Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل الخمائر والعفن القابل للزراعة عن التربة للتحقيق في التركيب السكاني الفطري

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

هذا البروتوكول هو وسيلة فعالة وسريعة لزراعة الخمائر والعفن Aspergillus fumigatus من مجموعات كبيرة من عينات التربة في أقل من 7 أيام. يمكن تعديل الطرق بسهولة لاستيعاب مجموعة من وسائط الحضانة ودرجات الحرارة حسب الحاجة للتجارب.

Abstract

تستضيف التربة كمية لا تصدق من الحياة الميكروبية ، حيث يحتوي كل غرام على ما يصل إلى مليارات الخلايا البكتيرية والقديمة والفطرية. تؤدي الفطريات متعددة الخلايا مثل القوالب والفطريات أحادية الخلية ، التي تعرف على نطاق واسع بأنها خمائر ، أدوارا أساسية في النظم الإيكولوجية للتربة كمحللة للمواد العضوية وكمصادر غذائية لسكان التربة الآخرين. يعتمد تنوع الأنواع الفطرية في التربة على العديد من العوامل المناخية مثل هطول الأمطار ودرجة الحرارة ، بالإضافة إلى خصائص التربة بما في ذلك المواد العضوية ودرجة الحموضة والرطوبة. إن الافتقار إلى العينات البيئية الكافية، وخاصة في مناطق آسيا وأفريقيا وأمريكا الجنوبية وأمريكا الوسطى، يعوق توصيف المجتمعات الفطرية في التربة واكتشاف أنواع جديدة.

قمنا بتمييز المجتمعات الفطرية في التربة في تسعة بلدان عبر القارات الست باستخدام حوالي 4000 عينة من التربة وبروتوكول تم تطويره في المختبر لعزل الخمائر والعفن. يبدأ هذا البروتوكول بالتخصيب الانتقائي المنفصل للخمائر والعفن ذي الصلة طبيا Aspergillus fumigatus ، في الوسائط السائلة مع تثبيط نمو البكتيريا. ثم يتم نقل المستعمرات الناتجة إلى وسائط صلبة ومعالجتها للحصول على ثقافات نقية ، تليها التوصيف الجيني في المصب. يتم تحديد هوية أنواع الخميرة من خلال تسلسل منطقة الفواصل المنسوخة الداخلية (ITS) لمجموعة جينات الحمض النووي الريبوسومي النووي الريبوسومي ، في حين يتم استكشاف البنية السكانية العالمية ل A. fumigatus من خلال تحليل علامات الأقمار الصناعية الدقيقة.

تم تطبيق البروتوكول بنجاح لعزل وتوصيف خميرة التربة ومجموعات A. fumigatus في الكاميرون وكندا والصين وكوستاريكا وأيسلندا وبيرو ونيوزيلندا والمملكة العربية السعودية. كشفت هذه النتائج عن رؤى تشتد الحاجة إليها حول الأنماط العالمية في تنوع خميرة التربة ، وكذلك البنية السكانية العالمية وملامح مقاومة مضادات الفطريات ل A. fumigatus. تقدم هذه الورقة طريقة عزل كل من الخمائر و A. fumigatus من عينات التربة الدولية.

Introduction

تلعب الفطريات في النظم الإيكولوجية للتربة أدوارا أساسية في تحلل المواد العضوية ، وتدوير المغذيات ، وتخصيب التربة1. يستخدم كل من النهج المستقلة عن الثقافة (أي التسلسل عالي الإنتاجية) والنهج المعتمدة على الثقافة على نطاق واسع في دراسة فطريات التربة 2,3. وفي حين أن الكم الكبير من البيانات الناتجة عن تسلسل الباركود الفوقي عالي الإنتاجية مفيد لتوضيح الأنماط الواسعة النطاق في بنية المجتمع المحلي وتنوعه، فإن النهج المعتمد على الثقافة يمكن أن يوفر معلومات تكميلية للغاية عن الهياكل التصنيفية والوظيفية للمجتمعات الفطرية، فضلا عن ملامح أكثر تحديدا للكائنات الحية الفردية من خلال التنوع النهائي والتحليلات الوظيفية بسبب توافر الثقافات الفطرية النقية.

على الرغم من أنه نادرا ما يتجاوز آلاف الخلايا لكل غرام من التربة ، فإن الخمائر ، التي تعرف على نطاق واسع بأنها فطريات أحادية الخلية ، هي متحللات أساسية ومصادر غذائية لسكان التربة الآخرين 4,5. في الواقع ، قد تكون الخمائر هي فطريات التربة السائدة في المحيط الحيوي البارد مثل القارة القطبية الجنوبية 6,7. التربة هي أيضا خزان رئيسي للخمائر ذات الصلة طبيا التي تسبب التهابات انتهازية خطيرة في البشر والثدييات الأخرى8. على الرغم من أوجه التشابه المورفولوجية ، فإن أنواع الخميرة متنوعة من الناحية الفيلوجية وتحدث بين الفطريات الخيطية في اثنين من الفيلات الرئيسية ، Ascomycota و Basidiomycota ، داخل المملكة الفطرية9. تفتقر الخمائر إلى توقيع الحمض النووي المحدد في جين الترميز الشريطي الفطري ، وهو منطقة الفاصل الداخلي المنسوخة (ITS) في المجموعة الجينية النووية الريبوسومية RNA10 ، مما يجعلها لا يمكن تمييزها عن الفطريات الأخرى في تحقيقات metagenomics وبالتالي تتطلب استخدام طرق تعتمد على الثقافة لعزل أنواع الخميرة.

تم تنفيذ البروتوكول أدناه لتوصيف مجتمعات خميرة التربة في تسعة بلدان وتحديد الاتجاهات والأنماط العالمية في تنوع خميرة التربة9،11،12. مناهج الميتاجينوميكس محدودة الاستخدام عند دراسة المجموعات المستهدفة من الكائنات الحية مثل الخمائر 2,3. نظرا لتنوعها الجيني ، لا يمكن تمييز الخمائر عن الفطريات الأخرى بناء على تسلسل الحمض النووي وحده. وبالتالي ، فإن دراسة مجموعات الخميرة تتطلب الاستخدام المستمر للعزلة المعتمدة على الثقافة. ومع ذلك ، فإن الزراعة غالبا ما تكون أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب المزيد من الموظفين لإجراء التجارب. لذلك ، تم تحسين البروتوكول وتبسيطه لمعالجة أسرع مع عدد محدود من الموظفين. الميزة الرئيسية للزراعة هي أن أنواع الخميرة المحددة هي خمائر حية وليست ميتة ، وبالتالي من المرجح أن تكون من سكان التربة الحقيقيين بدلا من الخلايا العابرة الموجودة في التربة. تشير التقديرات إلى أن ما يقرب من 40٪ من الحمض النووي الفطري في التربة إما ملوثات من بيئات أخرى ، أو خارج الخلية ، أو تأتي من خلايا لم تعد سليمة ، مما تسبب في نهج تسلسل عالية الإنتاجية للمبالغة في تقدير الثراء الفطري بنسبة تصل إلى 55٪ 13. يمكن للعزلة المعتمدة على الاستزراع أن تؤكد بسهولة هوية أنواع الخميرة مع فائدة إضافية تتمثل في تأمين الاستزراع النقي لاستخدامها في تحليلات المصب. في الواقع ، تم تحديد الثقافات النقية ل 44 نوعا جديدا من أنواع الخميرة المفترضة باستخدام بروتوكول عزل التربة هذا الذي سمح باستخدام مجموعة من الطرق لدراسة خصائصها التصنيفية والوظيفية بالتفصيل14.

يمكن أيضا استخدام البروتوكول أدناه لعزل القوالب الموجودة داخل التربة ، مثل A. fumigatus. Aspergillus fumigatus هو قالب محب للحرارة و saprophytic مع توزيع عالمي واسع في التربة15. وقد تم عزله من العديد من البيئات السريرية وغير السريرية. تشمل العينات غير السريرية عادة الهواء والحطام العضوي (السماد العضوي وغبار المنشار ونفايات لمبة الزنبق) والتربة (التربة الزراعية والحدائق والطبيعية)16،17،18،19. Aspergillus fumigatus هو عامل ممرض انتهازي بشري يسبب مجموعة من العدوى تسمى مجتمعة داء الرشاشيات ، وتؤثر على أكثر من 8 ملايين شخص في جميع أنحاء العالم16,20. يعاني ما يقرب من 300000 شخص حول العالم من داء الرشاشيات الغازي ، وهو أشد أشكال داء الرشاشيات16. اعتمادا على عوامل مثل عدد المرضى ، وموقع العدوى ، وفعالية العلاج المضاد للفطريات ، يمكن أن يصل معدل الوفيات إلى 90٪. على مدى العقود العديدة الماضية، زادت مقاومة العلاجات المضادة للفطريات، مما يتطلب جهود مراقبة عالمية في كل من السكان السريريين والبيئيين لتتبع هذه الأنماط الجينية المقاومة21،22،23. نظرا لقدرتها على النمو في درجات حرارة تصل إلى 50 درجة مئوية ، يمكن استغلال درجة الحرارة هذه لاختيار A. fumigatus المعزولة عن التربة باستخدام طرق تعتمد على الثقافة. عادة ما يتم وضع النمط الوراثي لعزلات الرشاشيات المدخنة في تسعة مواقع متكررة قصيرة (STR) متعددة الأشكال للغاية ، والتي تبين أنها تتمتع بقوة تمييزية عالية بين السلالات24. يمكن مقارنة هذه الأنماط الجينية STR بالمجموعات السكانية الأخرى التي تم مسحها سابقا لتتبع انتشار الأنماط الجينية A. fumigatus ، بما في ذلك الجينات المقاومة للأدوية ، في جميع أنحاء العالم.

فيما يلي وصف لبروتوكول للعزل السريع للخمائر و A. fumigatus من عينات التربة بطريقة تعتمد على الثقافة. اعتمادا على كمية التربة التي تم الحصول عليها لكل عينة ، يمكن مشاركة عينات التربة بين البروتوكولين. بالمقارنة مع الطرق المماثلة التي تعزل الخميرة و A. fumigatus من التربة ، يستخدم هذا البروتوكول تربة أقل بمقدار 10 أضعاف لكل عزلة تم الحصول عليها. تتطلب الدراسات التي تحاول عزل A. fumigatus من التربة ما بين 1 و 2 غرام من التربة لكل عزلة ، في حين أن هذا البروتوكول يتطلب فقط 0.1-0.2 غرام من التربة18،19،25. يستخدم هذا البروتوكول مواد بلاستيكية وحاويات أصغر تسهل تصميمه عالي الإنتاجية. لذلك ، يمكن معالجة عدد أكبر من العينات باستخدام مساحة أقل لمعدات مثل الحاضنات وبراميل الأسطوانة. يمكن معالجة عينات التربة بالكامل للحصول على عزلات في أقل من 7 أيام. تم تحسين هذا البروتوكول للسماح بمعالجة ما يصل إلى 150-200 عينة يوميا للشخص الواحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تتطلب أي خطوات تستخدم عينات التربة الدولية و/أو جراثيم A. fumigatus والفطريات العمل داخل خزانة السلامة الأحيائية للكائنات الحية من المستوى 2 (BSCII).

1. عزل الخميرة عن التربة

  1. إعداد حلول مضادة للبكتيريا والفطريات
    1. مسحوق الكلورامفينيكول في 70٪ من الإيثانول لإعداد محلول مخزون 50 جم / لتر. تعقيم عن طريق ترشيح حقنة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذا المضاد الحيوي سيمنع نمو معظم البكتيريا أثناء عزل خميرة التربة. نظرا لأن البكتيريا المقاومة للكلورامفينيكول قد تستمر في النمو ، يجب أن تؤخذ مورفولوجيا المستعمرة في الاعتبار بعناية عند التمييز بين الخمائر والبكتيريا. يمكن إضافة مضادات حيوية إضافية إلى الوسائط عند العمل مع التربة المشتبه في احتوائها على سلالات بكتيرية مقاومة للمضادات الحيوية. ولم يكن التلوث البكتيري في الأوساط المكملة بالكلورامفينيكول مشكلة تصادف عند عزل الخمائر عن التربة البيئية.
    2. مسحوق البنوميل في DMSO لإعداد محلول مخزون 5 جم / لتر. تعقيم عن طريق ترشيح حقنة وتخزينها في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمنع هذا الدواء الانتقائي المضاد للفطريات نمو معظم الفطريات الخيطية دون التأثير على نمو الخميرة أثناء عزل خميرة التربة26,27.
  2. إعداد وسائل الإعلام الثقافية والمعدات المعقمة
    1. لتحضير مرق YEPD (مستخلص الخميرة - الببتون - سكر العنب) ، أضف 10 غرام من مستخلص الخميرة ، و 20 غراما من الببتون ، و 20 غراما من سكر العنب إلى 1 لتر من الماء المقطر المزدوج. يحرك المزيج حتى يمتزج جيدا ويستمر الأوتوكلاف لمدة 40 دقيقة عند 121 درجة مئوية. يحفظ في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
    2. YEPD أجار الصلبة المتوسطة
      1. مزيج 10 غرام من مستخلص الخميرة ، 20 غرام من الببتون ، 20 غرام من سكر العنب ، و 20 غرام من الأجار في 1 لتر من الماء. يحرك المزيج جيدا للخلط والأوتوكلاف لمدة 40 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
      2. بمجرد تبريده بشكل كاف ، أضف 1 مل من الكلورامفينيكول والبينوميل من محاليل المخزون لرفع التركيزات النهائية لاثنين من مضادات الميكروبات إلى 50 ملغ / لتر و 5 ملغ / لتر ، على التوالي.
      3. تخلط جيدا عن طريق التحريك وتصب في أطباق بتري قطرها 10 سم. اتركيه في درجة حرارة الغرفة طوال الليل لضبطه وتخزينه على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
        ملاحظة: من 1 لتر من YEPD ، يمكن سكب ما يقرب من 40 لوحة.
    3. قم بتعقيم عصي قضيب خشبية ذات رأس عادي وموزعات خلايا قابلة لإعادة الاستخدام عن طريق التعقيم وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  3. حضانة التربة في المرق السائل
    1. قم بإعداد مجموعة من أنابيب الاستزراع المعقمة سعة 13 مل عن طريق وضع علامة عليها باستخدام معرف عينة التربة.
    2. باستخدام ماصة مصلية ، أضف 5 مل من مرق YEPD المكمل بالكلورامفينيكول والبينوميل في كل أنبوب.
    3. من خلال العمل في BSCII ، قم بنقل ~ 0.1 جم من التربة إلى أنبوب الاستزراع المناسب باستخدام قضيب خشبي معقم ذو رأس عادي.
      ملاحظة: استخدم قضيب جديد لكل عينة من عينات التربة وتخلص منه فور استخدامه لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
    4. قم بتغطية الأنبوب بإحكام إلى المحطة الأولى لمنع الانسكاب ولكن مع السماح بتبادل الهواء أثناء الحضانة. احتضن أنابيب الاستزراع في أسطوانة بكرة لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة تعتبر مثالية لزيادة نمو الخميرة إلى أقصى حد.
      ملاحظة: ينبغي تحديد درجة حرارة الحضانة بناء على متوسط درجة الحرارة السنوية لبلد منشأ عينات التربة. على سبيل المثال ، عند عزل خمائر التربة عن أيسلندا ، تم احتضان أنابيب الاستزراع عند 14 درجة مئوية ، في حين تم احتضان التربة من المملكة العربية السعودية عند 30 درجة مئوية. بسبب تباطؤ نمو الخميرة في درجات حرارة منخفضة ، قد يتعين تمديد وقت الحضانة لمدة تصل إلى 72 ساعة.
  4. نقل supernatant إلى الوسط الصلب.
    1. باستخدام مجموعة من ألواح YEPD + chloramphenicol + benomyl agar المعدة في الخطوة 1.2 ، قم بتسميتها بمعرف عينة التربة.
    2. قم بإزالة أنابيب الاستزراع المعدة في الخطوة 1.3 من أسطوانة الأسطوانة. من خلال العمل في BSCII ، قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لسحب جزيئات التربة والخلايا التي ربما استقرت في القاع مرة أخرى إلى التعليق.
    3. باستخدام ماصة صغيرة ، انقل 100 ميكرولتر من supernatant إلى لوحة. استخدم موزع خلايا معقم وقابل لإعادة الاستخدام لنشر السائل جيدا وبالتساوي على سطح الأجار.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي العمل في مجموعات من 10 عينات إلى تسريع هذه العملية بشكل كبير. ماصة supernatant على 10 لوحات أولا ثم أداء انتشار. استخدم موزعا جديدا لكل عينة لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
    4. تكدس الألواح في أكياس بلاستيكية ، وتغلقها ، وتحضنها رأسا على عقب لمدة 2-3 أيام في نفس درجة الحرارة المستخدمة سابقا لحضانة المرق السائل حتى يصبح النمو الميكروبي مرئيا.
  5. الكشف عن الخمائر والخطوط للمستعمرات الفردية
    1. بعد السماح بوقت حضانة كاف (عادة 2-3 أيام ، ولكن قد يستغرق وقتا أطول في درجات حرارة منخفضة) ، افحص الألواح في BSCII بحثا عن أي نمو للخميرة. ابحث عن الخمائر الكريمية والمستديرة وغير اللامعة التي يمكن تمييزها بسهولة عن المستعمرات البكتيرية والعفن.
      ملاحظة: تنتج بعض الخمائر أصباغا ملونة وقد تظهر باللون الأسود / البني أو الأصفر أو الأحمر ، ولكن قوامها وشكلها العام للمستعمرة سيكون مشابها للخمائر غير المصطبغة.
    2. اختر مستعمرة واحدة تشبه الخميرة من كل صفيحة لمزيد من المعالجة.
      ملاحظة: إذا لوحظ أكثر من نوع واحد من المورفولوجيا على صفيحة واحدة، فحدد مستعمرة تمثيلية واحدة لكل نوع مورفولوجي.
    3. باستخدام عصي قضيب خشبية معقمة ذات رأس عادي ، انقل كل مستعمرة مختارة إلى YEPD طازج + كلورامفينيكول + صفيحة بينوميل وخط للمستعمرات الفردية. تنفيذ ثلاثة خطوط منفصلة.
      1. اربط الطبق ذهابا وإيابا على ثلث الطبق باستخدام عصا قضيب. ابدأ الخطين الثاني والثالث عن طريق ربط قضيب عبر الخط السابق مرة واحدة. استخدم عصا قضيب جديدة لكل خط.
        ملاحظة: استخدم صفيحة واحدة لكل عزلة. تخلص من أدوات التطبيق فور استخدامها لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
    4. تكدس الألواح في أكياس بلاستيكية ، وتغلقها ، وتحضنها رأسا على عقب لمدة 2-3 أيام في نفس درجة الحرارة المستخدمة سابقا حتى تصبح المستعمرات المفردة مرئية.
  6. تحديد أنواع الخميرة عن طريق تسلسل ITS
    1. اختر مستعمرة واحدة منفصلة جيدا لكل عزل التربة والاستزراع الفرعي على صفيحة YEPD + chloramphenicol + benomyl الطازجة للحصول على المزيد من الخلايا. حضانة لمدة 2-3 أيام في نفس درجة الحرارة المستخدمة سابقا.
    2. حصاد الخلايا المزروعة حديثا وتعليقها في أنابيب التجميد -80 درجة مئوية التي تحتوي على 1 مل من الجلسرين المعقم 30٪ في الماء المقطر المزدوج لإنشاء معلقات الخلايا. حافظ على هذه المعلقات عند -80 درجة مئوية كحلول للمخزون.
    3. استخدم الخلايا الطازجة لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (تفاعل البوليميراز المتسلسل) مع الاشعال ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') و ITS4 (5' TCCTCCGTTTTATTGATATGC 3') لتضخيم جين الترميز الشريطي الفطري ، ITS9. استخدم شروط التدوير الحراري التالية: خطوة تمسخ أولية عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تليها 35 دورة من (i) 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، (ii) 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و (iii) 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: تتمتع Colony PCR بمعدل نجاح مرتفع ووقت تحول أسرع من استخراج الحمض النووي متبوعا بتفاعل البوليميراز المتسلسل.
    4. إذا فشلت مستعمرة PCR بشكل متكرر في حدوث سلالة ، فقم باستخراج الحمض النووي باستخدام البروتوكول المفضل وقم بإجراء ITS PCR باستخدام الحمض النووي الجينومي المستخرج كقالب (استخدم نفس شروط التدوير الحراري كما هو موضح أعلاه).
      ملاحظة: يوصى باستخراج الحمض النووي القائم على الكلوروفورم غير المكلف نسبيا28.
    5. قم بإجراء تسلسل Sanger لتحديد تسلسل الحمض النووي لمنطقة ITS المضخمة لكل سلالة.
    6. قارن تسلسل ITS الذي تم الحصول عليه من سلالات الخميرة بالتسلسلات المودعة في قواعد البيانات العامة مثل NCBI GenBank و UNITE لتحديد هوية الأنواع.

2. عزل الرشاشيات الدخان من التربة

  1. تحضير 1 مل من مرق سكر العنب سابورو المعقم (SDB) المكمل بالمضاد الحيوي الكلورامفينيكول لكل عينة من التربة.
    1. أضف 10 غرام من الببتون و 20 غرام من سكر العنب إلى 1 لتر من الماء المقطر. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    2. اسمح ل SDB أن يبرد إلى ~ 50 درجة مئوية ، أضف 1 مل من 50 جم / لتر من الكلورامفينيكول ليصل التركيز إلى 50 مجم / لتر.
      ملاحظة: يتم تحضير الكلورامفينيكول كما هو موضح أعلاه لعزل الخميرة. بصرف النظر عن تثبيط نمو البكتيريا ، يمنع الكلورامفينيكول أيضا إنتاج الغاز من البكتيريا التي ستتسبب في فتح الأنابيب أثناء خطوة الحضانة المفصلة في الخطوة 2.2.
    3. معقم 1 مل من SDB في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل لكل عينة تربة باستخدام ماصة ميكانيكية.
  2. أضف التربة إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل.
    1. ضع معطفا على مقاعد البدلاء أو حشوة ماصة داخل BSCII للمساعدة في التخلص من التربة المسكوبة.
    2. باستخدام عصي قضيب معقمة ، انقل حوالي 0.1 جم من التربة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 1 مل من SBD. أغلق الأنبوب والدوامة. احتضان التربة العالقة عند 50 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
      ملاحظة: الاهتزاز أثناء الحضانة غير مطلوب.
  3. حصاد Mycelial من مرق التربة الملقح
    1. تحضير أطباق أجار مستخلص الشعير (MEA).
      1. لكل لتر من MEA: أضف 20 جم من مستخلص الشعير ، و 20 جم من سكر العنب ، و 6 جم من الببتون ، و 15 جم من الأجار إلى 1 لتر من الماء المقطر. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
      2. اسمح ل MEA أن يبرد إلى ~ 50 درجة مئوية ، ثم أضف 1 مل من 50 جم / لتر من الكلورامفينيكول للوصول إلى تركيز نهائي قدره 50 مجم / لتر.
    2. انقل الفطريات من المرق الملقح بالتربة إلى ألواح MEA.
      1. تحديد تطعيمات التربة التي لها نمو فطري مرئي عند SDB إلى الحدود الجوية.
      2. استخدم عصي قضيب خشبية معقمة ذات رأس عادي لنقل الفطريات إلى وسط صفيحة MEA. احتضان لوحات MEA عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
  4. اختيار الميسيليا مع A. fumigatus الخصائص المورفولوجية.
    1. تحديد مستعمرات العفن التي لها خصائص A. fumigatus المورفولوجية المميزة (الشمواه الخضراء مثل النمو).
    2. أثناء العمل في BSCII ، استخدم عصي قضيب خشبية معقمة ذات رؤوس عادية أو حلقة تلقيح لحصاد الكونيديا / الفطريات عن طريق كشط السطح مرة واحدة. انقل الجراثيم/الفطريات إلى وسط صفيحة MEA عن طريق التدرج على الأجار لمستعمرات مفردة. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
      ملاحظة: نظرا لأن سلالات A. fumigatus المتعددة و / أو الفطريات الأخرى قد تكون موجودة على اللوحة ، فمن المهم أن تخطو لمستعمرات واحدة. يمكن استخدام بروتوكول التدرج أحادي المستعمرة في الخطوة 1.5.3 في بروتوكول عزل الخميرة.
    3. باستخدام عصا قضيب معقمة أو حلقة تلقيح، قم بزراعة مستعمرة واحدة تم إنشاؤها في الخطوة 2.4.1.2 على MEA عن طريق ربط المستعمرة مرة واحدة. انشر الجراثيم المحصودة في وسط اللوحة. حضانة في 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
  5. حصاد جراثيم A. fumigatus / mycelia لتخزين المستنبتات
    1. قم بإعداد محلول جليسرين معقم بنسبة 30٪ (لمحلول 100 مل ، أضف 30 مل من الجلسرين بنسبة 100٪ ممزوجا ب 70 مل من الماء المقطر المزدوج ، معقما عند 121 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة).
    2. العمل في BSCII ، استخدم ماصة p1000 لشفط 1 مل من محلول الجلسرين 30٪. قم بتوزيع 1 مل من محلول الجلسرين على مستعمرة A. fumigatus لحصاد الجراثيم / الميسيليا.
      1. بسبب كره الماء من A. fumigatus الجراثيم / mycelia ، استخدم طرف الماصة لخدش منطقة بوغية كثيفة من اللوحة.
        ملاحظة: عندما يتم الاستغناء عن الجلسرين في الخدش ، فإن الجلسرين سوف يلتصق بمنطقة الخدش بدلا من التدحرج فوق الأجار.
      2. قم بتوزيع الجلسرين ببطء على منطقة الخدش لإزاحة الجراثيم وتعليقها في محلول الجلسرين.
      3. بمجرد الاستغناء عنها بالكامل ، قم بقلب اللوحة برفق واستنشاق تعليق بوغ الجلسرين / الفطريات.
        ملاحظة: سيتم شفط ما يقرب من 750 إلى 800 ميكرولتر.
      4. انقل الشفطة إلى أنبوب تجميد معقم وخزنها على درجة حرارة -80 درجة مئوية. إذا لزم الأمر، قم بإنشاء مخزون عامل عن طريق تكرار الخطوات من 2.5.2.1 إلى 2.5.2.4.
  6. تحديد النمط الظاهري لسلالات A. fumigatus
    1. باستخدام مخزون البوغ الذي تم إنشاؤه من الخطوة 2.5.2 ، قم بإنشاء تخفيف 100x في الماء.
      1. استنشاق 10 ميكرولتر من مخزون الميسيليال والبوغ والاستغناء عن 990 ميكرولتر من الماء. دوامة التعليق.
    2. قم بتوزيع 10 ميكرولتر من تعليق البوغ المخفف على شريحة مجهر قياسية.
    3. اختياري: لطخة تعليق mycelial وبوغ مع الميثيلين الأزرق.
      1. لتلطيخ مع الميثيلين الأزرق ، قم بإصلاح conidia و conidiophores على الشريحة عن طريق تمرير الشريحة فوق موقد بنسن حتى يجف.
      2. ضع الميثيلين الأزرق لمدة 1-2 دقيقة واغسله بالماء.
      3. جفف الشريحة بورق النشاف.
    4. باستخدام المجهر المركب عند تكبير 400x ، قم بعرض التعليق وتحديد موقع conidiophores. قارن مورفولوجيا conidiophore الملاحظة مع مورفولوجيا A. fumigatus conidiophore.
  7. التحديد الجزيئي لسلالات A. fumigatus
    1. استخراج الحمض النووي من كل عزل باتباع بروتوكولات استخراج الحمض النووي الفطرية الشائعة.
    2. باستخدام الاشعال الخاصة بجينات الرشاشيات β-توبولين (β-tub1 و β-tub4) ، قم بتشغيل PCR والحصول على تسلسل المنتجات المضخمة ، باتباع البروتوكولات التي وصفها Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. قارن التسلسلات التي تم الحصول عليها بالتسلسلات المودعة في قواعد البيانات العامة مثل NCBI GenBank باستخدام BLAST.
      2. تأكد من أن تسلسلات الإجهاد هي أعلى مطابقة لتسلسلات A. fumigatus في قاعدة البيانات.
    3. بديل للخطوة 2.7.2 ، قم بتشغيل تفاعل PCR متعدد الإرسال يستهدف أنواع التزاوج A. fumigatus MAT1-1 و MAT1-229.
      1. استخدم التسلسلات التمهيدية الثلاثة التالية في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل متعدد الإرسال: AFM1: 5'-CCTTGACGCGGATGGGGGGGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. استخدم معلمات الدورة الحرارية التالية: 5 دقائق عند 95 درجة مئوية، و35 دورة من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية، و30 ثانية عند 60 درجة مئوية، و1 دقيقة عند 72 درجة مئوية قبل 5 دقائق نهائية عند 72 درجة مئوية.
      3. تشغيل الكهربائي هلام لتحديد المنتجات. ابحث عن 834 نقطة أساس MAT-1 أو 438 نقطة أساس MAT1-2. استخدم سلالات A. fumigatus التي أكدت تضخيم نوع التزاوج كضوابط إيجابية وسلبية.
  8. التنميط الجيني للسواتل الدقيقة لسلالات A. fumigatus من خلال تحليل الشظايا
    ملاحظة: على الرغم من أن الخطوات المدرجة أدناه تغطي على نطاق واسع التنميط الجيني A. fumigatus في تسعة مواقع للسواتل الصغيرة (STR)، لم يسلط الضوء إلا على عدد قليل من الاعتبارات الهامة. للحصول على تفاصيل حول التنميط الجيني A. fumigatus STR ، راجع De Valk et al.24,30.
    1. قم بإعداد ثلاثة خلطات رئيسية متعددة الإرسال PCR باستخدام الاشعال STRAf التي وصفها سابقا De Valk et al.24.
      1. الفلورسنت تسمية الاشعال الأمامية لتحديد حجم الشظايا من خلال الكهربائي الشعري. تأكد من أن تركيز الاشعال الأمامي هو نصف (0.5 ميكرومتر) تركيز الاشعال العكسي (1 ميكرومتر) داخل المزيج الرئيسي.
        ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، استخدم ملصقات الفلورسنت التي تحتوي على أطوال موجية للامتصاص تتطابق مع تلك الموجودة في معيار الصبغة المختار المستخدم أثناء الرحلان الكهربائي الشعري
      2. استخدم بوليميراز البداية الساخنة للحصول على أفضل النتائج.
      3. استخدم تركيز الحمض النووي 0.1 نانوغرام لكل تفاعل.
    2. قم بتشغيل PCR متعدد الإرسال لكل سلالة باستخدام برنامج PCR التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، و 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية ، تليها 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وتعليق عند 4 درجات مئوية.
    3. تحقق من المنتجات المضخمة من خلال الرحلان الكهربائي الهلامي.
    4. قم بتخفيف المنتجات إلى المستوى المطلوب (عادة ~ 50x) على النحو الموصى به من قبل المتخصصين في تحليل الشظايا وتشغيل الرحلان الكهربائي الشعري. قم بإجراء ثلاثة أشواط لكل سلالة ، حيث يغطي كل تشغيل ثلاثة تفاعلات متعددة الإرسال مع ثلاثة مجسات فلورسنت مختلفة.
    5. لتحديد حجم الجزء الصحيح لكل موقع من مواقع STR التسعة، استخدم برنامجا قادرا على تحليل الأجزاء.
      1. استرجع البيانات الخام التي تم الحصول عليها من الرحلان الكهربائي الشعري. سجل أحجام الأجزاء استنادا إلى أكبر ذروة باستخدام برنامج تحليل الأجزاء (على سبيل المثال ، أوزوريس).
      2. قم بتحويل أحجام الأجزاء إلى أرقام متكررة لكل موقع من المواقع التسعة. استخدم أحجام الأجزاء للأرقام المتكررة للسلالة المرجعية Af293 كما وصفها سابقا De Valk et al.24.
        ملاحظة: قد تحدث اختلافات طفيفة في أحجام الشظايا بين منصات الرحلان الكهربائي الشعري المختلفة. وبالتالي ، من المهم تضمين سلالة مرجعية مشتركة (وسلم داخلي) مع حجم شظية معروف لكل من المواقع التسعة لسلالات التنميط الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عزل الخميرة عن التربة
تم تنفيذ بروتوكول عزل الخميرة المذكور أعلاه لاستزراع الخمائر من عينات التربة الناشئة من 53 موقعا في تسعة بلدان 9,12. في المجموع، تم عزل 1,473 سلالة خميرة من 3,826 عينة تربة. ونظرا لاختلاف الظروف المناخية للبلدان التسعة الأصلية، حددت أفضل درجة حرارة حضانة لكل بلد استنادا إلى متوسط درجة حرارته السنوية (الجدول 1). وبالنظر إلى تباطؤ نمو الخميرة عند 14 درجة مئوية، تم احتضان عينات التربة من أيسلندا على أسطوانة دوارة لمدة 48 ساعة إضافية (96-120 ساعة إجمالا). بعد 2-3 أيام من الحضانة على وسط صلب ، كان النمو الميكروبي مرئيا على الألواح لجميع العينات (الشكل 1A). تم تخطيط مستعمرة مختارة عشوائيا لكل مورفولوجيا خميرة موجودة على صفيحة لمستعمرات واحدة على ألواح جديدة (الشكل 1B).

واختلف معدل نجاح عزل الخميرة بين البلدان (الجدول 1). فعلى سبيل المثال، تم استزراع 97 سلالة خميرة من 562 عينة تربة سعودية (17.3٪)، في حين تم استزراع 261 خميرة من 300 عينة تربة كندية (87٪). وينبغي إجراء تحليل للفصائل النادرة لتحديد ما إذا كان قد تم إجراء أخذ عينات كافية من التربة للحصول على تقديرات دقيقة للتنوع الحقيقي للخميرة في المواقع التي أخذت منها العينات. ومن الأمثلة على ذلك تحليل الفصائل النادرة لكل بلد حيث استخدم مؤشر شانون للتنوع كمقياس لتنوع خميرة التربة (الشكل 2). اقتربت منحنيات الفصيل النادرة الناتجة من عدم تماثل التشبع مما يشير إلى أنه من غير المحتمل أن يؤدي أخذ عينات إضافية إلى مزيد من تنوع الخميرة.

وكشف تسلسل منطقة نظم النقل الذكية أنه يمكن تصنيف 1473 من عزلات الخميرة إلى 134 نوعا متميزا. وشمل ذلك 90 نوعا معروفا و 44 نوعا جديدا محتملا. طبقنا نموذجا متعدد التأثيرات لتحديد المتنبئين بتنوع خميرة التربة العالمية القابلة للزراعة ، كما هو محدد كميا من خلال مؤشر شانون للتنوع31. في هذا النموذج، تم تركيب متوسط هطول الأمطار السنوي، ومتوسط درجة الحرارة السنوية، والارتفاع، والمسافة إلى خط الاستواء لمواقع أخذ العينات كتأثيرات ثابتة، في حين تم تعيين بلد أخذ العينات كتأثير عشوائي9. حدد هذا النموذج متوسط هطول الأمطار السنوي ليكون مرتبطا ارتباطا كبيرا بمؤشر شانون للتنوع (p = 0.012) ، في حين لم يتم العثور على ارتباطات كبيرة بين المتغيرات التنبؤية الأخرى ومؤشر تنوع شانون9.

لمقارنة هذا البروتوكول القائم على الثقافة بالطرق المستقلة عن الثقافة ، قارنا هذه النتائج بدراسة سابقة أجراها تيدرسو وزملاؤه والتي بحثت في التنوع العالمي لفطريات التربة باستخدام metagenomics2. أجرى تيدرسو وزملاؤه تسلسلا عالي الإنتاجية لمنطقة ITS على الحمض النووي المستخرج مباشرة من عينات التربة في 39 دولة ، أربعة منها ، وهي الكاميرون وكندا والصين ونيوزيلندا ، تم أخذ عينات منها أيضا في هذه الدراسة. أجرينا عمليات بحث عن الانفجار لتحديد تسلسلات ITS الموجودة في مجموعتي البيانات32 ، ووجدنا أن 26٪ من تسلسلات ITS لها تطابق كبير (>98.41٪ هوية النيوكليوتيدات) في مجموعة بيانات metagenomics. ومع ذلك ، تطابق <3٪ تسلسلا فطريا من نفس البلد ، في حين أن ال 23٪ المتبقية تطابق تسلسلا فطريا موجودا في بلد مختلف9. كنا أكثر نجاحا من دراسة الميتاجينوميكس في التعليق على تسلسلات ITS مع هوية أنواع الخميرة. أبلغ تيدرسو وزملاؤه عن ما مجموعه 50،589 وحدة تصنيف تشغيلية فطرية (OTUs) ، مع عدم معرفة عدد وحدات تصنيف الخميرة OTUs. من بين هذه الوحدات الفطرية ، تم شرح 33٪ فقط على أنها environmental_sequence (724 ، 1.4٪) ، uncultured_soil_fungus (2،405 ، 4.8٪) ، uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1،407 ، 2.8٪) ، أو uncultured_fungus (11،898 ، 23.5٪).

الرشاشيات الدخان عزل من التربة
بعد 3 أيام من حضانة التربة عند 50 درجة مئوية في 1 مل من SDB في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق ، يمكن العثور على mycelia تنمو داخل SDB ، على SDB إلى الحدود الجوية ، و / أو على الجدران الداخلية. عادة ما توجد فطريات الرشاشيات المدخنة تنمو على SDB إلى الحدود الجوية ولكن يمكن أيضا حصادها من أسفل سطح SDB مباشرة. بعد هذه الخطوة ، يتم نقل الميسيليا إلى MEA وتنمو لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية. قد يشكل النمو الفطري على الألواح فقط مورفولوجيا جلد الغزال الأخضر النموذجية ل A. fumigatus (الشكل 3A). والأكثر شيوعا ، قد تكون القوالب الأخرى المتحملة للحرارة موجودة داخل نفس التربة وتنمو مع A. fumigatus على نفس اللوحة أو من تلقاء نفسها (الشكل3B-D). قد تختلف معدلات عزل فطر الرشاشيات المدخنة بين المواقع الجغرافية ، على غرار ما تم العثور عليه لخمائر التربة. على سبيل المثال ، داخل فانكوفر ، كندا ، تم الحصول على 251 عزلة من خلال هذه الطريقة من 540 عينة تربة (46.5٪) (نتائج غير منشورة). وعلى النقيض من ذلك، تم حصاد 51 عزلة من نوع A. fumigatus داخل الكاميرون من 495 عينة تربة (10.3 في المائة)33.

A. يمكن عرض بنية fumigatus conidiophore وتحديدها باستخدام المجهر الضوئي. Conidiophores لديها كرة على مورفولوجيا العصا (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك ، فإن A. fumigatus conidiophores غير متجانسة ، حيث يتم ربط الفيليدات ، المرتبطة بسلاسل conidia ، مباشرة بالحويصلة الكروية. في أنواع الرشاشيات الأخرى ، تكون conidiophores ثنائية السيريات ، حيث ترتبط الفاليدات بالميتولا المرتبطة بالحويصلة.

تتوفر العديد من البرامج لإجراء تحليل شظايا للبيانات الخام من الرحلان الكهربائي الشعري ، وتحويل طيف الرحلان الكهربائي الشعري إلى أحجام شظايا. الشكل 5 هو كروماتوجرام تم إنشاؤه بواسطة برنامج أوزوريس. يتم عرض القنوات الثلاث التي تصور أطوال شظايا A. fumigatus dinucleotide (2A و 2B و 2C) و trinucleotide (3A و 3B و 3C) و tetranucleotide (4A و 4B و 4C) مواقع STR. بالإضافة إلى ذلك ، يتم أيضا عرض القطع الأثرية PCR التي تحدث إذا كان تركيز الحمض النووي للعينة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل مرتفعا جدا. تمثل أعلى قمم كل لون أحجام الأجزاء الخاصة بمواقع STR الثلاثة في هذه المؤامرة.

يمكن تصور التباين الجيني الموجود بين الأنماط الجينية A. fumigatus STR باستخدام حزمة R poppr. ينشئ البرنامج النصي R bruvo.msn مصفوفة المسافات الجينية ل Bruvo بين كل زوج من الأنماط الوراثية. ثم يتم استخدام هذه المصفوفة لإنشاء شبكة امتداد دنيا (MSN). يمكن بعد ذلك إنشاء MSN عالي الجودة باستخدام البرنامج النصي R plot_poppr_msn أو imsn (الشكل 6). التحليل التمييزي للمكونات الرئيسية (DAPC) هو طريقة أخرى لتصور العلاقات الجينية بين السلالات (الشكل 7). يتم استخدام البرنامج النصي R dapc في حزمة R adegenet لتنفيذ DAPC ويمكن استخدامه مع مجموعات معروفة أو غير معروفة. مع مجموعات غير معروفة ، فإنه يستخدم تجميع K-means لتحديد العدد المحتمل لمجموعات الأفراد.

Figure 1
الشكل 1: عزل الخميرة من عينات التربة . (أ) النمو الميكروبي مرئي على الأجار الصلب بعد 2-3 أيام من الحضانة. يمكن رؤية مستعمرات الخميرة تتخللها مستعمرات فطرية / بكتيرية أخرى. يتم اختيار مستعمرة خميرة تمثيلية واحدة لكل نوع مورفولوجي على صفيحة لخط للمستعمرات الفردية. (ب) يتم تنفيذ ثلاثة خطوط للحصول على مستعمرات واحدة من عزلات الخميرة. تم استخدام صفيحة واحدة للحصول على عزل كل تربة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تحليل الرافضة لأخذ عينات التربة. وفي كل بلد من البلدان التسعة التي أخذت منها العينات، يقترب تنوع خميرة التربة، على النحو المحدد كميا في مؤشر شانون للتنوع، من التشبع مع زيادة عدد عينات التربة. تم تكييف هذا الرقم من 9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مورفولوجيا فطر الرشاشيات المدخنة على Sabouraud dextroseagar. (A) مورفولوجيا نمو الشمواه الخضراء الشبيهة بالشمواه A. fumigatus. (ب-د) A. نمو fumigatus مع القوالب الحرارية الأخرى الموجودة داخل عينة التربة. A. يتم تقليل التبخير بشكل واضح في B و D. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: صورة لفطر الرشاشيات المدخن تحت المجهر الضوئي. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: ناتج أوزوريس من تسعة مواقع للسواتل الصغيرة من سلالة فطر الرشاشيات المدخنة . تتوافق النواتج مع (A) ثنائي النوكليوتيد (2A و 2B و 2C) و (B) ثلاثي النوكليوتيد (3A و 3B و 3C) و (C) رباعي النوكليوتيد (4A و 4B و 4C) STR loci. التمهيدي الأمامي 5' تسميات الفلورسنت هي: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. تم تخفيف منتجات التفاعل متعدد الإرسال 30x قبل الرحلان الكهربائي الشعري. تم استخدام معيار صبغة LIZ600 أثناء الرحلان الكهربائي الشعري. تم تحليل البيانات الخام باستخدام برنامج تحليل الذروة Osiris لتحديد القمم المحتملة بين 60 و 400 نقطة أساس. العديد من القطع الأثرية PCR هي قمم خارج النطاق تسبب نزيف التألق ، وقمم التلعثم ، وقمم N-1 (C). الاختصارات: 6-FAM = 6-كربوكسي فلوريسين ؛ HEX = سداسي كلورو فلوريسين ؛ STR = يتكرر الترادف القصير ؛ RFU = وحدات التألق النسبية ؛ BPS = أزواج الأساس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: شبكة ذات امتداد أدنى تبين العلاقة الجينية بين MLGs من A. fumigatus من أيسلندا والأقاليم الشمالية الغربية في كندا. تمثل كل عقدة MLG واحدا ، حيث يتوافق حجم العقدة مع عدد السلالات لكل MLG. العقد الأكثر تشابها وراثيا لها حواف أغمق وأكثر سمكا ، في حين أن العقد البعيدة وراثيا لها حواف أخف وأرق. تم تكييف هذا الرقم من 34. الاختصارات: ISL = أيسلندا; NWT = الأقاليم الشمالية الغربية في كندا; MLG = النمط الوراثي متعدد المواقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: التجميع الجيني باستخدام التحليل التمييزي للمكونات الرئيسية (DAPC) لمجموعات أيسلندا وNWT والأوراسية وأمريكا الشمالية وأوقيانوسيا A. fumigatus. تم تحديد النمط الجيني للعزلات في تسعة مواقع للسواتل الدقيقة وتم تصحيحها استنساخها ، حيث بلغ مجموعها 1,703 نمطا وراثيا فريدا متعدد المواقع. تم تلوين الأنماط الجينية وفقا للأصول الجغرافية. تم تكييف هذا الرقم من 34. الاختصارات: DAPC = التحليل التمييزي للمكونات الرئيسية؛ NWT = الأقاليم الشمالية الغربية; ISL = أيسلندا; CMR = الكاميرون; CAN = هاميلتون, أونتاريو, كندا; BEL = بلجيكا; FRA = فرنسا; DEU = ألمانيا; IND = الهند; الرابطة الوطنية من أجل الديمقراطية = هولندا; NOR = النرويج; NZL = نيوزيلندا; ESP = إسبانيا; CHE = سويسرا; الولايات المتحدة الأمريكية = الولايات المتحدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بلد درجة حرارة الحضانة (°C) عينات التربة عزل الخميرة الأنواع المعروفة / الأنواع الجديدة
الكاميرون 30 493 110 10/9
كندا 23 300 261 34/12
الصين 23 340 230 23/5
كوستاريكا 30 388 95 20/2
فرنسا 23 327 175 12/2
أيسلندا 14 316 211 11/0
نيوزيلندا 23 610 155 14/4
بيرو 23 490 139 30/9
المملكة العربية السعودية 30 562 97 8/1
مجموع 3826 1473 90/44

الجدول 1: عزل خميرة التربة عن تسعة بلدان في ست قارات. تم تحديد درجة حرارة الحضانة لعينات التربة من كل بلد بناء على متوسط درجة حرارته السنوية. النتائج المعروضة هنا مقتبسة من 9,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول الذي تم تطويره لعزل الخمائر و A. fumigatus من التربة هو طريقة سريعة وفعالة لمعالجة التربة عالية الإنتاجية والعزل الفطري. ولا يتطلب البروتوكول سوى كمية صغيرة من التربة (0.1-0.2 جم) لكل عينة، مما يسمح بأخذ عينات من المزيد من المواقع بجهد مماثل. يضمن وقت الاستجابة السريع إمكانية الحصول على النتائج في غضون إطار زمني قصير ويتيح الوقت لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وتكرار التجارب إذا لزم الأمر. يمكن تكرار هذا البروتوكول بسهولة عبر العديد من إعدادات المختبرات باستخدام معدات علم الأحياء الدقيقة وزراعة الخلايا القياسية. ومع ذلك ، عند عزل الخميرة أو القوالب عن التربة الدولية ، هناك حاجة إلى تدابير احترازية إضافية. يجب تعقيم جميع المعدات البلاستيكية التي لا يمكن التخلص منها ، مثل الصواني البلاستيكية وموزعات الخلايا ، عن طريق الغمر في التبييض بنسبة 10٪ ، تليها التعقيم. يجب إغلاق معطف المقعد المستخدم في كيس بلاستيكي وتعقيمه في الأوتوكلاف قبل التخلص منه.

تجدر الإشارة إلى أن عدد وهوية الخمائر المعزولة باستخدام البروتوكول أعلاه يمكن أن تكون محدودة بسبب ظروف الحضانة والوسائط المستخدمة. على سبيل المثال ، يمكن أن تفضل حضانة 24 ساعة في أسطوانة الأسطوانة عزل الخمائر الهوائية سريعة النمو على الأنواع بطيئة النمو. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون استخدام وسيط YEPD الغني بالمغذيات لعزل الخميرة قد استبعد أنواع الخميرة ذات المتطلبات والتفضيلات الغذائية المختلفة. وعلاوة على ذلك، فإن معظم المواقع التي أخذت عينات منها هنا تشهد تغيرات موسمية في درجات الحرارة والظروف المناخية الأخرى على مدار العام. إذا سمح الوقت والموارد ، يمكن معالجة عينات التربة نفسها تحت مجموعة من درجات الحرارة المختلفة للسماح بعزل مجموعة أوسع من الخمائر التي تعيش في هذه التربة.

في حين أن الأساليب المستقلة عن الثقافة حاسمة لتوضيح الأنماط واسعة النطاق في التنوع الفطري البيئي ، إلا أنها تفشل في أن تكون مفيدة بما فيه الكفاية للمجموعات المستهدفة من الفطريات مثل الخمائر. وسمح استخدام العزلة المعتمدة على الثقافة بإجراء تحقيق شامل في تنوع خميرة التربة العالمية وتنبؤاتها9. في حين أن دراسة metagenomics التي أجراها Tedersoo وزملاؤه حددت المتنبئات والأنماط العالمية في التنوع الفطري للتربة ، إلا أنه لا يمكن توضيح مدى انطباق هذه النتائج على وجه التحديد على تنوع الخميرة2. حدد تيدرسو وزملاؤه متوسط هطول الأمطار السنوي كمحرك مناخي رئيسي لتنوع فطريات التربة في جميع أنحاء العالم2. وجدت هذه الدراسة علاقة مماثلة بين متوسط هطول الأمطار السنوي وتنوع الخميرة القابلة للزراعة في التربة العالمية ، مما يسلط الضوء على أن الأساليب المعتمدة على الثقافة يمكن أن تكمل وتتوسع في نتائج نهج التسلسل عالية الإنتاجية9.

تعد إضافة الكلورامفينيكول خطوة مهمة في تحضير كل من الوسائط الصلبة والسائلة لمنع تداخل نمو الفطريات بواسطة البكتيريا. تعد إضافة الكلورامفينيكول إلى الوسائط السائلة أمرا بالغ الأهمية لأن نقص المضادات الحيوية سيسمح للبكتيريا الموجودة في التربة بالتخمر. سيؤدي ذلك إلى إنتاج غازات من شأنها أن تفتح بالقوة أنابيب الطرد المركزي الدقيق أو أنابيب زراعة 13 مل المستخدمة أثناء حضانة التربة في البروتوكول. إذا كان التلوث البكتيري في الكلورامفينيكول الذي يحتوي على أجار / مرق مشكلة ، يمكن استبدال الكلورامفينيكول أو استكماله بمضادات حيوية أقوى. عند عزل A. fumigatus عن التربة ، يمكن استبدال مرق SD بمحلول Tween 20 (0.2 M NaCl مع 1٪ Tween 20) للمساعدة في تعليق A. fumigatus conidia35,36 الكارهة للماء. بعد التعليق ، يمكن طلاء 100 ميكرولتر على SD agar وتحضينها عند 50 درجة مئوية.

ينمو فطر الرشاشيات بسرعة ويتكاثر بكثرة عند احتضانه بمفرده على كل من SD agar ووسائط MEA بين 22 درجة مئوية و 50 درجة مئوية. ومع ذلك ، اعتمادا على الأنواع الأخرى المتحملة للحرارة الموجودة في عينة التربة ، قد يتم إعاقة نمو A. fumigatus والجراثيم (الشكل 3A ، D). في ظل هذه الحالة ، قد تكون هناك حاجة إلى خطوة إلى عدة خطوات استزراع فرعية للحصول على مستعمرة نقية للحصاد والتوصيف اللاحقين.

تم إجراء تحليل شظايا سلالات A. fumigatus في الشكل 5 باستخدام برنامج أوزوريس. تم تسليط الضوء على العديد من القطع الأثرية PCR في الشكل 5C ويتم مناقشتها بالتفصيل من قبل De Valk et al.30. تحدث قمم التلعثم B-1 التي لها قيم تكرار أقصر بسبب انزلاق الخيط أثناء تخليق الخيط المضاد للإحساس بواسطة بوليميراز الحمض النووي. تحدث قمم N-1 إذا كان تركيز الحمض النووي مرتفعا جدا أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. تركيز الحمض النووي الموصى به هو 0.1 نانوغرام كما هو مذكور في البروتوكول أعلاه. قطعة أثرية أخرى هي نزيف الصبغة التي يمكن علاجها باستخدام ملصقات الفلورسنت ذات الأطوال الموجية غير المتداخلة للامتصاص. على سبيل المثال ، تولد تسميات الفلورسنت 6-FAM و HEX و ATTO550 ، بالإضافة إلى معيار صبغة LIZ600 ، قمم شظايا متميزة (الشكل 5). أخيرا ، لمنع القمم خارج النطاق ، قم بتخفيف كل تفاعل PCR (في هذه الحالة ، كان ~ 50x تخفيف) قبل الرحلان الكهربائي الشعري. لزيادة تقليل تألق الاشعال الأمامية غير المستخدمة في خليط التفاعل ، قم بتخفيض تركيزات التمهيدي الأمامي إلى النصف بالنسبة إلى الاشعال العكسي عند إنشاء المزيج الرئيسي.

تسمح الإنتاجية العالية والطبيعة المحافظة لهذا البروتوكول بالحصول بسرعة وسهولة نسبيا على العديد من الخمائر والقوالب من التربة. ومع ذلك ، هناك قيدين رئيسيين موجودين في منهجية أخذ العينات. أولا ، تم استخدام الخصائص المورفولوجية لمستعمرات الخميرة المزروعة من التربة لاختيار الأنواع الفريدة. ثم تم استزراعها واستخدامها لتحديد الأنواع عن طريق تسلسل أنظمة النقل الذكية. وقد تم ذلك لتحقيق أقصى قدر من تمثيل أنواع الخميرة الموجودة. ومع ذلك ، فإن أنواع الخميرة التي تشترك في مورفولوجيات مماثلة أو متطابقة مع المستعمرات المختارة قد تفشل في الاستزراع الفرعي. ثانيا ، أثناء عزل A. fumigatus ، حيث يتم اختيار مستعمرة فردية واحدة فقط لكل عينة تربة ، سيتم تفويت وجود أفراد متعددين داخل عينة التربة. وقد يؤدي ذلك إلى تمثيل ناقص للتنوع الجيني الحقيقي الموجود داخل مجتمع العينة، حيث لن يتم جمع الأنماط الجينية الفريدة الموجودة داخل عينة التربة نفسها. للتخفيف من هذه المشكلة ، خلال سلسلة خطوة مستعمرة واحدة بعد الزراعة الأولى على الوسائط الصلبة ، يمكن جمع العديد من المستعمرات الفردية للحصول على أنماط وراثية إضافية. يساعد الحجم الصغير للتربة المستخدمة لكل عينة على تقليل هذا الحد من أخذ العينات عند مقارنته بالطرق التي استخدمت كميات أكبر من التربة لكل عينة.

إن استخدام هذا البروتوكول عالي الإنتاجية والفعال في العمل لعزل الخميرة والعفن سيزيد من عدد الأفراد داخل سكان التربة مع استخدام جهد أقل لكل عينة. ستوفر الزيادة في القوة الإحصائية صورة أفضل لمجتمعات الخميرة القابلة للزراعة داخل التربة وتساعد على توصيف مجموعات التربة من A. fumigatus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

Acknowledgments

تم دعم هذا البحث من خلال منح من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (رقم المنحة. ALLRP 570780-2021) وجامعة ماكماستر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. The Yeasts: A Taxonomic Study. , Elsevier. (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 183، تنوع الخميرة، فطر الرشاشيات المدخنة، الثقافة النقية، التنميط المورفوتيبي، الترميز الشريطي للحمض النووي، التنميط الجيني للسواتل الدقيقة
عزل الخمائر والعفن القابل للزراعة عن التربة للتحقيق في التركيب السكاني الفطري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu,… More

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter