Summary
В этом протоколе описываются этапы индуцирования праймированного микобактериального увеита (PMU) у мышей. Этот метод описывает шаги, которые помогут вызвать надежное и прочное воспаление глаз в системе мышиной модели. Используя этот протокол, мы генерировали увейтные глаза и невоспаленные глаза других животных для дальнейшей оценки с помощью иммунологических, транскриптомных и протеомных анализов.
Abstract
Термин «увеит» описывает гетерогенный набор состояний, которые все характеризуются внутриглазным воспалением. В широком смысле увеит определяется этиологией: инфекция или аутоиммунитет. Инфекционный увеит требует лечения соответствующими противомикробными средствами, в то время как аутоиммунный увеит требует лечения кортикостероидами или другими иммунодепрессантами. Постинфекционный увеит является формой хронического увеита, которая требует кортикостероидов для контроля иммунных последствий после первоначальной инфекции. Увеит, связанный с инфекцией Mycobacterium tuberculosis (Mtb), является хорошо известной формой постинфекционного увеита, но механизмы заболевания до конца не изучены. Чтобы понять роль микобактериальных антигенов и врожденных лигандов в стимулировании хронического глазного воспаления после инфекции mTB, была разработана модель Праймированного микобактериального увеита (PMU) для использования у мышей. В этой рукописи изложены методы генерации ПМУ и мониторинга клинического течения воспаления с использованием цветного дна и оптической когерентной томографии (ОКТ). PMU индуцируется иммунизацией термоубитивным микобактериальным экстрактом с последующей интравитреальной инъекцией того же экстракта в один глаз семь дней спустя. Глазное воспаление контролируется продольно с использованием визуализации in vivo с последующим сбором образцов для широкого спектра анализов, включая гистологию, проточную цитометрию, анализ цитокинов, qPCR или секвенирование мРНК. Мышиная модель PMU является полезным новым инструментом для изучения глазных реакций на mTB, механизма хронического увеита и для доклинических тестов эффективности новых противовоспалительных методов лечения.
Introduction
Термин «увеит» описывает гетерогенный набор состояний, которые все характеризуются внутриглазным воспалением1. Животные модели увеита важны для понимания механизмов заболевания и доклинического тестирования новых методов лечения. Установлен ряд животных моделей увеита2. Два из них, которые были изучены наиболее широко, являются экспериментальным аутоиммунным увеитом (или увеоретинитом; EAU) и эндотоксин-индуцированный увеит (EIU). EAU обычно генерируется иммунизацией глазными антигенами или может возникать спонтанно, когда центральная толерантность нарушается в отсутствие гена AIRE 3,4. Другие варианты модели с тех пор были разработаны 5,6,7 для включения различных увейтогенных пептидов; они были тщательно рассмотрены 8,9,10. EAU является основной моделью для форм Т-клеточного аутоиммунного увеита, таких как болезнь Фогта-Коянаги-Харада и хориоретинит у людей. EIU генерируется системным или местным введением бактериального липополисахарида (LPS)10,11. EIU был использован в качестве модели острого увеита, генерируемого активацией врожденных иммунных сигнальных путей12. Обе модели сыграли важную роль в современном понимании глазной иммунологии, но ни одна из них не является эффективной моделью для постинфекционного хронического увеита. Недавно установленная у мышей, модель Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) теперь обеспечивает подход к опросу и оценке клинических и клеточных аспектов этой формы увеита13.
Во всем мире наблюдается высокая распространенность микобактериальной инфекции: более 10 миллионов новых случаев и более 1,4 миллиона смертей, зарегистрированных Всемирной организацией здравоохранения в 2019 году14. Внелегочное проявление активной туберкулезной (ТБ) инфекции включает увеит и является общепризнанной причиной инфекционного увеита15,16. Проявлениями туберкулез-ассоциированного увеита являются протеановые, что, вероятно, отражает множественные различные механизмы заболевания, включая прямую глазную инфекцию, а также менее изученное иммуноопосредованное воспаление 17,18,19. Предлагаемые механизмы для этих постинфекционных последствий включают хроническую воспалительную реакцию, стимулируемую персистенцией паучи-бациллярной инфекции в пигментном эпителии сетчатки (RPE), хроническую воспалительную реакцию, стимулируемую присутствием остаточных патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMPs) от успешно очищенной глазной инфекции, и неадекватную активацию адаптивного иммунного ответа против глазных антигенов посредством процесса молекулярной мимикрии или антигена. распространение, вызванное системной туберкулезной инфекцией 20,21,22,23.
Чтобы получить лучшее механистическое понимание хронического постинфекционного увеита и изучить роль микобактериальных антигенов в инициировании заболевания, модель PMU была разработана для использования у мышей13,24. Соответственно, чтобы вызвать воспаление, мышь сначала получает подкожную инъекцию антигена из убитого теплом штамма Mycobacterium tuberculosis H37Ra для имитации системной инфекции, а затем семь дней спустя интравитреальную инъекцию того же антигена, введенного в левый или правый глаз, чтобы имитировать местную глазную инфекцию. Интенсивность и продолжительность последующего увеита контролируют с помощью продольной in vivo оптической когерентной томографии (ОКТ) и фундальной визуализации глаза25. ПМУ характеризуется острым, миелоидно-доминантным панувеитом, который развивается в хронический Т-клеточно-доминантный задний увеит с vitritis, периваскулярным воспалением сетчатки и очаговыми областями наружного повреждения сетчатки26. Наличие гранулематозного воспаления в заднем сегменте глаза позволяет предположить, что модель ПМУ может быть использована для изучения некоторых форм передней (гранулематозной и негранулематозной) и промежуточного увеита, наблюдаемых у пациентов с иммунологическими доказательствами прошлой инфекции Mtb27. Кроме того, было предложено, чтобы компоненты Mtb, убитого теплом, используемые в модели PMU, вызывали иммунные реакции, лежащие в основе аспектов рецидивирующего увеита у пациентов с глазным туберкулезом, которые реагируют на противотуберкулярную терапию (ATT)28. Из-за различий в инициации заболевания и воспалительном течении по сравнению с EAU и EIU, PMU представляет собой новую животную модель увеита, которая не зависит от иммунизации глазными антигенами и может помочь прояснить механизмы заболевания у пациентов с хроническим увеитом. Этот протокол описывает методы генерации PMU, мониторинга клинического течения воспаления и сбора образцов глаз для посмертного анализа с помощью проточной цитометрии.
Protocol
Все выполненные процедуры были одобрены на местном уровне Комитетом по уходу за животными и их использованию в Вашингтонском университете (протокол исследования животных No 4481-02) или в соответствии с лицензией Министерства внутренних дел Соединенного Королевства (PPL 30/3281) и Группой этического обзора Бристольского университета. Эксперименты, проведенные в обоих учреждениях, соответствовали Заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) об использовании животных в офтальмологических и визуальных исследованиях. PMU был сгенерирован у 6-10-недельных мышей C57BL/6J; все мыши весили не менее 18 г на момент индукции увеита и были подтверждены отрицательными на мутацию rd8 гена Crb129. Мышей поддерживали стандартным чау-чау и лекарственной водой (ацетаминофен 200-300 мг / кг / день) ad libitum в специфических условиях, свободных от патогенов. Эвтаназию животных проводили с использованием стандартного метода ингаляции углекислого газа30.
1. Препарат антигена для подкожной инъекции
- Выполните все процедуры, описанные в этом разделе, внутри химического вытяжного шкафа, чтобы предотвратить вдыхание или контакт кожи с порошком Mtb H37Ra. Работайте в соответствии с вашей институциональной политикой для Complete Freund's Adjuvant (обычно BSL-1). Это включает в себя использование химически стойких перчаток, защитных очков и защитной рабочей одежды (лабораторного халата).
- Используйте хорошую стерильную технику для предотвращения загрязнения реагентов, которые будут введены подопытным животным.
- Получают суспензию Mtb в PBS, смешивая 5 мг лиофилизированного, термоубитого порошка M. tuberculosis H37Ra с 2,5 мл холодного PBS в микроцентрифужной трубке объемом 5 мл. Вихрь один раз на 30 с, а затем поместите на лед.
- Чтобы получить тонкую суспензию H37Ra в PBS, обработайте ее ультразвуком на льду в течение 5 минут.
- Отстегните корпус преобразователя и очистите зонд спиртовым тампоном 70% (v/v).
- Включите ультразвуковой аппарат, отрегулируйте настройку мощности до 4, повернув ручку управления питанием, и погрузите наконечник зонда в микобактериальный порошок, содержащий PBS. Убедитесь, что наконечник зонда погружен по крайней мере на половину глубины образца и что наконечник зонда не касается стенки трубки микроцентрифуги.
- Обработайте смесь ультразвуком на льду в течение 30 с, поставьте на паузу 30 с и повторите в общей сложности 5 мин, чтобы полностью диспергировать порошок в ровную суспензию без нагревания жидкости.
- Добавьте в смесь 2,5 мл неполного адъюванта Фройнда и повторяйте процесс обработки ультразвуком на льду до тех пор, пока эмульсия не образует консистенцию, похожую на зубную пасту.
- Установите мощность на 0 с помощью ручки управления и выключите устройство, чтобы завершить обработку ультразвуком. Снимите наконечник со суспензии и протрите зонд спиртовым тампоном.
- Храните эмульсию антигена при 4 °C. Изготовление партий эмульсии поможет обеспечить согласованность во всех экспериментах. Эмульсия может храниться при 4 °C до 3 месяцев.
2. Подкожные инъекции
- Выполняют подкожную инъекцию за неделю до интравитреальной инъекции (назначают как день -7).
- Загрузите шприц объемом 1 мл (без иглы) микобактериальной эмульсией. Из-за вязкости и непрозрачности эмульсии трудноразрешимые пузырьки воздуха могут заполнять шприц.
- Чтобы предотвратить воздушные пузыри в шприце, после загрузки 0,2-0,3 мл эмульсии переверните шприц (наконечник вверх) и осторожно постучите шприцем несколько раз по краю прилавка, чтобы вывести пузырьки на поверхность.
- Выталкивайте воздух из шприца и продолжайте заполнять шприц. Переворачивайте и периодически постукивайте до заполнения.
- Поместите иглу весом 25 г на шприц и продвиньте эмульсию, чтобы заполнить иглу. Храните шприц на льду до использования.
- Чтобы безопасно выполнить подкожную инъекцию, либо обезболивайте мышь, либо используйте гуманные методы сдерживания, которые обеспечивают легкий доступ к задним конечностямживотного 31.
- Для обезболивания для подкожной инъекции поместите животное в индукционную камеру изофлурана (3%-4% для индукции и 1%-3% для поддержания). После анестезии убедитесь, что мышь имеет медленную частоту дыхания и не проявляет никаких признаков респираторного дистресса.
- Разместите подкожные инъекции либо на дорсальной поверхности бедер, либо на вентральной поверхности ног проксимально к области паховых лимфатических узлов.
- Осторожно вставьте иглу, чтобы предотвратить инъекцию в мышцу. Вводят 0,05 мл эмульсии Mtb в подкожное пространство. Не удаляйте иглу сразу, чтобы позволить густой эмульсии быть полностью введенной.
- Повторите инъекцию как с левой, так и с правой стороны, в общей сложности 0,1 мл на животное.
- При анестезии поместите мышь на теплую грелку до полного выздоровления. Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
- Верните мышь в клетку после полного выздоровления и пометьте карточку клетки датой подкожной инъекции.
- Обеспечивают анальгезию пероральным ацетаминофеном (200 мг / кг / день), но не НПВП, поскольку противовоспалительные средства могут влиять на индукцию увеита.
3. Препарат антигена для интравитреальной инъекции
- Выполняйте все процедуры, описанные в этом разделе, в соответствующих стерильных условиях для предотвращения загрязнения интравитреальной суспензии Mtb.
- Внесите интравитреальные суспензии.
- Для индукции легкого и умеренного панувеита вводят интравитреальную суспензию в концентрации 5 мг/мл, добавляя 5 мг экстракта микобактерий к 1 мл 1x PBS.
- Для индукции умеренного и тяжелого панувеита принимают интравитреальную суспензию в концентрации 10 мг/мл, добавляя 10 мг экстракта микобактерий к 1 мл 1x PBS.
- Вихрь один раз на 30 с, а затем поместите на лед.
- Чтобы получить тонкую суспензию H37Ra в PBS, обрабатывайте ее ультразвуком на льду в течение 10 минут, как описано в шаге 1.4. Aliquot это стоковый раствор в объемах 100 мкл и хранить при -20 °C.
- Перед применением оттаивают при комнатной температуре и вихрь на высоком уровне в течение 1 мин. Держите аликвоты на льду во время транспортировки к животному объекту.
4. Процедура интравитреальной инъекции на 0 день
- Подготовка животных
- Наденьте смотровые перчатки, положите мышь на весы, чтобы получить ее вес в граммах.
- Вводят внутрибрюшинную инъекцию 0,02 мл/г массы тела раствора, содержащего 100 мг/мл кетамина и 20 мг/мл ксилазина, смешанного со стерильной водой для обезболивания животного. Альтернативный подход включает индукцию с использованием ~1,5% изофлурана (ингаляционного).
- Подождите примерно 2 минуты, пока мышь заснет, а затем поместите мышь в согревающую коробку и накройте крышку. Выполните болевые рефлекторные тесты, такие как ухо, палец и хвост, чтобы оценить глубину анестезии для процедуры32.
- После сна обезболивают роговицу 1 каплей 0,5% (v/v) тетракаина. Избегайте попадания тетракаина вблизи носа или рта мыши. Через 10 с смажьте лишнюю жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Было замечено, что расширение радужной оболочки и визуализация передней камеры (AC) улучшаются при введении местной анестезии, возможно, за счет улучшения подавления рефлексов роговицы с помощью комбинированной системной и местной анестезии. Однако при желании этот шаг может быть опущен. - Расширяют зрачок 1 каплей 2,5% (v/v) фенилэфрина. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать лишних капель, которые могут попасть в нос или рот. Через 2-3 мин смазать лишнюю жидкость.
- Чтобы снизить риск эндофтальмита, добавьте 1 каплю 5% бетадина на поверхность глаз и окружающие волосы. Оставить на глазу на 2-3 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все процедуры, описанные в этом разделе, в соответствующих стерильных условиях для предотвращения эндофтальмита. - Удалите бетадин и накройте глаза гипромеллозой (0,3%) или карбомерным гелем для глаз 0,2% мас./мас.), чтобы предотвратить сухость под наркозом. Это также поможет предотвратить образование катаракты.
- Настройка системы микроинъекций
- Выполняйте интравитреальную инъекцию с помощью микронасоса, подключенного к контроллеру микрошприцевого насоса и инжекторному шприцу (рисунок 1A-C). Альтернативно, вводят иглу 33 Г, прикрепленную к шприцу Гамильтона, как описано в подразделе 4.4.
- Подключите иглу 34 G к держателю для инъекций, чтобы собрать инжектор. Ослабьте серебряный винтовой колпачок на переднем конце держателя для инъекций и вставьте иглу в корпус держателя примерно наполовину. Затяните серебряный винт колпачка пальцем плотно.
- Подключите трубку к держателю впрыска, как указано на этапах 4.2.4-4.2.5.
- Чтобы вставить трубку в держатель для впрыска, ослабьте пластиковый винт на заднем конце держателя, проведите трубку через прокладку внутрь и затяните винт.
- Поддерживайте небольшой зазор с концом трубки, чтобы предотвратить повреждение трубки во время инъекции. См. рисунок 1С.
- Разморозить 100 мкл аликвотой суспензии микобактерии.
- Добавьте 3 мкл 1% раствора флуоресцеина натрия (AK-Fluor) и хорошо вихрь.
- Загрузите шприц объемом 10 мкл смесью антигена и флуоресцеина, не включая пузырьки воздуха.
- Снимите загрузочную иглу со шприца и проведите трубку через серебряную прокладку винтового колпачка, пока наконечник не достигнет нулевой отметки в корпусе шприца.
- После того, как кончик трубки будет правильно выровнен в нужное положение, затяните палец крышки винта.
- Промывайте раствор в шприце через инъекционную трубку для полной загрузки системы. Затем повторите шаги 4.2.8-4.2.11, чтобы перезагрузить шприц для инъекции.
- Чтобы установить нагруженный шприц на микронасос, нажмите кнопку разблокировки зажима на конце микронасоса, чтобы открыть шприцевые зажимы.
- Поместите колпачок плунжера в держатель плунжерного колпачка на заднем конце микронасоса.
- Затем сдвиньте воротник шприца на упор воротника, а корпус шприца в зажим шприца.
- Отпустите кнопку зажима и затяните стопорный винт плунжера. См. рисунок 1D.
- Проведите держатель инъекции и иглу через o-образный зажим на стереотаксическом инъекционном аппарате. Это пользовательская платформа; в качестве альтернативы шприц можно удерживать и позиционировать вручную.
- Установите объем инфузии и скорость инфузионного объема на контроллере микрошприцевого насоса для впрыска 500 нЛ за цикл со скоростью 40 нЛ/с соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать более быстрые темпы инъекций, однако может наблюдаться больший рефлюкс до того, как может быть достигнуто репозиционирование иглы. - Проверьте систему, чтобы обеспечить правильное функционирование перед выполнением интравитреальной инъекции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда система впрыска функционирует правильно, активация цикла впрыска с помощью ножной педали или панели управления приведет к видимому движению держателя плунжерного колпачка, и на кончике иглы будет видна небольшая капля зеленоватой жидкости. В случае, если жидкость не производится, активируйте дополнительные циклы или промывайте и перезагружайте шприц. - Перед инъекцией в глаз аккуратно протрите иглу 95% этаноловой прокладкой.
- Процедура интравитреальной инъекции
- Мышь помещается на стереотаксический аппарат для выполнения процедуры инъекции.
- Держите сцену/платформу, на которой держится мышь, в тепле, прикрепив к ее поверхности 2-3 бумажных полотенца.
- Поместите мышь в положение лежа на платформе. Используйте правую и левую ушные перекладинки, чтобы аккуратно зафиксировать голову животного. См. рисунок 1E.
- Расположите мышь и ориентируйтесь под прицел так, чтобы был виден верхний носовой аспект правого глаза.
- Используйте иглу весом 30 г, чтобы сместить ресницы и обнажить склеру. Визуализируйте лимбус и лучевой кровеносный сосуд.
- Используйте стерильную иглу 30 Г, чтобы сделать направляющее отверстие в склере 1-2 мм кзади лимбуса.
- Вставьте иглу 34 G, прикрепленную к держателю инъекции, в глаз через направляющее отверстие под углом, который позволит избежать хрусталика, но поместите кончик иглы в стекловидную полость.
- Используя контроллер микрошприцевого насоса, осторожно введите 1 мкл экстракта Mtb в стекловидную полость. В случае постоянного рефлюкса увеличьте объем инъекции до 1,5 мкл, чтобы обеспечить адекватную доставку дозы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиктивного контроля вводят 1 мкл PBS в глаз животного. - Проверьте интравитреальное размещение путем визуализации зеленоватого рефлекса в глазу. См. рисунок 1F.
- Через 10 с выньте иглу из глаза. Обратите внимание на любой рефлюкс.
- Снимите мышь с платформы, поместите 0,3% гипромеллозы или 0,2% мас./мас. карбомеровой глазной мази на оба глаза для защиты роговицы и переместите в рекуперационную согревающую коробку.
- Не оставляйте мышь без присмотра до тех пор, пока она не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя. Не возвращайтесь в компанию других животных до полного выздоровления.
- Когда мышь полностью проснется, вернитесь в клетку и добавьте ацетаминофен (200-300 мг / кг / день) в бутылку с лечебной водой. Наклейте на клетку карточку с указанием даты инъекции ИВТ.
- Интравитреальные инъекции, как правило, хорошо переносятся. Клинические признаки, которые могут указывать на боль и необходимость удаления из исследования, включают периокулярную алопецию (свидетельствующую о самотравме), изъязвление роговицы, потерю веса и сгорбленную осанку.
- Альтернативный метод интравитреальной инъекции
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура выполняется с использованием операционного микроскопа и иглы 33 G на микрошприце.- Проптозируйте глаз и удерживайте его в положении парой щипцов.
- Затем нанесите карбомерный гель для глаз 0,2 % мас./мас. или 0,3% гипромеллозного геля для глаз и поместите на глаз круговую обшивку (диаметром 7 мм).
- Установите подкожную иглу 33 G на шприц Гамильтона объемом 5 мкл и вставьте его примерно на 2 мм по окружности к лимбусу роговицы с углом инъекции ~ 45 °.
- Направьте иглу скосом в стекловидное тело, остановившись между хрусталиком и оптическим диском (с относительной точки зрения хирурга, это выше/покрывает оптический диск - примерно в 1,5 мм от места введения), и медленно вводят 2 мкл Mtb (при 2,5 мкг/мкл в PBS).
- Зажмите иглу на месте ненадолго (чтобы уменьшить количество рефлюкса инъекционного препарата), а затем извлеките ее.
- После инъекции верните глобус, освободив щипцы. Каплю 1% мас./мас. хлорамфениколовой мази можно вводить в глаз в это время, чтобы обеспечить дополнительную защиту от постинъекционного эндофтальмита.
- После инъекции перейдите в рекуперационную нагревательную коробку, как указано в шагах 4.3.11-4.3.13.
5. Oct визуализация для выявления и количественной оценки увеита
- Подготовка животных
- Обезболивание мыши, как описано на шагах 4.1.2-4.1.4
- Расширяют зрачок 1 каплей 2,5% фенилэфрина. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать лишних капель, которые могут попасть в нос или рот. Через 2-3 мин смажьте лишнюю жидкость.
- Поместите 0,3% гипромеллозы или 0,2% мас./мас. карбомера геля на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Это также поможет предотвратить образование катаракты.
- Заверните мышь в слой хирургической марли для поддержания тепла тела и поместите ее на кассету животного. Расположите голову с помощью перекладины.
- Получите изображения ОКТ передней и задней камер.
ПРИМЕЧАНИЕ: При получении изображений передней и задней камеры сначала получите изображения задней камеры (ПК), чтобы предотвратить деградацию изображения после образования катаракты. Образование катаракты можно предотвратить с помощью частой смазки и применения 0,3% гипромеллозы или 0,2% мас./мас. карбомера для глаз. Для расширенной визуализации (>10 мин) также помогает держать мышь в тепле (с помощью грелки).- После включения системы визуализации OCT закрепите правильный объектив изображения и при необходимости отрегулируйте положение опорного рычага.
- Откройте программное обеспечение для создания образов, создайте уникальный идентификатор мыши и начните создание образа в соответствии с протоколом производителя центра развертывания Office.
- Используя опцию Free Run с протоколом быстрого сканирования, расположите глаз с зрительным нервом, сосредоточенным на изображениях задней камеры, или верхушкой роговицы на изображениях передней камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1 содержит параметры протокола визуализации для двух коммерчески доступных систем визуализации мелких животных. Обратитесь к Таблице материалов для спецификаций продукции. - Для визуализации задней камеры поднесите ОКТ близко к поверхности глаза. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать контакта поверхности хрусталика с глазом.
- Как только глаз будет правильно позиционирован, остановите быстрое сканирование и выберите протокол сканирования громкости, а затем активируйте сканирование с помощью опции Aim .
- Для изображений заднего сегмента настраивайте до тех пор, пока зрительный нерв не будет центрирован в горизонтальном изображении выравнивания B-Scan и что сетчатка не будет выровнена по оси вертикального выравнивания
- Для изображений переднего сегмента отрегулируйте положение, чтобы центрировать верхнюю часть роговицы как в изображении выравнивания горизонтального B-scan, так и в вертикальном выравнивании B-Scan. Наличие артефакта отражения на обоих изображениях подтвердит правильное выравнивание. Затем сдвиньте горизонтальное изображение настолько, чтобы удалить артефакт отражения. См. рисунок 2.
- Нажмите «Снимок», чтобы записать образ сканирования тома, а затем нажмите « Сохранить».
- Затем получите усредненное сканирование центральной линии. Откройте протокол сканирования и нажмите на Aim, а затем Snapshot. Щелкните правой кнопкой мыши на той же панели, а затем выберите Среднее.
- Повторите шаги 5.2.1-5.2.9 для каждого глаза с обеими линзами.
- После того, как все изображения собраны, извлеките мышь из кассеты и обеспечьте защиту роговицы во время восстановления, как указано в шагах 4.3.11-4.3.13.
6. Оценка воспаления по ОКТ
- Оцените изображения OCT с помощью грейдеров, которые маскируются под состояние лечения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для PMU в мышиной модели рекомендуется система подсчета баллов, приведенная в таблице 2 . - Если были получены изображения как передней камеры (AC), так и задней камеры (PC), объедините эти оценки, чтобы получить окончательную оценку для каждого глаза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Воспаление передней камеры проходит до воспаления задней камеры.
7. Оценка воспаления по патологоанатомической гистологии
- В конце эксперимента соберите отдельные глаза путем энуклеации, зафиксируйте 4% формальдегида на ночь и приступайте к встраиванию парафина, сечению и окрашиванию H&E33.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать несколько участков 4-8 мкм вдоль оси зрачково-зрительного нерва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три секции на глаз оцениваются замаскированным грейдером с использованием системы оценки, представленной в таблице 3, и средний балл трех секций сообщается как окончательный балл гистологического воспаления.
Representative Results
Этот протокол демонстрирует индукцию увеита у мышей с использованием модели праймированного микобактериального увеита (PMU). Обеспечение последовательности в подкожной инъекции и точность интравитреальной инъекции являются ключевыми шагами в разработке модели праймированного микобактериального увеита (PMU). На рисунке 1 показана процедура интравитреальной инъекции мыши с использованием стереотаксического аппарата. Ушные вкладыши помогают мягко расположить голову в том же месте под микроскопом (рисунок 1Е). Они также сохраняют голову стабильной во время процедуры интравитреальной инъекции, что снижает риск инъекционной травмы. После успешной инъекции флуоресцеин в растворе для инъекций производит зеленоватое отражение изнутри глаза, которое можно увидеть под микроскопом или сбоку, как показано на рисунке 1F.
При выполнении, как описано, протокол генерирует устойчивый острый увеит, который может быть обнаружен с помощью визуализации ОКТ и глазного дна уже через 10 часов после интравитреальной инъекции. На рисунке 2 показано правильное выравнивание глаза для визуализации OCT. В таблице 1A перечислены параметры, используемые в протоколе OCT. Системный подход к получению изображений обеспечит качественные изображения, которые можно будет сравнивать с течением времени. Изображения передней камеры центрируются на вершине роговицы с использованием изображения SLO (рисунок 2A) с радужной оболочкой, выровненной параллельно горизонтальной и вертикальной плоскостям (рисунок 2B, C). Сканирование объема и линии захватывается вертикальным выравниванием, так что нижние и верхние области могут быть просмотрены одновременно. Изображения заднего сегмента центрируются на зрительном нерве с использованием изображения SLO лица (рисунок 2D), а яркая полоса RPE используется для выравнивания сетчатки параллельно как горизонтальной, так и вертикальной плоскостям (рисунок 2E, F).
На рисунке 3 показаны типичные результаты воспаления глаз PMU с использованием OCT-визуализации. Через двадцать четыре часа после интравитреальной инъекции воспалительные клетки наблюдаются в водном и стекловидном телах (рисунок 3B). При наличии умеренного или сильного воспаления гипопион будет виден в нижнем углу в АС. Степень глазного воспаления может быть оценена на этих изображениях OCT с использованием критериев, перечисленных в таблице 2. Репрезентативные примеры изображений, демонстрирующих воспалительные особенности, характерные для каждой оценки, показаны на рисунке 4. Оценки камер переменного тока и ПК могут быть сложены вместе для создания комбинированной оценки OCT. Комбинированные баллы >0, но ≤2,5 представляют собой легкое воспаление. Умеренное воспаление определяется баллами >2,5, но ≤4,5. Баллы >4,5 определяют тяжелое воспаление. Воспаление обычно достигает пика через 48 ч после интравитреальной инъекции с баллами OCT в AC и PC между 1 и 3 (комбинированные баллы от 2 до 6). Оценки AC и PC 0,5 или 4 встречаются реже. В случае, если оценки за пределами типичного диапазона встречаются часто, может потребоваться устранение неполадок для выявления факторов, способствующих выбросам баллов (см. раздел обсуждения). Показатели воспаления в передней камере, как правило, возвращаются к нулю в течение одной недели после интравитреальной инъекции. Напротив, задние баллы не возвращаются к нулю; вместо этого хроническое воспаление низкого уровня сохраняется в виде витрита, а периваскулярные лимфоциты проникают в сетчатку в течение 1-2 месяцев после интравитреальной инъекции.
Показатель воспаления при ПМУ также может быть определен с помощью гистологии. На рисунке 5 показаны репрезентативные участки H&E для использования при оценке тяжести PMU по гистологии. Количество воспалительных клеток в водном и стекловидном теле подсчитывают и используют для определения тяжести с использованием критериев оценки, перечисленных в таблице 3. Воспалительная клеточная инфильтрация цилиарного тела обычно наблюдается на одной стороне гистологического отдела (одностороннее вовлечение) при легком или умеренном воспалении. Когда воспаление тяжелое, это отражается наличием воспалительного клеточного инфильтрата в цилиарном теле с обеих сторон хрусталика (так называемое двустороннее вовлечение). В более поздние временные моменты после интравитреальной инъекции также могут быть выявлены хронические проявления воспаления, в том числе наличие периваскулярных и интраретинальных лейкоцитов и наружных складок сетчатки. Гистология также может быть полезна для выявления глаз, пораженных плохими методами инъекций. Травма хрусталика во время интравитреальной инъекции может быть идентифицирована по наличию аморфных эозино-окрашенных (розовых) белков хрусталика вне капсулы хрусталика, прилегающей к области травмы. Рефлюкс интравитреального мТБ в субконъюнктивальное пространство будет генерировать воспаление вне глаза, которое может быть идентифицировано путем тщательного обзора периокулярных структур, присутствующих на участках. Из-за неспособности удерживать экстракт mTB в глазах, эти глаза, как правило, имеют низкие показатели воспаления OCT.
Визуализация глазного дна Брайтфилда также может быть использована для выявления клинически значимых аспектов PMU, включая развитие гипопиона, витрита и инфильтрации клеток сетчатки или периваскулярной воспалительной воспалительной клетки. На рисунке 6 показаны два примера, когда воспаление сетчатки и периваскулярное воспаление можно увидеть на изображениях глазного дна. Эти два глаза также показывают диапазон воспаления, который распространен в модели PMU. В таблице 1B перечислены параметры, используемые в системе визуализации ОКТ глазного дна/сетчатки. Обратите внимание на влияние, которое сильное воспаление оказывает на качество изображения (рисунок 6, день 2, oct и изображения глазного дна в верхнем ряду) и степень заболевания, присутствующего на 21-й день. Отек роговицы также может снизить качество изображения при остром воспалении; тем не менее, редко бывает, чтобы отек роговицы был тяжелым только от воспаления. Чаще всего качество изображения ухудшается из-за повреждения эпителия в результате неполной защиты поверхности во время визуализации и анестезии.
Модель PMU может быть использована для индуцирования увеита у любой породы мышей или генотипа. В глазах альбиносов OCT все еще может использоваться для оценки воспаления, но отсутствие пигмента глазного дна затрудняет визуализацию воспаления с помощью визуализации Brightfield13,34. Посмертные исследования могут быть выполнены на глазных тканях, регионарных лимфатических узлах или селезенке. Некоторые примеры включают анализы на наличие иммунных клеток, такие как проточная цитометрия и иммуногистохимия, а также измерение воспалительных цитокинов. Во всех временных точках, протестированных после начала воспаления с PMU (с 1-го по 56-й день), в отдельных глазах присутствует достаточно воспалительных клеток CD45+ для обнаружения многих основных популяций лейкоцитов в глазу с помощью многопараметрического анализа потока12,35. Водные (2-5 мкл) и стекловидные (5-10 мкл) гуморы могут быть собраны из воспаленных глаз для определения концентрации белка, протеомных исследований или определения концентрации цитокинов36.
Рисунок 1: Настройка интравитреальной инъекции мыши. Интравитреальная инъекция выполняется на глаз мыши с использованием (А) контроллера микрошприцевого насоса, подключенного к микронасосу (В) и (С) инъекционного шприца. Шприц загружается и монтируется на микронасос (D). Головка мыши позиционируется с помощью (E) ушных вкладышей для обеспечения стабильности и согласованности во время процедуры интравитреальной инъекции. (F) Флуоресцеин в растворе для инъекций производит зеленоватое отражение изнутри глаза после успешной процедуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Правильное выравнивание глаза для визуализации OCT. (A) Используя изображение лазерного офтальмоскопа (SLO), глаз центрируется для визуализации передней камеры. Зеленая линия указывает положение сканирования горизонтальной линии, показанного на панели (B). Обратите внимание, что центральная роговица избегается, чтобы уменьшить артефакт отражения. (C) Вертикальное B-сканирование через парацентральную переднюю камеру. Это сканирование получается при 90° из горизонтального сканирования. Обратите внимание, что выравнивание секций диафрагмы с каждой стороны объектива является ровным в горизонтальном сканировании (панель B) и расположено один над другим в вертикальном сканировании (панель C). (D) Используя изображение SLO, изображение задней камеры центрируется на зрительном нерве. (E) Горизонтальное выравнивание B-сканирования, (F) Вертикальное выравнивание B-сканирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Индукция PMU порождает панувеит, который можно контролировать с помощью продольной ОКТ-визуализации. В верхнем ряду показана передняя камера (AC); в нижнем ряду показаны изображения ОКТ задней камеры (ПК), чтобы выделить патологические изменения в течении заболевания. (A) Базовое изображение OCT AC (вверху) и PC (внизу) до индукции увеита, оба оценивают 0. (B) День 1 после интравитреальной инъекции, показывающей наличие отека роговицы (черная стрелка), гипопиона (*) множественных свободно плавающих воспалительных клеток в AC (белые стрелки) и vitritis (белые наконечники стрел) в ПК. (C) День 7 после интравитреальной инъекции с небольшим количеством клеток AC на передней капсуле хрусталика (белая стрелка) и уменьшением витрита (белый наконечник стрелы). (D) День 28 после интравитреальной инъекции передней камеры с разрешенным воспалением AC и легким витритом. Сокращения: С- роговица, L - хрусталик, I - радужная оболочка, Aq - водный, V стекловидное тело, RGC - ганглиозные клетки сетчатки, PR - фоторецепторы, Ch- сосудистой оболочки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Примеры оценок OCT. Оценка центра развертывания Office от 0 до 4 присваивается каждому образу переменного тока и образу ПК с использованием категориальной системы, показанной в таблице 2. Оценки AC и PC объединяются для окончательной оценки OCT для глаза. (А,Г) Примеры нулевого балла. (В,Э) Примеры баллов 0,5. (С,Ф) Примеры баллов 1. (Г,Дж) Примеры баллов 2. (Н,К) Примеры баллов 3. (И,Л) Примеры баллов 4 показаны на панелях I и L. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Примеры оценки гистологии. Оценка гистологии определяется на основе пяти характеристик, видимых в разделах H & E: плотность белка передней камеры, количество клеток передней камеры, инфильтрация иммунных клеток цилиарного тела, плотность клеток стекловидного тела, воспаление сосудов сетчатки и структурные изменения сетчатки. За каждую характеристику присваивается оценка 0-2. Описание каждой оценки приведено в таблице 3. Репрезентативный пример оценки 0-2 для каждой характеристики показан на этом рисунке. В левом столбце отображается нулевой балл. В центральном столбце показаны примеры оценки 1. В правом столбце приведены примеры баллов 2. Оценка 2 для цилиарного тела присваивается, если цилиарное тело по обе стороны от хрусталика в том же разделе демонстрирует клеточное воспаление. Окончательная оценка гистологии представляет собой сумму баллов по каждому из пяти критериев (максимальный балл 10). Стрелка в нижней правой панели указывает на периваскулярные лейкоциты, связанные с поверхностным сосудом сетчатки. Черная шкала указывает на 500 мкм. Шкалы цилиарной шкалы указывают на 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Продольная визуализация глазного дна при PMU выявила диапазон тяжести заболевания. (A) Сильно воспаленные глаза демонстрируют множественные белые инфильтраты в сетчатке и извитость сосудов на цветной визуализации глазного дна (верхний ряд), а также плотный витрит и отек сетчатки на OCT (нижний ряд) на 2-й день. Прогрессирование числа поражений сетчатки может наблюдаться с течением времени, пока витрит улучшается. Зеленая линия указывает положение изображения центра развертывания Office. (B) Слабо воспаленные глаза демонстрируют все меньше и больше дискретных линейных поражений в глазном дне и ряд инфильтрирующих клеток в стекловидном теле. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| A | |||
| Мышиная передняя камера | Быстрое сканирование | Сканирование томов | Линейное сканирование |
| Длина X Ширина | 4.0 мм x 4.0 мм | 3,6 x 3,6 мм | 3,6 мм |
| Угол | 0 | 90 | 90 |
| A-scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-сканы | 50 | 400 | 1 |
| Кадры/ B-сканирование | 1 | 3 | 20 |
| Задняя камера мыши | Быстрое сканирование | Сканирование томов | Линейное сканирование |
| Длина X Ширина | 1,6 мм x 1,6 мм | 1,6 мм x 1,6 мм | 1,6 мм |
| Угол | 0 | 0 | 0 |
| A-scan/B-Scan | 800 | 1000 | 1000 |
| # B-сканы | 50 | 200 | 1 |
| Кадры/ B-сканирование | 1 | 3 | 20 |
| B | |||
| Задняя камера мыши | Сканирование томов | Линейное сканирование | |
| Длина X Ширина | 0,9 мм x 0,9 мм | 1,8 мм | |
| Угол | 0 | Любой (обычно 0 или 90) | |
| A-scan/B-Scan | 1024 | 1024 | |
| # B-сканы | 512 | 1 | |
| Кадры/ B-сканирование | 1 | 30 |
Таблица 1: Параметры сканирования. (A) Параметры сканирования центра развертывания Office. (B) Параметры ЦКТ-сканирования глазного дна/сетчатки
| Описания оценок центра развертывания Office | ||||||
| Счёт | Передняя камера | Задняя камера | ||||
| Н.А. | Нет вида за пределы передней роговицы | Нет вида заднего сегмента | ||||
| 0 | Отсутствие воспаления | Отсутствие воспаления | ||||
| 0.5 | 1–5 клеток в воде | Несколько клеток, занимающих менее 10% площади стекловидного тела | ||||
| ИЛИ отек роговицы | Отсутствие субретинальных или интраретинальных инфильтратов или нарушений архитектуры сетчатки | |||||
| 1 | 6–20 клеток в воде | Диффузные клетки (без плотных сгустков), занимающие от 10 до 50% площади стекловидного тела. | ||||
| ИЛИ один слой клеток на передней капсуле хрусталика | Отсутствие субретинальных или интраретинальных инфильтратов или нарушений архитектуры сетчатки | |||||
| 2 | 20–100 клеток в воде | Диффузные клетки (без плотных сгустков), занимающие > 50% площади стекловидного тела | ||||
| ИЛИ менее 20 клеток и присутствует гипопион | Отсутствие субретинальных или интраретинальных инфильтратов или нарушений архитектуры сетчатки | |||||
| 3 | 20–100 клеток в воде | Диффузные ячейки, равные степени 2 и 1 | ||||
| И гипопион ИЛИ зрачковая мембрана | И по меньшей мере одна плотная помутнение стекловидного тела, занимающая 10%-20% площади стекловидного тела ИЛИ наличие стекловидных клеток, равных степени 2 и редких (≤ 2) субретинальных или нтраретинальных помутненций | |||||
| 4 | Любое количество водных ячеек | Плотное стекловидное помутнение, занимающее > 20% площади стекловидного тела. | ||||
| И большая потеря гипопиона и зрачковой мембраны ИЛИ передней структуры из-за сильного воспаления | ИЛИ диффузные стекловидные клетки с большими субретинальными или интраретинальными помутнениями | |||||
Таблица 2: Критерии оценки PMU OCT: Изображения центра развертывания Office оцениваются в соответствии с критериями, перечисленными в таблице. Оценки AC и PC добавляются для получения окончательной оценки глаза. В тех случаях, когда четкий обзор глаза не был получен, изображениям присваивалась оценка NA, и они были исключены из исследования.
| Описание оценки гистологии | |||
| Характерный | 0 | 1 | 2 |
| Белок передней камеры (AC) | Окрашивание скудных бесклеточных частиц эозином в ас | Умеренное, но не сливающееся внеклеточное окрашивание эозина в любом месте AC | Сливающееся или близкое к сливающемуся внеклеточное окрашивание эозина по всему АС |
| Ячейка передней камеры (AC) | Нет ячеек | 1–100 клеток, но без плотных агрегаций клеток | >100 клеток, или плотные скопления клеток |
| Воспаление цилиарного тела | Отсутствие лейкоцитарной инфильтрации цилиарного тела или окружающего стекловидного тела | Одностороннее присутствие лейкоцитов, проникающих в цилиарное тело и/или окружающее стекловидное тело. | Двустороннее присутствие лейкоцитов, проникающих в цилиарное тело и/или окружающее стекловидное тело. |
| Воспаление сосудов сетчатки | Отсутствие сосудов сетчатки с периваскулярными лейкоцитами | Один сосуд на участок с периваскулярными лейкоцитами | >1 сосуд на участок с периваскулярными лейкоцитами |
| Складка сетчатки или повреждение | Отсутствие повреждений сетчатки | 1–3 складки сетчатки на секцию | >3 складки сетчатки на участок, или любое другое разрушение слоя сетчатки или интраретинальное кровоизлияние |
Таблица 3: Критерии оценки гистологии PMU: Участки глаза H&E были оценены на основе критериев, перечисленных в таблице. Три участка одного и того же глаза были оценены и усреднены, чтобы получить окончательную оценку гистологии глаза.
Discussion
Животные модели увеита сыграли важную роль в понимании механизмов глазного воспаления и гомеостаза, а также в обеспечении доклинической оценки медицинской и хирургической терапии для пациентов с увеитом37. Как кроличий, так и крысиный варианты модели PMU продемонстрировали свою ценность в доклинической терапии с помощью доказательств концептуальных исследований 38,39,40. Благодаря наличию разнообразного спектра трансгенных штаммов у мышей, создание системы моделирования PMU на мышах теперь позволяет проводить более подробные механистические исследования для выявления конкретных типов клеток, путей и генов, которые способствуют патологии этого заболевания.
Животные модели увеита могут продемонстрировать вариабельность между животными в частоте и интенсивности воспаления41. В штамме мыши C57BL/6 PMU надежно генерируется с использованием протокола, описанного здесь. Специфические для штамма вариации течения и интенсивности увеита были зарегистрированы как для EAU, так и для EIU42,43. Хотя специфические для штамма воздействия на тяжесть и течение PMU не были измерены экспериментально, эта модель использовалась у диких типов C57BL/6J, а также у мышей-альбиносов (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) и вызывала аналогичные воспалительные реакции. При создании модели PMU контроль над соображениями, перечисленными ниже, может помочь новым исследователям ограничить изменчивость и произвести наиболее последовательный и воспроизводимый увеит.
Обеспечьте консистенцию в подкожных инъекциях:
Чтобы обеспечить последовательную подкожную инъекцию, убедитесь, что все пузырьки воздуха удалены из эмульсии. Соображения включают короткую центрифугу (30 с при 400 х г) предварительно изготовленной эмульсии перед загрузкой шприца. Это удалит воздух, захваченный эмульсией. Кроме того, при загрузке шприца периодически переворачивайте (опрокидывайте) и нажимайте на шприц, чтобы удалить пузырьки воздуха. Во время инъекции не ставьте шприц слишком глубоко, чтобы избежать внутримышечного введения. И наоборот, неглубокая (внутрикожная) инъекция может привести к эрозии эмульсии через кожу. Не забудьте сделать небольшую паузу перед извлечением шприца из места инъекции, чтобы обеспечить полное введение толстой вязкой эмульсии и предотвратить рефлюкс с кожи.
Через семь дней после установки подкожной инъекции подтвердите наличие пальпируемых узелков по обе стороны задних ног. Если узелки не могут быть идентифицированы, возможно, что был введен воздух, а не эмульсия. В этом случае острое воспаление может быть не таким сильным, и хроническое воспаление может не развиться.
Предотвратить развитие инфекционного эндофтальмита:
Бактериальный или грибковый эндофтальмит будет генерировать смешивающую переменную, если не предотвратить44. Чтобы предотвратить бактериальный эндофтальмит, всегда практикуйте хорошую асептическую технику при изготовлении интравитреальной суспензии, обращении и очистке всех многоразовых инструментов, которые будут контактировать с глазом. Важно использовать стерильные одноразовые предметы, автоклавирование или чистку с помощью 95% спиртовых стирок или салфеток. Надлежащее использование бетадина, нанесенного на глазную поверхность, веки и периокулярный мех, также поможет предотвратить эндофтальмит45. Легко распознать глаз с инфекцией, так как глазные структуры будут уничтожены сильным воспалением во время курса после инъекции. Это не характерно для PMU. Наличие внутриглазного кровотечения также может свидетельствовать об эндофтальмите или травме от инъекции. В таких случаях исключите этих животных из исследования.
Обеспечьте согласованность при интравитреальной инъекции:
Интравитреальная инъекция является критическим шагом в индукции надежного и воспроизводимого воспаления при ПМУ. Обеспечение постоянного количества суспензии Mtb с каждой инъекцией, предотвращение травмы и предотвращение рефлюкса суспензии - все это факторы, которые следует учитывать при выполнении инъекций. Чтобы обеспечить стабильную подвеску, тщательно вихрьте суспензию при оттаивании и перед загрузкой ее в шприц. Поскольку этот используемый экстракт Mtb не образует раствора, суспензия может подвергаться осаждению с течением времени. Чтобы обеспечить равномерную концентрацию экстракта Mtb в каждой инъекции, используйте или выталкивайте и перезаряжайте шприц в течение 15 минут после загрузки. Фенилэфрин используется для дилатации, чтобы обеспечить большее поле зрения для заднего глаза и снизить риск травмы глаза во время инъекции. Эта капля генерирует естественное втягивание век и небольшой проптоз земного шара, что позволяет хорошо визуализировать область 1-2 мм сзади от лимбуса без необходимости захватывать глаз щипцами. Использование щипцов для сдерживания глаза может вызвать потенциальную травму и временно увеличить внутриглазное давление и риск рефлюкса суспензии Mtb. Травма также может быть вызвана попыткой ввести слишком большой объем в глаз. Объем инъекции ограничен 2 мкл для предотвращения значительного и длительного повышения внутриглазного давления и травмы глаза. Кроме того, у молодых животных будут глаза, которые меньше, чем у взрослых мышей. Обычно 6-8 недельные мыши (20-25 г) обеспечивают однородный размер глаз и обеспечивают большую консистенцию при воспалении после инъекции Mtb. Более высокая частота постинъекционного рефлюкса микобактериальной суспензии наблюдалась у более мелких мышей. Это, в свою очередь, приводит к менее ожидаемому острому воспалению. Разбавленный флуоресцеиновый раствор используется для обеспечения начинающим инъекторам визуальной обратной связи об успехе их метода инъекции. Дилатация в момент инъекции позволит получить прямую визуализацию вводимого материала в стекловидную полость и возможность отметить любые признаки травмы хрусталика. В случае травмы хрусталика это может вызвать изменение четкости хрусталика, что вызовет катаракту, которую можно визуализировать на OCT. В случае глазной травмы глаза должны быть исключены из исследования из-за возможности вызванного линзой увеита46. Мы рекомендуем сделать паузу на 10 с перед извлечением шприца из глаза, чтобы обеспечить рассеивание суспензии Mtb в глазу и уменьшить рефлюкс.
Модель PMU может быть модифицирована для изменения интенсивности острого воспаления путем изменения концентрации Mtb в интравитреальной инъекции. Различные дозировки в диапазоне от 2,5 мкг / мкл до 15 мкг / мкл были протестированы ранее в нашей лаборатории. Тем не менее, было обнаружено, что дозы выше 10 мкг / мкл вызывают серьезное повреждение глаз, включая спонтанный разрыв хрусталика, тяжелый отек роговицы и рубцевание, а также гифему. Такая степень выраженности не характерна для пациентов с постинфекционным увеитом, а значит, такие концентрации не рекомендуются. Было обнаружено, что доза 5 мкг/мкл надежно вызывает легкое и умеренное острое воспаление и легкий хронический увеит; доза 10 мкг/мкл вызывает достоверно умеренное и тяжелое острое заболевание и более заметное хроническое заболевание. Таким образом, изменение интравитреальной концентрации может обеспечить альтернативную тяжесть заболевания для использования по мере необходимости на основе экспериментального вопроса. Контроль должен быть выбран для обеспечения того, чтобы результаты были обусловлены реакцией на мТБ, а не травмой, связанной с подкожными или интравитреальными инъекциями. В фиктивном контроле инъекций PBS можно использовать вместо экстракта mTB. Для сравнения с неэкспонированными животными следует рассматривать истинные наивные образцы, поскольку глаза собратьев не всегда эквивалентны.
Из-за небольшого размера глаза мыши OCT может быть более чувствительным анализом для обнаружения воспаления в передней камере, чем прямая визуализация или микроскопическая фотография яркого поля. Предыдущая работа с PMU у крыс25 определила, что с помощью гистологии может быть обнаружено больше клеток, чем с помощью OCT, но существует хорошая корреляция между двумя модальностями. OCT имеет дополнительное преимущество, что его можно использовать для продольного мониторинга воспаления у того же животного. Другие основные мышиные модели увеита, такие как EAU и EIU, также использовали OCT для количественного анализа 12,47,48. В модели PMU мышей клетки передней камеры видны только на OCT и не могут быть замечены на клинических экзаменах, если не присутствует большой гипопион. Воспаление стекловидного тела (vitritis) можно наблюдать с помощью цветной визуализации глазного дна, но обнаружение количественных изменений возможно только при визуализации OCT. Другие аспекты модели, такие как воспаление сосудов сетчатки и повреждение сетчатки, могут быть легко идентифицированы с помощью OCT и микроскопической фотографии глазного дна.
При использовании OCT важно учитывать, как локализованная визуализация может быть затронута региональными различиями в степени воспаления. Предыдущие отчеты выявили неравномерное распределение клеток в передней камере человека, причем больше клеток расположено ниже49. У мышей распространена подобная предрасположенность. Таким образом, вертикальное или радиальное сканирование через переменный ток поможет обеспечить изображения, которые захватывают диапазон воспаления. Кроме того, выполнение визуализации в том же месте также обеспечит согласованность изображений, собранных в одном и том же глазу продольно. Для получения изображений в одной части глаза используют устойчивые ориентиры и системный подход. Для изображений передней камеры изображение центрируется непосредственно рядом с вершиной роговицы и ориентировано вертикально, так что присутствие гипопиона может быть обнаружено в нижнем углу. Для изображений заднего сегмента изображение центрируется на зрительном нерве. Рекомендуется рассмотреть возможность использования не менее 3 сканирований строк для оценки, чтобы обеспечить региональную изменчивость. В тех случаях, когда воспаление ограничено периферическими местами, получение объемного сканирования может быть полезным. Сбор сканирования томов также может помочь уловить региональные различия, но увеличит требования к хранению данных.
Другие анализы in vivo, которые могут быть использованы для характеристики воспаления в мышиной модели PMU, включают биолюминесцентную визуализацию13,35. Посмертные анализы, такие как многопараметрический проточный цитометрический анализ, могут быть выполнены для выявления и количественной оценки инфильтрирующих популяций типа иммунных клеток в водной и задней камере глаза12,26. В модели PMU острое воспаление характеризуется врожденным ответом с преобладающим нейтрофильным инфильтратом, за которым следует хронический и стойкий адаптивный доминантный ответ Т-клеток, который сохраняется в течение болеемесяца 35. Другие анализы иммунной функции, которые могут быть выполнены на посмертных тканях, включают анализ цитокинов глазной жидкости. Кроме того, другие последующие анализы, такие как секвенирование мРНК и иммунофлуоресцентная визуализация, могут быть использованы для оценки паттернов экспрессии генов и белков популяций иммунных клеток сетчатки при увеите50,51.
Модель PMU может быть воспроизведена в других системах грызунов с использованием адаптаций, подходящих для различных видов. Модель PMU ранее использовалась у крыс и кроликов 38,39,40. У крыс острый панувеит развивается после интравитреальной инъекции, которая проходит спонтанно в течение 14 дней без развития признаков хронического воспаления по гистологии24. У кроликов индукция увеита использует два раунда подкожной инъекции перед интравитреальной инъекцией, но также вызывает устойчивый панувеит. Одним из преимуществ использования мышиной модели является наличие многочисленных трансгенных и нокаутирующих штаммов, которые могут помочь понять основной механизм увеита52. Все модели грызунов могут быть использованы для доклинического тестирования терапии, если агент вводится системно или в виде местной капли. Однако из-за их большего размера глаза крыс и кроликов являются лучшими моделями для использования в доклинических исследованиях имплантируемых или местных инъекционных вариантов лечения увеита.
Таким образом, этот протокол предоставляет исследователям, заинтересованным в изучении механизмов хронического воспаления глаз, новый инструмент, который не зависит от предшествующей иммунизации глазными антигенами.
Disclosures
У авторов нет финансовых конфликтов для раскрытия.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается финансированием национальных институтов здравоохранения, Бетесда, штат Мэриленд, США (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, грантом UW Vision Research Core Grant (NEI P30EY01730), подарками от Mark Daily, MD Research Fund и Christopher and Alida Latham Research fund, неограниченным ведомственным грантом от Research to Prevention Blindness и премией за развитие карьеры от Research to Prevent Blindness (KP). Работа, проведенная в Бристоле, была поддержана дополнительным финансированием от Sight Research UK и The Underwood Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AK-FLUOR | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 10% Fluorescein sodium 100 mg/mL in 5 mL vial | |
| AnaSed | Akorn Animal Health, IL, USA | NDC 59399-110-20 | Xylazine 20 mg/mL |
| Betadine 5% Sterile Ophthalmic Prep Solution | Alcon, TX, USA | 8007-1 | |
| B-D Precision Glide Needles -25 G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305122 | |
| B-D Precision Glide needle -30-G | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 305106 | |
| Bond MAX, Bond Rx | Leica Biosystems, IL,USA | Automated IHC staining system | |
| Chloramphenicol ointment | Martindale Pharma, Romford, UK | 1% w/w Chloramphenicol | |
| EG1150H | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Embedding | |
| Envisu R2300 | Bioptigen/Leica | OCT Machine | |
| Freund's Incomplete Adjuvant | BD Difco, NJ, USA | 263910 | |
| GenTeal lubricant eye ointment | Alcon, TX, USA | --- | |
| GenTeal lubricant eye gel | Alcon, TX, USA | --- | |
| H37Ra lyophilized Mycobacteria extract | BD Difco, NJ, USA | 231141 | |
| Hamilton RN Needle (33/12/2)S | Hamilton, Reno, NV | 7803-05(33/12/2) | 33 G |
| Hamilton syringe | Hamilton, Reno, NV | CAL7633-01 | 5 µL |
| Insulin needle | Exel International, USA | 26029 | 1 mL |
| Isoflurane | |||
| Ketaset | Zoetis, USA | 377341 | Ketamine HCL 100 mg/mL |
| Microinjection Syringe Pump and Micro4Controller | World Precision Instruments, FL, USA | UMP3 | |
| Micron IV | Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA | Alternative Imaging/OCT Machine | |
| Nanofil 10 µL syringe | World Precision Instruments, FL, USA | NANOFIL | |
| Nanofil Intraocular Injection Kit | World Precision Instruments, FL, USA | IO-KIT | |
| Olympus SZX10 | Olympus | Dissection scope | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Phenylephrine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP 2.5% Sterile 15 mL | Akorn Pharmaceuticals, IL, USA | 17478020115 | |
| RM2255 | Leica Biosystems, IL,USA | Tissue Sectioning | |
| TB Syringe | Becton, Dickinson and Company, NJ, USA | 309602 | 1 mL |
| Tetracaine 0.5% | Alcon, TX, USA | 1041544 | |
| Tissue Tek VIP series | Sakura Finetek USA, Inc.,CA. | Histology Tissue Processing | |
| Tropicamide 1% | Chauvin Pharmaceuticals, Romford, UK | Minims | |
| Tylenol | Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA | NDC 50580-614-01 | Acetaminophen |
| Viscotears | Novartis Pharmaceuticals, Camberley, UK | Carbomer eye gel 0.2% w/w |
References
- American Academy of Ophthalmology. Aao 2019-2020 Basic and Clinical Science Course, Section 09: Uveitis and Ocular Inflammation. American Academy of Ophthalmology. , (2019).
- Caspi, R. R. Animal models of autoimmune and immune-mediated uveitis. Drug Discovery today. Disease Models. 3 (1), 3-9 (2006).
- DeVoss, J., et al. Spontaneous autoimmunity prevented by thymic expression of a single self-antigen. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2727-2735 (2006).
- Caspi, R. R., et al. A new model of autoimmune disease. Experimental autoimmune uveoretinitis induced in mice with two different retinal antigens. Journal of Immunology. 140 (5), 1490-1495 (1988).
- Tang, J., Zhu, W., Silver, P. B., Su, S. -B., Chan, C. -C., Caspi, R. R. Autoimmune uveitis elicited with antigen-pulsed dendritic cells has a distinct clinical signature and is driven by unique effector mechanisms: Initial encounter with autoantigen defines disease phenotype. The Journal of Immunology. 178 (9), 5578-5587 (2007).
- Broekhuyse, R. M., Kuhlmann, E. D., Winkens, H. J. Experimental melanin-protein induced uveitis (EMIU) is the sole type of uveitis evoked by a diversity of ocular melanin preparations and melanin-derived soluble polypeptides. Japanese Journal of Ophthalmology. 40 (4), 459-468 (1996).
- Pennesi, G., et al. A humanized model of experimental autoimmune uveitis in HLA class II transgenic mice. The Journal of Clinical Investigation. 111 (8), 1171-1180 (2003).
- Caspi, R. R. Understanding autoimmune uveitis through animal models. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (3), 1872-1879 (2011).
- Bansal, S., Barathi, V. A., Iwata, D., Agrawal, R. Experimental autoimmune uveitis and other animal models of uveitis: An update. Indian Journal of Ophthalmology. 63 (3), 211-218 (2015).
- Smith, J. R., Hart, P. H., Williams, K. A. Basic pathogenic mechanisms operating in experimental models of acute anterior uveitis. Immunology and Cell Biology. 76 (6), 497-512 (1998).
- Rosenbaum, J. T., McDevitt, H. O., Guss, R. B., Egbert, P. R. Endotoxin-induced uveitis in rats as a model for human disease. Nature. 286 (5773), 611-613 (1980).
- Chu, C. J., et al. Multimodal analysis of ocular inflammation using the endotoxin-induced uveitis mouse model. Disease Models & Mechanisms. 9 (4), 473-481 (2016).
- Gutowski, M. B., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. In vivo bioluminescence imaging for longitudinal monitoring of inflammation in animal models of uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1521-1528 (2017).
- World Health Organization.
- Biswas, J., Badrinath, S. S. Ocular morbidity in patients with active systemic tuberculosis. International Ophthalmology. 19 (5), 293-298 (1995).
- Donahue, H. C. Ophthalmologic experience in a tuberculosis sanatorium. American Journal of Ophthalmology. 64 (4), 742-748 (1967).
- El-Asrar, M. A., Abouammoh, M., Al-Mezaine, H. S.
- Bodaghi, B., et al. Chronic severe uveitis: etiology and visual outcome in 927 patients from a single center. Medicine. 80 (4), 263-270 (2001).
- Cunningham, E. T., Forrester, J. V., Rao, N. A., Zierhut, M.
- Wroblewski, K. J., Hidayat, A. A., Neafie, R. C., Rao, N. A., Zapor, M. Ocular tuberculosis: a clinicopathologic and molecular study. Ophthalmology. 118 (4), 772-777 (2011).
- Yeh, S., Sen, H. N., Colyer, M., Zapor, M., Wroblewski, K.
- Tagirasa, R., Parmar, S., Barik, M. R., Devadas, S., Basu, S. Autoreactive T cells in immunopathogenesis of TB-associated uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (13), 5682-5691 (2017).
- Agrawal, R., et al. Insights into the molecular pathogenesis of ocular tuberculosis. Tuberculosis. 126, 102018 (2021).
- Pepple, K. L., et al. Primed mycobacterial uveitis (PMU): Histologic and cytokine characterization of a model of uveitis in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8438-8448 (2015).
- Pepple, K. L., Choi, W. J., Wilson, L., Van Gelder, R. N., Wang, R. K. Quantitative assessment of anterior segment inflammation in a rat model of uveitis using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (8), 3567-3575 (2016).
- Pepple, K. L., Wilson, L., Van Gelder, R. N. Comparison of aqueous and vitreous Lymphocyte populations from two rat models of experimental uveitis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (6), 2504-2511 (2018).
- Basu, S., Elkington, P., Rao, N. A. Pathogenesis of ocular tuberculosis: New observations and future directions. Tuberculosis. 124, 101961 (2020).
- Basu, S., Rao, N., Elkington, P. Animal models of ocular tuberculosis: Implications for diagnosis and treatment. Ocular Immunology and Inflammation. , 1-7 (2020).
- Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2921-2927 (2012).
- Underwood, W., Anthony, R. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. 2013 (30), 2020-2021 (2020).
- Donovan, J., Brown, P., et al. Handling and restraint. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. Chapter 1, Unit 1.3 (2006).
- Tremoleda, J. L., Kerton, A., Gsell, W. Anaesthesia and physiological monitoring during in vivo imaging of laboratory rodents: considerations on experimental outcomes and animal welfare. EJNMMI Research. 2 (1), 44 (2012).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Paques, M., et al. Panretinal, high-resolution color photography of the mouse fundus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (6), 2769-2774 (2007).
- John, S., Rolnick, K., Wilson, L., Wong, S., Van Gelder, R. N., Pepple, K. L. Bioluminescence for in vivo detection of cell-type-specific inflammation in a mouse model of uveitis. Scientific Reports. 10 (1), 11377 (2020).
- Fortmann, S. D., Lorenc, V. E., Hackett, S., Campochiaro, P. A. Murine Vitreous Tap (MurViTap): a novel technique to extract uncontaminated mouse vitreous humor, quantify retinal vascular permeability, and compare proteins secreted by diseased and normal retina. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (8), 5978 (2017).
- Caspi, R. R. Understanding autoimmunity in the eye: from animal models to novel therapies. Discovery Medicine. 17 (93), 155-162 (2014).
- Mruthyunjaya, P., et al. Efficacy of low-release-rate fluocinolone acetonide intravitreal implants to treat experimental uveitis. Archives of Ophthalmology. 124 (7), 1012-1018 (2006).
- Jaffe, G. J., Yang, C. S., Wang, X. C., Cousins, S. W., Gallemore, R. P., Ashton, P. Intravitreal sustained-release cyclosporine in the treatment of experimental uveitis. Ophthalmology. 105 (1), 46-56 (1998).
- Pepple, K. L., et al. Uveitis therapy with shark variable novel antigen receptor domains targeting tumor necrosis factor alpha or inducible t-cell costimulatory ligand. Translational Vision Science & Technology. 8 (5), 11 (2019).
- Mattapallil, M. J., et al. Characterization of a New epitope of IRBP that induces moderate to severe uveoretinitis in mice with H-2b haplotype. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5439-5449 (2015).
- Silver, P. B., Chan, C. C., Wiggert, B., Caspi, R. R. The requirement for pertussis to induce EAU is strain-dependent: B10.RIII, but not B10.A mice, develop EAU and Th1 responses to IRBP without pertussis treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2898-2905 (1999).
- Li, Q., Peng, B., Whitcup, S. M., Jang, S. U., Chan, C. C. Endotoxin induced uveitis in the mouse: susceptibility and genetic control. Experimental Eye Research. 61 (5), 629-632 (1995).
- Astley, R. A., Coburn, P. S., Parkunan, S. M., Callegan, M. C.
- Lau, P. E., Jenkins, K. S., Layton, C. J. Current evidence for the prevention of endophthalmitis in anti-VEGF intravitreal injections. Journal of Ophthalmology. 2018, 8567912 (2018).
- Nche, E. N., Amer, R.
- Chu, C. J., et al. Assessment and in vivo scoring of murine experimental autoimmune uveoretinitis using optical coherence tomography. PLoS ONE. 8 (5), 63002 (2013).
- Harimoto, K., Ito, M., Karasawa, Y., Sakurai, Y., Takeuchi, M. Evaluation of mouse experimental autoimmune uveoretinitis by spectral domain optical coherence tomography. The British Journal of Ophthalmology. 98 (6), 808-812 (2014).
- Li, Y., Lowder, C., Zhang, X., Huang, D. Anterior chamber cell grading by optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 258-265 (2013).
- Bell, O. H., et al. Single eye mRNA-seq reveals normalisation of the retinal microglial transcriptome following acute inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3033 (2019).
- Lipski, D. A., et al. Retinal endothelial cell phenotypic modifications during experimental autoimmune uveitis: a transcriptomic approach. BMC Ophthalmology. 20 (1), 106 (2020).
- Agarwal, R. K., Silver, P. B., Caspi, R. R. Rodent Models of Experimental Autoimmune Uveitis. Autoimmunity. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Perl, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 443-469 (2012).
