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Biology

Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

Dieses Protokoll ist eine effektive, schnelle Methode, um Hefen und den Schimmelpilz Aspergillus fumigatus aus großen Sätzen von Bodenproben in nur 7 Tagen zu kultivieren. Die Methoden können leicht modifiziert werden, um eine Reihe von Inkubationsmedien und Temperaturen aufzunehmen, die für Experimente benötigt werden.

Abstract

Der Boden beherbergt eine unglaubliche Menge an mikrobiellem Leben, wobei jedes Gramm bis zu Milliarden von bakteriellen, archaealen und Pilzzellen enthält. Mehrzellige Pilze wie Schimmelpilze und einzellige Pilze, die allgemein als Hefen definiert werden, spielen in Bodenökosystemen eine wesentliche Rolle als Zersetzer von organischem Material und als Nahrungsquellen für andere Bodenbewohner. Die Vielfalt der Pilzarten im Boden hängt von einer Vielzahl von klimatischen Faktoren wie Niederschlag und Temperatur sowie von Bodeneigenschaften wie organischer Substanz, pH-Wert und Feuchtigkeit ab. Das Fehlen angemessener Umweltproben, insbesondere in Regionen Asiens, Afrikas, Südamerikas und Mittelamerikas, behindert die Charakterisierung von Bodenpilzgemeinschaften und die Entdeckung neuartiger Arten.

Wir charakterisierten Bodenpilzgemeinschaften in neun Ländern auf sechs Kontinenten anhand von ~ 4.000 Bodenproben und einem im Labor entwickelten Protokoll zur Isolierung von Hefen und Schimmelpilzen. Dieses Protokoll beginnt mit einer separaten selektiven Anreicherung für Hefen und den medizinisch relevanten Schimmelpilz Aspergillus fumigatus in flüssigen Medien unter Hemmung des Bakterienwachstums. Resultierende Kolonien werden dann in feste Medien übertragen und weiterverarbeitet, um Reinkulturen zu erhalten, gefolgt von einer nachgelagerten genetischen Charakterisierung. Die Identität der Hefespezies wird durch Sequenzierung ihrer internen transkribierten Spacer (ITS) -Region des nukleären ribosomalen RNA-Genclusters festgestellt, während die globale Populationsstruktur von A. fumigatus mittels Mikrosatelliten-Markeranalyse untersucht wird.

Das Protokoll wurde erfolgreich angewendet, um Bodenhefe- und A. fumigatus-Populationen in Kamerun, Kanada, China, Costa Rica, Island, Peru, Neuseeland und Saudi-Arabien zu isolieren und zu charakterisieren. Diese Ergebnisse zeigten dringend benötigte Einblicke in globale Muster in der Bodenhefediversität sowie in die globale Populationsstruktur und antimykotische Resistenzprofile von A. fumigatus. In diesem Beitrag wird die Methode zur Isolierung von Hefen und A. fumigatus aus internationalen Bodenproben vorgestellt.

Introduction

Pilze in Bodenökosystemen spielen eine wesentliche Rolle bei der Zersetzung organischer Stoffe, dem Nährstoffkreislauf und der Bodendüngung1. Sowohl kulturunabhängige (d.h. Hochdurchsatz-Sequenzierung) als auch kulturabhängige Ansätze werden häufig bei der Untersuchung von Bodenpilzen 2,3 eingesetzt. Während die große Datenmenge, die durch die Hochdurchsatz-Metabarcode-Sequenzierung generiert wird, nützlich ist, um breit angelegte Muster in der Gemeinschaftsstruktur und -diversität aufzuklären, kann der kulturabhängige Ansatz sehr komplementäre Informationen über die taxonomischen und funktionellen Strukturen von Pilzgemeinschaften sowie spezifischere Profile einzelner Organismen durch nachgelagerte Diversitäts- und Funktionsanalysen aufgrund der Verfügbarkeit reiner Pilzkulturen liefern.

Obwohl sie selten Tausende von Zellen pro Gramm Boden überschreiten, sind Hefen, die allgemein als einzellige Pilze definiert werden, essentielle Zersetzer und Nahrungsquellen für andere Bodenbewohner 4,5. Tatsächlich können Hefen die vorherrschenden Bodenpilze in kalten Biosphären wie der kontinentalen Antarktissein 6,7. Der Boden ist auch ein primäres Reservoir für medizinisch relevante Hefen, die beim Menschen und anderen Säugetieren schwere opportunistische Infektionen verursachen8. Trotz morphologischer Ähnlichkeiten sind Hefearten phylogenetisch vielfältig und kommen unter filamentösen Pilzen in zwei Hauptstämmen, Ascomycota und Basidiomycota, innerhalb des Pilzreichs9 vor. Hefen fehlt eine definierende DNA-Signatur am pilzlichen Barcoding-Gen, der internen transkribierten Spacer-Region (ITS) des nukleären ribosomalen RNA-Genclusters10, was sie in metagenomischen Untersuchungen nicht von anderen Pilzen unterscheidbar macht und daher den Einsatz kulturabhängiger Methoden zur Isolierung von Hefearten erfordert.

Das folgende Protokoll wurde implementiert, um Bodenhefegemeinschaften von neun Ländern zu charakterisieren und globale Trends und Muster in der Bodenhefediversitätzu identifizieren 9,11,12. Metagenomik-Ansätze sind von begrenztem Nutzen bei der Untersuchung von Zielgruppen von Organismen wie Hefen 2,3. Aufgrund ihrer phylogenetischen Vielfalt können Hefen allein aufgrund der DNA-Sequenz nicht von anderen Pilzen unterschieden werden. Daher erfordert die Untersuchung von Hefepopulationen die fortgesetzte Verwendung einer kulturabhängigen Isolation. Die Kultivierung ist jedoch oft deutlich zeitaufwendiger und erfordert mehr Personal, um die Experimente durchzuführen. Daher wurde das Protokoll für eine schnellere Verarbeitung mit begrenztem Personal optimiert und optimiert. Der Hauptvorteil der Kultivierung besteht darin, dass die identifizierten Hefearten lebende Hefen und keine toten sind und daher eher echte Bodenbewohner als vorübergehende Zellen in den Böden sind. Es wurde geschätzt, dass etwa 40% der Pilz-DNA im Boden entweder Verunreinigungen aus anderen Umgebungen, extrazellulär sind oder aus Zellen stammen, die nicht mehr intakt sind, was dazu führt, dass Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätze den Pilzreichtum um bis zu 55% überschätzen13. Kulturabhängige Isolierung kann die Identität von Hefearten leicht bestätigen, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass die Reinkultur für die Verwendung in nachgelagerten Analysen gesichert wird. Tatsächlich wurden Reinkulturen von 44 mutmaßlichen neuen Hefearten unter Verwendung dieses Bodenisolationsprotokolls identifiziert, das die Verwendung einer Reihe von Methoden zur detaillierten Untersuchung ihrer taxonomischen und funktionellen Eigenschaftenermöglichte 14.

Das folgende Protokoll kann auch verwendet werden, um im Boden vorhandene Formen wie A. fumigatus zu isolieren. Aspergillus fumigatus ist ein thermophiler und saprophytischer Schimmelpilz mit einer weiten, globalen Verbreitung im Boden15. Es wurde aus zahlreichen klinischen und nicht-klinischen Umgebungen isoliert. Nicht-klinische Probenahmen umfassen üblicherweise Luft, organische Ablagerungen (Kompost, Sägestaub, Tulpenzwiebelabfälle) und Boden (landwirtschaftliche, gartenbezogene und natürliche Böden) 16,17,18,19. Aspergillus fumigatus ist ein humaner opportunistischer Erreger, der eine Reihe von Infektionen verursacht, die zusammen als Aspergillose bezeichnet werden und über 8 Millionen Menschen weltweitbetreffen 16,20. Etwa 300.000 Menschen auf der ganzen Welt leiden an invasiver Aspergillose, der schwersten Form der Aspergillose16. Abhängig von Faktoren wie der Patientenpopulation, dem Infektionsort und der Wirksamkeit der antimykotischen Therapie kann die Sterblichkeitsrate bis zu 90% betragen. In den letzten Jahrzehnten hat die Resistenz gegen antimykotische Therapien zugenommen, was globale Überwachungsbemühungen sowohl in klinischen als auch in Umweltpopulationen erfordert, um diese Resistenzgenotypen21,22,23 zu verfolgen. Aufgrund seiner Fähigkeit, bei Temperaturen von über 50 ° C zu wachsen, kann diese Temperatur genutzt werden, um A. fumigatus-Isolate aus dem Boden mit kulturabhängigen Methoden auszuwählen. Aspergillus fumigatus-Isolate werden üblicherweise an neun hochpolymorphen STR-Loci (Short Tandem Repeat) genotypisiert, von denen gezeigt wird, dass sie eine hohe Unterscheidungskraft zwischen den Stämmenaufweisen 24. Diese STR-Genotypen können mit anderen zuvor untersuchten Populationen verglichen werden, um die Ausbreitung von A. fumigatus-Genotypen, einschließlich Arzneimittelresistenzgenen, auf der ganzen Welt zu verfolgen.

Im Folgenden beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Isolation von Hefen und A. fumigatus aus Bodenproben in kulturabhängiger Weise. Abhängig von der Menge an Boden, die pro Probe erhalten wird, können die Bodenproben zwischen den beiden Protokollen geteilt werden. Im Vergleich zu ähnlichen Methoden, die Hefe und A. fumigatus aus dem Boden isolieren, verwendet dieses Protokoll 10x weniger Boden pro erhaltenem Isolat. Studien, die versuchen, A. fumigatus aus dem Boden zu isolieren, erfordern zwischen 1 und 2 g Boden pro Isolat, während dieses Protokoll nur 0,1-0,2 g Boden18,19,25 erfordert. Dieses Protokoll verwendet kleinere Kunststoffe und Behälter, die das Hochdurchsatzdesign erleichtern. Daher kann eine größere Anzahl von Proben mit weniger Platz für Geräte wie Inkubatoren und Walzentrommeln verarbeitet werden. Bodenproben können in nur 7 Tagen vollständig verarbeitet werden, um Isolate zu erhalten. Dieses Protokoll wurde optimiert, um die Verarbeitung von bis zu 150-200 Proben pro Tag und Person zu ermöglichen.

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Protocol

HINWEIS: Alle Schritte, bei denen internationale Bodenproben und/oder A. fumigatus-Sporen und Myzelien verwendet werden, müssen in einer Biosicherheitskabine für Organismen der Stufe 2 (BSCII) gearbeitet werden.

1. Isolierung von Hefe aus dem Boden

  1. Herstellung von antibakteriellen und antimykotischen Lösungen
    1. Suspendieren Sie Chloramphenicolpulver in 70% Ethanol, um eine 50 g / L Stammlösung herzustellen. Durch Spritzenfiltration sterilisieren und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Dieses Antibiotikum verhindert das Wachstum der meisten Bakterien während der Bodenhefe-Isolierung. Da Chloramphenicol-resistente Bakterien noch wachsen können, muss die Koloniemorphologie bei der Unterscheidung von Hefen und Bakterien sorgfältig berücksichtigt werden. Bei der Arbeit mit Böden, die im Verdacht stehen, antibiotikaresistente Bakterienstämme zu enthalten, können den Medien zusätzliche Antibiotika zugesetzt werden. Bakterielle Kontamination in chloramphenicol-ergänzten Medien war kein Problem bei der Isolierung von Hefen aus Umweltböden.
    2. Suspend Benomylpulver in DMSO, um eine 5 g / L Stammlösung herzustellen. Durch Spritzenfiltration sterilisieren und bei 4 °C lagern.
      HINWEIS: Dieses selektive Antimykotikum verhindert das Wachstum der meisten fadenförmigen Pilze, ohne das Hefewachstum während der Bodenhefeisolierungzu beeinträchtigen 26,27.
  2. Vorbereitung von Nährmedien und Sterilgutgeräten
    1. Um YEPD (Hefeextrakt-Pepton-Dextrose) Brühe herzustellen, fügen Sie 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton und 20 g Dextrose zu 1 L doppelt destilliertem Wasser hinzu. Gut vermischt umrühren und 40 min bei 121 °C autoklavieren. Bis zum Gebrauch bei Raumtemperatur lagern.
    2. YEPD festes Agarmedium
      1. Mischen Sie 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 20 g Dextrose und 20 g Agar in 1 L Wasser. Gut rühren zum Mischen und Autoklavieren für 40 min bei 121 °C.
      2. Nach ausreichendem Abkühlen 1 ml Chloramphenicol und Benomyl aus Stammlösungen hinzufügen, um die Endkonzentrationen der beiden antimikrobiellen Mittel auf 50 mg/L bzw. 5 mg/L zu erhöhen.
      3. Unter Rühren gut vermischen und in Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm gießen. Bei Raumtemperatur über Nacht einwirken lassen und bis zum Gebrauch bei 4 °C lagern.
        HINWEIS: Aus 1 L YEPD können ca. 40 Platten gegossen werden.
    3. Sterilisieren Sie Holz-Applikatorstäbchen mit einfacher Spitze und wiederverwendbare Zellstreuer durch Autoklavieren und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.
  3. Inkubation von Erde in flüssiger Brühe
    1. Bereiten Sie einen Satz steriler 13-ml-Kulturröhrchen vor, indem Sie sie mit der Bodenproben-ID kennzeichnen.
    2. Mit einer serologischen Pipette 5 ml YEPD-Brühe mit Chloramphenicol und Benomyl in jede Tube geben.
    3. Wenn Sie in einem BSCII arbeiten, übertragen Sie ~ 0,1 g Erde in das entsprechende Kulturrohr mit einem sterilen, hölzernen Applikator mit glatter Spitze.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jede Bodenprobe einen frischen Applikator und verwerfen Sie ihn sofort nach der Verwendung, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
    4. Verschließen Sie das Rohr sicher bis zum ersten Anschlag, um ein Verschütten zu verhindern, aber dennoch den Luftaustausch während der Inkubation zu ermöglichen. Inkubieren Sie die Kulturröhrchen in einer Walzentrommel für 24 h bei einer Temperatur, die als optimal für die Maximierung des Hefewachstums angesehen wird.
      HINWEIS: Die Inkubationstemperatur sollte auf der Grundlage der mittleren Jahrestemperatur des Herkunftslandes der Bodenproben festgelegt werden. So wurden beispielsweise bei der Isolierung von Bodenhefen aus Island die Kulturröhren bei 14 °C inkubiert, während Böden aus Saudi-Arabien bei 30 °C inkubiert wurden. Aufgrund des langsameren Hefewachstums bei niedrigeren Temperaturen muss die Inkubationszeit möglicherweise auf bis zu 72 h verlängert werden.
  4. Übertragen Sie den Überstand auf das feste Medium.
    1. Beschriften Sie diese mit dem Satz YEPD + Chloramphenicol + Benomylagarplatten, der in Schritt 1.2 hergestellt wurde, mit der Bodenproben-ID.
    2. Entfernen Sie die in Schritt 1.3 vorbereiteten Kulturröhrchen von der Walzentrommel. Arbeiten Sie in einem BSCII und wirbeln Sie die Röhre kurzzeitig um, um Bodenpartikel und Zellen, die sich möglicherweise unten abgesetzt haben, wieder in die Suspension zu ziehen.
    3. Übertragen Sie mit einer Mikropipette 100 μL des Überstands auf eine Platte. Verwenden Sie einen sterilen, wiederverwendbaren Zellstreuer, um die Flüssigkeit gründlich und gleichmäßig über die Agaroberfläche zu verteilen.
      HINWEIS: Das Arbeiten in Sätzen von 10 Proben kann diesen Prozess erheblich beschleunigen. Den Überstand zuerst auf 10 Platten pipettieren und dann verteilen. Verwenden Sie für jede Probe einen frischen Streuer, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
    4. Stapeln Sie die Platten in Plastiktüten, versiegeln Sie sie und inkubieren Sie sie 2-3 Tage lang kopfüber bei der gleichen Temperatur, die zuvor für die Inkubation von Flüssigbrühe verwendet wurde, bis mikrobielles Wachstum sichtbar ist.
  5. Nachweis von Hefen und Streifen für einzelne Kolonien
    1. Nachdem Sie eine ausreichende Inkubationszeit (typischerweise 2-3 Tage, aber bei niedrigeren Temperaturen länger dauern können) eingeplant haben, untersuchen Sie die Platten in einem BSCII auf Hefewachstum. Suchen Sie nach cremigen, runden, matten Hefen, die sich leicht von Bakterien- und Schimmelpilzkolonien unterscheiden lassen.
      HINWEIS: Einige Hefen produzieren farbige Pigmente und können schwarz / braun, gelb oder rot erscheinen, aber ihre allgemeine Kolonietextur und -form würde nicht pigmentierten Hefen ähneln.
    2. Wählen Sie aus jeder Platte eine hefeartige Kolonie für die weitere Verarbeitung aus.
      HINWEIS: Wenn mehr als eine Art von Morphologie auf einer einzelnen Platte beobachtet wird, wählen Sie eine repräsentative Kolonie für jeden morphologischen Typ aus.
    3. Übertragen Sie jede ausgewählte Kolonie mit sterilen, einfachen Applikatorstäbchen aus Holz auf eine frische YEPD + Chloramphenicol + Benomylplatte und einen Streifen für einzelne Kolonien. Führen Sie drei separate Streifen aus.
      1. Streichen Sie mit einem Applikatorstab über ein Drittel der Platte hin und her. Beginnen Sie den zweiten und dritten Streifen, indem Sie den Applikator einmal über den vorhergehenden Streifen streichen. Verwenden Sie für jeden Streifen einen neuen Applikatorstick.
        HINWEIS: Verwenden Sie eine Platte pro Isolat. Entsorgen Sie Applikatoren sofort nach der Verwendung, um eine Kreuzkontamination zwischen den Proben zu vermeiden.
    4. Stapeln Sie die Platten in Plastiktüten, versiegeln Sie sie und inkubieren Sie sie 2-3 Tage lang kopfüber bei der gleichen Temperatur, die zuvor verwendet wurde, bis einzelne Kolonien sichtbar werden.
  6. Identifizierung von Hefearten mittels ITS-Sequenzierung
    1. Wählen Sie eine gut getrennte, einzelne Kolonie pro Bodenisolat und Subkultur auf einer frischen YEPD + Chloramphenicol + Benomylplatte, um mehr Zellen zu erhalten. Inkubieren Sie für 2-3 Tage bei der gleichen Temperatur, die zuvor verwendet wurde.
    2. Ernten Sie die frisch gewachsenen Zellen und suspendieren Sie sie in -80 ° C Gefrierröhrchen mit 1 ml sterilisiertem 30% Glycerin in doppelt destilliertem Wasser, um Zellsuspensionen herzustellen. Halten Sie diese Suspensionen bei -80 °C als Standardlösungen.
    3. Verwenden Sie frische Zellen, um eine Kolonie-PCR (Polymerase-Kettenreaktion) mit den Grundierungen ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGGG 3') und ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') durchzuführen, um das pilzliche Barcoding-Gen, ITS9, zu amplifizieren. Verwenden Sie die folgenden Thermozyklusbedingungen: einen ersten Denaturierungsschritt bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen von (i) 95 °C für 30 s, (ii) 55 °C für 30 s und (iii) 72 °C für 1 min.
      HINWEIS: Die Colony PCR hat eine hohe Erfolgsquote und eine schnellere Bearbeitungszeit als die DNA-Extraktion mit anschließender PCR.
    4. Wenn die Kolonie-PCR für einen Stamm wiederholt ausfällt, extrahieren Sie die DNA mit dem Protokoll der Wahl und führen Sie eine ITS-PCR mit extrahierter genomischer DNA als Vorlage durch (verwenden Sie die gleichen Thermocycling-Bedingungen wie oben).
      HINWEIS: Eine relativ kostengünstige DNA-Extraktion auf Chloroformbasiswird empfohlen 28.
    5. Führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch, um die DNA-Sequenz der amplifizierten ITS-Region für jeden Stamm zu bestimmen.
    6. Vergleichen Sie die erhaltene ITS-Sequenz der Hefestämme mit Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie NCBI GenBank und UNITE hinterlegt sind, um die Artenidentität festzustellen.

2. Isolierung von Aspergillus fumigatus aus dem Boden

  1. Bereiten Sie 1 ml sterile Sabouraud-Dextrose-Brühe (SDB) vor, die mit dem Antibiotikum Chloramphenicol pro Bodenprobe ergänzt wird.
    1. Fügen Sie 10 g Pepton und 20 g Dextrose zu 1 L destilliertem Wasser hinzu. Autoklav bei 121 °C für 40 min.
    2. Lassen Sie das SDB auf ~ 50 ° C abkühlen, fügen Sie 1 ml 50 g / L Chloramphenicol hinzu, um die Konzentration auf 50 mg / L zu bringen.
      HINWEIS: Chloramphenicol wird wie oben beschrieben für die Hefeisolierung hergestellt. Neben der Hemmung des Bakterienwachstums verhindert Chloramphenicol auch die Produktion von Gas aus Bakterien, das dazu führt, dass sich die Röhrchen während des in Schritt 2.2 beschriebenen Inkubationsschritts öffnen.
    3. Aseptisch aliquotiert 1 ml SDB in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen pro Bodenprobe mit einer mechanischen Pipette.
  2. Fügen Sie Erde zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen hinzu.
    1. Verlegen Sie eine Bankschicht oder eine saugfähige Polsterung in einem BSCII, um die Entsorgung von verschüttetem Boden zu erleichtern.
    2. Übertragen Sie mit autoklavierten Applikatorstäben etwa 0,1 g Erde in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das 1 ml SBD enthält. Schließen Sie die Röhre und den Vortex. Inkubieren Sie den suspendierten Boden bei 50 °C für 3 Tage.
      HINWEIS: Ein Schütteln während der Inkubation ist nicht erforderlich.
  3. Myzelernte von bodengeimpfter Brühe
    1. Bereiten Sie Malzextrakt-Agar (MEA) -Platten vor.
      1. Pro Liter MEA: 20 g Malzextrakt, 20 g Dextrose, 6 g Pepton und 15 g Agar zu 1 L destilliertem Wasser hinzufügen. Autoklav bei 121 °C für 40 min.
      2. Lassen Sie das MEA auf ~ 50 ° C abkühlen, und fügen Sie dann 1 ml 50 g / L Chloramphenicol hinzu, um eine Endkonzentration von 50 mg / L zu erreichen.
    2. Übertragen Sie die Myzelien aus der bodengeimpften Brühe auf MEA-Platten.
      1. Identifizieren Sie Bodeninokule, die sichtbares Myzelwachstum an der SDB-Luftgrenze aufweisen.
      2. Verwenden Sie sterilisierte Applikatorstäbe mit einfacher Holzspitze, um die Myzelie in die Mitte einer MEA-Platte zu übertragen. Inkubieren Sie die MEA-Platten bei 37 °C für 3 Tage.
  4. Selektion von Myzelien mit morphologischen Eigenschaften von A. fumigatus.
    1. Identifizieren Sie Schimmelpilzkolonien, die charakteristische morphologische Eigenschaften von A. fumigatus aufweisen (grünes Wildleder wie Wachstum).
    2. Wenn Sie in einem BSCII arbeiten, verwenden Sie sterilisierte Applikatorstäbchen mit einfacher Holzspitze oder eine Impfschleife, um Konidien / Myzelien zu ernten, indem Sie die Oberfläche einmal abkratzen. Übertragen Sie die Sporen / Myzelien in die Mitte einer MEA-Platte, indem Sie für einzelne Kolonien auf das Agar streifen. 2 Tage bei 37 °C inkubieren.
      HINWEIS: Da mehrere A. fumigatus-Stämme und / oder andere Pilze auf der Platte vorhanden sein können, ist es wichtig, nach einzelnen Kolonien zu streifen. Das Einzelkolonie-Streifenprotokoll in Schritt 1.5.3 im Hefeisolationsprotokoll kann verwendet werden.
    3. Subkulturieren Sie mit einem sterilen Applikatorstab oder einer Impfschleife eine einzelne Kolonie, die in Schritt 2.4.1.2 erzeugt wurde, auf MEA, indem Sie die Kolonie einmal streifen. Verteilen Sie die geernteten Sporen in der Mitte des Tellers. 2 Tage bei 37 °C inkubieren.
  5. Ernte von A. fumigatus Sporen/Myzelien zur Kulturlagerung
    1. Bereiten Sie eine sterile 30% ige Glycerinlösung vor (für eine 100 ml Lösung fügen Sie 30 ml 100% Glycerin hinzu, gemischt mit 70 ml doppelt destilliertem Wasser, sterilisiert bei 121 ° C für 40 min).
    2. Wenn Sie in einem BSCII arbeiten, verwenden Sie eine p1000-Pipette, um 1 ml der 30% igen Glycerinlösung abzusaugen. Geben Sie die 1 ml Glycerinlösung auf die A. fumigatus-Kolonie ab, um Sporen / Myzelien zu ernten.
      1. Aufgrund der Hydrophobie von A. fumigatus Sporen/Myzelien verwenden Sie die Pipettenspitze, um eine dicht sporulierte Region der Platte zu zerkratzen.
        HINWEIS: Wenn Glycerin im Kratzer abgegeben wird, würde das Glycerin an der Kratzfläche haften, anstatt über den Agar zu rollen.
      2. Geben Sie das Glycerin langsam auf den Kratzbereich ab, um die Sporen zu entfernen und in der Glycerinlösung zu suspendieren.
      3. Nach vollständiger Abgabe die Platte leicht kippen und die Glycerinspore / Myzeliensuspension abpumpen.
        HINWEIS: Etwa 750 bis 800 μL werden abgesaugt.
      4. Das Aspirat in ein steriles Gefrierrohr geben und bei -80 °C lagern. Erstellen Sie bei Bedarf Arbeitsmaterial, indem Sie die Schritte 2.5.2.1 bis 2.5.2.4 wiederholen.
  6. Phänotypische Identifizierung von A. fumigatus-Stämmen
    1. Erzeugen Sie mit dem aus Schritt 2.5.2 erstellten Sporenstock eine 100-fache Verdünnung in Wasser.
      1. 10 μL der Myzel- und Sporenbestände aspirieren und in 990 μL Wasser dosieren. Wirbeln Sie die Aufhängung ein.
    2. Dosieren Sie 10 μL der verdünnten Sporensuspension auf einen Standard-Objektträger.
    3. OPTIONAL: Färben Sie die Myzel- und Sporensuspension mit Methylenblau.
      1. Um mit Methylenblau zu färben, fixieren Sie die Konidien und Konidiophoren auf dem Objektträger, indem Sie das Dia über einen Bunsenbrenner führen, bis es trocken ist.
      2. Methylenblau für 1-2 min auftragen und mit Wasser abwaschen.
      3. Trocknen Sie den Objektträger mit Löschpapier.
    4. Mit einem zusammengesetzten Mikroskop bei 400-facher Vergrößerung können Sie die Suspension betrachten und Konidiophoren lokalisieren. Vergleichen Sie die beobachtete Konidiophoremorphologie mit der A. fumigatus conidiophore Morphologie.
  7. Molekulare Identifizierung von A. fumigatus-Stämmen
    1. Extrahieren Sie DNA aus jedem Isolat nach gängigen DNA-Extraktionsprotokollen für Pilze.
    2. Unter Verwendung von Primern, die für die Aspergillus-β-Tubulin-Gene (β-tub1 und β-tub4) spezifisch sind, führen Sie eine PCR durch und erhalten Sie die Sequenz für die amplifizierten Produkte gemäß den von Alcazar-Fuoli et al.17 beschriebenen Protokollen.
      1. Vergleichen Sie die erhaltenen Sequenzen mit Sequenzen, die in öffentlichen Datenbanken wie NCBI GenBank mit BLAST hinterlegt sind.
      2. Vergewissern Sie sich, dass die Dehnungssequenzen mit den A. fumigatus-Sequenzen in der Datenbank übereinstimmen.
    3. Alternativ zu Schritt 2.7.2 wird eine Multiplex-PCR-Reaktion durchgeführt, die auf die A. fumigatus-Paarungstypen MAT1-1 und MAT1-229 abzielt.
      1. Verwenden Sie die folgenden drei Primersequenzen in der Multiplex-PCR-Reaktion: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGGGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3′.
      2. Verwenden Sie die folgenden Thermocycler-Parameter: 5 min bei 95 °C, 35 Zyklen à 30 s bei 95 °C, 30 s bei 60 °C und 1 min bei 72 °C vor letzten 5 min bei 72 °C.
      3. Führen Sie die Gelelektrophorese durch, um die Produkte zu identifizieren. Suchen Sie nach 834 bp MAT-1 oder 438 bp MAT1-2. Verwenden Sie A. fumigatus-Stämme , die die Verstärkung des Paarungstyps als Positiv- und Negativkontrollen bestätigt haben.
  8. Mikrosatelliten-Genotypisierung von A. fumigatus-Stämmen durch Fragmentanalyse
    HINWEIS: Obwohl die unten aufgeführten Schritte die Genotypisierung von A. fumigatus an neun Mikrosatelliten (STR) -Loci weitgehend abdecken, wurden nur einige wichtige Überlegungen hervorgehoben. Einzelheiten zur A. fumigatus STR-Genotypisierung finden Sie in De Valk et al.24,30.
    1. Bereiten Sie drei PCR-Multiplex-Master-Mixe mit den zuvor von De Valk et al.24 beschriebenen STRAf-Primern vor.
      1. Fluoreszierende Markierung von Vorwärtsprimern zur Bestimmung der Fragmentgröße durch Kapillarelektrophorese. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration der Vorwärtsprimer die Hälfte (0,5 μM) der Konzentration der Reverse-Primer (1 μM) innerhalb des Master-Mixes beträgt.
        HINWEIS: Für die besten Ergebnisse verwenden Sie fluoreszierende Markierungen mit Absorptionswellenlängen, die denen des gewählten Farbstoffstandards entsprechen, der während der Kapillarelektrophorese verwendet wird.
      2. Verwenden Sie Heißstartpolymerase für beste Ergebnisse.
      3. Verwenden Sie eine DNA-Konzentration von 0,1 ng pro Reaktion.
    2. Führen Sie die Multiplex-PCR für jede Belastung mit dem folgenden PCR-Programm durch: 95 °C für 10 min, 40 Zyklen von 95 °C für 30 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 60 s, gefolgt von 72 °C für 10 min und einem Halt bei 4 °C.
    3. Suchen Sie nach verstärkten Produkten durch Gelelektrophorese.
    4. Verdünnen Sie die Produkte auf das gewünschte Niveau (typischerweise ~ 50x), wie von Fragmentanalysespezialisten empfohlen, und führen Sie eine Kapillarelektrophorese durch. Führen Sie drei Durchläufe für jede Dehnung durch, wobei jeder Durchlauf drei gemultiplexte Reaktionen mit drei verschiedenen fluoreszierenden Sonden abdeckt.
    5. Um die richtige Fragmentgröße für jeden der neun STR-Loci zu bestimmen, verwenden Sie eine Software, die zur Fragmentanalyse fähig ist.
      1. Rufen Sie die Rohdaten ab, die bei der Kapillarelektrophorese erhalten wurden. Bewerten Sie die Fragmentgrößen basierend auf dem größten Peak mit der Fragmentanalysesoftware (z. B. Osiris).
      2. Konvertieren Sie die Fragmentgrößen in Wiederholungszahlen für jeden der neun Loci. Verwenden Sie die Fragmentgrößen der Wiederholungsnummern des Referenzstamms Af293, wie zuvor von De Valk et al.24 beschrieben.
        HINWEIS: Leichte Abweichungen in der Fragmentgröße können zwischen verschiedenen Kapillarelektrophoreseplattformen auftreten. Daher ist es wichtig, einen gemeinsamen Referenzstamm (und eine interne Leiter) mit bekannter Fragmentgröße für jeden der neun Loci für Genotypisierungsstämme anzugeben.

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Representative Results

Hefe-Isolierung vom Boden
Das obige Hefe-Isolationsprotokoll wurde umgesetzt, um Hefen aus Bodenproben von 53 Standorten in neun Ländern zu kultivieren 9,12. Insgesamt wurden 1.473 Hefestämme aus 3.826 Bodenproben isoliert. Angesichts der unterschiedlichen klimatischen Bedingungen der neun Ursprungsländer wurde die beste Inkubationstemperatur für jedes Land auf der Grundlage seiner mittleren Jahrestemperatur ermittelt (Tabelle 1). Angesichts des langsameren Hefewachstums bei 14 °C wurden Bodenproben aus Island auf einer Walzentrommel für weitere 48 h (insgesamt 96-120 h) inkubiert. Nach 2-3 Tagen Inkubation auf festem Medium war das mikrobielle Wachstum auf den Platten für alle Proben sichtbar (Abbildung 1A). Eine zufällig ausgewählte Kolonie für jede auf einer Platte vorhandene Hefemorphologie wurde für einzelne Kolonien auf frischen Platten gestreift (Abbildung 1B).

Die Rate der erfolgreichen Hefe-Isolierung war von Land zu Land unterschiedlich (Tabelle 1). Zum Beispiel wurden 97 Hefestämme aus 562 saudi-arabischen Bodenproben (17,3%) kultiviert, während 261 Hefen aus 300 kanadischen Bodenproben (87%) kultiviert wurden. Es sollte eine Verdünnungsanalyse durchgeführt werden, um festzustellen, ob ausreichende Bodenproben durchgeführt wurden, um genaue Schätzungen der wahren Hefediversität an den beprobten Standorten zu erhalten. Eine Beispielanalyse der Verdünnung für jedes Land wurde vorgeformt, wobei der Shannon-Diversitätsindex als Maß für die Bodenhefediversität verwendet wurde (Abbildung 2). Die resultierenden Verdünnungskurven näherten sich der Sättigungsasymptote, was darauf hindeutet, dass zusätzliche Probenahmen wahrscheinlich nicht zu mehr Hefediversität geführt hätten.

Die Sequenzierung der ITS-Region ergab, dass die 1.473 Hefeisolate in 134 verschiedene Arten eingeteilt werden können. Dazu gehörten 90 bekannte Arten und 44 potenziell neuartige Arten. Wir haben ein Mixed-Effects-Modell angewendet, um Prädiktoren für die globale kultivierbare Bodenhefediversität zu identifizieren, wie sie durch den Shannon-Diversitätsindex31 quantifiziert wurde. In diesem Modell wurden der mittlere jährliche Niederschlag, die mittlere Jahrestemperatur, die Höhe und die Entfernung der Probenahmestellen zum Äquator als feste Effekte festgelegt, während das Stichprobenland als Zufallseffekt festgelegtwurde 9. Dieses Modell identifizierte den mittleren jährlichen Niederschlag, der signifikant mit dem Shannon-Diversitätsindex korreliert war (p = 0,012), während keine signifikanten Korrelationen zwischen anderen Prädiktorvariablen und dem Shannon-Diversitätsindex9 gefunden wurden.

Um dieses kulturbasierte Protokoll mit kulturunabhängigen Methoden zu vergleichen, verglichen wir diese Ergebnisse mit einer früheren Studie von Tedersoo und Kollegen, die die globale Vielfalt von Bodenpilzen mit Hilfe der Metagenomikuntersuchte 2. Tedersoo und Kollegen führten eine Hochdurchsatzsequenzierung der ITS-Region an DNA durch, die direkt aus Bodenproben von 39 Ländern extrahiert wurde, von denen vier in dieser Studie ebenfalls beprobt wurden, nämlich Kamerun, Kanada, China und Neuseeland. Wir führten BLAST-Suchen durch, um ITS-Sequenzen in beiden Datensätzenzu identifizieren 32, und fanden heraus, dass 26% der ITS-Sequenzen eine signifikante Übereinstimmung (>98,41% Nukleotididentität) im Metagenomik-Datensatz aufwiesen. <3% stimmten jedoch mit einer Pilzsequenz aus demselben Land überein, während die restlichen 23% mit einer Pilzsequenz übereinstimmten, die in einem anderen Land gefunden wurde9. Wir waren erfolgreicher als die Metagenomik-Studie bei der Annotation der ITS-Sequenzen mit der Identität der Hefearten. Tedersoo und Kollegen berichteten von insgesamt 50.589 operativen taxonomischen Pilzeinheiten (OTUs), wobei die Anzahl der Hefe-OTUs nicht bekannt ist. Von diesen Pilz-OTUs wurden 33% lediglich als environmental_sequence (724, 1,4%), uncultured_soil_fungus (2.405, 4,8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1.407, 2,8%) oder uncultured_fungus (11.898, 23,5%) kommentiert.

Aspergillus fumigatus Isolierung aus dem Boden
Nach 3 Tagen Bodeninkubation bei 50 °C in 1 ml SDB in einem Mikrozentrifugenröhrchen können Myzelien gefunden werden, die innerhalb des SDB, auf dem SDB zur Luftgrenze und/oder an den Innenwänden wachsen. Aspergillus fumigatus mycelia wächst typischerweise an der SDB-Luftgrenze, kann aber auch von knapp unter der SDB-Oberfläche geerntet werden. Nach diesem Schritt werden die Myzelien auf MEA übertragen und 3 Tage lang bei 37 °C gezüchtet. Myzelwachstum auf Platten kann nur die für A. fumigatus typische grüne Wildledermorphologie bilden (Abbildung 3A). Häufiger können andere thermotolerante Formen im selben Boden vorhanden sein und mit A. fumigatus auf derselben Platte oder von selbst wachsen (Abbildung3B-D). Die Isolationsraten von Aspergillus fumigatus können zwischen den geografischen Standorten variieren, ähnlich wie bei Bodenhefen. Zum Beispiel wurden in Vancouver, Kanada, 251 Isolate durch diese Methode aus 540 Bodenproben (46,5%) (unveröffentlichte Ergebnisse). Im Gegensatz dazu wurden in Kamerun 51 A. fumigatus-Isolate aus 495 Bodenproben (10,3 %)33 geerntet.

Die Struktur von A. fumigatus conidiophore kann mittels Lichtmikroskopie betrachtet und identifiziert werden. Konidiophoren haben eine Kugel-auf-Stock-Morphologie (Abbildung 4). Darüber hinaus sind A. fumigatus conidiophores uniseriate, wobei die Philalide, die an die Konidienketten gebunden sind, direkt an das sphärische Vesikel gebunden sind. Bei anderen Aspergillus-Arten sind Konidiophoren Biseriate, bei denen die Phialide mit Metulae verbunden sind, die an das Vesikel gebunden sind.

Mehrere Softwareprogramme stehen zur Verfügung, um eine Fragmentanalyse der Rohdaten der Kapillarelektrophorese durchzuführen und das Kapillarelektrophoresespektrum in Fragmentgrößen umzuwandeln. Abbildung 5 ist ein Chromatogramm, das vom Programm Osiris erzeugt wird. Die drei Kanäle, die die Fragmentlängen von A. fumigatus dinucleotid (2A, 2B und 2C), Trinukleotid (3A, 3B und 3C) und Tetranukleotid (4A, 4B und 4C) STR-Loci visualisieren, sind gezeigt. Darüber hinaus werden auch PCR-Artefakte gezeigt, die auftreten, wenn die DNA-Konzentration der Probe während der PCR zu hoch ist. Die höchsten Spitzen jeder Farbe stellen die Fragmentgrößen der drei STR-Loci in diesem Diagramm dar.

Die genetische Variation zwischen A. fumigatus STR-Genotypen kann mit dem R-Paket poppr visualisiert werden. Das R-Skript bruvo.msn erstellt eine paarweise Bruvo-Matrix genetischer Entfernungen zwischen jedem Paar von Genotypen. Diese Matrix wird dann verwendet, um ein Minimum Spanning Network (MSN) zu generieren. Mit dem R-Skript plot_poppr_msn oder imsn kann dann ein hochwertiges MSN generiert werden (Abbildung 6). Eine diskriminatorische Analyse der Hauptkomponenten (DAPC) ist eine weitere Methode, um die genetischen Beziehungen zwischen Stämmen sichtbar zu machen (Abbildung 7). Das R-Skript dapc im R-Paket adegenet wird verwendet, um DAPC auszuführen und kann mit bekannten oder unbekannten Gruppenprioren verwendet werden. Bei unbekannten Gruppenprioren verwendet es K-Means-Clustering, um die wahrscheinliche Anzahl von Gruppen von Individuen zu identifizieren.

Figure 1
Abbildung 1: Isolierung von Hefe aus Bodenproben. (A) Mikrobielles Wachstum ist auf festem Agar nach 2-3 Tagen Inkubation sichtbar. Hefekolonien können unter anderen Pilz- / Bakterienkolonien eingestreut werden. Eine repräsentative Hefekolonie für jeden morphologischen Typ auf einer Platte wird ausgewählt, um für einzelne Kolonien zu streifen. (B) Drei Streifen werden durchgeführt, um einzelne Kolonien von Hefeisolaten zu erhalten. Eine Platte wurde verwendet, um jedes Bodenisolat zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Rarefaktionsanalyse der Bodenprobenahme. In jedem der neun untersuchten Länder nähert sich die Bodenhefediversität, wie sie durch den Shannon-Diversitätsindex quantifiziert wird, der Sättigung, wenn die Anzahl der Bodenproben zunimmt. Diese Figur wurde von 9 adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Aspergillus fumigatus Morphologie auf Sabouraud dextroseagar. (A) Grüne Wildleder-ähnliche A. fumigatus Wachstumsmorphologie. (B-D) A. Fumigatuswachstum mit anderen thermophilen Schimmelpilzen, die in der Bodenprobe vorhanden sind. A. fumigatus conidiation ist in B und D sichtbar reduziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Foto eines Aspergillus fumigatus conidiophore unter einem Lichtmikroskop. Maßstabsleiste = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Osiris-Output von neun Mikrosatelliten-Loci aus einem Aspergillus fumigatus-Stamm . Die Ausgänge entsprechen den (A) Dinukleotid- (2A-, 2B- und 2C-), (B)-Trinukleotid- (3A-, 3B- und 3C-) und (C)-Tetranukleotid-Loci (4A, 4B und 4C). Forward Primer 5' fluoreszierende Markierungen sind: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. Multiplex-Reaktionsprodukte wurden vor der Kapillarelektrophorese 30x verdünnt. Der LIZ600-Farbstoffstandard wurde während der Kapillarelektrophorese verwendet. Die Rohdaten wurden mit der Peak-Analyse-Software Osiris analysiert, die potenzielle Peaks zwischen 60 und 400 bp identifizierte. Mehrere PCR-Artefakte sind Off-Scale-Peaks, die Fluoreszenzblutungen, Stotterspitzen und N-1-Peaks (C) verursachen. Abkürzungen: 6-FAM = 6-Carboxyfluorescein; HEX = Hexachlorfluorescein; STR = kurze Tandemwiederholungen; RFU = relative Fluoreszenzeinheiten; BPS = Basenpaare. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Minimum-Spanning-Netzwerk, das die genetische Verwandtschaft zwischen MLGs von A. fumigatus aus Island und den Nordwest-Territorien in Kanada zeigt. Jeder Knoten stellt eine MLG dar, wobei die Knotengröße der Anzahl der Dehnungen für jede MLG entspricht. Knoten, die genetisch ähnlicher sind, haben dunklere und dickere Kanten, während genetisch weit entfernte Knoten hellere und dünnere Kanten haben. Diese Zahl wurde von 34 adaptiert. Abkürzungen: ISL = Island; NWT = Nordwest-Territorien in Kanada; MLG = Multilocus-Genotyp. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Genetische Clusterbildung unter Verwendung der Diskriminanzanalyse von Hauptkomponenten (DAPC) von isländischen, NWT-, eurasischen, nordamerikanischen und ozeanischen A. fumigatus-Populationen. Isolate wurden an neun Mikrosatellitenloci genotypisiert und klonkorrigiert, insgesamt 1.703 einzigartige Multilocus-Genotypen. Genotypen wurden nach geographischen Ursprüngen eingefärbt. Diese Zahl wurde von 34 adaptiert. Abkürzungen: DAPC = Diskriminanzanalyse der Hauptkomponenten; NWT = Nordwest-Territorien; ISL = Island; CMR = Kamerun; CAN = Hamilton, Ontario, Kanada; BEL = Belgien; FRA = Frankreich; DEU = Deutschland; IND = Indien; NLD = Niederlande; NOR = Norwegen; NZL = Neuseeland; ESP = Spanien; CHE = Schweiz; USA = Vereinigte Staaten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Land Inkubationstemperatur (°C) Bodenproben Hefe-Isolate Bekannte Arten/ Neuartige Arten
Kamerun 30 493 110 10/9
Kanada 23 300 261 34/12
China 23 340 230 23/5
Costa Rica 30 388 95 20/2
Frankreich 23 327 175 12/2
Island 14 316 211 11/0
Neuseeland 23 610 155 14/4
Peru 23 490 139 30/9
Saudi-Arabien 30 562 97 8/1
Gesamt 3826 1473 90/44

Tabelle 1: Isolierung von Bodenhefe aus neun Ländern auf sechs Kontinenten. Die Inkubationstemperatur für Bodenproben aus jedem Land wurde auf der Grundlage der mittleren Jahrestemperatur bestimmt. Die hier vorgestellten Ergebnisse sind von 9,12 adaptiert.

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Discussion

Das für die Isolierung von Hefen und A. fumigatus aus dem Boden entwickelte Protokoll ist eine schnelle und effiziente Methode zur Hochdurchsatz-Bodenbearbeitung und Pilzisolation. Das Protokoll erfordert nur eine geringe Menge Boden (0,1-0,2 g) pro Probe, so dass mehr Standorte mit ähnlichem Aufwand beprobt werden können. Die schnelle Durchlaufzeit stellt sicher, dass die Ergebnisse innerhalb eines kurzen Zeitrahmens erzielt werden können, und lässt Zeit für die Fehlerbehebung und bei Bedarf wiederholte Experimente. Dieses Protokoll kann mit Standardgeräten für Mikrobiologie und Zellkultivierung problemlos in vielen Laborumgebungen repliziert werden. Bei der Isolierung von Hefen oder Schimmelpilzen aus internationalem Boden sind jedoch zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen erforderlich. Alle Einweg-Kunststoffgeräte, wie Kunststoffschalen und Zellstreuer, sollten durch Eintauchen in 10% Bleichmittel, gefolgt von Autoklavieren, sterilisiert werden. Der gebrauchte Bankmantel sollte in einer Plastiktüte versiegelt und vor dem Entsorgen in einem Autoklaven sterilisiert werden.

Zu beachten ist, dass die Anzahl und Identität der mit dem obigen Protokoll isolierten Hefen durch die Inkubationsbedingungen und die verwendeten Medien begrenzt werden kann. Zum Beispiel kann eine 24-Stunden-Inkubation in der Walzentrommel die Isolierung von schnell wachsenden aeroben Hefen gegenüber langsam wachsenden Arten begünstigen. Darüber hinaus kann die Verwendung von nährstoffreichem YEPD-Medium zur Hefeisolierung Hefearten mit unterschiedlichen Nährstoffanforderungen und -präferenzen ausgeschlossen haben. Darüber hinaus erleben die meisten hier untersuchten Standorte das ganze Jahr über saisonale Temperaturschwankungen und andere klimatische Bedingungen. Wenn es Zeit und Ressourcen erlauben, können die gleichen Bodenproben unter einem Bereich unterschiedlicher Temperaturen verarbeitet werden, um die Isolierung einer breiteren Palette von Hefen, die diese Böden bewohnen, zu ermöglichen.

Während kulturunabhängige Methoden für die Aufklärung großräumiger Muster in der Umweltpilzvielfalt von entscheidender Bedeutung sind, sind sie für Pilzgruppen wie Hefen nicht ausreichend informativ. Der Einsatz kulturabhängiger Isolation ermöglichte eine umfassende Untersuchung der globalen Bodenhefediversität und ihrer Prädiktoren9. Während die von Tedersoo und Kollegen durchgeführte Metagenomik-Studie globale Prädiktoren und Muster in der Bodenpilzvielfalt identifizierte, konnte das Ausmaß, in dem diese Ergebnisse speziell auf die Hefediversität zutreffen, nicht geklärtwerden 2. Tedersoo und Kollegen identifizierten den mittleren jährlichen Niederschlag als einen der wichtigsten klimatischen Treiber der Bodenpilzvielfaltweltweit 2. Diese Studie fand eine ähnliche Korrelation zwischen dem mittleren jährlichen Niederschlag und der kultivierbaren Hefevielfalt in globalen Böden und hob hervor, dass kulturabhängige Methoden die Ergebnisse von Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätzenergänzen und erweitern können 9.

Die Zugabe von Chloramphenicol ist ein wichtiger Schritt bei der Herstellung von festen und flüssigen Medien, um eine Beeinträchtigung des Pilzwachstums durch Bakterien zu verhindern. Die Zugabe von Chloramphenicol zu flüssigen Medien ist von entscheidender Bedeutung, da der Mangel an Antibiotika es den im Boden vorhandenen Bakterien ermöglicht, zu fermentieren. Dies wird zur Produktion von Gasen führen, die Mikrozentrifugenröhrchen oder 13-ml-Kulturröhrchen, die während der Bodeninkubation im Protokoll verwendet werden, gewaltsam öffnen. Wenn eine bakterielle Kontamination in Chloramphenicol, das Agar / Brühe enthält, ein Problem darstellt, kann Chloramphenicol durch stärkere Antibiotika ersetzt oder ergänzt werden. Bei der Isolierung von A. fumigatus aus dem Boden kann die SD-Brühe durch eine Tween-20-Lösung (0,2 M NaCl mit 1% Tween 20) substituiert werden, um die hydrophobe A. fumigatus conidia35,36 auszusetzen. Nach der Suspension können 100 μL auf SD-Agar aufgetragen und bei 50 °C inkubiert werden.

Aspergillus fumigatus wächst schnell und sporuliert reichlich, wenn er allein auf SD-Agar- und MEA-Medien zwischen 22 °C und 50 °C inkubiert wird. Je nachdem, welche anderen thermotoleranten Spezies in der Bodenprobe vorhanden sind, können das Wachstum und die Sporulation von A. fumigatus jedoch behindert werden (Abbildung 3A, D). In einer solchen Situation können ein bis mehrere Unterkulturschritte erforderlich sein, um eine reine Kolonie für die anschließende Ernte und Charakterisierung zu erhalten.

Die Fragmentanalyse von A. fumigatus-Stämmen in Abbildung 5 wurde mit dem Programm Osiris durchgeführt. Mehrere PCR-Artefakte wurden in Abbildung 5C hervorgehoben und werden von De Valk et al.30 ausführlich diskutiert. B-1-Stotterspitzen, die kürzere Wiederholungswerte aufweisen, werden durch Strangschlupf während der Synthese des Antisense-Strangs durch die DNA-Polymerase verursacht. N-1-Peaks treten auf, wenn die DNA-Konzentration während der PCR zu hoch ist. Die empfohlene DNA-Konzentration beträgt 0,1 ng, wie im obigen Protokoll angegeben. Ein weiteres Artefakt ist die Farbstoffausblutung, die mit fluoreszierenden Markierungen mit nicht überlappenden Absorptionswellenlängen behoben werden kann. Beispielsweise erzeugen die fluoreszierenden Markierungen 6-FAM, HEX und ATTO550 sowie der LIZ600-Farbstoffstandard unterschiedliche Fragmentspitzen (Abbildung 5). Um Off-Scale-Peaks zu vermeiden, verdünnen Sie schließlich jede PCR-Reaktion (in diesem Fall war es ~ 50x Verdünnung) vor der Kapillarelektrophorese. Um die Fluoreszenz der nicht verwendeten Vorwärtsprimer im Reaktionsgemisch weiter zu reduzieren, halbieren Sie die Vorwärtsprimerkonzentrationen relativ zu den Reverse-Primern, wenn Sie das Master-Mix erzeugen.

Der hohe Durchsatz und die konservative Natur dieses Protokolls ermöglichen eine relativ schnelle und einfache Erfassung vieler Hefen und Formen aus Böden. Es gibt jedoch zwei Haupteinschränkungen bei der Stichprobenmethodik. Zuerst wurden die morphologischen Eigenschaften von Hefekolonien, die aus dem Boden gewonnen wurden, verwendet, um nach einzigartigen Arten zu selektieren. Diese wurden dann subkultiviert und zur Artbestimmung mittels ITS-Sequenzierung verwendet. Dies geschah, um die Repräsentation der vorhandenen Hefearten zu maximieren. Hefearten, die ähnliche oder identische Morphologien wie die ausgewählten Kolonien aufwiesen, können jedoch nicht subkultiviert werden. Zweitens, während der Isolierung von A. fumigatus , da nur eine einzelne Kolonie pro Bodenprobe ausgewählt wird, wird die Anwesenheit mehrerer Individuen innerhalb der Bodenprobe übersehen. Dies kann zu einer Unterrepräsentation der wahren genetischen Vielfalt innerhalb der Stichprobenpopulation führen, da einzigartige Genotypen, die in derselben Bodenprobe vorhanden sind, nicht gesammelt werden. Um dieses Problem zu mildern, können während des Streifens für einen einzelnen Kolonieschritt nach der ersten Kultivierung auf festen Medien mehrere einzelne Kolonien gesammelt werden, um zusätzliche Genotypen zu erhalten. Das geringe Bodenvolumen, das pro Probe verwendet wird, trägt dazu bei, diese Probenahmebeschränkung im Vergleich zu Methoden, bei denen größere Bodenmengen pro Probe verwendet wurden, zu minimieren.

Die Verwendung dieses hochdurchsatz- und arbeitseffizienten Protokolls zur Isolierung von Hefe und Schimmel wird die Anzahl der Individuen innerhalb der Bodenpopulation erhöhen und gleichzeitig weniger Aufwand pro Probe erfordern. Die Zunahme der statistischen Aussagekraft wird ein besseres Bild der kultivierbaren Hefegemeinschaften im Boden liefern und dazu beitragen, die Bodenpopulationen von A. fumigatus zu charakterisieren.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Acknowledgments

Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) und McMaster University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

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Biologie Ausgabe 183 Hefediversität Aspergillus fumigatus Reinkultur Morphotypisierung DNA-Barcoding Mikrosatelliten-Genotypisierung
Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur
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Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

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