Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.

Abstract

De bodem is gastheer voor een ongelooflijke hoeveelheid microbieel leven, waarbij elke gram tot miljarden bacteriële, archaeale en schimmelcellen bevat. Meercellige schimmels zoals schimmels en eencellige schimmels, breed gedefinieerd als gisten, vervullen essentiële rollen in bodemecosystemen als afbrekers van organisch materiaal en als voedselbronnen voor andere bodembewoners. De diversiteit van schimmelsoorten in de bodem is afhankelijk van een groot aantal klimatologische factoren zoals regenval en temperatuur, evenals bodemeigenschappen zoals organisch materiaal, pH en vocht. Gebrek aan adequate milieubemonstering, vooral in regio's van Azië, Afrika, Zuid-Amerika en Midden-Amerika, belemmert de karakterisering van bodemschimmelgemeenschappen en de ontdekking van nieuwe soorten.

We hebben bodemschimmelgemeenschappen in negen landen op zes continenten gekarakteriseerd met behulp van ~ 4.000 bodemmonsters en een protocol dat in het laboratorium is ontwikkeld voor de isolatie van gisten en schimmels. Dit protocol begint met afzonderlijke selectieve verrijking voor gisten en de medisch relevante schimmel Aspergillus fumigatus, in vloeibare media terwijl de bacteriegroei wordt geremd. Resulterende kolonies worden vervolgens overgebracht naar vaste media en verder verwerkt om zuivere culturen te verkrijgen, gevolgd door downstream genetische karakterisering. De identiteit van gistsoorten wordt vastgesteld via sequencing van hun interne getranscribeerde spacer (ITS) -regio van het nucleaire ribosomale RNA-gencluster, terwijl de wereldwijde populatiestructuur van A. fumigatus wordt onderzocht via microsatellietmarkeranalyse.

Het protocol werd met succes toegepast om bodemgist- en A. fumigatuspopulaties in Kameroen, Canada, China, Costa Rica, IJsland, Peru, Nieuw-Zeeland en Saoedi-Arabië te isoleren en te karakteriseren. Deze bevindingen onthulden de broodnodige inzichten in wereldwijde patronen in bodemgistdiversiteit, evenals de wereldwijde bevolkingsstructuur en antischimmelresistentieprofielen van A. fumigatus. Dit artikel presenteert de methode om zowel gisten als A. fumigatus te isoleren uit internationale bodemmonsters.

Introduction

Schimmels in bodemecosystemen spelen een essentiële rol bij de afbraak van organisch materiaal, nutriëntenkringloop en bodembemesting1. Zowel cultuuronafhankelijke (d.w.z. high-throughput sequencing) als cultuurafhankelijke benaderingen worden veel gebruikt bij de studie van bodemschimmels 2,3. Hoewel de grote hoeveelheid gegevens die wordt gegenereerd door metabarcode-sequencing met hoge doorvoer nuttig is voor het ophelderen van grootschalige patronen in gemeenschapsstructuur en diversiteit, kan de cultuurafhankelijke benadering zeer complementaire informatie bieden over de taxonomische en functionele structuren van schimmelgemeenschappen, evenals meer specifieke profielen van individuele organismen door middel van downstream diversiteit en functionele analyses vanwege de beschikbaarheid van pure schimmelculturen.

Ondanks het feit dat ze zelden duizenden cellen per gram grond overschrijden, zijn gisten, breed gedefinieerd als eencellige schimmels, essentiële afbrekers en voedselbronnen voor andere bodembewoners 4,5. In feite kunnen gisten de overheersende bodemschimmels zijn in koude biosferen zoals continentaal Antarctica 6,7. Bodem is ook een primair reservoir van medisch relevante gisten die ernstige opportunistische infecties veroorzaken bij mensen en andere zoogdieren8. Ondanks morfologische overeenkomsten zijn gistsoorten fylogenetisch divers en komen ze voor bij filamenteuze schimmels in twee belangrijke phyla, Ascomycota en Basidiomycota, binnen het schimmelrijk9. Gisten missen een bepalende DNA-signatuur bij het schimmelbarcoding-gen, het interne getranscribeerde spacer (ITS) -gebied van het nucleaire ribosomale RNA-gencluster10, waardoor ze niet te onderscheiden zijn van andere schimmels in metagenomics-onderzoeken en dus het gebruik van cultuurafhankelijke methoden vereisen om gistsoorten te isoleren.

Het onderstaande protocol werd geïmplementeerd om bodemgistgemeenschappen van negen landen te karakteriseren en wereldwijde trends en patronen in bodemgistdiversiteit te identificeren 9,11,12. Metagenomics-benaderingen zijn van beperkt nut bij het bestuderen van gerichte groepen organismen zoals gisten 2,3. Vanwege hun fylogenetische diversiteit kunnen gisten niet worden onderscheiden van andere schimmels op basis van dna-sequentie alleen. Het bestuderen van gistpopulaties vereist dus het voortdurende gebruik van cultuurafhankelijke isolatie. Het kweken is echter vaak aanzienlijk tijdrovender en vereist meer personeel om de experimenten uit te voeren. Daarom is het protocol geoptimaliseerd en gestroomlijnd voor een snellere verwerking met beperkt personeel. Het belangrijkste voordeel van kweken is dat de geïdentificeerde gistsoorten levende gisten zijn en geen dode, en dus eerder echte bodembewoners zijn dan voorbijgaande cellen die in de bodem aanwezig zijn. Er is geschat dat ongeveer 40% van het schimmel-DNA in de bodem ofwel verontreinigingen zijn uit andere omgevingen, extracellulair, of afkomstig zijn van cellen die niet langer intact zijn, waardoor high-throughput sequencing-benaderingen worden veroorzaakt om schimmelrijkdom met maar liefst 55% te overschatten 13. Cultuurafhankelijke isolatie kan de identiteit van gistsoorten gemakkelijk bevestigen met als bijkomend voordeel dat zuivere cultuur wordt veiliggesteld voor gebruik in downstream-analyses. Inderdaad, zuivere culturen van 44 vermeende nieuwe gistsoorten werden geïdentificeerd met behulp van dit bodemisolatieprotocol dat het gebruik van een reeks methoden mogelijk maakte om hun taxonomische en functionele eigenschappen in detail te bestuderen14.

Het onderstaande protocol kan ook worden gebruikt om schimmels in de bodem te isoleren, zoals A. fumigatus. Aspergillus fumigatus is een thermofiele en saprofytische schimmel met een brede, wereldwijde verspreiding in de bodem15. Het is geïsoleerd uit tal van klinische en niet-klinische omgevingen. Niet-klinische bemonstering omvat gewoonlijk lucht, organisch puin (compost, zaagsel, tulpenbollenafval) en grond (landbouw-, tuin- en natuurlijke bodems)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus is een menselijke opportunistische ziekteverwekker die een reeks infecties veroorzaakt die gezamenlijk aspergillose worden genoemd en die wereldwijd meer dan 8 miljoen mensen16,20 treffen. Ongeveer 300.000 mensen over de hele wereld lijden aan invasieve aspergillose, de meest ernstige vorm van aspergillose16. Afhankelijk van factoren zoals de patiëntenpopulatie, de plaats van infectie en de werkzaamheid van antischimmeltherapie, kan het sterftecijfer oplopen tot 90%. In de afgelopen decennia is de resistentie tegen antischimmeltherapieën toegenomen, waardoor wereldwijde surveillance-inspanningen in zowel klinische als omgevingspopulaties nodig zijn om deze resistentiegenotypes te volgen 21,22,23. Gezien het vermogen om te groeien bij temperaturen boven 50 °C, kan deze temperatuur worden gebruikt om te selecteren op A. fumigatus isolaten uit de bodem met behulp van cultuurafhankelijke methoden. Aspergillus fumigatusisolaten worden gewoonlijk gegenotypeerd bij negen zeer polymorfe korte tandem repeat (STR) loci, waarvan is aangetoond dat ze een hoog discriminerend vermogen hebben tussen stammen24. Deze STR-genotypen kunnen worden vergeleken met andere eerder onderzochte populaties om de verspreiding van A. fumigatus-genotypen, inclusief medicijnresistentiegenen, over de hele wereld te volgen.

Hieronder beschrijven we een protocol voor de snelle isolatie van gisten en A. fumigatus uit bodemmonsters op een cultuurafhankelijke manier. Afhankelijk van de hoeveelheid grond die per monster wordt verkregen, kunnen de bodemmonsters worden verdeeld tussen de twee protocollen. In vergelijking met vergelijkbare methoden die gist en A. fumigatus uit de bodem isoleren, gebruikt dit protocol 10x minder grond per verkregen isolaat. Studies die proberen A. fumigatus uit de bodem te isoleren, vereisen tussen 1 en 2 g grond per isolaat, terwijl dit protocol slechts 0,1-0,2 g grond 18,19,25 vereist. Dit protocol maakt gebruik van kleinere kunststoffen en containers die het ontwerp met hoge doorvoer vergemakkelijken. Daarom kan een groter aantal monsters worden verwerkt met minder ruimte voor apparatuur zoals incubators en roltrommels. Bodemmonsters kunnen volledig worden verwerkt om isolaten te verkrijgen in slechts 7 dagen. Dit protocol is geoptimaliseerd om verwerking van maximaal 150-200 monsters per dag per persoon mogelijk te maken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Alle stappen die gebruik maken van internationale bodemmonsters en / of A. fumigatus-sporen en mycelia vereisen werken in een bioveiligheidskast voor niveau 2-organismen (BSCII).

1. Isolatie van gist uit de bodem

  1. Bereiding van antibacteriële en schimmelwerende oplossingen
    1. Suspensie chlooramfenicolpoeder in 70% ethanol om een 50 g / L stockoplossing te bereiden. Steriliseren door spuitfiltratie en bewaren bij 4 °C.
      OPMERKING: Dit antibioticum voorkomt de groei van de meeste bacteriën tijdens bodemgistisolatie. Omdat chlooramfenicolresistente bacteriën nog steeds kunnen groeien, moet de morfologie van kolonies zorgvuldig in overweging worden genomen bij het onderscheiden van gisten van bacteriën. Extra antibiotica kunnen aan media worden toegevoegd bij het werken met grond waarvan wordt vermoed dat deze antibioticaresistente bacteriestammen bevat. Bacteriële besmetting in met chlooramfenicol aangevulde media was geen probleem bij het isoleren van gisten uit milieugronden.
    2. Suspensie benomylpoeder in DMSO om een 5 g/L stamoplossing te bereiden. Steriliseren door spuitfiltratie en bewaren bij 4 °C.
      OPMERKING: Dit selectieve antischimmelmiddel voorkomt de groei van de meeste filamenteuze schimmels zonder de gistgroei tijdens bodemgistisolatiete beïnvloeden 26,27.
  2. Bereiding van kweekmedia en steriele apparatuur
    1. Om YEPD (Gistextract-Peptone-Dextrose) bouillon te bereiden, voegt u 10 g gistextract, 20 g pepton en 20 g dextrose toe aan 1 l dubbel gedestilleerd water. Roer tot het goed gemengd is en autoclaaf gedurende 40 minuten bij 121 °C. Bewaren bij kamertemperatuur tot gebruik.
    2. YEPD massief agar medium
      1. Meng 10 g gistextract, 20 g pepton, 20 g dextrose en 20 g agar in 1 l water. Roer goed om te mengen en autoclaaf gedurende 40 min bij 121 °C.
      2. Voeg, eenmaal voldoende afgekoeld, 1 ml chlooramfenicol en benomyl toe uit stamoplossingen om de uiteindelijke concentraties van de twee antimicrobiële stoffen op respectievelijk 50 mg / L en 5 mg / L te brengen.
      3. Meng goed door te roeren en giet in petrischaaltjes met een diameter van 10 cm. Laat een nacht op kamertemperatuur staan en bewaar het op 4 °C tot gebruik.
        OPMERKING: Vanaf 1 L YEPD kunnen ongeveer 40 platen worden gegoten.
    3. Steriliseer houten applicatorsticks met platte punt en herbruikbare celverspreiders door autoclaveren en bewaren bij kamertemperatuur.
  3. Incubatie van grond in vloeibare bouillon
    1. Bereid een set steriele kweekbuizen van 13 ml voor door ze te labelen met bodemmonster-ID.
    2. Voeg met behulp van een serologische pipet 5 ml YEPD-bouillon aangevuld met chlooramfenicol en benomyl toe aan elke buis.
    3. Werk in een BSCII en breng ~ 0,1 g grond over in de juiste kweekbuis met behulp van een steriele, houten applicator met platte punt.
      OPMERKING: Gebruik een verse applicator voor elk bodemmonster en gooi deze onmiddellijk na gebruik weg om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen.
    4. Sluit de buis stevig af tot de eerste stop om morsen te voorkomen, maar laat nog steeds luchtuitwisseling toe tijdens incubatie. Incubeer de kweekbuizen in een roltrommel gedurende 24 uur bij een temperatuur die optimaal wordt geacht voor het maximaliseren van de gistgroei.
      OPMERKING: De incubatietemperatuur moet worden bepaald op basis van de gemiddelde jaarlijkse temperatuur van het land van herkomst van de bodemmonsters. Bij het isoleren van bodemgisten uit IJsland werden de kweekbuizen bijvoorbeeld geïncubeerd bij 14 °C, terwijl bodems uit Saoedi-Arabië bij 30 °C werden geïncubeerd. Vanwege de langzamere gistgroei bij lagere temperaturen, moet de incubatietijd mogelijk tot 72 uur worden verlengd.
  4. Breng het supernatant over op het vaste medium.
    1. Gebruik de set YEPD + chlooramfenicol + benomyl agar platen bereid in stap 1.2 en label ze met de bodemmonster-ID.
    2. Verwijder de kweekbuizen die in stap 1.3 zijn voorbereid uit de roltrommel. Werkend in een BSCII, kort vortex de buis om bodemdeeltjes en cellen die zich mogelijk aan de onderkant hebben bezonken terug in suspensie te trekken.
    3. Breng met behulp van een micropipette 100 μL van het supernatant over op een plaat. Gebruik een steriele, herbruikbare celverspreider om de vloeistof grondig en gelijkmatig over het agaroppervlak te verspreiden.
      OPMERKING: Werken in sets van 10 monsters kan dit proces aanzienlijk versnellen. Pipetteer het supernatant eerst op 10 platen en voer vervolgens spreiding uit. Gebruik voor elk monster een verse strooier om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen.
    4. Stapel de platen in plastic zakken, sluit af en incubeer ondersteboven gedurende 2-3 dagen bij dezelfde temperatuur die eerder werd gebruikt voor vloeibare bouillonincubatie totdat microbiële groei zichtbaar is.
  5. Detectie van gisten en streaking voor enkele kolonies
    1. Nadat u voldoende incubatietijd hebt toegestaan (meestal 2-3 dagen, maar kan langer duren bij lagere temperaturen), inspecteert u de platen in een BSCII op gistgroei. Zoek naar romige, ronde, matte gisten die gemakkelijk te onderscheiden zijn van bacterie- en schimmelkolonies.
      OPMERKING: Sommige gisten produceren gekleurde pigmenten en kunnen zwart / bruin, geel of rood lijken, maar hun algehele kolonietextuur en -vorm zouden vergelijkbaar zijn met niet-gepigmenteerde gisten.
    2. Selecteer een gistachtige kolonie uit elke plaat voor verdere verwerking.
      OPMERKING: Als meer dan één type morfologie op een enkele plaat wordt waargenomen, selecteert u één representatieve kolonie voor elk morfologisch type.
    3. Gebruik steriele, houten applicatorsticks met platte punt om elke geselecteerde kolonie over op een verse YEPD + chlooramfenicol + benomylplaat en streep voor enkele kolonies. Voer drie afzonderlijke strepen uit.
      1. Streep heen en weer over een derde van de plaat met behulp van een applicatorstok. Begin de tweede en derde streep door de applicator eenmaal over de voorgaande streep te strepen. Gebruik een nieuwe applicatorstick voor elke streep.
        LET OP: Gebruik één plaat per isolaat. Gooi applicatoren onmiddellijk na gebruik weg om kruisbesmetting tussen monsters te voorkomen.
    4. Stapel de platen in plastic zakken, sluit af en incubeer ondersteboven gedurende 2-3 dagen bij dezelfde temperatuur die eerder werd gebruikt totdat afzonderlijke kolonies zichtbaar worden.
  6. Identificatie van gistsoorten via ITS-sequencing
    1. Selecteer een goed gescheiden, enkele kolonie per bodemisolaat en subcultuur op een verse YEPD + chlooramfenicol + benomylplaat om meer cellen te verkrijgen. Incubeer gedurende 2-3 dagen bij dezelfde temperatuur die eerder werd gebruikt.
    2. Oogst de vers gekweekte cellen en suspensie ze in -80 ° C vriesbuizen met 1 ml gesteriliseerde 30% glycerol in dubbel gedestilleerd water om celsuspensies te creëren. Houd deze suspensies op -80 °C als stamoplossingen.
    3. Gebruik verse cellen om kolonie PCR (polymerasekettingreactie) uit te voeren met primers ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') en ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGCTGC 3') om het schimmelbarcoding-gen ITS9 te versterken. Gebruik de volgende thermocyclingcondities: een eerste denaturatiestap bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 35 cycli van i) 95 °C gedurende 30 s, ii) 55 °C gedurende 30 s en iii) 72 °C gedurende 1 min.
      OPMERKING: Colony PCR heeft een hoog slagingspercentage en een snellere doorlooptijd dan DNA-extractie gevolgd door PCR.
    4. Als kolonie PCR herhaaldelijk faalt voor een stam, extraheer dan DNA met behulp van het protocol van keuze en voer ITS PCR uit met behulp van geëxtraheerd genomisch DNA als sjabloon (gebruik dezelfde thermocyclingcondities als hierboven).
      OPMERKING: Een relatief goedkope op chloroform gebaseerde DNA-extractie wordt aanbevolen28.
    5. Voer Sanger-sequencing uit om de DNA-sequentie van het versterkte ITS-gebied voor elke stam te bepalen.
    6. Vergelijk de verkregen ITS-sequentie van de giststammen met sequenties die zijn gedeponeerd in openbare databases zoals NCBI GenBank en UNITE om de soortidentiteit vast te stellen.

2. Isolatie van Aspergillus fumigatus uit de bodem

  1. Bereid 1 ml steriele Sabouraud dextrose bouillon (SDB) aangevuld met het antibioticum chlooramfenicol per bodemmonster.
    1. Voeg 10 g pepton en 20 g dextrose toe aan 1 l gedestilleerd water. Autoclaaf bij 121 °C gedurende 40 min.
    2. Laat de SDB afkoelen tot ~50 °C, voeg 1 ml chlooramfenicol van 50 g/l toe om de concentratie op 50 mg/l te brengen.
      OPMERKING: Chlooramfenicol wordt op dezelfde manier bereid als hierboven beschreven voor gistisolatie. Naast het remmen van bacteriegroei, voorkomt chlooramfenicol ook de productie van gas uit bacteriën die ervoor zorgen dat de buizen openen tijdens de incubatiestap die in stap 2.2 wordt beschreven.
    3. Aseptisch aliquot 1 ml SDB in een microcentrifugebuis van 1,5 ml per bodemmonster met behulp van een mechanische pipet.
  2. Voeg aarde toe aan 1,5 ml microcentrifugebuizen.
    1. Leg banklaag of absorberende vulling in een BSCII om te helpen bij het verwijderen van gemorste grond.
    2. Breng met behulp van geautoclaveerde applicatorsticks ongeveer 0,1 g grond over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 1 ml SBD. Sluit de buis en vortex. Incubeer de gesuspendeerde grond bij 50 °C gedurende 3 dagen.
      OPMERKING: Schudden tijdens incubatie is niet vereist.
  3. Myceliale oogst van in de grond geënte bouillon
    1. Bereid moutextract agar (MEA) borden.
      1. Per liter MEA: voeg 20 g moutextract, 20 g dextrose, 6 g pepton en 15 g agar toe aan 1 l gedestilleerd water. Autoclaaf bij 121 °C gedurende 40 min.
      2. Laat de MEA afkoelen tot ~50 °C en voeg vervolgens 1 ml chlooramfenicol van 50 g/l toe om tot een eindconcentratie van 50 mg/l te komen.
    2. Breng de mycelia van de in de grond geënte bouillon over op MEA-platen.
      1. Identificeer bodeminocculums die zichtbare myceliale groei hebben op de SDB naar luchtgrens.
      2. Gebruik gesteriliseerde houten applicatorsticks met platte punt om de mycelia naar het midden van een MEA-plaat over te brengen. Incubeer de MEA-platen bij 37 °C gedurende 3 dagen.
  4. Selectie van mycelia met A. fumigatus morfologische eigenschappen.
    1. Identificeer schimmelkolonies die karakteristieke A. fumigatus morfologische eigenschappen hebben (groene suèdeachtige groei).
    2. Werk in een BSCII en gebruik gesteriliseerde houten applicatorsticks met platte punt of een inentingslus om conidia / mycelia te oogsten door het oppervlak eenmaal te schrapen. Breng de sporen/mycelia over naar het midden van een MEA-plaat door op de agar te strepen voor enkele kolonies. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 dagen.
      OPMERKING: Aangezien er meerdere A. fumigatusstammen en/of andere schimmels op de plaat aanwezig kunnen zijn, is het belangrijk om te streaken voor enkele kolonies. Het single-colony streaking protocol in Stap 1.5.3 in het gistisolatieprotocol kan worden gebruikt.
    3. Met behulp van een steriele applicatorstick of inentingslus, subcultuur een enkele kolonie gegenereerd in stap 2.4.1.2 op MEA door de kolonie eenmaal te strepen. Verspreid de geoogste sporen in het midden van de plaat. Incubeer bij 37 °C gedurende 2 dagen.
  5. Oogsten van A. fumigatus sporen/mycelia voor kweekopslag
    1. Bereid een steriele 30% glyceroloplossing (voeg voor een oplossing van 100 ml 30 ml 100% glycerol toe, gemengd met 70 ml dubbel gedestilleerd water, gesteriliseerd bij 121 °C gedurende 40 minuten).
    2. Werk in een BSCII en gebruik een p1000-pipet om 1 ml van de 30% glyceroloplossing aan te zuigen. Doseer de 1 ml glyceroloplossing op de A. fumigatus-kolonie om sporen / mycelia te oogsten.
      1. Vanwege de hydrofobiciteit van A. fumigatus-sporen / mycelia, gebruik de pipetpunt om een dicht gesporuleerd gebied van de plaat te krassen.
        OPMERKING: Wanneer glycerol in de kras wordt afgegeven, zou de glycerol zich hechten aan het krabgebied in plaats van over de agar te rollen.
      2. Doseer de glycerol langzaam op het krabgebied om de sporen los te maken en hang ze op in de glyceroloplossing.
      3. Eenmaal volledig afgegeven, kantelt u de plaat lichtjes en aspirateert u de glycerolsporen / mycelia-suspensie.
        OPMERKING: Er wordt ongeveer 750 tot 800 μL aangezogen.
      4. Breng het aspiraat over in een steriele vriesbuis en bewaar het bij -80 °C. Maak indien nodig werkvoorraad aan door stap 2.5.2.1 tot en met 2.5.2.4 te herhalen.
  6. Fenotypische identificatie van A. fumigatus stammen
    1. Maak met behulp van de sporenvoorraad die is gemaakt uit stap 2.5.2 een verdunning van 100x in water.
      1. Adem 10 μL van de myceliale en sporenvoorraden aan en doseer in 990 μL water. Vortex de suspensie.
    2. Doseer 10 μL van de verdunde sporensuspensie op een standaard microscoopglaasje.
    3. OPTIONEEL: Beits de myceliale en sporensuspensie met methyleenblauw.
      1. Om te kleuren met methyleenblauw, bevestigt u de conidia en conidioforen aan de glijbaan door de glijbaan over een Bunsen-brander te laten gaan totdat deze droog is.
      2. Breng methyleenblauw aan gedurende 1-2 minuten en was af met water.
      3. Droog de dia met vloeipapier.
    4. Gebruik een samengestelde microscoop met een vergroting van 400x, bekijk de suspensie en lokaliseer conidioforen. Vergelijk de waargenomen conidiofore morfologie met A. fumigatus conidiophore morfologie.
  7. Moleculaire identificatie van A. fumigatus stammen
    1. Extraheer DNA uit elk isolaat volgens gemeenschappelijke schimmel-DNA-extractieprotocollen.
    2. Met behulp van primers die specifiek zijn voor de Aspergillus-β-tubulinen (β-tub1 en β-tub4), voert u PCR uit en verkrijgt u de sequentie voor de versterkte producten, volgens protocollen beschreven door Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Vergelijk de verkregen sequenties met sequenties die zijn gedeponeerd in openbare databases zoals NCBI GenBank met behulp van BLAST.
      2. Controleer of de stamsequenties een topmatch zijn met A. fumigatus-sequenties in de database.
    3. Als alternatief voor stap 2.7.2 voert u een multiplex PCR-reactie uit op de A. fumigatus-paringstypen MAT1-1 en MAT1-229.
      1. Gebruik de volgende drie primersequenties in de multiplex PCR-reactie: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Gebruik de volgende thermocyclerparameters: 5 min bij 95 °C, 35 cycli van 30 s bij 95 °C, 30 s bij 60 °C en 1 min bij 72 °C vóór een laatste 5 minuten bij 72 °C.
      3. Voer gel-elektroforese uit om de producten te identificeren; zoek naar 834 bp MAT-1 of 438 bp MAT1-2. Gebruik A. fumigatus-stammen die de versterking van het paringstype hebben bevestigd als positieve en negatieve controles.
  8. Microsatelliet genotypering van A. fumigatus stammen door fragmentanalyse
    OPMERKING: Hoewel de onderstaande stappen in grote lijnen betrekking hebben op genotypering A. fumigatus bij negen microsatelliet (STR) loci, zijn slechts enkele belangrijke overwegingen benadrukt. Voor meer informatie over A. fumigatus STR genotypering, zie De Valk et al.24,30.
    1. Bereid drie PCR multiplex master mixen met behulp van de STRAf primers eerder beschreven door De Valk et al.24.
      1. Label fluorescerend voorwaartse primers om de fragmentgrootte te bepalen door middel van capillaire elektroforese. Zorg ervoor dat de concentratie van de voorwaartse primers de helft (0,5 μM) is van die van de omgekeerde primers (1 μM) in het hoofdmengsel.
        OPMERKING: Gebruik voor de beste resultaten fluorescerende labels met absorptiegolflengten die overeenkomen met die van de gekozen kleurstofstandaard die wordt gebruikt tijdens capillaire elektroforese
      2. Gebruik hot start polymerase voor het beste resultaat.
      3. Gebruik een DNA-concentratie van 0,1 ng per reactie.
    2. Voer de multiplex PCR voor elke stam uit met behulp van het volgende PCR-programma: 95 °C gedurende 10 minuten, 40 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 60 s, gevolgd door 72 °C gedurende 10 minuten en een hold bij 4 °C.
    3. Controleer op versterkte producten door gel-elektroforese.
    4. Verdun de producten tot het gewenste niveau (meestal ~ 50x) zoals aanbevolen door fragmentanalysespecialisten en voer capillaire elektroforese uit. Voer drie runs uit voor elke stam, waarbij elke run drie multiplexreacties beslaat met drie verschillende fluorescerende sondes.
    5. Om de juiste fragmentgrootte voor elk van de negen STR-loci te bepalen, gebruikt u software die in staat is tot fragmentanalyse.
      1. Haal de ruwe gegevens op die zijn verkregen uit capillaire elektroforese. Scoor de fragmentgroottes op basis van de grootste piek met behulp van de fragmentanalysesoftware (bijv. Osiris).
      2. Converteer de fragmentgroottes naar herhalingsgetallen voor elk van de negen loci. Gebruik de fragmentgroottes van de herhalingsgetallen van de referentiestam Af293 zoals eerder beschreven door De Valk et al.24.
        OPMERKING: Kleine variaties in fragmentgroottes kunnen optreden tussen verschillende capillaire elektroforeseplatforms. Het is dus belangrijk om een gemeenschappelijke referentiestam (en een interne ladder) op te nemen met een bekende fragmentgrootte voor elk van de negen loci voor genotyperingsstammen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gistisolatie uit de bodem
Het bovenstaande gistisolatieprotocol werd geïmplementeerd om gisten te kweken uit bodemmonsters afkomstig van 53 locaties in negen landen 9,12. In totaal werden 1.473 giststammen geïsoleerd uit 3.826 bodemmonsters. Gezien de verschillende klimatologische omstandigheden van de negen landen van oorsprong werd de beste incubatietemperatuur voor elk land bepaald op basis van de gemiddelde jaartemperatuur (tabel 1). Gezien de langzamere gistgroei bij 14 °C werden bodemmonsters uit IJsland nog eens 48 uur (96-120 uur totaal) op een roltrommel geïncubeerd. Na 2-3 dagen incubatie op vast medium was microbiële groei zichtbaar op platen voor alle monsters (figuur 1A). Een willekeurig geselecteerde kolonie voor elke gistmorfologie die op een plaat aanwezig was, werd voor afzonderlijke kolonies op verse platen gestreept (figuur 1B).

De snelheid van succesvolle gistisolatie verschilde van land tot land (tabel 1). Zo werden 97 giststammen gekweekt uit 562 Saoedi-Arabische bodemmonsters (17,3%), terwijl 261 gisten werden gekweekt uit 300 Canadese bodemmonsters (87%). Er moet een zeldzaamheidsanalyse worden uitgevoerd om te bepalen of er voldoende bodemmonsters zijn genomen om nauwkeurige schattingen te krijgen van de werkelijke gistdiversiteit op bemonsterde locaties. Een voorbeeld van een zeldzaamheidsanalyse voor elk land werd vooraf uitgevoerd, waarbij de Shannon-diversiteitsindex werd gebruikt als een maat voor de diversiteit van bodemgisten (figuur 2). De resulterende zeldzaamheidscurven benaderden de verzadigingsasymptoot, wat aangeeft dat extra bemonstering waarschijnlijk niet meer gistdiversiteit had opgeleverd.

Sequencing van de ITS-regio onthulde dat de 1.473 gistisolaten kunnen worden onderverdeeld in 134 verschillende soorten. Dit omvatte 90 bekende soorten en 44 potentieel nieuwe soorten. We pasten een mixed-effects model toe om voorspellers van de wereldwijde cultureerbare bodemgistdiversiteit te identificeren, zoals gekwantificeerd door de Shannon diversity index31. In dit model werden de gemiddelde jaarlijkse neerslag, de gemiddelde jaarlijkse temperatuur, de hoogte en de afstand tot de evenaar van de bemonsteringslocaties als vaste effecten aangebracht, terwijl het bemonsteringsland werd ingesteld als een willekeurig effect9. Dit model identificeerde dat de gemiddelde jaarlijkse neerslag significant gecorreleerd was met de Shannon-diversiteitsindex (p = 0,012), terwijl er geen significante correlaties werden gevonden tussen andere predictorvariabelen en de Shannon-diversiteitsindex9.

Om dit op cultuur gebaseerde protocol te vergelijken met cultuuronafhankelijke methoden, vergeleken we deze bevindingen met een eerdere studie van Tedersoo en collega's die de wereldwijde diversiteit van bodemschimmels onderzochten met behulp van metagenomica2. Tedersoo en collega's voerden high-throughput sequencing van de ITS-regio uit op DNA dat rechtstreeks werd geëxtraheerd uit bodemmonsters van 39 landen, waarvan er vier, namelijk Kameroen, Canada, China en Nieuw-Zeeland, ook in deze studie werden bemonsterd. We voerden BLAST-zoekopdrachten uit om ITS-sequenties te identificeren die aanwezig zijn in beide datasets32, en vonden dat 26% van de ITS-sequenties een significante match had (>98,41% nucleotide-identiteit) in de metagenomics-dataset. <3% kwam echter overeen met een schimmelsequentie uit hetzelfde land, terwijl de resterende 23% overeenkwam met een schimmelsequentie die in een ander land werd gevonden9. We waren succesvoller dan de metagenomics-studie in het annoteren van de ITS-sequenties met gistsoortidentiteit. Tedersoo en collega's rapporteerden in totaal 50.589 schimmeloperatieve taxonomische eenheden (OTA's), waarbij het aantal gist-OTUs niet bekend was. Van deze schimmel-OTA's werd 33% slechts geannoteerd als environmental_sequence (724, 1,4%), uncultured_soil_fungus (2.405, 4,8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1.407, 2,8%) of uncultured_fungus (11.898, 23,5%).

Aspergillus fumigatus isolatie van de bodem
Na 3 dagen grondincubatie bij 50 °C in 1 ml SDB in een microcentrifugebuis, kan mycelia groeien in de SDB, op de SDB tot luchtgrens en/of op de binnenwanden. Aspergillus fumigatus mycelia worden meestal gevonden op de SDB naar luchtgrens, maar kunnen ook worden geoogst van net onder het SDB-oppervlak. Na deze stap worden de mycelia overgebracht naar MEA en gedurende 3 dagen gekweekt bij 37 °C. Myceliale groei op platen kan alleen de groene suèdemorfologie vormen die typerend is voor A. fumigatus (figuur 3A). Vaker kunnen andere thermotolerante schimmels in dezelfde grond aanwezig zijn en met A. fumigatus op dezelfde plaat of op zichzelf groeien (figuur3B-D). Aspergillus fumigatus isolatie tarieven kunnen variëren tussen geografische locaties, vergelijkbaar met wat is gevonden voor bodem gisten. In Vancouver, Canada, werden bijvoorbeeld 251 isolaten verkregen via deze methode uit 540 bodemmonsters (46,5%) (ongepubliceerde resultaten). In Kameroen daarentegen werden 51 A. fumigatusisolaten geoogst uit 495 bodemmonsters (10,3%)33.

A. fumigatus conidiofore structuur kan worden bekeken en geïdentificeerd met behulp van lichtmicroscopie. Conidioforen hebben een bal op stokmorfologie (figuur 4). Bovendien zijn A. fumigatus conidioforen uniseriate, waarbij de phialides, bevestigd aan de conidia-ketens, direct aan het bolvormige blaasje zijn bevestigd. Bij andere Aspergillus-soorten zijn conidioforen biseriaat, waarbij de phialides verbonden zijn met metulae die aan het blaasje zijn bevestigd.

Er zijn verschillende softwareprogramma's beschikbaar om fragmentanalyses uit te voeren van de ruwe gegevens van capillaire elektroforese, waarbij het capillaire elektroforesespectrum wordt omgezet in fragmentgroottes. Figuur 5 is een chromatogram gegenereerd door het programma Osiris. De drie kanalen die de fragmentlengtes van A. fumigatus dinucleotide (2A, 2B en 2C), trinucleotide (3A, 3B en 3C) en tetranucleotide (4A, 4B en 4C) STR loci visualiseren, worden getoond. Daarnaast worden ook PCR-artefacten getoond die optreden als de DNA-concentratie van het monster tijdens PCR te hoog is. De hoogste toppen van elke kleur vertegenwoordigen de fragmentgroottes van de drie STR-loci in dit perceel.

De aanwezige genetische variatie tussen A. fumigatus STR genotypen kan worden gevisualiseerd met behulp van het R-pakket poppr. Het R-script bruvo.msn creëert een paarsgewijze Bruvo's genetische afstandenmatrix tussen elk paar genotypen. Deze matrix wordt vervolgens gebruikt om een minimum spanning netwerk (MSN) te genereren. Een MSN van hoge kwaliteit kan vervolgens worden gegenereerd met behulp van het R-script plot_poppr_msn of imsn (figuur 6). Een discriminerende analyse van de belangrijkste componenten (DAPC) is een andere methode om de genetische relaties tussen stammen te visualiseren (figuur 7). Het R-script dapc in het R-pakket adegenet wordt gebruikt om DAPC uit te voeren en kan worden gebruikt met bekende of onbekende groepsprioriteiten. Bij onbekende groepsprioriteiten maakt het gebruik van K-middelen clustering om het waarschijnlijke aantal groepen individuen te identificeren.

Figure 1
Figuur 1: Gistisolatie uit bodemmonsters. (A) Microbiële groei is zichtbaar op vaste agar na 2-3 dagen incubatie. Gistkolonies kunnen worden gezien afgewisseld met andere schimmel / bacteriële kolonies. Eén representatieve gistkolonie voor elk morfologisch type op een plaat wordt geselecteerd om te streaken voor enkele kolonies. (B) Er worden drie strepen uitgevoerd om enkele kolonies gistisolaten te verkrijgen. Eén plaat werd gebruikt om elk bodemisolaat te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Rarefactieanalyse van bodembemonstering. In elk van de negen bemonsterde landen benadert de diversiteit van bodemgisten, zoals gekwantificeerd door de Shannon-diversiteitsindex, de verzadiging naarmate het aantal bodemmonsters toeneemt. Dit cijfer is aangepast van 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Aspergillus fumigatus morfologie op Sabouraud dextroseagar. (A) Groene suède-achtige A. fumigatus groeimorfologie. (B-D) A. fumigatusgroei met andere thermofiele schimmels die aanwezig zijn in het bodemmonster. A. fumigatus conidiatie is zichtbaar verminderd in B en D. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Foto van een Aspergillus fumigatus conidiofore onder een lichtmicroscoop. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Osiris output van negen microsatelliet loci van een Aspergillus fumigatus stam. De uitgangen komen overeen met de (A) Dinucleotide (2A, 2B en 2C), (B) trinucleotide (3A, 3B en 3C) en (C) tetranucleotide (4A, 4B en 4C) STR loci. Forward primer 5' fluorescerende labels zijn: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. Multiplexreactieproducten werden 30x verdund voorafgaand aan capillaire elektroforese. De LIZ600 kleurstofstandaard werd gebruikt tijdens capillaire elektroforese. Ruwe gegevens werden geanalyseerd met behulp van de piekanalysesoftware Osiris die potentiële pieken tussen 60 en 400 bp identificeerde. Verschillende PCR-artefacten zijn off-scale pieken die fluorescentiebloedingen, stotterpieken en N-1-pieken (C) veroorzaken. Afkortingen: 6-FAM = 6-carboxyfluoresceïne; HEX = hexachloorfluoresceïne; STR = korte tandemherhalingen; RFU = relatieve fluorescentie-eenheden; BPS = basenparen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Minimaal dekkend netwerk dat de genetische relatie weergeeft tussen MLG's van A. fumigatus uit IJsland en Northwest Territories in Canada. Elk knooppunt vertegenwoordigt één MLG, waarbij de knooppuntgrootte overeenkomt met het aantal stammen voor elke MLG. Knooppunten die genetisch meer op elkaar lijken, hebben donkere en dikkere randen, terwijl knooppunten die genetisch ver weg zijn, lichtere en dunnere randen hebben. Dit cijfer is aangepast van 34. Afkortingen: ISL = Iceland; NWT = Northwest Territories in Canada; MLG = multilocus genotype. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Genetische clustering met behulp van discriminante analyse van hoofdcomponenten (DAPC) van IJsland, NWT, Euraziatische, Noord-Amerikaanse en Oceanische A. fumigatuspopulaties . Isolaten werden gegenotypeerd op negen microsatelliet loci en kloongecorrigeerd, in totaal 1.703 unieke multilocus genotypen. Genotypen werden gekleurd volgens geografische oorsprong. Dit cijfer is aangepast van 34. Afkortingen: DAPC = discriminante analyse van de belangrijkste componenten; NWT = Noordwestelijke Gebieden; ISL = IJsland; CMR = Kameroen; CAN = Hamilton, Ontario, Canada; BEL = België; FRA = Frankrijk; DEU = Duitsland; IND = India; NLD = Nederland; NOR = Noorwegen; NZL = Nieuw-Zeeland; ESP = Spanje; CHE = Zwitserland; USA = Verenigde Staten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Land Incubatietemperatuur (°C) Bodemmonsters Gistisolaten Bekende soorten/ Nieuwe soorten
Kameroen 30 493 110 10/9
Canada 23 300 261 34/12
China 23 340 230 23/5
Costa Rica 30 388 95 20/2
Frankrijk 23 327 175 12/2
IJsland 14 316 211 11/0
Nieuw-Zeeland 23 610 155 14/4
Peru 23 490 139 30/9
Saudi-Arabië 30 562 97 8/1
Totaal 3826 1473 90/44

Tabel 1: Bodemgistisolatie uit negen landen op zes continenten. De incubatietemperatuur voor bodemmonsters uit elk land werd bepaald op basis van de gemiddelde jaarlijkse temperatuur. De hier gepresenteerde resultaten zijn aangepast van 9,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol dat is ontwikkeld voor het isoleren van gisten en A. fumigatus uit de bodem is een snelle en efficiënte methode voor bodemverwerking met hoge doorvoer en schimmelisolatie. Het protocol vereist slechts een kleine hoeveelheid grond (0,1-0,2 g) per monster, waardoor meer locaties met vergelijkbare inspanning kunnen worden bemonsterd. De snelle doorlooptijd zorgt ervoor dat resultaten binnen een kort tijdsbestek kunnen worden verkregen en biedt tijd voor het oplossen van problemen en het indien nodig herhalen van experimenten. Dit protocol kan eenvoudig worden gerepliceerd in vele laboratoriumomgevingen met behulp van standaard microbiologische en celkweekapparatuur. Bij het isoleren van gist of schimmels van internationale grond zijn echter extra voorzorgsmaatregelen vereist. Alle niet-wegwerp plastic apparatuur, zoals plastic trays en celverspreiders, moet worden gesteriliseerd door onderdompeling in 10% bleekmiddel, gevolgd door autoclaveren. De gebruikte bankjas moet worden verzegeld in een plastic zak en worden gesteriliseerd in een autoclaaf voordat deze wordt weggegooid.

Opgemerkt wordt dat het aantal en de identiteit van gisten die zijn geïsoleerd met behulp van het bovenstaande protocol, kunnen worden beperkt door de broedomstandigheden en de gebruikte media. 24 uur incubatie in de roltrommel kan bijvoorbeeld de isolatie van snelgroeiende aerobe gisten bevorderen boven langzaam groeiende soorten. Bovendien kan het gebruik van een voedingsrijk YEPD-medium voor gistisolatie gistsoorten met verschillende voedingsbehoeften en -voorkeuren hebben uitgesloten. Bovendien ervaren de meeste locaties die hier worden bemonsterd het hele jaar door seizoensgebonden variaties in temperatuur en andere klimatologische omstandigheden. Als de tijd en middelen het toelaten, kunnen dezelfde bodemmonsters worden verwerkt onder een reeks verschillende temperaturen om isolatie van een breder scala aan gisten die deze bodems bewonen mogelijk te maken.

Hoewel cultuuronafhankelijke methoden cruciaal zijn voor het ophelderen van grootschalige patronen in de diversiteit van omgevingsschimmels, zijn ze niet voldoende informatief voor gerichte groepen schimmels zoals gisten. Het gebruik van cultuurafhankelijke isolatie maakte een uitgebreid onderzoek mogelijk naar de wereldwijde bodemgistdiversiteit en zijn voorspellers9. Hoewel de metagenomics-studie uitgevoerd door Tedersoo en collega's wereldwijde voorspellers en patronen in bodemschimmeldiversiteit identificeerde, kon de mate waarin deze bevindingen specifiek van toepassing zijn op gistdiversiteit niet worden opgehelderd2. Tedersoo en collega's identificeerden de gemiddelde jaarlijkse neerslag als een belangrijke klimatologische aanjager van de diversiteit van bodemschimmels wereldwijd2. Deze studie vond een vergelijkbare correlatie tussen gemiddelde jaarlijkse neerslag en kweekbare gistdiversiteit in de wereldwijde bodems, wat benadrukt dat cultuurafhankelijke methoden de bevindingen van high-throughput sequencingbenaderingen kunnen aanvullen en uitbreiden9.

De toevoeging van chlooramfenicol is een belangrijke stap in de bereiding van zowel vaste als vloeibare media om schimmelgroeiinterferentie door bacteriën te voorkomen. De toevoeging van chlooramfenicol aan vloeibare media is cruciaal omdat het gebrek aan antibiotica de bacteriën in de bodem zal laten fermenteren. Dit zal leiden tot de productie van gassen die microcentrifugebuizen of 13 ml kweekbuizen die worden gebruikt tijdens bodemincubatie in het protocol met geweld openen. Als bacteriële besmetting in chlooramfenicol dat agar / bouillon bevat een probleem is, kan chlooramfenicol worden vervangen of aangevuld met sterkere antibiotica. Bij het isoleren van A. fumigatus uit de bodem kan SD-bouillon worden vervangen door een Tween 20-oplossing (0,2 M NaCl met 1% Tween 20) om de hydrofobe A. fumigatus conidia35,36 te helpen suspensie. Na suspensie kan 100 μL op SD-agar worden geplateerd en bij 50 °C worden geïncubeerd.

Aspergillus fumigatus groeit snel en sporuleert overvloedig wanneer het alleen wordt geïncubeerd op zowel SD-agar- als MEA-media tussen 22 °C en 50 °C. Afhankelijk van welke andere thermotolerante soorten in het bodemmonster aanwezig zijn, kunnen de groei en sporulatie van A. fumigatus echter worden belemmerd (figuur 3A,D). In een dergelijke situatie kunnen één tot meerdere subculturerende stappen nodig zijn om een zuivere kolonie te verkrijgen voor latere oogst en karakterisering.

De fragmentanalyse van A. fumigatusstammen in figuur 5 werd uitgevoerd met behulp van het programma Osiris. Verschillende PCR-artefacten zijn gemarkeerd in figuur 5C en worden in detail besproken door De Valk et al.30. B-1 stotterpieken met kortere herhaalwaarden worden veroorzaakt door strandverschuiving tijdens de synthese van de antisense streng door het DNA-polymerase. N-1 pieken treden op als de DNA-concentratie te hoog is tijdens PCR. De aanbevolen DNA-concentratie is 0,1 ng zoals vermeld in het bovenstaande protocol. Een ander artefact is kleurstofbloedingen die kunnen worden verholpen met behulp van fluorescerende labels met niet-overlappende absorptiegolflengten. De fluorescerende labels 6-FAM, HEX en ATTO550, evenals de LIZ600-kleurstofstandaard, genereren bijvoorbeeld verschillende fragmentpieken (figuur 5). Ten slotte, om off-scale pieken te voorkomen, verdun elke PCR-reactie (in dit geval was het ~ 50x verdunning) voorafgaand aan capillaire elektroforese. Om de fluorescentie van de ongebruikte voorwaartse primers in het reactiemengsel verder te verminderen, halveert u de voorwaartse primerconcentraties ten opzichte van de omgekeerde primers bij het maken van de mastermix.

De hoge doorvoer en het conservatieve karakter van dit protocol zorgt voor een relatief snelle en gemakkelijke verwerving van veel gisten en schimmels uit de bodem. Er zijn echter twee belangrijke beperkingen aanwezig met de steekproefmethode. Ten eerste werden de morfologische kenmerken van gistkolonies gekweekt uit de bodem gebruikt om te selecteren op unieke soorten. Deze werden vervolgens gesubcultureerd en gebruikt voor soortidentificatie via ITS-sequencing. Dit werd gedaan om de representatie van aanwezige gistsoorten te maximaliseren. Gistsoorten die vergelijkbare of identieke morfologieën deelden aan de geselecteerde kolonies, kunnen echter niet worden gesubcultureerd. Ten tweede, tijdens A. fumigatus isolatie, omdat slechts één individuele kolonie per bodemmonster wordt geselecteerd, zal de aanwezigheid van meerdere individuen in het bodemmonster worden gemist. Dit kan leiden tot een ondervertegenwoordiging van de werkelijke genetische diversiteit in de steekproefpopulatie, aangezien unieke genotypen die in hetzelfde bodemmonster aanwezig zijn, niet zullen worden verzameld. Om dit probleem te verminderen, kunnen tijdens de streak voor een enkele koloniestap na de eerste kweek op vaste media verschillende enkele kolonies worden verzameld om extra genotypen te verkrijgen. Het kleine volume grond dat per monster wordt gebruikt, helpt deze bemonsteringsbeperking te minimaliseren in vergelijking met methoden die grotere hoeveelheden grond per monster gebruikten.

Het gebruik van dit high-throughput en arbeidsefficiënte protocol voor de isolatie van gist en schimmel zal het aantal individuen binnen de bodempopulatie verhogen terwijl minder inspanning per monster wordt gebruikt. De toename van de statistische kracht zal een beter beeld geven van kweekbare gistgemeenschappen in de bodem en helpen bij het karakteriseren van bodempopulaties van A. fumigatus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgments

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) en McMaster University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. The Yeasts: A Taxonomic Study. , Elsevier. (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

Tags

Biologie Nummer 183 Gistdiversiteit Aspergillus fumigatus zuivere cultuur mormotypering DNA-barcoding microsatelliet genotypering
Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu,… More

Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter