis 0 eller 90)
A-skanning/B-skanning 1024 1024
# B-skanner 512 1
Rammer / B-skanning 1 30

Tabell 1: Skann parametere. (A) OCT-skanneparametere. (B) Fundus/retinal OCT-skanningsparametere

Beskrivelser av OCT-poengsum
Score Fremre kammer Bakre kammer
NA Ingen utsikt utover fremre hornhinne Ingen visning av bakre segment
0 Ingen betennelse Ingen betennelse
0.5 1–5 celler i vandig Få celler som opptar mindre enn 10% av glasslegemet
ELLER hornhinneødem Ingen subretinale eller intraretinale infiltrater eller retinale arkitekturforstyrrelser
1 6–20 celler i vandig Diffuse celler (ingen tette klumper) opptar mellom 10 og 50% av glasslegemet.
ELLER et enkelt lag med celler på den fremre linsekapselen Ingen subretinale eller intraretinale infiltrater eller retinale arkitekturforstyrrelser
2 20–100 celler i vandig Diffuse celler (ingen tette klumper) som opptar > 50% av glasslegemet
ELLER færre enn 20 celler og en hypopyon tilstede Ingen subretinale eller intraretinale infiltrater eller retinale arkitekturforstyrrelser
3 20–100 celler i vandig Diffuse celler lik grad 2 og 1
OG en hypopyon ELLER en pupillmembran OG minst en tett glassaktig opasitet som opptar 10% -20% av glasslegemet ELLER tilstedeværelsen av glasslegemeceller lik grad 2 og sjeldne (≤ 2) subretinale eller ntraretinale fortetninger
4 Et hvilket som helst antall vandige celler Tett glassaktig opasitet opptar > 20% av glasslegemet.
OG en stor hypopyon og pupillmembran ELLER fremre strukturtap på grunn av alvorlig betennelse ELLER diffuse glasslegemeceller med store subretinale eller intraretinale fortetninger

Tabell 2: Kriterier for PMU OCT-skår: OCT-bilder skåres i henhold til kriteriene som er oppført i tabellen. AC- og PC-poeng legges til for å oppnå øyets endelige poengsum. I tilfeller der man ikke fikk et klart syn på øyet, ble bildene tildelt en skår med NA, og disse ble ekskludert fra studien.

Histologi Score Beskrivelse
Karakteristisk 0 1 2
Fremre kammer (AC) protein Lite acellulære partikler som farges med eosin i vekselstrømmen Moderat, men ikke sammenflytende, ekstracellulær eosinfarging hvor som helst i vekselstrømmen Konfluent eller nær konfluent ekstracellulær eosinfarging gjennom vekselstrømmen
Cellen i fremre kammer (AC) Ingen celler 1–100 celler, men ingen tette aggregeringer av celler >100 celler, eller tette aggregeringer av celler
Ciliary Body Betennelse Ingen leukocyttinfiltrasjon av ciliærlegemet eller omkringliggende glasslegeme Ensidig tilstedeværelse av leukocytter som infiltrerer ciliærlegemet og/eller det omkringliggende glasslegemet. Bilateral tilstedeværelse av leukocytter som infiltrerer ciliærlegemet og/eller det omkringliggende glasslegemet.
Retinal vaskulær betennelse Ingen retinale kar med perivaskulære leukocytter Ett fartøy per seksjon med perivaskulære leukocytter >1 kar per seksjon med perivaskulære leukocytter
Retinal fold eller skade Ingen retinal skade 1–3 netthinnefolder per seksjon >3 retinale folder per seksjon, eller annen retinal lagødeleggelse eller intraretinal blødning

Tabell 3: Kriterier for PMU histologiskår: H&E-deler av øyet ble skåret ut fra kriteriene i tabellen. Tre seksjoner fra samme øye ble skåret og gjennomsnitt for å oppnå den endelige histologiskåren i øyet.

Discussion

Dyremodeller av uveitt har vært medvirkende til å forstå mekanismene for okulær betennelse og homeostase, samt muliggjøre preklinisk evaluering av medisinske og kirurgiske terapier for pasienter med uveitt37. Både kanin- og rottevarianter av PMU-modellen har vist sin verdi i preklinisk terapi via proof of concept-studier38,39,40. På grunn av tilgjengeligheten av et mangfoldig utvalg av transgene stammer hos mus, tillater etablering av musens PMU-modellsystem nå mer detaljerte mekanistiske studier for å identifisere spesifikke celletyper, veier og gener som bidrar til patologien til denne sykdommen.

Dyremodeller av uveitt kan demonstrere variasjon fra dyr til dyr i forekomst og intensitet av betennelse41. I musestammen C57BL/6 genereres PMU pålitelig ved hjelp av protokollen som er beskrevet her. Stammespesifikke variasjoner i uveittforløp og intensitet er rapportert for både EAU og EIU42,43. Mens stammespesifikke effekter på alvorlighetsgrad og forløb av PMU ikke er målt eksperimentelt, har denne modellen blitt brukt i villtype C57BL / 6J så vel som i albinomus (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) og produsert lignende inflammatoriske responser. Ved generering av PMU-modellen kan kontroll av hensynene som er oppført nedenfor hjelpe nye forskere med å begrense variabiliteten og produsere den mest konsistente og reproduserbare uveitten.

Sørg for konsistens i subkutane injeksjoner:
For å gi en konsekvent subkutan injeksjon, sørg for at alle luftbobler fjernes fra emulsjonen. Betraktninger inkluderer en kort sentrifuge (30 s ved 400 x g) av den forhåndslagde emulsjonen før sprøyten påføres. Dette vil fjerne luft fanget i emulsjonen. Når du legger sprøyten, må du også periodisk snu (tip-up) og banke på sprøyten for å fjerne eventuelle luftbobler. Ikke plasser sprøyten for dypt mens du injiserer for å unngå intramuskulær injeksjon. Omvendt kan en grunne (intradermale) injeksjon resultere i erosjon av emulsjonen gjennom huden. Husk å ta en kort pause før sprøyten tas ut av injeksjonsstedet for å sikre fullstendig injeksjon av den tykke viskøse emulsjonen og for å forhindre refluks fra huden.

Syv dager etter at subkutan injeksjon er plassert, bekreft tilstedeværelsen av palpable knuter på hver side av bakbenene. Hvis ingen knuter kan identifiseres, er det mulig at luft ble injisert i stedet for emulsjon. I dette tilfellet kan akutt betennelse ikke være så robust, og kronisk betennelse kan ikke utvikle seg.

Forhindre utvikling av smittsom endofthalmitis:
Bakteriell eller sopp endofthalmitis vil generere en forvirrende variabel hvis ikke forhindret44. For å forhindre bakteriell endofthalmitis, må du alltid praktisere god aseptisk teknikk når du lager intravitreal suspensjon, håndtering og rengjøring av alle gjenbrukbare verktøy som kommer i kontakt med øyet. Bruk av sterile engangsartikler, autoklavering eller rengjøring med 95% alkoholvask eller våtservietter er viktig. Riktig bruk av betadin påført den okulære overflaten, lokkene og periokulær pels vil også bidra til å forhindre endofthalmitis45. Det er enkelt å gjenkjenne et øye med infeksjon, da de okulære strukturene vil bli utslettet av ekstrem betennelse under kurset etter injeksjon. Dette er ikke typisk for PMU. Tilstedeværelsen av intraokulær blødning kan også foreslå endoftalmitt eller traumer fra injeksjonen. I slike tilfeller utelukker disse dyrene fra studien.

Sørg for konsistens i den intravitreale injeksjonen:
Den intravitreale injeksjonen er et kritisk trinn i induksjonen av pålitelig og reproduserbar betennelse i PMU. Å gi en konsekvent mengde Mtb-suspensjon med hver injeksjon, unngå traumer og forhindre tilbakestrømning av suspensjonen er alle faktorer som bør vurderes når injeksjonene utføres. For å sikre en jevn suspensjon, vortex stamløsningen grundig ved tining og før du legger den i sprøyten. Siden dette Mtb-ekstraktet som brukes ikke danner en løsning, kan suspensjonen gjennomgå sedimentering over tid. For å sikre jevn konsentrasjon av Mtb-ekstraktet i hver injeksjon, bruk eller utvis og fyll sprøyten på nytt innen 15 minutter etter lasting. Fenylefrin brukes til utvidelse for å gi et større synsfelt til bakre øye og redusere risikoen for traumer i øyet under injeksjonen. Denne dråpen genererer naturlig tilbaketrekning av lokket og liten proptose av kloden, noe som gir god visualisering av området 1-2 mm bakre til limbus uten å måtte gripe øyet med tang. Bruk av tang for å begrense øyet kan forårsake potensielt traume og forbigående øke intraokulært trykk og risikoen for refluks av Mtb-suspensjonen. Traumer kan også være forårsaket av forsøk på å injisere for mye volum i øyet. Injeksjonsvolumet er begrenset til 2 μL for å forhindre signifikant og langvarig økning av intraokulært trykk og traumer i øyet. I tillegg vil yngre dyr ha øyne som er mindre enn voksne mus. Vanligvis 6-8 ukers mus (20-25 g) gir en jevn øyestørrelse og sikrer større konsistens i betennelsen etter injeksjon av Mtb. En høyere frekvens av refluks etter injeksjon av mykobakteriell suspensjon ble observert hos mindre mus. Dette fører igjen til en mindre enn forventet akutt betennelse. En fortynnet fluoresceinoppløsning brukes til å gi nybegynneren visuell tilbakemelding om suksessen til injeksjonsteknikken. Utvidelse på injeksjonstidspunktet vil muliggjøre direkte visualisering av det injiserte materialet i glasshulen og muligheten til å merke tegn på linsetrauma. I tilfelle av linse traumer, kan det føre til en endring i linsens klarhet som vil forårsake en grå stær som kan visualiseres på OCT. Ved okulært traume må øynene utelukkes fra studien på grunn av muligheten for linseindusert uveitt46. Vi anbefaler at du stopper i 10 s før sprøyten fjernes fra øyet for å tillate spredning av Mtb-suspensjonen i øyet og redusere refluks.

PMU-modellen kan modifiseres for å endre intensiteten av akutt betennelse ved å variere konsentrasjonen av Mtb i den intravitreale injeksjonen. Ulike doser fra 2,5 μg / μL til 15 μg / μL har blitt testet tidligere i vårt laboratorium. Imidlertid ble doser høyere enn 10 μg / μL funnet å forårsake alvorlig øyeskade, inkludert spontan linseruptur, alvorlig hornhinneødem og arrdannelse og hyphema. Denne graden av alvorlighetsgrad er ikke typisk hos mennesker med postinfeksiøs uveitt, og disse konsentrasjonene anbefales derfor ikke. En dose på 5 μg/μL ble funnet å gi mild til moderat akutt betennelse og mild kronisk uveitt; dosen på 10 μg/μL gir en pålitelig moderat til alvorlig akutt sykdom og mer bemerkelsesverdig kronisk sykdom. Dermed kan varierende intravitreal konsentrasjon gi alternative sykdomsalvorlighetsgrader for bruk etter behov basert på det eksperimentelle spørsmålet. Kontroller bør velges for å sikre at resultatene skyldes responsen på mTB og ikke traumer forbundet med subkutane eller intravitreale injeksjoner. I sham-injeksjonskontrollene kan PBS brukes i stedet for mTB-ekstraktet. For sammenligninger med ueksponerte dyr, bør sanne naive prøver vurderes da medøyne ikke alltid er likeverdige.

På grunn av den lille størrelsen på museøyet, kan OCT være en mer følsom analyse for å oppdage betennelse i det fremre kammeret enn direkte visualisering eller mikroskopisk lysfeltfotografering. Tidligere arbeid med PMU hos rotter25 fastslo at flere celler kan påvises ved histologi enn ved OCT, men at det er en god korrelasjon mellom de to modalitetene. OCT har den ekstra fordelen at den kan brukes til å overvåke betennelsen i lengderetningen i samme dyr. Andre store musemodeller av uveitt, som EAU og EIU, har også ansatt OCT for kvantitativ analyse 12,47,48. I PMU-modellen av mus er fremre kammerceller bare synlige ved OCT og kan ikke ses på kliniske eksamener med mindre en stor hypopyon er tilstede. Glasslegemebetennelse (vitritis) kan observeres med fargefundusavbildning, men å oppdage kvantitativ endring er bare mulig med OCT-avbildning. Andre aspekter av modellen, som retinal vaskulær betennelse og retinal skade, kan lett identifiseres med enten OCT og mikroskopisk brightfield fundus fotografering.

Ved bruk av OCT er det viktig å vurdere hvordan lokalisert avbildning kan påvirkes av regionale forskjeller i graden av betennelse. Tidligere rapporter har identifisert en ujevn fordeling av celler i det fremre kammeret til mennesker, med flere celler plassert dårligere49. Hos mus er en lignende predisposisjon vanlig. Dermed vil vertikale eller radiale skanninger gjennom AC bidra til å sikre bilder som fanger rekkevidden av betennelse. I tillegg vil det å utføre avbildning på samme sted også gi konsistens til bilder samlet i samme øye i lengderetningen. For å få bilder i samme del av øyet, bruk stabile landemerker og en systematisk tilnærming. For fremre kammerbilder er bildet sentrert umiddelbart ved siden av hornhinnens topp og orientert vertikalt slik at tilstedeværelsen av en hypopyon kan oppdages i den nedre vinkelen. For bakre segmentbilder er bildet sentrert på optisk nerve. Det anbefales å vurdere å bruke minst 3 linjeskanninger for å sikre at regional variasjon fanges opp. I tilfeller der betennelse er begrenset til perifere steder, kan det være nyttig å anskaffe volumskanninger. Innsamlingen av volumskanninger kan også bidra til å fange opp regionale variasjoner, men vil øke kravene til datalagring.

Andre in vivo-analyser som kan brukes til å karakterisere betennelse i PMU-musemodellen inkluderer bioluminescensavbildning13,35. Post mortem-analyser som multiparameterstrømningscytometrisk analyse kan utføres for å identifisere og kvantifisere infiltrerende immuncelletypepopulasjoner i øyets vandige og bakre kammer12,26. I PMU-modellen er akutt betennelse preget av en medfødt respons med et dominerende nøytrofilinfilinfiltrat, etterfulgt av en kronisk og vedvarende adaptiv T-celle dominerende respons som vedvarer i over en måned35. Andre analyser av immunfunksjon som kan utføres på post mortem vev inkluderer okulær væske cytokin analyse. I tillegg kan andre nedstrøms analyser som mRNA-sekvensering og immunfluorescensavbildning brukes til å vurdere gen- og proteinuttrykksmønstre av retinale immuncellepopulasjoner i uveitt50,51.

PMU-modellen kan replikeres i andre gnagersystemer ved hjelp av tilpasninger som passer for de forskjellige artene. PMU-modellen har tidligere vært brukt hos rotter og kaniner38,39,40. Hos rotter utvikler akutt panuveitt etter intravitreal injeksjon som løses spontant over 14 dager uten å utvikle tegn på kronisk betennelse ved histologi24. Hos kaniner benytter induksjon av uveitt to runder subkutan injeksjon før intravitreal injeksjon, men genererer også en robust panuveitt. En av fordelene ved å bruke musemodellen er tilgjengeligheten av mange transgene og knockout-stammer som kan bidra til å forstå den grunnleggende mekanismen for uveitt52. Alle gnagermodeller kan brukes til preklinisk terapitesting hvis midlet administreres systemisk eller som en aktuell dråpe. På grunn av deres større størrelse er imidlertid rotte- og kaninøyne bedre modeller for bruk i prekliniske studier av implanterbare eller lokale injeksjonsbehandlingsalternativer for uveitt.

Oppsummert gir denne protokollen forskere interessert i å studere mekanismene for kronisk okulær betennelse med et nytt verktøy som ikke er avhengig av tidligere immunisering med okulære antigener.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske konflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av finansiering fra National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), gaver fra Daily, MD Research Fund og Christopher og Alida Latham Research Fund, et ubegrenset avdelingsstipend fra Research to Prevent Blindness, og karriereutviklingspris fra Research to Prevent Blindness (KP). Arbeidet som ble utført i Bristol ble støttet av ytterligere finansiering fra Sight Research UK og The Underwood Trust.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AK-FLUOR Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial
AnaSed Akorn Animal Health, IL, USA NDC 59399-110-20 Xylazine 20 mg/mL
Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution Alcon, TX, USA 8007-1
B-D Precision Glide Needles -25 G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305122
B-D Precision Glide needle -30-G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305106
Bond MAX, Bond Rx Leica Biosystems, IL,USA Automated IHC staining system
Chloramphenicol ointment Martindale Pharma, Romford, UK 1% w/w Chloramphenicol
EG1150H Leica Biosystems, IL,USA Tissue Embedding
Envisu R2300 Bioptigen/Leica OCT Machine
Freund's Incomplete Adjuvant BD Difco, NJ, USA 263910
GenTeal lubricant eye ointment Alcon, TX, USA ---
GenTeal lubricant eye gel Alcon, TX, USA ---
H37Ra lyophilized Mycobacteria extract BD Difco, NJ, USA 231141
Hamilton RN Needle (33/12/2)S Hamilton, Reno, NV 7803-05(33/12/2) 33 G
Hamilton syringe Hamilton, Reno, NV CAL7633-01 5 µL
Insulin needle Exel International, USA 26029 1 mL
Isoflurane
Ketaset Zoetis, USA 377341 Ketamine HCL 100 mg/mL
Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller World Precision Instruments, FL, USA UMP3
Micron IV Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA Alternative Imaging/OCT Machine
Nanofil 10 µL syringe World Precision Instruments, FL, USA NANOFIL
Nanofil Intraocular Injection Kit World Precision Instruments, FL, USA IO-KIT
Olympus SZX10 Olympus Dissection scope
PBS Gibco 14190
Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 17478020115
RM2255 Leica Biosystems, IL,USA Tissue Sectioning
TB Syringe Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 309602 1 mL
Tetracaine 0.5% Alcon, TX, USA 1041544
Tissue Tek VIP series Sakura Finetek USA, Inc.,CA. Histology Tissue Processing
Tropicamide 1% Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK Minims
Tylenol Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA NDC 50580-614-01 Acetaminophen
Viscotears Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK Carbomer eye gel 0.2% w/w

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Academy of Ophthalmology. Aao 2019-2020 Basic and Clinical Science Course, Section 09: Uveitis and Ocular Inflammation. American Academy of Ophthalmology. , (2019).
  2. Caspi, R. R. Animal models of autoimmune and immune-mediated uveitis. Drug Discovery today. Disease Models. 3 (1), 3-9 (2006).
  3. DeVoss, J., et al. Spontaneous autoimmunity prevented by thymic expression of a single self-antigen. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2727-2735 (2006).
  4. Caspi, R. R., et al. A new model of autoimmune disease. Experimental autoimmune uveoretinitis induced in mice with two different retinal antigens. Journal of Immunology. 140 (5), 1490-1495 (1988).
  5. Tang, J., Zhu, W., Silver, P. B., Su, S. -B., Chan, C. -C., Caspi, R. R. Autoimmune uveitis elicited with antigen-pulsed dendritic cells has a distinct clinical signature and is driven by unique effector mechanisms: Initial encounter with autoantigen defines disease phenotype. The Journal of Immunology. 178 (9), 5578-5587 (2007).
  6. Broekhuyse, R. M., Kuhlmann, E. D., Winkens, H. J. Experimental melanin-protein induced uveitis (EMIU) is the sole type of uveitis evoked by a diversity of ocular melanin preparations and melanin-derived soluble polypeptides. Japanese Journal of Ophthalmology. 40 (4), 459-468 (1996).
  7. Pennesi, G., et al. A humanized model of experimental autoimmune uveitis in HLA class II transgenic mice. The Journal of Clinical Investigation. 111 (8), 1171-1180 (2003).
  8. Caspi, R. R. Understanding autoimmune uveitis through animal models. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (3), 1872-1879 (2011).
  9. Bansal, S., Barathi, V. A., Iwata, D., Agrawal, R. Experimental autoimmune uveitis and other animal models of uveitis: An update. Indian Journal of Ophthalmology. 63 (3), 211-218 (2015).
  10. Smith, J. R., Hart, P. H., Williams, K. A. Basic pathogenic mechanisms operating in experimental models of acute anterior uveitis. Immunology and Cell Biology. 76 (6), 497-512 (1998).
  11. Rosenbaum, J. T., McDevitt, H. O., Guss, R. B., Egbert, P. R. Endotoxin-induced uveitis in rats as a model for human disease. Nature. 286 (5773), 611-613 (1980).
  12. Chu, C. J., et al. Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model. Disease Models & Mechanisms. 9 (4), 473-481 (2016).
  13. Gutowski, M. B., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. In vivo bioluminescence imaging for longitudinal monitoring of inflammation in animal models of uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1521-1528 (2017).
  14. World Health Organization. Global tuberculosis report 2019. World Health Organization. , (2019).
  15. Biswas, J., Badrinath, S. S. Ocular morbidity in patients with active systemic tuberculosis. International Ophthalmology. 19 (5), 293-298 (1995).
  16. Donahue, H. C. Ophthalmologic experience in a tuberculosis sanatorium. American Journal of Ophthalmology. 64 (4), 742-748 (1967).
  17. El-Asrar, M. A., Abouammoh, M., Al-Mezaine, H. S. Tuberculous uveitis. Middle East African Journal of Ophthalmology. 16 (4), 188-201 (2009).
  18. Bodaghi, B., et al. Chronic severe uveitis: etiology and visual outcome in 927 patients from a single center. Medicine. 80 (4), 263-270 (2001).
  19. Cunningham, E. T., Forrester, J. V., Rao, N. A., Zierhut, M. Post-infectious uveitis. Ocular Immunology and Inflammation. 24 (6), 603-606 (2016).
  20. Wroblewski, K. J., Hidayat, A. A., Neafie, R. C., Rao, N. A., Zapor, M. Ocular tuberculosis: a clinicopathologic and molecular study. Ophthalmology. 118 (4), 772-777 (2011).
  21. Yeh, S., Sen, H. N., Colyer, M., Zapor, M., Wroblewski, K. Update on ocular tuberculosis. Current Opinion in Ophthalmology. 23 (6), 551-556 (2012).
  22. Tagirasa, R., Parmar, S., Barik, M. R., Devadas, S., Basu, S. Autoreactive T cells in immunopathogenesis of TB-associated uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (13), 5682-5691 (2017).
  23. Agrawal, R., et al. Insights into the molecular pathogenesis of ocular tuberculosis. Tuberculosis. 126, 102018 (2021).
  24. Pepple, K. L., et al. Primed mycobacterial uveitis (PMU): Histologic and cytokine characterization of a model of uveitis in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8438-8448 (2015).
  25. Pepple, K. L., Choi, W. J., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Wang, R. K. Quantitative assessment of anterior segment inflammation in a rat model of uveitis using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (8), 3567-3575 (2016).
  26. Pepple, K. L., Wilson, L., Van Gelder, R. N. Comparison of aqueous and vitreous Lymphocyte populations from two rat models of experimental uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (6), 2504-2511 (2018).
  27. Basu, S., Elkington, P., Rao, N. A. Pathogenesis of ocular tuberculosis: New observations and future directions. Tuberculosis. 124, 101961 (2020).
  28. Basu, S., Rao, N., Elkington, P. Animal models of ocular tuberculosis: Implications for diagnosis and treatment. Ocular Immunology and Inflammation. , 1-7 (2020).
  29. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2921-2927 (2012).
  30. Underwood, W., Anthony, R. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. 2013 (30), 2020-2021 (2020).
  31. Donovan, J., Brown, P., et al. Handling and restraint. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. Chapter 1, Unit 1.3 (2006).
  32. Tremoleda, J. L., Kerton, A., Gsell, W. Anaesthesia and physiological monitoring during in vivo imaging of laboratory rodents: considerations on experimental outcomes and animal welfare. EJNMMI Research. 2 (1), 44 (2012).
  33. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  34. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  35. John, S., Rolnick, K., Wilson, L., Wong, S., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. Bioluminescence for in vivo detection of cell-type-specific inflammation in a mouse model of uveitis. Scientific Reports. 10 (1), 11377 (2020).
  36. Fortmann, S. D., Lorenc, V. E., Hackett, S., Campochiaro, P. A. Murine Vitreous Tap (MurViTap): a novel technique to extract uncontaminated mouse vitreous humor, quantify retinal vascular permeability, and compare proteins secreted by diseased and normal retina. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (8), 5978 (2017).
  37. Caspi, R. R. Understanding autoimmunity in the eye: from animal models to novel therapies. Discovery Medicine. 17 (93), 155-162 (2014).
  38. Mruthyunjaya, P., et al. Efficacy of low-release-rate fluocinolone acetonide intravitreal implants to treat experimental uveitis. Archives of Ophthalmology. 124 (7), 1012-1018 (2006).
  39. Jaffe, G. J., Yang, C. S., Wang, X. C., Cousins, S. W., Gallemore, R. P., Ashton, P. Intravitreal sustained-release cyclosporine in the treatment of experimental uveitis. Ophthalmology. 105 (1), 46-56 (1998).
  40. Pepple, K. L., et al. Uveitis therapy with shark variable novel antigen receptor domains targeting tumor necrosis factor alpha or inducible t-cell costimulatory ligand. Translational Vision Science & Technology. 8 (5), 11 (2019).
  41. Mattapallil, M. J., et al. Characterization of a New epitope of IRBP that induces moderate to severe uveoretinitis in mice with H-2b haplotype. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5439-5449 (2015).
  42. Silver, P. B., Chan, C. C., Wiggert, B., Caspi, R. R. The requirement for pertussis to induce EAU is strain-dependent: B10.RIII, but not B10.A mice, develop EAU and Th1 responses to IRBP without pertussis treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2898-2905 (1999).
  43. Li, Q., Peng, B., Whitcup, S. M., Jang, S. U., Chan, C. C. Endotoxin induced uveitis in the mouse: susceptibility and genetic control. Experimental Eye Research. 61 (5), 629-632 (1995).
  44. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  45. Lau, P. E., Jenkins, K. S., Layton, C. J. Current evidence for the prevention of endophthalmitis in anti-VEGF intravitreal injections. Journal of Ophthalmology. 2018, 8567912 (2018).
  46. Nche, E. N., Amer, R. Lens-induced uveitis: an update. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 258 (7), 1359-1365 (2020).
  47. Chu, C. J., et al. Assessment and in vivo scoring of murine experimental autoimmune uveoretinitis using optical coherence tomography. PLoS ONE. 8 (5), 63002 (2013).
  48. Harimoto, K., Ito, M., Karasawa, Y., Sakurai, Y., Takeuchi, M. Evaluation of mouse experimental autoimmune uveoretinitis by spectral domain optical coherence tomography. The British Journal of Ophthalmology. 98 (6), 808-812 (2014).
  49. Li, Y., Lowder, C., Zhang, X., Huang, D. Anterior chamber cell grading by optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 258-265 (2013).
  50. Bell, O. H., et al. Single eye mRNA-seq reveals normalisation of the retinal microglial transcriptome following acute inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3033 (2019).
  51. Lipski, D. A., et al. Retinal endothelial cell phenotypic modifications during experimental autoimmune uveitis: a transcriptomic approach. BMC Ophthalmology. 20 (1), 106 (2020).
  52. Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent Models of Experimental Autoimmune Uveitis. Autoimmunity. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Perl, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 443-469 (2012).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 178
Primed Mycobacterial Uveitt (PMU) som en modell for postinfeksiøs uveitt
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

John, S., Bell, O. H., Wilson, L.,… More

John, S., Bell, O. H., Wilson, L., Copland, D. A., Pepple, K. L. Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis. J. Vis. Exp. (178), e62925, doi:10.3791/62925 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter