Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Primet mykobakteriel uveitis (PMU) som en model for postinfektiøs uveitis

Published: December 17, 2021 doi: 10.3791/62925
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Ophthalmology, University of Washington, 2Academic Unit of Ophthalmology, Translational Health Sciences, University of Bristol

Summary

Denne protokol skitserer trinene til inducering af primet mykobakteriel uveitis (PMU) hos mus. Denne metode skitserer trinene til at hjælpe med at producere pålidelig og robust okulær betændelse i musemodelsystemet. Ved hjælp af denne protokol genererede vi uveitiske øjne og ubetændte medøjne fra enkeltdyr til yderligere evaluering med immunologiske, transkriptomiske og proteomiske assays.

Abstract

Udtrykket 'uveitis' beskriver et heterogent sæt tilstande, der alle har intraokulær inflammation. Generelt er uveitis defineret af ætiologi: infektion eller autoimmunitet. Infektiøs uveitis kræver behandling med de relevante antimikrobielle midler, mens autoimmun uveitis kræver behandling med kortikosteroider eller andre immunsuppressive midler. Post-infektiøs uveitis er en form for kronisk uveitis, der kræver kortikosteroider for at kontrollere immun sequela efter den første infektion. Uveitis forbundet med Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infektion er en velkendt form for post-infektiøs uveitis, men sygdomsmekanismerne forstås ikke fuldt ud. For at forstå den rolle, mykobakterielle antigener og medfødte ligander spiller i stimulering af kronisk okulær inflammation efter mTB-infektion, blev modellen Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) udviklet til brug i mus. Dette manuskript skitserer metoderne til generering af PMU og overvågning af det kliniske forløb af inflammation ved hjælp af farvefundus og optisk kohærenstomografi (OCT) billeddannelse. PMU induceres ved immunisering med varmedræbt mykobakterielt ekstrakt efterfulgt af intravitreal injektion af det samme ekstrakt i det ene øje syv dage senere. Okulær inflammation overvåges i længderetningen ved hjælp af in vivo-billeddannelse og efterfølges af prøveindsamling til en bred vifte af assays, herunder histologi, flowcytometri, cytokinanalyse, qPCR eller mRNA-sekventering. Musemodellen af PMU er et nyttigt nyt værktøj til at studere de okulære reaktioner på mTB, mekanismen for kronisk uveitis og til prækliniske effektivitetstest af nye antiinflammatoriske terapier.

Introduction

Udtrykket 'uveitis' beskriver et heterogent sæt tilstande, der alle har intraokulær inflammation1. Dyremodeller af uveitis er vigtige for at forstå sygdomsmekanismer og for præklinisk test af nye terapier. Der er etableret en række dyremodeller af uveitis2. De to, der er blevet undersøgt mest omfattende, er eksperimentel autoimmun uveitis (eller uveoretinitis; EAU) og endotoksininduceret uveitis (EIU). EAU genereres typisk ved immunisering med okulære antigener eller kan forekomme spontant, når central tolerance forstyrres i fravær af AIRE-genet 3,4. Andre varianter af modellen er siden blevet udviklet 5,6,7 til at omfatte forskellige uveitogene peptider; disse er blevet gennemgået grundigt 8,9,10. EAU er den primære model for former for T-celleafhængig autoimmun uveitis såsom Vogt-Koyanagi-Harada sygdom og birdshot chorioretinitis hos mennesker. EIU genereres ved systemisk eller lokal injektion af bakterielt lipopolysaccharid (LPS)10,11. EIU er blevet brugt som en model for akut uveitis genereret ved aktivering af medfødte immunsignaleringsveje12. Begge modeller har været medvirkende til den nuværende forståelse af okulær immunologi, men ingen af dem er effektive modeller for post-infektiøs kronisk uveitis. For nylig etableret hos mus, giver Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) -modellen nu en tilgang til at forhøre og evaluere kliniske og cellulære aspekter af denne form for uveitis13.

Der er en høj forekomst af mykobakteriel infektion på verdensplan med over 10 millioner nye tilfælde og mere end 1,4 millioner dødsfald rapporteret af Verdenssundhedsorganisationen i 201914. Ekstrapulmonal manifestation af aktiv tuberkulose (TB) infektion omfatter uveitis og er en velkendt årsag til infektiøs uveitis15,16. Manifestationerne af TB-associeret uveitis er protean, hvilket sandsynligvis afspejler flere forskellige sygdomsmekanismer til at omfatte direkte okulær infektion samt mindre forstået immunmedieret inflammation17,18,19. De foreslåede mekanismer for disse postinfektiøse følgevirkninger omfatter et kronisk inflammatorisk respons stimuleret af persistensen af en pauci-bacillær infektion i retinal pigmentepitel (RPE), et kronisk inflammatorisk respons stimuleret af tilstedeværelsen af resterende patogenassocierede molekylære mønstre (PAMP'er) fra en vellykket ryddet okulær infektion og uhensigtsmæssig aktivering af det adaptive immunrespons mod okulære antigener gennem en proces med molekylær efterligning eller antigen spredning forårsaget af systemisk TB-infektion20,21,22,23.

For at få en bedre mekanistisk forståelse af kronisk postinfektiøs uveitis og studere mykobakterielle antigeners rolle i initiering af sygdom, blev PMU-modellen udviklet til brug hos mus13,24. For at fremkalde betændelse modtager musen derfor først en subkutan injektion af antigen fra den varmedræbte Mycobacterium tuberculosis H37Ra-stamme for at efterligne systemisk infektion, efterfulgt syv dage senere af intravitreal injektion af det samme antigen administreret til venstre eller højre øje for at efterligne lokal okulær infektion. Intensiteten og varigheden af den efterfølgende uveitis overvåges ved langsgående in vivo optisk kohærenstomografi (OCT) og fundal billeddannelse af øjet25. PMU er kendetegnet ved en akut, myeloid-dominerende panuveitis, der udvikler sig til en kronisk T-celle-dominerende posterior uveitis med vitritis, perivaskulær retinal inflammation og fokusområder af ydre retinal skade26. Tilstedeværelsen af granulomatøs inflammation i det bageste segment af øjet tyder på, at PMU-modellen kan bruges til at studere nogle former for anterior (granulomatøs og ikke-granulomatøs) og mellemliggende uveitis, set hos patienter med immunologiske beviser for tidligere Mtb-infektion27. Derudover er komponenterne i varmedræbt Mtb, der anvendes i PMU-modellen, blevet foreslået at udløse immunresponser, der ligger til grund for aspekterne af tilbagevendende uveitis hos patienter med okulær tuberkulose, der reagerer på anti-tuberkulær terapi (ATT)28. På grund af forskellene i sygdomsinitiering og inflammatorisk forløb sammenlignet med EAU og EIU repræsenterer PMU en ny dyremodel for uveitis, der ikke er afhængig af immunisering med okulære antigener og kan hjælpe med at belyse sygdomsmekanismer hos patienter med kronisk uveitis. Denne protokol skitserer metoderne til generering af PMU, overvågning af det kliniske forløb af inflammation og indsamling af okulære prøver til post mortem-analyse med flowcytometri.

Protocol

Alle udførte procedurer blev godkendt lokalt af Animal Care and Use Committee ved University of Washington (dyreforsøgsprotokol # 4481-02) eller i overensstemmelse med Det Forenede Kongeriges indenrigsministeriums licens (PPL 30/3281) og University of Bristol Ethical Review Group. Eksperimenter udført på begge institutioner var i overensstemmelse med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) Erklæring til brug af dyr i oftalmisk og visuel forskning. PMU blev genereret i 6-10 uger gamle C57BL/6J mus; alle mus vejede mindst 18 g på tidspunktet for induktion af uveitis og blev bekræftet negative for rd8-mutationen af Crb1-genet29. Mus blev opretholdt med standard chow og medicineret vand (acetaminophen 200-300 mg/kg/dag) ad libitum under specifikke patogenfrie forhold. Dyreaflivning blev udført ved hjælp af en standard kuldioxidindåndingsmetode30.

1. Antigenpræparat til subkutan injektion

  1. Udfør alle procedurer i dette afsnit inde i en kemisk røghætte for at forhindre indånding eller hudkontakt med Mtb H37Ra-pulveret. Håndter i henhold til dine institutionelle politikker for Complete Freund's Adjuvant (typisk BSL-1). Dette omfatter brug af kemikalieresistente handsker, sikkerhedsbriller og beskyttende arbejdstøj (kittel).
  2. Brug en god steril teknik til at forhindre forurening af reagenser, der vil blive introduceret i forsøgsdyr.
  3. Mtb-suspensionen fremstilles i PBS ved at blande 5 mg frysetørret, varmedræbt M. tuberkulose H37Ra-pulver med 2,5 ml koldt PBS i et 5 ml mikrocentrifugerør. Vortex en gang i 30 s og derefter placere på is.
  4. For at generere en fin suspension af H37Ra i PBS sonikeres suspensionen på is i 5 min.
    1. Frigør konverterenhedens krop, og rengør sonden med en 70% (v / v) alkoholpind.
    2. Tænd for sonikatoren, juster strømindstillingen til 4 ved at dreje tænd / sluk-knappen og nedsænk sondens spids i det PBS-holdige mykobakterielle pulver. Sørg for, at sondespidsen er nedsænket til mindst halvdelen af prøvens dybde, og at sondespidsen ikke rører mikrocentrifugerørets væg.
  5. Soniker blandingen på is i 30 s, pause 30 s og gentag i alt 5 minutter for fuldt ud at sprede pulveret i en jævn suspension uden opvarmning af væsken.
  6. Tilsæt 2,5 ml Freunds ufuldstændige adjuvans til blandingen, og gentag sonikeringsprocessen på is, indtil emulsionen danner en tandpastalignende konsistens.
  7. Indstil strømmen til 0 ved hjælp af kontrolknappen, og sluk for enheden for at afslutte sonikeringen. Fjern spidsen fra suspensionen og tør sonden af med en spritserviet.
  8. Antigenemulsionen opbevares ved 4 °C. At lave partier af emulsionen hjælper med at sikre konsistens på tværs af eksperimenter. Emulsionen kan opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.

2. Subkutan injektion

  1. Udfør subkutan injektion en uge før den intravitreale injektion (betegnet som dag -7).
  2. Læg en 1 ml sprøjte (ingen nål fastgjort) med mykobakteriel emulsion. På grund af emulsionens viskositet og opacitet kan luftbobler, der er vanskelige at se, fylde sprøjten.
    1. For at forhindre luftbobler i sprøjten, efter at have lagt 0,2-0,3 ml emulsion, skal du vende sprøjten (spidsen opad) og forsigtigt banke sprøjten gentagne gange på kanten af en tæller for at bringe boblerne til overfladen.
  3. Udvis luften fra sprøjten, og fortsæt med at fylde sprøjten. Vend om, og tryk med mellemrum, indtil den er fyldt.
  4. Placer en 25 G nål på sprøjten, og fremryk emulsionen for at fylde nålen. Opbevar sprøjten på is, indtil den er brugt.
  5. For at udføre den subkutane injektion sikkert skal du enten bedøve musen eller anvende humane fastholdelsesmetoder, der giver nem adgang til dyrets bagparti31.
  6. For at bedøve til subkutan injektion skal dyret placeres i et isofluraninduktionskammer (3% -4% til induktion og 1% -3% til vedligeholdelse). Når den er bedøvet, skal du sikre dig, at musen har en langsom respirationsfrekvens og ikke udviser tegn på åndedrætsbesvær.
  7. Placer de subkutane injektioner på enten hofternes dorsale overflade eller på den ventrale overflade af benene proksimale til regionen af de inguinale lymfeknuder.
    1. Indsæt forsigtigt nålen for at forhindre indsprøjtning i musklen. Injicer 0,05 ml Mtb-emulsion i det subkutane rum. Fjern ikke nålen med det samme for at tillade fuld injektion af tyk emulsion.
    2. Gentag injektionen på både venstre og højre side i alt 0,1 ml pr. dyr.
  8. Hvis bedøvet, skal du placere musen på en varm varmepude indtil fuldstændig opsving. Efterlad ikke musen uden opsyn, før den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency.
  9. Sæt musen tilbage i buret efter fuldstændig bedring, og mærk burkortet med datoen for subkutan injektion.
  10. Giv analgesi med oral acetaminophen (200 mg / kg / dag), men ikke NSAID'er, da antiinflammatoriske midler kan påvirke induktionen af uveitis.

3. Fremstilling af antigenlager til intravitreal injektion

  1. Udfør alle procedurer i dette punkt under passende sterile forhold for at forhindre kontaminering af den intravitreale Mtb-suspension.
  2. Lav de intravitreale suspensioner.
    1. Til induktion af mild til moderat panuveitis fremstilles den intravitreale suspension i en koncentration på 5 mg / ml ved at tilsætte 5 mg mykobakterieekstrakt til 1 ml 1x PBS.
    2. Til induktion af moderat til svær panuveitis fremstilles den intravitreale suspension i en koncentration på 10 mg/ml ved at tilsætte 10 mg mykobakterieekstrakt til 1 ml 1x PBS.
  3. Vortex en gang i 30 s og derefter placere på is.
  4. For at generere en fin suspension af H37Ra i PBS sonikeres suspensionen på is i 10 minutter som beskrevet i trin 1.4. Aliquot denne stamopløsning i 100 μL volumener og opbevares ved -20 °C.
  5. Før brug optøes ved stuetemperatur og hvirvel på høj i 1 min. Opbevar aliquoterne på is under transport til dyreanlægget.

4. Intravitreal injektionsprocedure på dag 0

  1. Forberedelse af dyr
    1. Brug monterede undersøgelseshandsker, placer musen på en vægtvægt for at opnå dens vægt i gram.
    2. Der gives en intraperitoneal injektion på 0,02 ml/g legemsvægt af en opløsning indeholdende 100 mg/ml ketamin og 20 mg/ml xylazin blandet med sterilt vand for at bedøve dyret. En alternativ tilgang inkluderer induktion ved hjælp af ~ 1,5% isofluran (inhaleret).
    3. Vent ca. 2 minutter på, at musen falder i søvn, og læg derefter musen i en varmeboks og dæk låget til. Udfør smertereflekstest som øre-, tå- og haleklemme for at vurdere dybden af anæstesi til proceduren32.
    4. Når du er i søvn, skal du bedøve hornhinden med 1 dråbe 0,5% (v / v) tetrakain. Undgå at få tetrakain nær næsen eller munden på musen. Efter 10 sekunder duppes den overskydende væske af.
      BEMÆRK: Det er blevet observeret, at irisudvidelse og visualisering af forreste kammer (AC) forbedres, når topisk anæstesi administreres, muligvis på grund af forbedret hornhinderefleksundertrykkelse med den kombinerede systemiske og topiske anæstesi. Dette trin kan dog udelades, hvis det ønskes.
    5. Dyl pupillen med 1 dråbe 2,5% (v / v) phenylephrin. Vær forsigtig for at undgå overskydende dråber, der kan komme ind i næsen eller munden. Efter 2-3 min duppes den overskydende væske af.
    6. For at mindske risikoen for endophthalmitis tilsættes 1 dråbe 5% betadin til øjenoverfladen og det omgivende hår. Lad øjet stå i 2-3 min.
      BEMÆRK: Udfør alle procedurer i dette afsnit under passende sterile forhold for at forhindre endophthalmitis.
    7. Fjern betadin og dæk øjet med hypromellose (0,3%) eller carbomer eye gel 0,2% w/w) for at forhindre tørhed under anæstesi. Dette vil også hjælpe med at forhindre dannelse af grå stær.
  2. Opsætning af mikroinjektionssystemet
    1. Udfør den intravitreale injektion ved hjælp af en mikropumpe, der er tilsluttet en mikrosprøjtepumperegulator og en injektionssprøjte (figur 1A-C). Alternativt injiceres med en 33 G-nål, der er fastgjort til en Hamilton-sprøjte som beskrevet i underafsnit 4.4.
    2. Tilslut en 34 G nål til injektionsholderen for at samle injektoren. Løsn sølvskruehætten i forenden af injektionsholderen, og skub nålen ind i holderens krop ca. halvvejs. Spænd sølvskruehætten tæt på.
    3. Tilslut slangen til injektionsholderen som nævnt i trin 4.2.4-4.2.5.
    4. For at indsætte slangen på injektionsholderen skal du løsne plastskruen på bagsiden af holderen, skubbe slangen gennem pakningen indeni og stramme skruen.
    5. Oprethold et lille hul med enden af slangen for at forhindre slangeskader under injektionen. Se figur 1C.
    6. Optø en 100 μL aliquot af mycobacterium stock suspension.
    7. Der tilsættes 3 μL fluoresceinnatriumopløsning (AK-Fluor) og en hvirvelbrønd.
    8. Læg en 10 μL sprøjte med antigen- og fluoresceinblandingen uden at inkludere luftbobler.
    9. Fjern læssekanylen fra sprøjten, og skub slangen gennem sølvskruehættepakningen, indtil spidsen når nulmærket i sprøjtelegemet.
    10. Når spidsen af slangen er korrekt justeret til den ønskede position, skal du stramme skruelågets finger tæt.
    11. Skyl opløsningen i sprøjten gennem injektionsslangen for at fylde systemet helt. Gentag derefter trin 4.2.8-4.2.11 for at genindlæse sprøjten til injektion.
    12. For at installere den fyldte sprøjte på mikropumpen skal du trykke på klemmeudløserknappen i slutningen af mikropumpen for at åbne sprøjteklemmerne.
    13. Placer stemplets hætte i stempelhætteholderen i mikropumpens bagende.
    14. Skub derefter sprøjtekraven på kravestoppet og sprøjtens krop ind i sprøjteklemmen.
    15. Slip klemmeknappen, og stram stempelholderskruen. Se figur 1D.
    16. Skub injektionsholderen og nålen gennem o-klemmen på det stereotaktiske injektionsapparat. Dette er en brugerdefineret platform; Alternativt kan sprøjten holdes og placeres manuelt.
    17. Indstil infusionsvolumen og infusionsvolumen på mikrosprøjtens pumperegulator til at injicere 500 nL pr. cyklus med en hastighed på henholdsvis 40 nL/s.
      BEMÆRK: Hurtigere injektionshastigheder kan bruges, men mere tilbagesvaling kan opleves, før nåleomplacering kan opnås.
    18. Test systemet for at sikre, at det fungerer korrekt, inden der udføres en intravitreal injektion.
      BEMÆRK: Når injektionssystemet fungerer korrekt, vil aktivering af en injektionscyklus ved hjælp af fodpedalen eller kontrolpuden give synlig bevægelse af stempelhætteholderen, og en lille dråbe grønlig væske vil blive set ved spidsen af nålen. I tilfælde af at der ikke produceres væske, skal du aktivere yderligere cyklusser eller skylle og genindlæse sprøjten.
    19. Før du injicerer øjet, skal du forsigtigt tørre nålen med en 95% ethanolpude.
  3. Intravitreal injektionsprocedure
    1. Musen placeres på et stereotaxisk apparat for at udføre injektionsproceduren.
    2. Hold scenen/platformen, som musen hviler på, varm ved at fastgøre 2-3 køkkenrulle på overfladen.
    3. Placer musen i en udsat position på platformen. Brug højre og venstre ørestænger til forsigtigt at fastgøre dyrets hoved. Se figur 1E.
    4. Placer musen og orienter sig under omfanget, så det overlegne nasale aspekt af højre øje er synligt.
    5. Brug en 30 G nål til at fortrænge øjenvipperne og udsætte sclera. Visualiser limbus og det radiale blodkar.
    6. Brug en steril 30 G nål til at lave et styrehul i sclera 1-2 mm bagud til limbus.
    7. Indsæt 34 G-nålen, der er fastgjort til injektionsholderen, i øjet gennem styrehullet i en vinkel, der undgår linsen, men anbring nålespidsen i glaslegemehulen.
    8. Brug mikrosprøjtepumperegulatoren til forsigtigt at injicere 1 μL Mtb-ekstrakt i glaslegemet. I tilfælde af konsekvent tilbagesvaling øges injektionsvolumen til 1,5 μL for at sikre tilstrækkelig dosisafgivelse.
      BEMÆRK: Ved fupkontrol injiceres 1 μL PBS i dyrets øje.
    9. Kontroller intravitreal placering ved visualisering af en grønlig refleks i øjet. Se figur 1F.
    10. Efter 10 s trækkes nålen ud af øjet. Bemærk enhver tilbagesvaling.
    11. Fjern musen fra platformen, placer 0,3% hypromellose eller 0,2% w/w carbomer øjensalve på begge øjne for hornhindebeskyttelse, og flyt til genopretningsvarningsboksen.
    12. Efterlad ikke musen uden opsyn, før den har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde sternal recumbency. Vend ikke tilbage til andre dyr, før de er fuldt genoprettet.
    13. Når musen er helt vågen, skal du vende tilbage til buret og tilsætte acetaminophen (200-300 mg/kg/dag) medicinsk vandflaske. Mærk burkortet med datoen for indsprøjtning med de erhvervsrettede ungdomsuddannelser.
    14. Intravitreale injektioner tolereres generelt godt. Kliniske tegn, der kan indikere smerte og behovet for fjernelse fra undersøgelsen, omfatter periokulær alopeci (tegn på selvtraume), hornhindesårdannelse, vægttab og bøjet kropsholdning.
  4. Alternativ metode til intravitreal injektion
    BEMÆRK: Denne procedure udføres ved hjælp af et operationsmikroskop og en 33 G nål på en mikrosprøjte.
    1. Proptose øjet og hold det på plads med et par tang.
    2. Påfør derefter carbomer eye gel 0,2 % w/w eller 0,3% hypromellose eye gel og læg en cirkulær coverslip (7 mm diameter) over øjet.
    3. Monter en 33 G kanyle på en 5 μL Hamilton sprøjte, og indsæt den ca. 2 mm omkreds i hornhindeslimhinden med en ~45° injektionsvinkel.
    4. Før nålen skråt ind i glaslegemet, stop mellem linsen og synsskiven (fra kirurgens relative synspunkt er dette over / dækker den optiske skive - ca. 1,5 mm fra indsættelsesstedet), og injicer 2 μL Mtb (ved 2,5 ug / μL i PBS) langsomt.
    5. Hold nålen på plads kort (for at reducere mængden af tilbagesvaling af injiceret), og fjern den derefter.
    6. Efter injektion skal du placere kloden ved at frigive tangen. En dråbe på 1% w/w chloramphenicol salve kan administreres til øjet på dette tidspunkt for at give yderligere beskyttelse mod endophthalmitis efter injektion.
    7. Efter injektion flyttes til genfindingsvarmeboksen som nævnt i trin 4.3.11-4.3.13.

5. OCT-billeddannelse for at detektere og kvantificere uveitis

  1. Forberedelse af dyr
    1. Bedøve musen som beskrevet i trin 4.1.2-4.1.4
    2. Dyl eleven med 1 dråbe 2,5% phenylephrin. Vær forsigtig for at undgå overskydende dråber, der kan komme ind i næsen eller munden. Efter 2-3 minutter duppes den overskydende væske af.
    3. Placer 0,3% hypromellose eller 0,2% w/w carbomergel på øjet for at forhindre tørhed under anæstesi. Dette vil også bidrage til at forhindre dannelse af grå stær.
    4. Pak musen ind i et lag kirurgisk gasbind for at opretholde kropsvarmen og læg den på dyrekassetten. Placer hovedet med bidestangen.
  2. Anskaf OLT-billederne af de forreste og bageste kamre.
    BEMÆRK: Hvis der opnås forreste og bageste kammerbilleder, skal du først få billederne af det bageste kammer (PC) for at forhindre billedforringelse efter dannelse af grå stær. Dannelse af grå stær kan forhindres ved hyppig smøring og påføring af 0,3% hypromellose eller 0,2% w/w carbomer øjengel. For udvidet billeddannelse (>10 min) hjælper det også at holde musen varm (ved hjælp af en varmepude).
    1. Når OCT-billedbehandlingssystemet er tændt, skal du sikre det korrekte billedobjektiv og justere referencearmens position efter behov.
    2. Åbn billedbehandlingssoftwaren, opret det unikke muse-id, og begynd billeddannelse i henhold til OCT-producentens protokol.
    3. Brug Free Run-indstillingen med den hurtige scanningsprotokol til at placere øjet med synsnerven centreret på bageste kammerbilleder eller hornhindens spids på forreste kammerbilleder.
      BEMÆRK: Tabel 1 indeholder billeddannelsesprotokolparametre for to kommercielt tilgængelige billeddannelsessystemer til små dyr. Se materialetabellen for produktspecifikationer.
    4. For bageste kammerbilleddannelse skal du bringe OCT tæt på øjets overflade. Vær forsigtig for at undgå at bringe linsens overflade i kontakt med øjet.
    5. Når øjet er korrekt placeret, skal du stoppe den hurtige scanning og vælge lydstyrkescanningsprotokollen og aktivere scanningen med indstillingen Mål .
    6. For bageste segmentbilleder skal du justere, indtil synsnerven er centreret i det vandrette B-scanningsjusteringsbillede, og at nethinden er justeret med den lodrette justeringsakse
    7. For forreste segmentbilleder skal du justere positionen for at centrere hornhindens spids i både billedet Vandret B-scanningsjustering og lodret justering B-scanningsjustering. Tilstedeværelsen af en refleksionsartefakt i begge billeder bekræfter korrekt justering. Skift derefter det vandrette billede nok til at fjerne refleksionsartefakten. Se figur 2.
    8. Klik på Snapshot for at fange lydstyrkescanningsbilledet, og klik derefter på Gem.
    9. Få derefter den gennemsnitlige centrale linjescanning. Åbn scanningsprotokollen, og klik på Mål efterfulgt af Snapshot. Højreklik på det samme panel, og klik derefter på Gennemsnit.
    10. Trin 5.2.1-5.2.9 gentages for hvert øje med begge linser.
    11. Når alle billeder er samlet, skal du fjerne musen fra kassetten og give hornhindebeskyttelse under genopretning som angivet i trin 4.3.11-4.3.13.

6. Scoring af betændelse efter OCT

  1. Scor OCT-billederne ved hjælp af gradere, der er maskeret til behandlingstilstanden.
    BEMÆRK: For PMU i musemodellen anbefales pointsystemet i tabel 2 .
  2. Hvis der blev opnået både billeder af det forreste kammer (AC) og det bageste kammer (PC), skal du kombinere disse scorer for at opnå den endelige score for hvert øje.
    BEMÆRK: Forreste kammerbetændelse løser før bageste kammerbetændelse.

7. Scoring af betændelse ved post mortem histologi

  1. I slutningen af eksperimentet skal du samle individuelle øjne ved enukleation, fiksere 4% formaldehyd natten over og fortsætte med paraffinindlejring, sektionering og H&E-farvning33.
    BEMÆRK: Flere 4-8 μm sektioner langs pupillær-optisk nerveakse anbefales.
    BEMÆRK: Tre sektioner pr. øje scores af en maskeret grader ved hjælp af scoringssystemet i tabel 3, og den gennemsnitlige score for de tre sektioner rapporteres som den endelige histologiinflammationsscore.

Representative Results

Denne protokol viser induktion af uveitis hos mus ved hjælp af den primede mykobakterielle uveitismodel (PMU). Sikring af konsistens i den subkutane injektion og nøjagtighed af den intravitreale injektion er vigtige trin i udviklingen af den primede mykobakterielle uveitismodel (PMU). Figur 1 viser musens intravitreale injektionsprocedure ved hjælp af et stereotaxisk apparat. Ørestænger hjælper med at placere hovedet forsigtigt på samme sted under mikroskopet (figur 1E). De holder også hovedet stabilt under den intravitreale injektionsprocedure, hvilket mindsker risikoen for injektionstraumer. Efter en vellykket injektion frembringer fluorescein i injektionsopløsningen en grønlig refleksion inde fra øjet, der kan ses under mikroskopet eller fra et sidebillede som afbildet i figur 1F.

Når den udføres som skitseret, genererer protokollen robust akut uveitis, der kan påvises ved hjælp af OCT- og fundus-billeddannelse så tidligt som 10 timer efter intravitreal injektion. Figur 2 viser den korrekte justering af øjet for OCT-billeddannelse. Tabel 1A viser de parametre, der anvendes i OLT-protokollen. En systematisk tilgang til at få billeder vil give billeder af høj kvalitet, der kan sammenlignes over tid. Forreste kammerbilleder er centreret på toppen af hornhinden ved hjælp af en face SLO-billedet (figur 2A) med iris justeret parallelt med både vandrette og lodrette planer (figur 2B, C). Volumen- og linjescanninger registreres med en lodret justering, så ringere og overlegne regioner kan ses samtidigt. Bageste segmentbilleder er centreret på synsnerven ved hjælp af en face SLO-billedet (figur 2D), og RPE's lyse bånd bruges til at justere nethinden parallelt med både de vandrette og lodrette planer (figur 2E, F).

Figur 3 viser typiske fund af PMU okulær inflammation ved hjælp af OCT-billeddannelse. Fireogtyve timer efter intravitreal injektion ses inflammatoriske celler i vandig og glasagtig (figur 3B). I nærvær af moderat eller alvorlig betændelse ses en hypopyon i den ringere vinkel i AC. Graden af okulær inflammation kan scores på disse OCT-billeder ved hjælp af kriterierne i tabel 2. Repræsentative eksempler på billeder, der viser de inflammatoriske træk, der er typiske for hver score, er vist i figur 4. AC- og PC-kammerscorer kan lægges sammen for at generere den kombinerede OCT-score. Kombinerede scorer >0, men ≤2,5 repræsenterer mild betændelse. Moderat inflammation bestemmes af score >2,5, men ≤4,5. Scores >4.5 identificerer alvorlig betændelse. Inflammation topper typisk 48 timer efter intravitreal injektion med OCT-score i AC og PC mellem 1 og 3 (kombineret score mellem 2 og 6). AC- og PC-score på 0,5 eller 4 er mindre almindelige. I tilfælde af at der ofte opstår scoringer uden for det typiske interval, kan det være nødvendigt med fejlfinding for at identificere de faktorer, der bidrager til outlier-score (se diskussionsafsnittet). Inflammationsscore i det forreste kammer har tendens til at vende tilbage til nul inden for en uge efter intravitreal injektion. I modsætning hertil vender posterior score ikke tilbage til nul; I stedet fortsætter kronisk inflammation på lavt niveau i form af vitritis, og perivaskulære lymfocytter infiltrerer i nethinden i 1-2 måneder efter intravitreal injektion.

Inflammationsscore i PMU kan også bestemmes ved hjælp af histologi. Figur 5 viser repræsentative H&E-sektioner til brug for scoring af sværhedsgraden af PMU efter histologi. Antallet af inflammatoriske celler i vandig og glasagtig tælles og bruges til at bestemme sværhedsgraden ved hjælp af scorekriterierne i tabel 3. Inflammatorisk celleinfiltration af ciliarylegemet ses almindeligvis på den ene side af histologiafsnittet (ensidig involvering) i mild eller moderat inflammation. Når betændelse er alvorlig, afspejles dette ved tilstedeværelsen af et inflammatorisk celleinfiltrat i ciliarylegemet på begge sider af linsen (kaldet bilateral involvering). I senere tidspunkter efter intravitreal injektion kan kroniske inflammationsmanifestationer, herunder tilstedeværelsen af perivaskulære og intraretinale leukocytter og ydre retinale folder, også identificeres. Histologi kan også være nyttigt til at identificere øjne, der er påvirket af dårlige injektionsteknikker. Traumer i linsen under den intravitreale injektion kan identificeres ved tilstedeværelsen af amorfe eosinfarvede (lyserøde) linseproteiner uden for linsekapslen ved siden af traumeområdet. Refluks af den intravitreale mTB i det subkonjunktive rum vil generere betændelse uden for øjet, der kan identificeres ved en omhyggelig gennemgang af periokulære strukturer, der er til stede på sektionerne. På grund af manglende fastholdelse af mTB-ekstrakt i øjnene, vil disse øjne typisk have lave OCT-score af betændelse.

Brightfield fundus billeddannelse kan også bruges til at identificere klinisk relevante aspekter af PMU, herunder udvikling af hypopyon, vitritis og retinal eller perivaskulær inflammatorisk celleinfiltration. Figur 6 viser to eksempler, hvor nethinde- og perivaskulær inflammation kan ses på fundusbilleder. Disse to øjne viser også det område af betændelse, der er almindeligt i PMU-modellen. Tabel 1B viser de parametre, der anvendes i fundus/retinal OCT-billeddannelsessystemet. Bemærk den indvirkning, som alvorlig betændelse har på billedkvaliteten (figur 6, dag 2, OCT og fundusbilleder i øverste række) og omfanget af sygdom til stede på dag 21. Hornhindeødem kan også nedsætte billedkvaliteten under akut betændelse; Det er dog ualmindeligt, at hornhindeødem er alvorligt fra betændelse alene. Mere almindeligt vil billedkvaliteten blive forringet af epitelskader som følge af ufuldstændig overfladebeskyttelse under billeddannelse og anæstesihændelser.

PMU-modellen kan bruges til at inducere uveitis i enhver muserace eller genotype. I albinoøjne kan OCT stadig bruges til at score betændelse, men fraværet af funduspigment gør visualisering af inflammation udfordrende ved brightfield-billeddannelse13,34. Post mortem-undersøgelser kan udføres på okulært væv, regionale lymfeknuder eller milten. Nogle eksempler inkluderer assays for tilstedeværelsen af immunceller, såsom flowcytometri og immunohistokemi og måling af inflammatoriske cytokiner. På alle tidspunkter, der er testet efter initiering af inflammation med PMU (dag 1 til dag 56), er der tilstrækkelige CD45+ inflammatoriske celler til stede i individuelle øjne til at detektere mange større leukocytpopulationer i øjet ved multiparameterflowanalyse12,35. Vandig (2-5 μL) og glasagtig (5-10 μL) humor kan indsamles fra betændte øjne til bestemmelse af proteinkoncentration, proteomiske undersøgelser eller bestemmelse af cytokinkoncentration36.

Figure 1
Figur 1: Opsætning af intravitreal injektion af mus. Den intravitreale injektion udføres på museøjet ved hjælp af (A) en mikrosprøjtepumperegulator, der er tilsluttet (B) mikropumpen og (C) en injektionssprøjte. Sprøjten lægges og monteres på (D) mikropumpen. Musehovedet er placeret ved hjælp af (E) ørestænger for at sikre stabilitet og konsistens under den intravitreale injektionsprocedure. (F) Fluorescein i injektionsopløsningen frembringer en grønlig refleksion inde fra øjet efter en vellykket procedure. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Korrekt justering af øjet til OCT-billeddannelse . (A) Ved hjælp af billedet af en-face scanning laser ophthalmoscope (SLO) er øjet centreret til forreste kammerbilleddannelse. Den grønne linje angiver placeringen af den vandrette linjescanning, der vises i panelet (B). Bemærk, at den centrale hornhinde undgås for at mindske refleksionsartefakt. (C) Lodret B-scanning gennem det paracentrale forreste kammer. Denne scanning opnås ved 90° fra den vandrette scanning. Bemærk, at justeringen af irissektionerne på hver side af objektivet er plan i den vandrette scanning (panel B) og arrangeret over hinanden i den lodrette scanning (panel C). (D) Ved hjælp af SLO-billedet er det bageste kammerbillede centreret om synsnerven. (e) vandret B-scanningsjustering, (f) lodret B-scanningsjustering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Induktion af PMU genererer panuveitis, der kan overvåges ved langsgående OCT-billeddannelse. Den øverste række viser forreste kammer (AC); den nederste række viser bageste kammer (PC) OCT-billeder for at fremhæve patologiske ændringer i sygdomsforløbet. (A) Baseline OCT-billede af AC (øverst) og PC (nederst) før induktion af uveitis, begge scorer 0. (B) Dag 1 efter intravitreal injektion, der viser tilstedeværelsen af hornhindeødem (sort pil), en hypopyon (*) flere fritflydende inflammatoriske celler i AC (hvide pile) og vitritis (hvide pilespidser) i pc'en. (C) Dag 7 efter intravitreal injektion med få AC-celler på den forreste linsekapsel (hvid pil) og nedsat vitritis (hvid pilespids). (D) Dag 28 efter intravitreal injektion forreste kammer med opløst AC-betændelse og mild vitritis. Forkortelser: C- hornhinde, L - linse, I - iris, Aq - vandig, V glaslegeme, RGC - retinale ganglionceller, PR - fotoreceptorer, Ch- choroid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Eksempler på OLT-score. Der tildeles en OCT-score mellem 0 og 4 til hvert AC-billede og pc-billede ved hjælp af det kategoriske system, der er vist i tabel 2. AC- og PC-scorerne kombineres til den endelige OCT-score for øjet. (A,D) Eksempler på en score på nul. (B,E) Eksempler på en score på 0,5. (C,F) Eksempler på en score på 1. (G,J) Eksempler på en score på 2. (H,K) Eksempler på en score på 3. (I,L) Eksempler på en score på 4 er vist i panelerne I og L. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Eksempler på histologiscore. Histologi score bestemmes ud fra fem karakteristika synlige i H&E sektioner: Anterior kammer proteintæthed, forreste kammercellenummer, immuncelleinfiltration af ciliary kroppen, glasagtig celletæthed, retinal vaskulær inflammation og strukturelle retinale ændringer. En score på 0-2 tildeles for hver egenskab. Beskrivelsen af hver score findes i tabel 3. Et repræsentativt eksempel score på 0-2 for hver egenskab er vist i denne figur. Den venstre kolonne viser scoren på nul. Den midterste kolonne viser eksempler på score 1. Den højre kolonne viser eksempler på score 2. En score på 2 for ciliary body score tildeles, hvis ciliary body på hver side af linsen i samme sektion viser cellulær inflammation. Den endelige histologiscore er summen af scoren for hvert af de fem kriterier (max score 10). Pilen i nederste højre panel angiver perivaskulære leukocytter forbundet med et overfladisk retinal kar. Sort skalabjælke angiver 500 μm. Ciliary skala søjler angiver 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Langsgående fundusbilleddannelse i PMU identificerede en række sygdoms sværhedsgrad . (A) Alvorligt betændte øjne viser flere hvide infiltrater i nethinden og vaskulær tortuositet på farve fundus billeddannelse (øverste række) samt tæt vitritis og retinalt ødem på OCT (nederste række) på dag 2. Progression i antallet af retinale læsioner kan ses over tid, mens vitritis forbedres. Grøn linje angiver placeringen af OCT-billedet. (B) Let betændte øjne viser færre og flere diskrete lineære læsioner i fundus og en række infiltrerende celler i glaslegemerummet. Skala bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

En
Mus forreste kammer Hurtig scanning Scanning af volumen Lineær scanning
Længde x bredde 4,0 mm x 4,0 mm 3,6 mm x 3,6 mm 3,6 mm
Vinkel 0 90 90
A-scanning/B-scanning 800 1000 1000
# B-scanninger 50 400 1
Rammer/ B-scanning 1 3 20
Mus bageste kammer Hurtig scanning Scanning af volumen Lineær scanning
Længde x bredde 1,6 mm x 1,6 mm 1,6 mm x 1,6 mm 1,6 mm
Vinkel 0 0 0
A-scanning/B-scanning 800 1000 1000
# B-scanninger 50 200 1
Rammer/ B-scanning 1 3 20
B
Mus bageste kammer Scanning af volumen Lineær scanning
Længde x bredde 0,9 mm x 0,9 mm 1,8 mm
Vinkel 0 Enhver (typisk 0 eller 90)
A-scanning/B-scanning 1024 1024
# B-scanninger 512 1
Rammer/ B-scanning 1 30

Tabel 1: Scanningsparametre. (A) OCT-scanningsparametre. (B) Fundus/retinale OLT-scanningsparametre

OCT Score beskrivelser
Score Forreste afdeling Bageste afdeling
NA Ingen udsigt ud over forreste hornhinde Intet billede af det bageste segment
0 Ingen betændelse Ingen betændelse
0.5 1-5 celler i det vandige Få celler, der optager mindre end 10% af glaslegemeområdet
ELLER hornhindeødem Ingen subretinale eller intraretinale infiltrater eller retinal arkitekturforstyrrelse
1 6-20 celler i vandig Diffuse celler (ingen tætte klumper), der optager mellem 10 og 50% af glaslegemeområdet.
ELLER et enkelt lag af celler på den forreste linsekapsel Ingen subretinale eller intraretinale infiltrater eller retinal arkitekturforstyrrelse
2 20-100 celler i det vandige Diffuse celler (ingen tætte klumper), der optager > 50% af glaslegemeområdet
ELLER færre end 20 celler og en hypopyon til stede Ingen subretinale eller intraretinale infiltrater eller retinal arkitekturforstyrrelse
3 20-100 celler i det vandige Diffuse celler lig med klasse 2 og 1
OG en hypopyon ELLER en pupillær membran OG mindst en tæt glasagtig opacitet, der optager 10% -20% af glaslegemeområdet ELLER tilstedeværelsen af glasagtige celler svarende til grad 2 og sjældne (≤ 2) subretinale eller ntraretinale opaciteter
4 Et vilkårligt antal vandige celler Tæt glasagtig opacitet, der optager > 20% af glaslegemeområdet.
OG en stor hypopyon og pupillær membran ELLER forreste strukturtab på grund af alvorlig betændelse ELLER diffuse glaslegemer med store subretinale eller intraretinale opaciteter

Tabel 2: PMU OCT-scorekriterier: OCT-billeder scores i henhold til kriterierne i tabellen. AC- og PC-score tilføjes for at opnå øjets endelige score. I tilfælde, hvor der ikke blev opnået et klart billede af øjet, blev der tildelt en score af NA til billederne, og disse blev udelukket fra undersøgelsen.

Histologi Score Beskrivelse
Karakteristisk 0 1 2
Forreste kammer (AC) protein Ringe acellulære partikler, der farvning med eosin i AC Moderat, men ikke sammenflydende, ekstracellulær eosinfarvning overalt i AC Konfluent eller nær sammenflydende ekstracellulær eosinfarvning i hele AC
Forreste kammer (AC) celle Ingen celler 1-100 celler, men ingen tætte aggregeringer af celler >100 celler eller tætte aggregeringer af celler
Ciliary Body betændelse Ingen leukocytinfiltration af ciliarylegemet eller omgivende glaslegeme Ensidig tilstedeværelse af leukocytter, der infiltrerer ciliarylegemet og / eller det omgivende glaslegeme. Bilateral tilstedeværelse af leukocytter, der infiltrerer ciliarylegemet og / eller det omgivende glaslegeme.
Retinal vaskulær betændelse Ingen retinale kar med perivaskulære leukocytter Et kar pr. sektion med perivaskulære leukocytter >1 beholder pr. sektion med perivaskulære leukocytter
Retinal fold eller skade Ingen nethindeskader 1-3 retinale folder pr. sektion >3 retinale folder pr. sektion eller anden ødelæggelse af retinalt lag eller intraretinal blødning

Tabel 3: PMU histologi score kriterier: H&E sektioner af øjet blev scoret ud fra kriterierne i tabellen. Tre sektioner fra det samme øje blev scoret og gennemsnitligt for at opnå den endelige histologi score for øjet.

Discussion

Dyremodeller af uveitis har været medvirkende til at forstå mekanismerne for okulær inflammation og homeostase samt muliggøre præklinisk evaluering af medicinske og kirurgiske terapier til patienter med uveitis37. Både kanin- og rottevarianter af PMU-modellen har vist deres værdi i præklinisk behandling via proof of concept-studier38,39,40. På grund af tilgængeligheden af en bred vifte af transgene stammer i mus tillader etablering af musens PMU-modelsystem nu mere detaljerede mekanistiske undersøgelser for at identificere specifikke celletyper, veje og gener, der bidrager til patologien af denne sygdom.

Dyremodeller af uveitis kan demonstrere dyr til dyr variabilitet i forekomsten og intensiteten af inflammation41. I C57BL/6-musestammen genereres PMU pålideligt ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her. Stammespecifikke variationer i uveitisforløb og intensitet er rapporteret for både EAU og EIU42,43. Mens stammespecifikke virkninger på sværhedsgraden og forløbet af PMU ikke er blevet målt eksperimentelt, er denne model blevet brugt i vildtype C57BL / 6J såvel som i albinomus (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) og produceret lignende inflammatoriske reaktioner. Ved generering af PMU-modellen kan styring af nedenstående overvejelser hjælpe nye forskere med at begrænse variabilitet og producere den mest konsistente og reproducerbare uveitis.

Sørg for konsistens i de subkutane injektioner:
For at give en konsekvent subkutan injektion skal du sikre dig, at alle luftbobler fjernes fra emulsionen. Overvejelserne omfatter en kort centrifuge (30 s ved 400 x g) af den færdiglavede emulsion inden injektion af sprøjten. Dette fjerner luft fanget i emulsionen. Når sprøjten lægges i, skal du også regelmæssigt vende (tippe op) og trykke på sprøjten for at fjerne eventuelle luftbobler. Under injektionen må sprøjten ikke placeres for dybt for at undgå intramuskulær injektion. Omvendt kan en overfladisk (intradermal) injektion resultere i erosion af emulsionen gennem huden. Husk at holde en kort pause, før sprøjten fjernes fra injektionsstedet, for at sikre fuldstændig injektion af den tykke tyktflydende emulsion og for at forhindre tilbagesvaling fra huden.

Syv dage efter placering af den subkutane injektion skal du bekræfte tilstedeværelsen af håndgribelige knuder på hver side af bagbenene. Hvis der ikke kan identificeres knuder, er det muligt, at luft blev injiceret snarere end emulsion. I dette tilfælde er akut betændelse muligvis ikke så robust, og kronisk betændelse kan ikke udvikle sig.

Forhindre udvikling af infektiøs endophthalmitis:
Bakteriel eller svampe endophthalmitis vil generere en forvirrende variabel, hvis ikke forhindret44. For at forhindre bakteriel endophthalmitis skal du altid øve god aseptisk teknik, når du fremstiller den intravitreale suspension, håndtering og rengøring af alle genanvendelige værktøjer, der kommer i kontakt med øjet. Brug af sterile engangsartikler, autoklavering eller rengøring med 95% alkoholvask eller klude er vigtig. Passende brug af betadin påført den okulære overflade, låg og periokulær pels vil også hjælpe med at forhindre endophthalmitis45. Det er ligetil at genkende et øje med infektion, da de okulære strukturer vil blive udslettet af ekstrem betændelse under postinjektionsforløbet. Dette er ikke typisk for PMU. Tilstedeværelsen af intraokulær blødning kan også tyde endophthalmitis eller traumer fra injektionen. I sådanne tilfælde udelukkes disse dyr fra undersøgelsen.

Sørg for konsistens i den intravitreale injektion:
Den intravitreale injektion er et kritisk trin i induktionen af pålidelig og reproducerbar inflammation i PMU. Tilvejebringelse af en ensartet mængde Mtb-suspension med hver injektion, undgåelse af traumer og forebyggelse af tilbagesvaling af suspensionen er alle faktorer, der bør overvejes, når injektionerne udføres. For at sikre en ensartet suspension skal du skrue lagerophænget grundigt ved optøning og inden ilægning af det i sprøjten. Da dette anvendte Mtb-ekstrakt ikke danner en opløsning, kan suspensionen gennemgå sedimentering over tid. For at sikre ensartet koncentration af Mtb-ekstraktet i hver injektion skal du bruge eller udvise og genindlæse sprøjten inden for 15 minutter efter pålæsning. Phenylephrin bruges til udvidelse for at give et større synsfelt til det bageste øje og reducere risikoen for traumer i øjet under injektionen. Denne dråbe genererer naturlig lågretraktion og let proptose af kloden, hvilket muliggør god visualisering af området 1-2 mm bagud til limbus uden behov for at gribe øjet med tang. Brug af tang til at fastholde øjet kan forårsage potentielt traume og forbigående øge intraokulært tryk og risikoen for tilbagesvaling af Mtb-suspensionen. Traumer kan også være forårsaget af forsøg på at injicere for meget volumen i øjet. Injektionsvolumenet er begrænset til 2 μL for at forhindre betydelig og langvarig forhøjelse af intraokulært tryk og traumer i øjet. Derudover vil yngre dyr have øjne, der er mindre end voksne mus. Typisk 6-8 ugers mus (20-25 g) giver en ensartet øjenstørrelse og sikrer større konsistens i betændelsen efter injektion af Mtb. En højere hyppighed af tilbagesvaling efter injektion af den mykobakterielle suspension blev observeret hos mindre mus. Dette fører igen til en mindre end forventet akut betændelse. En fortyndet fluoresceinopløsning bruges til at give nybegynderinjektoren visuel feedback om succesen med deres injektionsteknik. Udvidelse på injektionstidspunktet giver mulighed for direkte visualisering af det injicerede materiale i glaslegemet og muligheden for at bemærke tegn på linsetraume. I tilfælde af linsetraume kan det forårsage en ændring i linseklarhed, der vil forårsage en grå stær, som kan visualiseres på OCT. I tilfælde af okulært traume skal øjnene udelukkes fra undersøgelsen på grund af muligheden for linseinduceret uveitis46. Vi anbefaler at holde pause i 10 sek., før sprøjten fjernes fra øjet for at tillade spredning af Mtb-suspensionen i øjet og mindske tilbagesvaling.

PMU-modellen kan modificeres for at ændre intensiteten af akut inflammation ved at variere koncentrationen af Mtb i den intravitreale injektion. Forskellige doser fra 2,5 μg/μL til 15 μg/μL er tidligere blevet testet i vores laboratorium. Imidlertid viste doser højere end 10 μg / μL at forårsage alvorlig øjenskade, herunder spontan linsebrud, alvorligt hornhindeødem og ardannelse og hyphema. Denne grad af sværhedsgrad er ikke typisk hos humane patienter med postinfektiøs uveitis, og derfor anbefales disse koncentrationer ikke. En dosis på 5 μg/μL viste sig pålideligt at producere mild til moderat akut inflammation og mild kronisk uveitis; 10 μg/μL dosis giver en pålidelig moderat til svær akut sygdom og mere bemærkelsesværdig kronisk sygdom. Således kan varierende intravitreal koncentration give alternative sygdoms sværhedsgrader til brug efter behov baseret på det eksperimentelle spørgsmål. Der bør vælges kontroller for at sikre, at resultaterne skyldes responsen på mTB og ikke traumer forbundet med de subkutane eller intravitreale injektioner. I sham injektionskontrol kan PBS anvendes i stedet for mTB-ekstraktet. For sammenligninger med ueksponerede dyr bør ægte naive prøver betragtes som medøjne ikke altid ens.

På grund af museøjets lille størrelse kan OCT være et mere følsomt assay til at detektere betændelse i det forreste kammer end direkte visualisering eller mikroskopisk lysfeltfotografering. Tidligere arbejde med PMU hos rotter25 fastslog, at flere celler kan påvises ved histologi end ved OCT, men at der er en god sammenhæng mellem de to modaliteter. OCT har den ekstra fordel, at det kan bruges til at overvåge betændelsen i længderetningen hos det samme dyr. Andre store musemodeller af uveitis, såsom EAU og EIU, har også anvendt OCT til kvantitativ analyse 12,47,48. I PMU-modellen af mus er forreste kammerceller kun synlige på OCT og kan ikke ses ved kliniske undersøgelser, medmindre en stor hypopyon er til stede. Glasagtig betændelse (vitritis) kan observeres med farve fundus billeddannelse, men detektering af kvantitativ ændring er kun mulig med OCT-billeddannelse. Andre aspekter af modellen, såsom retinal vaskulær inflammation og retinal skade, kan let identificeres med enten OCT og mikroskopisk brightfield fundus fotografering.

Når du bruger OCT, er det vigtigt at overveje, hvordan lokaliseret billeddannelse kan påvirkes af regionale forskelle i graden af inflammation. Tidligere rapporter har identificeret en ujævn fordeling af celler i det forreste kammer hos mennesker, med flere celler placeret ringere49. Hos mus er en lignende disposition almindelig. Således vil lodrette eller radiale scanninger gennem AC hjælpe med at sikre billeder, der fanger inflammationsområdet. Derudover vil udførelse af billeddannelse på samme sted også give konsistens til billeder indsamlet i samme øje i længderetningen. For at få billeder i samme del af øjet skal du bruge stabile landemærker og en systematisk tilgang. For forreste kammerbilleder er billedet centreret umiddelbart ved siden af hornhindens spids og orienteret lodret, så tilstedeværelsen af en hypopyon kan detekteres i den ringere vinkel. For bageste segmentbilleder er billedet centreret om synsnerven. Det anbefales at overveje at bruge mindst 3 linjescanninger til scoring for at sikre, at regional variabilitet registreres. I tilfælde, hvor betændelse er begrænset til perifere steder, kan det være nyttigt at erhverve volumenscanninger. Indsamlingen af volumenscanninger kan også hjælpe med at fange regionale variationer, men vil øge kravene til datalagring.

Andre in vivo-assays, der kan bruges til at karakterisere inflammation i PMU-musemodellen, inkluderer bioluminescensbilleddannelse13,35. Post mortem-assays som multi-parameter flow cytometrisk analyse kan udføres for at identificere og kvantificere infiltrerende immuncelletypepopulationer i øjets vandige og bageste kammer12,26. I PMU-modellen er akut inflammation karakteriseret ved et medfødt respons med et overvejende neutrofilinfiltrat efterfulgt af et kronisk og vedvarende adaptivt T-celle dominerende respons, der vedvarer i over en måned35. Andre assays af immunfunktion, der kan udføres på post mortem væv omfatter okulær væske cytokin analyse. Derudover kan andre downstream-assays som mRNA-sekventering og immunfluorescensbilleddannelse bruges til at vurdere gen- og proteinekspressionsmønstre for retinale immuncellepopulationer i uveitis50,51.

PMU-modellen kan replikeres i andre gnaversystemer ved hjælp af tilpasninger, der passer til de forskellige arter. PMU-modellen har tidligere været anvendt til rotter og kaniner38,39,40. Hos rotter udvikler akut panuveitis efter intravitreal injektion, der løser spontant over 14 dage uden at udvikle tegn på kronisk inflammation ved histologi24. Hos kaniner anvender induktion af uveitis to runder subkutan injektion før intravitreal injektion, men genererer også en robust panuveitis. En af fordelene ved at bruge musemodellen er den klare tilgængelighed af adskillige transgene og knockout-stammer, der kan hjælpe med at forstå den grundlæggende mekanisme for uveitis52. Alle gnavermodeller kan bruges til præklinisk terapitest, hvis midlet administreres systemisk eller som en aktuel dråbe. På grund af deres større størrelse er rotte- og kaninøjne imidlertid bedre modeller til brug i prækliniske undersøgelser af implanterbare eller lokale injektionsbehandlingsmuligheder for uveitis.

Sammenfattende giver denne protokol forskere, der er interesserede i at studere mekanismerne for kronisk okulær inflammation med et nyt værktøj, der ikke er afhængig af forudgående immunisering med okulære antigener.

Disclosures

Forfatterne har ingen økonomiske konflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde understøttes af finansiering fra National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), gaver fra Mark Daily, MD Research Fund og Christopher og Alida Latham Research Fund, en ubegrænset afdelingsbevilling fra Research to Prevent Blindness og karriereudviklingspris fra Research to Prevent Blindness (KP). Arbejdet i Bristol blev støttet af yderligere finansiering fra Sight Research UK og The Underwood Trust.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AK-FLUOR Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial
AnaSed Akorn Animal Health, IL, USA NDC 59399-110-20 Xylazine 20 mg/mL
Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution Alcon, TX, USA 8007-1
B-D Precision Glide Needles -25 G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305122
B-D Precision Glide needle -30-G Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 305106
Bond MAX, Bond Rx Leica Biosystems, IL,USA Automated IHC staining system
Chloramphenicol ointment Martindale Pharma, Romford, UK 1% w/w Chloramphenicol
EG1150H Leica Biosystems, IL,USA Tissue Embedding
Envisu R2300 Bioptigen/Leica OCT Machine
Freund's Incomplete Adjuvant BD Difco, NJ, USA 263910
GenTeal lubricant eye ointment Alcon, TX, USA ---
GenTeal lubricant eye gel Alcon, TX, USA ---
H37Ra lyophilized Mycobacteria extract BD Difco, NJ, USA 231141
Hamilton RN Needle (33/12/2)S Hamilton, Reno, NV 7803-05(33/12/2) 33 G
Hamilton syringe Hamilton, Reno, NV CAL7633-01 5 µL
Insulin needle Exel International, USA 26029 1 mL
Isoflurane
Ketaset Zoetis, USA 377341 Ketamine HCL 100 mg/mL
Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller World Precision Instruments, FL, USA UMP3
Micron IV Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA Alternative Imaging/OCT Machine
Nanofil 10 µL syringe World Precision Instruments, FL, USA NANOFIL
Nanofil Intraocular Injection Kit World Precision Instruments, FL, USA IO-KIT
Olympus SZX10 Olympus Dissection scope
PBS Gibco 14190
Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL Akorn Pharmaceuticals, IL, USA 17478020115
RM2255 Leica Biosystems, IL,USA Tissue Sectioning
TB Syringe Becton, Dickinson and Company, NJ, USA 309602 1 mL
Tetracaine 0.5% Alcon, TX, USA 1041544
Tissue Tek VIP series Sakura Finetek USA, Inc.,CA. Histology Tissue Processing
Tropicamide 1% Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK Minims
Tylenol Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA NDC 50580-614-01 Acetaminophen
Viscotears Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK Carbomer eye gel 0.2% w/w

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Academy of Ophthalmology. Aao 2019-2020 Basic and Clinical Science Course, Section 09: Uveitis and Ocular Inflammation. American Academy of Ophthalmology. , (2019).
  2. Caspi, R. R. Animal models of autoimmune and immune-mediated uveitis. Drug Discovery today. Disease Models. 3 (1), 3-9 (2006).
  3. DeVoss, J., et al. Spontaneous autoimmunity prevented by thymic expression of a single self-antigen. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2727-2735 (2006).
  4. Caspi, R. R., et al. A new model of autoimmune disease. Experimental autoimmune uveoretinitis induced in mice with two different retinal antigens. Journal of Immunology. 140 (5), 1490-1495 (1988).
  5. Tang, J., Zhu, W., Silver, P. B., Su, S. -B., Chan, C. -C., Caspi, R. R. Autoimmune uveitis elicited with antigen-pulsed dendritic cells has a distinct clinical signature and is driven by unique effector mechanisms: Initial encounter with autoantigen defines disease phenotype. The Journal of Immunology. 178 (9), 5578-5587 (2007).
  6. Broekhuyse, R. M., Kuhlmann, E. D., Winkens, H. J. Experimental melanin-protein induced uveitis (EMIU) is the sole type of uveitis evoked by a diversity of ocular melanin preparations and melanin-derived soluble polypeptides. Japanese Journal of Ophthalmology. 40 (4), 459-468 (1996).
  7. Pennesi, G., et al. A humanized model of experimental autoimmune uveitis in HLA class II transgenic mice. The Journal of Clinical Investigation. 111 (8), 1171-1180 (2003).
  8. Caspi, R. R. Understanding autoimmune uveitis through animal models. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (3), 1872-1879 (2011).
  9. Bansal, S., Barathi, V. A., Iwata, D., Agrawal, R. Experimental autoimmune uveitis and other animal models of uveitis: An update. Indian Journal of Ophthalmology. 63 (3), 211-218 (2015).
  10. Smith, J. R., Hart, P. H., Williams, K. A. Basic pathogenic mechanisms operating in experimental models of acute anterior uveitis. Immunology and Cell Biology. 76 (6), 497-512 (1998).
  11. Rosenbaum, J. T., McDevitt, H. O., Guss, R. B., Egbert, P. R. Endotoxin-induced uveitis in rats as a model for human disease. Nature. 286 (5773), 611-613 (1980).
  12. Chu, C. J., et al. Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model. Disease Models & Mechanisms. 9 (4), 473-481 (2016).
  13. Gutowski, M. B., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. In vivo bioluminescence imaging for longitudinal monitoring of inflammation in animal models of uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1521-1528 (2017).
  14. World Health Organization. Global tuberculosis report 2019. World Health Organization. , (2019).
  15. Biswas, J., Badrinath, S. S. Ocular morbidity in patients with active systemic tuberculosis. International Ophthalmology. 19 (5), 293-298 (1995).
  16. Donahue, H. C. Ophthalmologic experience in a tuberculosis sanatorium. American Journal of Ophthalmology. 64 (4), 742-748 (1967).
  17. El-Asrar, M. A., Abouammoh, M., Al-Mezaine, H. S. Tuberculous uveitis. Middle East African Journal of Ophthalmology. 16 (4), 188-201 (2009).
  18. Bodaghi, B., et al. Chronic severe uveitis: etiology and visual outcome in 927 patients from a single center. Medicine. 80 (4), 263-270 (2001).
  19. Cunningham, E. T., Forrester, J. V., Rao, N. A., Zierhut, M. Post-infectious uveitis. Ocular Immunology and Inflammation. 24 (6), 603-606 (2016).
  20. Wroblewski, K. J., Hidayat, A. A., Neafie, R. C., Rao, N. A., Zapor, M. Ocular tuberculosis: a clinicopathologic and molecular study. Ophthalmology. 118 (4), 772-777 (2011).
  21. Yeh, S., Sen, H. N., Colyer, M., Zapor, M., Wroblewski, K. Update on ocular tuberculosis. Current Opinion in Ophthalmology. 23 (6), 551-556 (2012).
  22. Tagirasa, R., Parmar, S., Barik, M. R., Devadas, S., Basu, S. Autoreactive T cells in immunopathogenesis of TB-associated uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (13), 5682-5691 (2017).
  23. Agrawal, R., et al. Insights into the molecular pathogenesis of ocular tuberculosis. Tuberculosis. 126, 102018 (2021).
  24. Pepple, K. L., et al. Primed mycobacterial uveitis (PMU): Histologic and cytokine characterization of a model of uveitis in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8438-8448 (2015).
  25. Pepple, K. L., Choi, W. J., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Wang, R. K. Quantitative assessment of anterior segment inflammation in a rat model of uveitis using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (8), 3567-3575 (2016).
  26. Pepple, K. L., Wilson, L., Van Gelder, R. N. Comparison of aqueous and vitreous Lymphocyte populations from two rat models of experimental uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (6), 2504-2511 (2018).
  27. Basu, S., Elkington, P., Rao, N. A. Pathogenesis of ocular tuberculosis: New observations and future directions. Tuberculosis. 124, 101961 (2020).
  28. Basu, S., Rao, N., Elkington, P. Animal models of ocular tuberculosis: Implications for diagnosis and treatment. Ocular Immunology and Inflammation. , 1-7 (2020).
  29. Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2921-2927 (2012).
  30. Underwood, W., Anthony, R. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. 2013 (30), 2020-2021 (2020).
  31. Donovan, J., Brown, P., et al. Handling and restraint. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. Chapter 1, Unit 1.3 (2006).
  32. Tremoleda, J. L., Kerton, A., Gsell, W. Anaesthesia and physiological monitoring during in vivo imaging of laboratory rodents: considerations on experimental outcomes and animal welfare. EJNMMI Research. 2 (1), 44 (2012).
  33. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
  34. Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
  35. John, S., Rolnick, K., Wilson, L., Wong, S., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. Bioluminescence for in vivo detection of cell-type-specific inflammation in a mouse model of uveitis. Scientific Reports. 10 (1), 11377 (2020).
  36. Fortmann, S. D., Lorenc, V. E., Hackett, S., Campochiaro, P. A. Murine Vitreous Tap (MurViTap): a novel technique to extract uncontaminated mouse vitreous humor, quantify retinal vascular permeability, and compare proteins secreted by diseased and normal retina. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (8), 5978 (2017).
  37. Caspi, R. R. Understanding autoimmunity in the eye: from animal models to novel therapies. Discovery Medicine. 17 (93), 155-162 (2014).
  38. Mruthyunjaya, P., et al. Efficacy of low-release-rate fluocinolone acetonide intravitreal implants to treat experimental uveitis. Archives of Ophthalmology. 124 (7), 1012-1018 (2006).
  39. Jaffe, G. J., Yang, C. S., Wang, X. C., Cousins, S. W., Gallemore, R. P., Ashton, P. Intravitreal sustained-release cyclosporine in the treatment of experimental uveitis. Ophthalmology. 105 (1), 46-56 (1998).
  40. Pepple, K. L., et al. Uveitis therapy with shark variable novel antigen receptor domains targeting tumor necrosis factor alpha or inducible t-cell costimulatory ligand. Translational Vision Science & Technology. 8 (5), 11 (2019).
  41. Mattapallil, M. J., et al. Characterization of a New epitope of IRBP that induces moderate to severe uveoretinitis in mice with H-2b haplotype. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5439-5449 (2015).
  42. Silver, P. B., Chan, C. C., Wiggert, B., Caspi, R. R. The requirement for pertussis to induce EAU is strain-dependent: B10.RIII, but not B10.A mice, develop EAU and Th1 responses to IRBP without pertussis treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2898-2905 (1999).
  43. Li, Q., Peng, B., Whitcup, S. M., Jang, S. U., Chan, C. C. Endotoxin induced uveitis in the mouse: susceptibility and genetic control. Experimental Eye Research. 61 (5), 629-632 (1995).
  44. Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C. Modeling intraocular bacterial infections. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 30-48 (2016).
  45. Lau, P. E., Jenkins, K. S., Layton, C. J. Current evidence for the prevention of endophthalmitis in anti-VEGF intravitreal injections. Journal of Ophthalmology. 2018, 8567912 (2018).
  46. Nche, E. N., Amer, R. Lens-induced uveitis: an update. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 258 (7), 1359-1365 (2020).
  47. Chu, C. J., et al. Assessment and in vivo scoring of murine experimental autoimmune uveoretinitis using optical coherence tomography. PLoS ONE. 8 (5), 63002 (2013).
  48. Harimoto, K., Ito, M., Karasawa, Y., Sakurai, Y., Takeuchi, M. Evaluation of mouse experimental autoimmune uveoretinitis by spectral domain optical coherence tomography. The British Journal of Ophthalmology. 98 (6), 808-812 (2014).
  49. Li, Y., Lowder, C., Zhang, X., Huang, D. Anterior chamber cell grading by optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 258-265 (2013).
  50. Bell, O. H., et al. Single eye mRNA-seq reveals normalisation of the retinal microglial transcriptome following acute inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3033 (2019).
  51. Lipski, D. A., et al. Retinal endothelial cell phenotypic modifications during experimental autoimmune uveitis: a transcriptomic approach. BMC Ophthalmology. 20 (1), 106 (2020).
  52. Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent Models of Experimental Autoimmune Uveitis. Autoimmunity. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Perl, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 443-469 (2012).

Tags

Immunologi og infektion udgave 178
Primet mykobakteriel uveitis (PMU) som en model for postinfektiøs uveitis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

John, S., Bell, O. H., Wilson, L.,… More

John, S., Bell, O. H., Wilson, L., Copland, D. A., Pepple, K. L. Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis. J. Vis. Exp. (178), e62925, doi:10.3791/62925 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter