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Biology

Isolamento di lieviti e muffe coltivabili dai terreni per studiare la struttura della popolazione fungina

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

Questo protocollo è un metodo efficace e veloce per coltivare lieviti e la muffa Aspergillus fumigatus da grandi serie di campioni di terreno in appena 7 giorni. I metodi possono essere facilmente modificati per adattarsi a una gamma di mezzi di incubazione e temperature necessarie per gli esperimenti.

Abstract

Il suolo ospita un'incredibile quantità di vita microbica, con ogni grammo contenente fino a miliardi di cellule batteriche, archeali e fungine. I funghi multicellulari come muffe e funghi unicellulari, ampiamente definiti come lieviti, svolgono ruoli essenziali negli ecosistemi del suolo come decompositori di materiale organico e come fonti di cibo per altri abitanti del suolo. La diversità delle specie fungine nel suolo dipende da una moltitudine di fattori climatici come precipitazioni e temperatura, nonché dalle proprietà del suolo tra cui materia organica, pH e umidità. La mancanza di un adeguato campionamento ambientale, specialmente nelle regioni dell'Asia, dell'Africa, del Sud America e dell'America centrale, ostacola la caratterizzazione delle comunità fungine del suolo e la scoperta di nuove specie.

Abbiamo caratterizzato le comunità fungine del suolo in nove paesi in sei continenti utilizzando circa 4.000 campioni di suolo e un protocollo sviluppato in laboratorio per l'isolamento di lieviti e muffe. Questo protocollo inizia con l'arricchimento selettivo separato per i lieviti e la muffa clinicamente rilevante Aspergillus fumigatus, in mezzi liquidi mentre inibisce la crescita batterica. Le colonie risultanti vengono quindi trasferite in mezzi solidi e ulteriormente elaborate per ottenere colture pure, seguite dalla caratterizzazione genetica a valle. L'identità delle specie di lievito viene stabilita attraverso il sequenziamento della loro regione interna del distanziatore trascritto (ITS) del cluster genico dell'RNA ribosomiale nucleare, mentre la struttura della popolazione globale di A. fumigatus viene esplorata tramite l'analisi dei marcatori di microsatelliti.

Il protocollo è stato applicato con successo per isolare e caratterizzare le popolazioni di lievito del suolo e A. fumigatus in Camerun, Canada, Cina, Costa Rica, Islanda, Perù, Nuova Zelanda e Arabia Saudita. Questi risultati hanno rivelato approfondimenti tanto necessari sui modelli globali nella diversità del lievito del suolo, nonché sulla struttura della popolazione globale e sui profili di resistenza antifungina di A. fumigatus. Questo documento presenta il metodo per isolare sia i lieviti che A. fumigatus da campioni di suolo internazionali.

Introduction

I funghi negli ecosistemi del suolo svolgono ruoli essenziali nella decomposizione della materia organica, nel ciclo dei nutrienti e nella fertilizzazione del suolo1. Sia gli approcci indipendenti dalla coltura (cioè il sequenziamento ad alto rendimento) che gli approcci dipendenti dalla coltura sono ampiamente utilizzati nello studio dei funghi del suolo 2,3. Mentre la grande quantità di dati generati dal sequenziamento del metabarcodo ad alto rendimento è utile per chiarire modelli su larga scala nella struttura e nella diversità della comunità, l'approccio dipendente dalla cultura può fornire informazioni altamente complementari sulle strutture tassonomiche e funzionali delle comunità fungine, nonché profili più specifici dei singoli organismi attraverso la diversità a valle e le analisi funzionali dovute alla disponibilità di colture fungine pure.

Nonostante raramente superino migliaia di cellule per grammo di terreno, i lieviti, ampiamente definiti come funghi unicellulari, sono decompositori e fonti di cibo essenziali per altri abitanti del suolo 4,5. In effetti, i lieviti possono essere i funghi del suolo predominanti nelle biosfere fredde come l'Antartide continentale 6,7. Il suolo è anche un serbatoio primario di lieviti rilevanti dal punto di vista medico che causano gravi infezioni opportunistiche negli esseri umani e in altri mammiferi8. Nonostante le somiglianze morfologiche, le specie di lievito sono filogeneticamente diverse e si trovano tra i funghi filamentosi in due phyla principali, Ascomycota e Basidiomycota, all'interno del regno fungino9. I lieviti mancano di una firma del DNA che definisce il gene del codice a barre fungino, la regione interna del distanziatore trascritto (ITS) del cluster10 del gene dell'RNA ribosomiale nucleare, rendendoli indistinguibili da altri funghi nelle indagini di metagenomica e quindi rendendo necessario l'uso di metodi dipendenti dalla coltura per isolare le specie di lievito.

Il protocollo seguente è stato implementato per caratterizzare le comunità di lieviti del suolo di nove paesi e identificare tendenze e modelli globali nella diversità del lievito del suolo 9,11,12. Gli approcci di metagenomica sono di utilità limitata quando si studiano gruppi mirati di organismi come i lieviti 2,3. A causa della loro diversità filogenetica, i lieviti non possono essere distinti da altri funghi basati sulla sola sequenza di DNA. Pertanto, lo studio delle popolazioni di lieviti richiede l'uso continuato dell'isolamento dipendente dalla cultura. Tuttavia, la coltivazione è spesso significativamente più dispendiosa in termini di tempo e richiede più personale per eseguire gli esperimenti. Pertanto, il protocollo è stato ottimizzato e semplificato per un'elaborazione più rapida con personale limitato. Il vantaggio principale della coltivazione è che le specie di lievito identificate sono lieviti vivi e non morti, e quindi hanno maggiori probabilità di essere veri abitanti del suolo piuttosto che cellule transitorie presenti nei terreni. È stato stimato che circa il 40% del DNA fungino nel suolo sono contaminanti provenienti da altri ambienti, extracellulari, o provengono da cellule che non sono più intatte, causando approcci di sequenziamento ad alto rendimento per sovrastimare la ricchezza fungina fino al 55%13. L'isolamento dipendente dalla coltura può facilmente confermare l'identità delle specie di lievito con l'ulteriore vantaggio di garantire la coltura pura da utilizzare nelle analisi a valle. In effetti, colture pure di 44 nuove specie di lievito putativo sono state identificate utilizzando questo protocollo di isolamento del suolo che ha permesso l'uso di una serie di metodi per studiare le loro proprietà tassonomiche e funzionali in dettaglio14.

Il protocollo riportato di seguito può essere utilizzato anche per isolare le muffe presenti all'interno del suolo, come A. fumigatus. Aspergillus fumigatus è una muffa termofila e saprofita con un'ampia distribuzione globale nel suolo15. È stato isolato da numerosi ambienti clinici e non clinici. Il campionamento non clinico include comunemente aria, detriti organici (compost, segatura, rifiuti di bulbi di tulipani) e suolo (terreni agricoli, da giardino e naturali)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus è un patogeno opportunistico umano che causa una serie di infezioni collettivamente definite aspergillosi, che colpiscono oltre 8 milioni di persone in tutto il mondo16,20. Circa 300.000 persone in tutto il mondo soffrono di aspergillosi invasiva, che è la forma più grave di aspergillosi16. A seconda di fattori come la popolazione di pazienti, il sito di infezione e l'efficacia della terapia antifungina, il tasso di mortalità può arrivare fino al 90%. Negli ultimi decenni, la resistenza alle terapie antifungine è aumentata, richiedendo sforzi di sorveglianza globale sia nelle popolazioni cliniche che ambientali per tracciare questi genotipi di resistenza 21,22,23. Data la sua capacità di crescere a temperature superiori a 50 °C, questa temperatura può essere sfruttata per selezionare isolati di A. fumigatus dal suolo utilizzando metodi dipendenti dalla coltura. Gli isolati di Aspergillus fumigatus sono comunemente genotipizzati in nove loci a ripetizione tandem breve (STR) altamente polimorfici, che hanno dimostrato di avere un elevato potere discriminatorio tra i ceppi24. Questi genotipi STR possono essere confrontati con altre popolazioni precedentemente intervistate per tracciare la diffusione dei genotipi di A. fumigatus, compresi i geni di resistenza ai farmaci, in tutto il mondo.

Di seguito descriviamo un protocollo per il rapido isolamento di lieviti e A. fumigatus da campioni di terreno in modo dipendente dalla coltura. A seconda della quantità di terreno ottenuta per campione, i campioni di terreno possono essere condivisi tra i due protocolli. Rispetto a metodi simili che isolano il lievito e A. fumigatus dal suolo, questo protocollo utilizza 10 volte meno terreno per isolato ottenuto. Gli studi che tentano di isolare A. fumigatus dal suolo richiedono tra 1 e 2 g di terreno per isolato, mentre questo protocollo richiede solo 0,1-0,2 g diterreno 18,19,25. Questo protocollo utilizza plastiche e contenitori più piccoli che facilitano la sua progettazione ad alta produttività. Pertanto, un numero maggiore di campioni può essere elaborato utilizzando meno spazio per attrezzature come incubatori e tamburi a rulli. I campioni di terreno possono essere completamente elaborati per ottenere isolati in appena 7 giorni. Questo protocollo è stato ottimizzato per consentire l'elaborazione di un massimo di 150-200 campioni al giorno a persona.

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Protocol

NOTA: Qualsiasi passaggio che utilizzi campioni internazionali di suolo e/o spore e miceli di A. fumigatus richiede di lavorare all'interno di un armadio di biosicurezza per organismi di livello 2 (BSCII).

1. Isolamento del lievito dal terreno

  1. Preparazione di soluzioni antibatteriche e antifungine
    1. Sospendere la polvere di cloramfenicolo in etanolo al 70% per preparare una soluzione madre da 50 g/L. Sterilizzare mediante filtrazione a siringa e conservare a 4 °C.
      NOTA: Questo antibiotico impedirà la crescita della maggior parte dei batteri durante l'isolamento del lievito del suolo. Poiché i batteri resistenti al cloramfenicolo possono ancora crescere, la morfologia delle colonie deve essere attentamente presa in considerazione quando si distinguono i lieviti dai batteri. Ulteriori antibiotici possono essere aggiunti ai mezzi quando si lavora con terreno sospettato di contenere ceppi batterici resistenti agli antibiotici. La contaminazione batterica nei mezzi integrati con cloramfenicolo non è stato un problema riscontrato durante l'isolamento dei lieviti dai terreni ambientali.
    2. Sospendere la polvere di benomil in DMSO per preparare una soluzione madre da 5 g/L. Sterilizzare mediante filtrazione a siringa e conservare a 4 °C.
      NOTA: Questo farmaco antifungino selettivo previene la crescita della maggior parte dei funghi filamentosi senza influenzare la crescita del lievito durante l'isolamento del lievito nel suolo26,27.
  2. Preparazione di terreni di coltura e attrezzature sterili
    1. Per preparare il brodo YEPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose), aggiungere 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone e 20 g di destrosio a 1 L di acqua a doppia distillazione. Mescolare fino a quando ben miscelato e autoclave per 40 minuti a 121 °C. Conservare a temperatura ambiente fino all'uso.
    2. YEPD medio agar solido
      1. Mescolare 10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 g di destrosio e 20 g di agar in 1 L di acqua. Mescolare bene per mescolare e autoclave per 40 minuti a 121 °C.
      2. Una volta sufficientemente raffreddato, aggiungere 1 mL di cloramfenicolo e benomil dalle soluzioni madre per portare le concentrazioni finali dei due antimicrobici rispettivamente a 50 mg/L e 5 mg/L.
      3. Mescolare bene mescolando e versare in piastre di Petri da 10 cm di diametro. Lasciare a temperatura ambiente durante la notte per impostare e conservare a 4 °C fino all'uso.
        NOTA: Da 1 L di YEPD, è possibile versare circa 40 piastre.
    3. Sterilizzare i bastoncini applicatori in legno a punta semplice e gli spandicellulari riutilizzabili mediante autoclave e conservare a temperatura ambiente.
  3. Incubazione del terreno in brodo liquido
    1. Preparare un set di tubi di coltura sterili da 13 ml etichettandoli con ID campione di terreno.
    2. Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 5 ml di brodo YEPD integrato con cloramfenicolo e benomil in ciascun tubo.
    3. Lavorando in un BSCII, trasferire ~ 0,1 g di terreno nel tubo di coltura appropriato utilizzando un applicatore sterile a punta semplice in legno.
      NOTA: utilizzare un applicatore fresco per ogni campione di terreno e scartare immediatamente dopo l'uso per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.
    4. Chiudere saldamente il tubo fino alla prima fermata per evitare fuoriuscite, ma consentire comunque lo scambio d'aria durante l'incubazione. Incubare i tubi di coltura in un tamburo a rulli per 24 ore a una temperatura ritenuta ottimale per massimizzare la crescita del lievito.
      NOTA: la temperatura di incubazione deve essere decisa in base alla temperatura media annua del paese di origine dei campioni di suolo. Ad esempio, quando si isolavano i lieviti del suolo dall'Islanda, i tubi di coltura venivano incubati a 14 °C, mentre i terreni dell'Arabia Saudita venivano incubati a 30 °C. A causa della crescita più lenta del lievito a temperature più basse, il tempo di incubazione potrebbe dover essere esteso fino a 72 ore.
  4. Trasferire il surnatante sul mezzo solido.
    1. Utilizzando il set di piastre YEPD + cloramfenicolo + benomyl agar preparate nella fase 1.2, etichettarle con l'ID del campione di terreno.
    2. Rimuovere i tubi di coltura preparati nel passaggio 1.3 dal tamburo del rullo. Lavorando in un BSCII, ruota brevemente il tubo per attirare particelle di terreno e cellule che potrebbero essersi depositate nella parte inferiore in sospensione.
    3. Utilizzando una micropipetta, trasferire 100 μL del surnatante su una piastra. Utilizzare uno spandicelle sterile e riutilizzabile per distribuire il liquido in modo completo e uniforme sulla superficie dell'agar.
      NOTA: lavorare in set di 10 campioni può accelerare significativamente questo processo. Pipettare prima il surnatante su 10 piastre e poi eseguire lo spreading. Utilizzare uno spanditore fresco per ogni campione per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.
    4. Impilare le piastre in sacchetti di plastica, sigillare e incubare a testa in giù per 2-3 giorni alla stessa temperatura utilizzata in precedenza per l'incubazione del brodo liquido fino a quando la crescita microbica è visibile.
  5. Rilevazione di lieviti e striature per singole colonie
    1. Dopo aver concesso un tempo di incubazione sufficiente (in genere 2-3 giorni, ma può richiedere più tempo a temperature più basse), ispezionare le piastre in un BSCII per qualsiasi crescita di lievito. Cerca lieviti cremosi, rotondi, opachi che si distinguono facilmente dalle colonie batteriche e muffe.
      NOTA: Alcuni lieviti producono pigmenti colorati e possono apparire neri / marroni, gialli o rossi, ma la loro consistenza e forma complessiva della colonia sarebbero simili ai lieviti non pigmentati.
    2. Seleziona una colonia simile al lievito da ogni piatto per un'ulteriore lavorazione.
      NOTA: se si osserva più di un tipo di morfologia su una singola piastra, selezionare una colonia rappresentativa per ciascun tipo morfologico.
    3. Utilizzando bastoncini di applicatore sterili e in legno a punta semplice, trasferire ogni colonia selezionata su una piastra YEPD + cloramfenicolo + benomil fresco e una striscia per singole colonie. Eseguire tre strisce separate.
      1. Striscia avanti e indietro oltre un terzo della piastra usando un bastoncino applicatore. Iniziare la seconda e la terza striscia strisciando l'applicatore attraverso la striscia precedente una volta. Utilizzare un nuovo applicatore stick per ogni striscia.
        NOTA: utilizzare una piastra per isolato. Scartare gli applicatori immediatamente dopo l'uso per evitare la contaminazione incrociata tra i campioni.
    4. Impilare le piastre in sacchetti di plastica, sigillare e incubare a testa in giù per 2-3 giorni alla stessa temperatura utilizzata in precedenza fino a quando le singole colonie diventano visibili.
  6. Identificazione delle specie di lievito tramite sequenziamento ITS
    1. Seleziona una singola colonia ben separata per isolato di terreno e sottocoltura su una piastra fresca YEPD + cloramfenicolo + benomil per ottenere più cellule. Incubare per 2-3 giorni alla stessa temperatura utilizzata in precedenza.
    2. Raccogliere le cellule appena coltivate e sospenderle in tubi congelatori a -80 °C contenenti 1 mL di glicerolo al 30% sterilizzato in acqua a doppia distillazione per creare sospensioni cellulari. Mantenere queste sospensioni a -80 °C come soluzioni di serie.
    3. Utilizzare cellule fresche per eseguire la PCR della colonia (reazione a catena della polimerasi) con primer ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') e ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATATGC 3') per amplificare il gene del codice a barre fungino, ITS9. Utilizzare le seguenti condizioni di termociclizzazione: una fase iniziale di denaturazione a 95 °C per 10 minuti seguita da 35 cicli di (i) 95 °C per 30 s, (ii) 55 °C per 30 s e (iii) 72 °C per 1 min.
      NOTA: La PCR della colonia ha un alto tasso di successo e un tempo di consegna più rapido rispetto all'estrazione del DNA seguita dalla PCR.
    4. Se la PCR della colonia fallisce ripetutamente per un ceppo, estrarre il DNA utilizzando il protocollo di scelta ed eseguire la PCR ITS utilizzando il DNA genomico estratto come modello (utilizzare le stesse condizioni di termociclismo di cui sopra).
      NOTA: Si raccomanda un'estrazione del DNA a base di cloroformio relativamente economica28.
    5. Eseguire il sequenziamento Sanger per determinare la sequenza di DNA della regione ITS amplificata per ciascun ceppo.
    6. Confrontare la sequenza ITS ottenuta dei ceppi di lievito con le sequenze depositate in database pubblici come NCBI GenBank e UNITE per stabilire l'identità delle specie.

2. Isolamento di Aspergillus fumigatus dal suolo

  1. Preparare 1 mL di brodo sterile di destrosio Sabouraud (SDB) integrato con l'antibiotico cloramfenicolo per campione di terreno.
    1. Aggiungere 10 g di peptone e 20 g di destrosio a 1 L di acqua distillata. Autoclave a 121 °C per 40 min.
    2. Lasciare raffreddare l'SDB a ~50 °C, aggiungere 1 mL di cloramfenicolo da 50 g/L per portare la concentrazione a 50 mg/L.
      NOTA: Il cloramfenicolo viene preparato come descritto sopra per l'isolamento del lievito. Oltre a inibire la crescita batterica, il cloramfenicolo impedisce anche la produzione di gas dai batteri che causerà l'apertura dei tubi durante la fase di incubazione descritta nel passaggio 2.2.
    3. Aliquota asettica di 1 mL di SDB in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL per campione di terreno utilizzando una pipetta meccanica.
  2. Aggiungere terreno a tubi microcentrifuga da 1,5 ml.
    1. Posare il panca o l'imbottitura assorbente all'interno di un BSCII per aiutare nello smaltimento del terreno versato.
    2. Utilizzando bastoncini applicatori autoclavati, trasferire circa 0,1 g di terreno in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL contenente 1 mL di SBD. Chiudere il tubo e il vortice. Incubare il terreno sospeso a 50 °C per 3 giorni.
      NOTA: non è necessario agitare durante l'incubazione.
  3. Raccolta miceliale del brodo inoculato dal suolo
    1. Preparare piatti di agar estratto di malto (MEA).
      1. Per litro di MEA: aggiungere 20 g di estratto di malto, 20 g di destrosio, 6 g di peptone e 15 g di agar a 1 L di acqua distillata. Autoclave a 121 °C per 40 min.
      2. Lasciare raffreddare il MEA a ~50 °C, quindi aggiungere 1 mL di cloramfenicolo da 50 g/L per portare ad una concentrazione finale di 50 mg/L.
    2. Trasferire il micelio dal brodo inoculato al suolo su piastre MEA.
      1. Identificare gli inoculi del suolo che hanno una crescita miceliale visibile al confine tra SDB e aria.
      2. Utilizzare bastoncini di applicazione in legno sterilizzato per trasferire i miceli al centro di una piastra MEA. Incubare le piastre MEA a 37 °C per 3 giorni.
  4. Selezione di miceli con proprietà morfologiche di A. fumigatus .
    1. Identificare le colonie di muffe che hanno caratteristiche proprietà morfologiche di A. fumigatus (crescita simile alla pelle scamosciata verde).
    2. Lavorando in un BSCII, utilizzare bastoncini applicatori in legno sterilizzato o un anello di inoculazione per raccogliere conidi / miceli raschiando la superficie una volta. Trasferire le spore/miceli al centro di una placca MEA strisciando sull'agar per singole colonie. Incubare a 37 °C per 2 giorni.
      NOTA: Poiché sulla piastra possono essere presenti più ceppi di A. fumigatus e/o altri funghi, è importante strisciare per singole colonie. È possibile utilizzare il protocollo di streaking a colonia singola nella fase 1.5.3 nel protocollo di isolamento del lievito.
    3. Utilizzando un bastoncino applicatore sterile o un ciclo di inoculazione, sottoculturare una singola colonia generata nella fase 2.4.1.2 su MEA strisciando la colonia una volta. Distribuire le spore raccolte al centro del piatto. Incubare a 37 °C per 2 giorni.
  5. Raccolta di spore/miceli di A. fumigatus per la conservazione in coltura
    1. Preparare una soluzione sterile di glicerolo al 30% (per una soluzione da 100 ml, aggiungere 30 ml di glicerolo al 100% miscelato con 70 ml di acqua a doppia distillazione, sterilizzato a 121 °C per 40 minuti).
    2. Lavorando in un BSCII, utilizzare una pipetta p1000 per aspirare 1 mL della soluzione di glicerolo al 30%. Erogare 1 mL di soluzione di glicerolo sulla colonia di A. fumigatus per raccogliere spore/miceli.
      1. A causa dell'idrofobicità delle spore / miceli di A. fumigatus , utilizzare la punta della pipetta per graffiare una regione densamente sporulata della piastra.
        NOTA: Quando il glicerolo viene erogato nel graffio, il glicerolo aderisce all'area del graffio piuttosto che rotolare sull'agar.
      2. Erogare lentamente il glicerolo sulla zona del graffio per rimuovere le spore e sospenderle nella soluzione di glicerolo.
      3. Una volta completamente erogato, capovolgere leggermente la piastra e aspirare la sospensione di spore di glicerolo / micelio.
        NOTA: verranno aspirati circa 750-800 μL.
      4. Trasferire l'aspirato in un tubo congelatore sterile e conservare a -80 °C. Se necessario, creare materiale di lavoro ripetendo i passaggi da 2.5.2.1 a 2.5.2.4.
  6. Identificazione fenotipica di ceppi di A. fumigatus
    1. Utilizzando il calcio di spore creato dal passaggio 2.5.2, creare una diluizione 100x in acqua.
      1. Aspirare 10 μL delle scorte miceliali e spore ed erogare in 990 μL di acqua. Vortice la sospensione.
    2. Erogare 10 μL della sospensione di spore diluite su un vetrino standard per microscopio.
    3. OPTIONAL: Colorare la sospensione miceliale e sporica con blu di metilene.
      1. Per macchiare con blu di metilene, fissare i conidi e i conidiofori alla diapositiva passando la diapositiva su un bruciatore Bunsen fino a quando non si asciuga.
      2. Applicare il blu di metilene per 1-2 minuti e lavare con acqua.
      3. Asciugare la diapositiva con carta assorbente.
    4. Utilizzando un microscopio composto con ingrandimento 400x, visualizzare la sospensione e individuare i conidiofori. Confrontare la morfologia conidiofora osservata con la morfologia conidiofora di A. fumigatus .
  7. Identificazione molecolare di ceppi di A. fumigatus
    1. Estrarre il DNA da ciascun isolato seguendo i comuni protocolli di estrazione del DNA fungino.
    2. Utilizzando primer specifici per i geni Aspergillus β-tubulina (β-tub1 e β-tub4), eseguire la PCR e ottenere la sequenza per i prodotti amplificati, seguendo i protocolli descritti da Alcazar-Fuoli et al.17.
      1. Confronta le sequenze ottenute con le sequenze depositate in database pubblici come NCBI GenBank usando BLAST.
      2. Verificare che le sequenze di deformazione corrispondano in modo ottimale alle sequenze di A. fumigatus nel database.
    3. In alternativa al passaggio 2.7.2, eseguire una reazione MULTIPLEX PCR mirata ai tipi di accoppiamento A. fumigatus MAT1-1 e MAT1-229.
      1. Utilizzare le seguenti tre sequenze di primer nella reazione MULTIPLEX PCR: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5′-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3′; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCGCCACG-3′.
      2. Utilizzare i seguenti parametri del termociclatore: 5 min a 95 °C, 35 cicli da 30 s a 95 °C, 30 s a 60 °C e 1 min a 72 °C prima di un ultimo 5 min a 72 °C.
      3. Eseguire l'elettroforesi su gel per identificare i prodotti; cercare 834 bp MAT-1 o 438 bp MAT1-2. Utilizzare ceppi di A. fumigatus che hanno confermato l'amplificazione del tipo di accoppiamento come controlli positivi e negativi.
  8. Genotipizzazione di microsatelliti di ceppi di A. fumigatus attraverso l'analisi dei frammenti
    NOTA: Sebbene i passaggi elencati di seguito riguardino ampiamente la genotipizzazione di A. fumigatus in nove loci di microsatelliti (STR), sono state evidenziate solo alcune considerazioni importanti. Per i dettagli sulla genotipizzazione STR di A. fumigatus, fare riferimento a De Valk et al.24,30.
    1. Preparare tre master mix multiplex PCR utilizzando i primer STRAf precedentemente descritti da De Valk et al.24.
      1. Etichettare fluorescentemente i primer in avanti per determinare la dimensione del frammento attraverso l'elettroforesi capillare. Assicurarsi che la concentrazione dei primer in avanti sia la metà (0,5 μM) di quella dei primer inversi (1 μM) all'interno della miscela master.
        NOTA: per ottenere i migliori risultati, utilizzare etichette fluorescenti con lunghezze d'onda di assorbanza che corrispondono a quelle dello standard di colorante scelto utilizzato durante l'elettroforesi capillare
      2. Utilizzare la polimerasi a caldo per ottenere i migliori risultati.
      3. Utilizzare una concentrazione di DNA di 0,1 ng per reazione.
    2. Eseguire la MULTIPLEX PCR per ogni ceppo utilizzando il seguente programma PCR: 95 °C per 10 min, 40 cicli di 95 °C per 30 s, 60 °C per 30 s e 72 °C per 60 s, seguiti da 72 °C per 10 min e una tenuta a 4 °C.
    3. Verificare la presenza di prodotti amplificati tramite elettroforesi su gel.
    4. Diluire i prodotti al livello desiderato (in genere ~ 50x) come raccomandato dagli specialisti di analisi dei frammenti ed eseguire l'elettroforesi capillare. Eseguire tre cicli per ogni ceppo, con ogni corsa che copre tre reazioni multiplexate con tre diverse sonde fluorescenti.
    5. Per determinare la dimensione corretta del frammento per ciascuno dei nove loci STR, utilizzare un software in grado di analizzare i frammenti.
      1. Recuperare i dati grezzi ottenuti dall'elettroforesi capillare. Assegna un punteggio alle dimensioni dei frammenti in base al picco più grande utilizzando il software di analisi dei frammenti (ad esempio, Osiride).
      2. Convertire le dimensioni dei frammenti in numeri ripetuti per ciascuno dei nove loci. Utilizzare le dimensioni dei frammenti dei numeri di ripetizione del ceppo di riferimento Af293 come precedentemente descritto da De Valk et al.24.
        NOTA: Lievi variazioni nelle dimensioni dei frammenti possono verificarsi tra diverse piattaforme di elettroforesi capillare. Pertanto, è importante includere un ceppo di riferimento comune (e una scala interna) con dimensioni note del frammento per ciascuno dei nove loci per i ceppi di genotipizzazione.

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Representative Results

Isolamento del lievito dal suolo
Il protocollo di isolamento del lievito di cui sopra è stato implementato per coltivare lieviti da campioni di terreno provenienti da 53 località in nove paesi 9,12. In totale, 1.473 ceppi di lievito sono stati isolati da 3.826 campioni di suolo. Date le diverse condizioni climatiche dei nove paesi di origine, la migliore temperatura di incubazione per ciascun paese è stata determinata in base alla sua temperatura media annua (tabella 1). Data la crescita più lenta del lievito a 14 °C, i campioni di terreno provenienti dall'Islanda sono stati incubati su un tamburo a rulli per ulteriori 48 ore (96-120 ore totali). Dopo 2-3 giorni di incubazione su terreno solido, la crescita microbica era visibile sulle piastre per tutti i campioni (Figura 1A). Una colonia selezionata casualmente per ogni morfologia di lievito presente su una piastra è stata striata per singole colonie su piastre fresche (Figura 1B).

Il tasso di successo dell'isolamento del lievito differiva da un paese all'altro (Tabella 1). Ad esempio, 97 ceppi di lievito sono stati coltivati da 562 campioni di suolo dell'Arabia Saudita (17,3%), mentre 261 lieviti sono stati coltivati da 300 campioni di suolo canadese (87%). Un'analisi di rarefazione deve essere eseguita per determinare se è stato condotto un campionamento del suolo sufficiente per ottenere stime accurate della vera diversità del lievito nei luoghi campionati. Un esempio di analisi di rarefazione per ciascun paese è stato preformato in cui l'indice di diversità di Shannon è stato utilizzato come misura della diversità del lievito del suolo (Figura 2). Le curve di rarefazione risultanti si avvicinavano all'asintoto di saturazione, indicando che un campionamento aggiuntivo non avrebbe probabilmente prodotto una maggiore diversità di lieviti.

Il sequenziamento della regione ITS ha rivelato che i 1.473 isolati di lievito possono essere classificati in 134 specie distinte. Ciò includeva 90 specie conosciute e 44 specie potenzialmente nuove. Abbiamo applicato un modello a effetti misti per identificare i predittori della diversità globale del lievito del suolo coltivabile, come quantificato dall'indice di diversità di Shannon31. In questo modello, le precipitazioni medie annuali, la temperatura media annuale, l'elevazione e la distanza dall'equatore dei luoghi di campionamento sono stati adattati come effetti fissi, mentre il paese di campionamento è stato impostato come effetto casuale9. Questo modello ha identificato le precipitazioni medie annuali per essere significativamente correlate con l'indice di diversità di Shannon (p = 0,012), mentre non sono state trovate correlazioni significative tra altre variabili predittive e l'indice di diversità di Shannon9.

Per confrontare questo protocollo basato sulla cultura con metodi indipendenti dalla cultura, abbiamo confrontato questi risultati con uno studio precedente di Tedersoo e colleghi che ha studiato la diversità globale dei funghi del suolo usando la metagenomica2. Tedersoo e colleghi hanno eseguito il sequenziamento ad alto rendimento della regione ITS sul DNA estratto direttamente da campioni di suolo di 39 paesi, quattro dei quali, vale a dire Camerun, Canada, Cina e Nuova Zelanda, sono stati anche campionati in questo studio. Abbiamo eseguito ricerche BLAST per identificare le sequenze ITS presenti in entrambi i set di dati32 e abbiamo scoperto che il 26% delle sequenze ITS aveva una corrispondenza significativa (identità nucleotidica >98,41%) nel set di dati di metagenomica. Tuttavia, <3% corrispondeva a una sequenza fungina dello stesso paese, mentre il restante 23% corrispondeva a una sequenza fungina trovata in un paese diverso9. Abbiamo avuto più successo dello studio di metagenomica nell'annotare le sequenze ITS con l'identità delle specie di lievito. Tedersoo e colleghi hanno riportato un totale di 50.589 unità tassonomiche operative fungine (OTU), con il numero di OTU di lievito non noto. Di queste OTU fungine, il 33% è stato semplicemente annotato come environmental_sequence (724, 1,4%), uncultured_soil_fungus (2.405, 4,8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1.407, 2,8%) o uncultured_fungus (11.898, 23,5%).

Aspergillus fumigatus isolamento dal suolo
Dopo 3 giorni di incubazione del suolo a 50 °C in 1 mL di SDB in un tubo di microcentrifuga, i miceli possono essere trovati crescere all'interno dell'SDB, sul confine SDB-aria e/o sulle pareti interne. I miceli di Aspergillus fumigatus crescono tipicamente sul confine tra SDB e aria, ma possono anche essere raccolti appena sotto la superficie SDB. Dopo questa fase, i miceli vengono trasferiti in MEA e coltivati per 3 giorni a 37 °C. La crescita miceliale su placche può formare solo la morfologia della pelle scamosciata verde tipica di A. fumigatus (Figura 3A). Più comunemente, altre muffe termotolleranti possono essere presenti all'interno dello stesso terreno e crescere con A. fumigatus sulla stessa piastra o da sole (Figura3B-D). I tassi di isolamento di Aspergillus fumigatus possono variare tra le posizioni geografiche, in modo simile a quello che è stato trovato per i lieviti del suolo. Ad esempio, all'interno di Vancouver, in Canada, 251 isolati sono stati ottenuti attraverso questo metodo da 540 campioni di suolo (46,5%) (risultati non pubblicati). Al contrario, all'interno del Camerun, 51 isolati di A. fumigatus sono stati raccolti da 495 campioni di suolo (10,3%)33.

La struttura a conidioforo di A. fumigatus può essere visualizzata e identificata utilizzando la microscopia ottica. I conidiofori hanno una morfologia palla su bastone (Figura 4). Inoltre, A. fumigatus conidiophores è uniseriato, dove le fialidi, attaccate alle catene conidiche, sono attaccate direttamente alla vescicola sferica. In altre specie di Aspergillus, i conidiofori sono biseriati, dove le fialidi sono collegate a metulae attaccate alla vescicola.

Sono disponibili diversi programmi software per eseguire l'analisi dei frammenti dei dati grezzi dall'elettroforesi capillare, convertendo lo spettro dell'elettroforesi capillare in dimensioni di frammento. La Figura 5 è un cromatogramma generato dal programma Osiride. Vengono mostrati i tre canali che visualizzano le lunghezze dei frammenti di A. fumigatus dinucleotide (2A, 2B e 2C), trinucleotide (3A, 3B e 3C) e tetranucleotide (4A, 4B e 4C). Inoltre, vengono mostrati anche artefatti PCR che si verificano se la concentrazione di DNA del campione durante la PCR è troppo alta. I picchi più alti di ogni colore rappresentano le dimensioni dei frammenti dei tre loci STR in questo grafico.

La variazione genetica presente tra i genotipi STR di A. fumigatus può essere visualizzata utilizzando il pacchetto R poppr. Lo script R bruvo.msn crea una matrice di distanze genetiche di Bruvo a coppie tra ogni coppia di genotipi. Questa matrice viene quindi utilizzata per generare una rete msN (Minimum spanning network). È quindi possibile generare un MSN di alta qualità utilizzando lo script R plot_poppr_msn o IMSN (Figura 6). Un'analisi discriminatoria dei componenti principali (DAPC) è un altro metodo per visualizzare le relazioni genetiche tra i ceppi (Figura 7). Il dapc di script R nel pacchetto R adegenet viene utilizzato per eseguire DAPC e può essere utilizzato con priori di gruppo noti o sconosciuti. Con i precedenti di gruppo sconosciuti, utilizza il clustering K-means per identificare il probabile numero di gruppi di individui.

Figure 1
Figura 1: Isolamento del lievito dai campioni di terreno. (A) La crescita microbica è visibile sull'agar solido dopo 2-3 giorni di incubazione. Le colonie di lievito possono essere viste intervallate da altre colonie fungine / batteriche. Una colonia di lievito rappresentativa per ogni tipo morfologico su una piastra viene selezionata per strisciare per singole colonie. (B) Vengono eseguite tre striature per ottenere singole colonie di isolati di lievito. Una piastra è stata utilizzata per ottenere ogni isolato di terreno. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Analisi di rarefazione del campionamento del suolo. In ciascuno dei nove paesi campionati, la diversità del lievito del suolo, quantificata dall'indice di diversità di Shannon, si avvicina alla saturazione all'aumentare del numero di campioni di suolo. Questa cifra è stata adattata da 9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Morfologia di Aspergillus fumigatus su Sabouraud dextroseagar. (A) Morfologia di crescita di A. fumigatus simile alla pelle scamosciata verde. (B-D) A. crescita fumigatus con altre muffe termofile presenti all'interno del campione di terreno. A. fumigatus conidiation è visibilmente ridotto in B e D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Foto di un Aspergillus fumigatus conidiophore al microscopio ottico. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Output di Osiride di nove loci di microsatelliti da un ceppo di Aspergillus fumigatus . Le uscite corrispondono ai (A) Dinucleotide (2A, 2B e 2C), (B) trinucleotide (3A, 3B e 3C) e (C) tetranucleotide (4A, 4B e 4C) STR loci. Le etichette fluorescenti 5' del primer anteriore sono: A = 6-FAM; B = ESADECIMALE; C = ATTO550. I prodotti di reazione multiplex sono stati diluiti 30 volte prima dell'elettroforesi capillare. Lo standard di tintura LIZ600 è stato utilizzato durante l'elettroforesi capillare. I dati grezzi sono stati analizzati utilizzando il software di analisi dei picchi Osiris identificando potenziali picchi tra 60 e 400 bp. Diversi artefatti PCR sono picchi fuori scala che causano sanguinamento da fluorescenza, picchi di balbuzie e picchi di N-1 (C). Abbreviazioni: 6-FAM = 6-carbossifluoresceina; HEX = esaclorofluoresceina; STR = brevi ripetizioni in tandem; RFU = unità di fluorescenza relative; BPS = coppie di basi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Rete a estensione minima che mostra la relazione genetica tra mlG di A. fumigatus dall'Islanda e dai Territori del Nord-Ovest in Canada. Ogni nodo rappresenta un MLG, dove la dimensione del nodo corrisponde al numero di ceppi per ogni MLG. I nodi che sono geneticamente più simili hanno bordi più scuri e spessi, mentre i nodi geneticamente distanti hanno bordi più chiari e sottili. Questa cifra è stata adattata da 34. Abbreviazioni: ISL = Islanda; NWT = Territori del Nord-Ovest in Canada; MLG = genotipo multilocus. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Clustering genetico mediante analisi discriminante dei componenti principali (DAPC) delle popolazioni di A. fumigatus islandesi, NWT, eurasiatiche, nordamericane e oceaniche. Gli isolati sono stati genotipizzati in nove loci microsatellitari e corretti per clonazione, per un totale di 1.703 genotipi multilocus unici. I genotipi sono stati colorati in base alle origini geografiche. Questa cifra è stata adattata da 34. Abbreviazioni: DAPC = analisi discriminante dei componenti principali; NWT = Territori del Nord-Ovest; ISL = Islanda; CMR = Camerun; CAN = Hamilton, Ontario, Canada; BEL = Belgio; FRA = Francia; DEU = Germania; IND = India; NLD = Paesi Bassi; NOR = Norvegia; NZL = Nuova Zelanda; ESP = Spagna; CHE = Svizzera; USA = Stati Uniti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Paese Temperatura di incubazione (°C) Campioni di terreno Isolati di lievito Specie conosciute/ Nuove specie
Camerun 30 493 110 10/9
Canada 23 300 261 34/12
Cina 23 340 230 23/5
Costa Rica 30 388 95 20/2
Francia 23 327 175 12/2
Islanda 14 316 211 11/0
Nuova Zelanda 23 610 155 14/4
Perù 23 490 139 30/9
Arabia Saudita 30 562 97 8/1
Totale 3826 1473 90/44

Tabella 1: Isolamento del lievito nel suolo da nove paesi in sei continenti. La temperatura di incubazione per i campioni di suolo di ciascun paese è stata determinata in base alla sua temperatura media annuale. I risultati qui presentati sono adattati da 9,12.

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Discussion

Il protocollo sviluppato per isolare lieviti e A. fumigatus dal suolo è un metodo rapido ed efficiente per la lavorazione del suolo ad alto rendimento e l'isolamento fungino. Il protocollo richiede solo una piccola quantità di terreno (0,1-0,2 g) per campione, consentendo di campionare più siti con uno sforzo simile. I tempi di consegna rapidi assicurano che i risultati possano essere ottenuti in un breve lasso di tempo e consentono di risolvere i problemi e ripetere gli esperimenti, se necessario. Questo protocollo può essere facilmente replicato in molte impostazioni di laboratorio utilizzando apparecchiature standard di microbiologia e coltivazione cellulare. Tuttavia, quando si isolano lieviti o muffe dal suolo internazionale, sono necessarie ulteriori misure precauzionali. Tutte le attrezzature in plastica non usa e getta, come vassoi di plastica e spandicellulari, devono essere sterilizzate mediante immersione in candeggina al 10%, seguita da autoclave. Il rivestimento da banco usato deve essere sigillato in un sacchetto di plastica e sterilizzato in autoclave prima di essere scartato.

Da notare, il numero e l'identità dei lieviti isolati utilizzando il protocollo di cui sopra possono essere limitati dalle condizioni di incubazione e dai mezzi utilizzati. Ad esempio, l'incubazione di 24 ore nel tamburo a rulli può favorire l'isolamento di lieviti aerobici a crescita rapida rispetto alle specie a crescita lenta. Inoltre, l'uso di un mezzo YEPD ricco di nutrienti per l'isolamento del lievito potrebbe aver escluso specie di lievito con requisiti e preferenze nutrizionali diversi. Inoltre, la maggior parte delle località campionate qui sperimenta variazioni stagionali di temperatura e altre condizioni climatiche durante tutto l'anno. Se il tempo e le risorse lo consentono, gli stessi campioni di terreno possono essere elaborati in una gamma di temperature diverse per consentire l'isolamento di una gamma più ampia di lieviti che abitano questi terreni.

Mentre i metodi indipendenti dalla cultura sono cruciali per chiarire modelli su larga scala nella diversità fungina ambientale, non riescono ad essere sufficientemente informativi per gruppi mirati di funghi come i lieviti. L'uso dell'isolamento dipendente dalla coltura ha permesso un'indagine completa sulla diversità globale del lievito del suolo e sui suoi predittori9. Mentre lo studio di metagenomica condotto da Tedersoo e colleghi ha identificato predittori e modelli globali nella diversità fungina del suolo, la misura in cui questi risultati si applicano specificamente alla diversità del lievito non può essere chiarita2. Tedersoo e colleghi hanno identificato le precipitazioni medie annuali come uno dei principali driver climatici della diversità fungina del suolo in tutto il mondo2. Questo studio ha trovato una correlazione simile tra precipitazioni medie annuali e diversità di lievito coltivabile nei suoli globali, evidenziando che i metodi dipendenti dalla cultura possono integrare ed espandere i risultati degli approcci di sequenziamento ad alto rendimento9.

L'aggiunta di cloramfenicolo è un passo importante nella preparazione di mezzi solidi e liquidi per prevenire l'interferenza della crescita fungina da parte dei batteri. L'aggiunta di cloramfenicolo ai mezzi liquidi è fondamentale in quanto la mancanza di antibiotici permetterà ai batteri presenti nel terreno di fermentare. Ciò porterà alla produzione di gas che apriranno forzatamente tubi di microcentrifuga o tubi di coltura da 13 ml utilizzati durante l'incubazione del suolo nel protocollo. Se la contaminazione batterica nel cloramfenicolo contenente agar / brodo è un problema, il cloramfenicolo può essere sostituito o integrato con antibiotici più forti. Quando si isola A. fumigatus dal suolo, il brodo SD può essere sostituito con una soluzione di Tween 20 (0,2 M NaCl con 1% Tween 20) per aiutare a sospendere l'idrofobo A. fumigatus conidia35,36. Dopo la sospensione, 100 μL possono essere placcati su agar SD e incubati a 50 °C.

Aspergillus fumigatus cresce rapidamente e sporula abbondantemente quando incubato da solo su terreni SD agar e MEA tra 22 °C e 50 °C. Tuttavia, a seconda di quali altre specie termotolleranti sono presenti nel campione di suolo, la crescita e la sporulazione di A. fumigatus possono essere ostacolate (Figura 3A,D). In tale situazione, potrebbero essere necessarie da una a diverse fasi di sottoculturazione per ottenere una colonia pura per la successiva raccolta e caratterizzazione.

L'analisi dei frammenti dei ceppi di A. fumigatus nella Figura 5 è stata condotta utilizzando il programma Osiris. Diversi artefatti PCR sono stati evidenziati nella Figura 5C e sono discussi in dettaglio da De Valk et al.30. I picchi di balbuzie B-1 che hanno valori di ripetizione più brevi sono causati dallo slittamento del filamento durante la sintesi del filamento antisenso da parte della DNA polimerasi. I picchi di N-1 si verificano se la concentrazione di DNA è troppo alta durante la PCR. La concentrazione di DNA raccomandata è di 0,1 ng come indicato nel protocollo di cui sopra. Un altro artefatto è il sanguinamento del colorante che può essere risolto utilizzando etichette fluorescenti con lunghezze d'onda di assorbanza non sovrapposte. Ad esempio, le etichette fluorescenti 6-FAM, HEX e ATTO550, così come lo standard di tintura LIZ600, generano picchi di frammento distinti (Figura 5). Infine, per prevenire picchi fuori scala, diluire ogni reazione PCR (in questo caso, era ~ 50x diluizione) prima dell'elettroforesi capillare. Per ridurre ulteriormente la fluorescenza dei primer anteriori inutilizzati nella miscela di reazione, dimezzare le concentrazioni di primer in avanti rispetto ai primer inversi durante la creazione della miscela principale.

L'elevata produttività e la natura conservativa di questo protocollo consentono un'acquisizione relativamente rapida e facile di molti lieviti e muffe dai terreni. Tuttavia, ci sono due limitazioni principali presenti con la metodologia di campionamento. In primo luogo, le caratteristiche morfologiche delle colonie di lievito coltivate dal suolo sono state utilizzate per selezionare specie uniche. Questi sono stati poi sottocolti e utilizzati per l'identificazione delle specie tramite sequenziamento ITS. Questo è stato fatto per massimizzare la rappresentazione delle specie di lievito presenti. Tuttavia, le specie di lievito che condividevano morfologie simili o identiche alle colonie selezionate potrebbero non essere sottocoltate. In secondo luogo, durante l'isolamento di A. fumigatus , poiché viene selezionata una sola colonia individuale per campione di suolo, mancherà la presenza di più individui all'interno del campione di suolo. Ciò può portare a una sottorappresentazione della vera diversità genetica presente all'interno della popolazione campione, in quanto non verranno raccolti genotipi unici presenti nello stesso campione di suolo. Per mitigare questo problema, durante la striscia per la fase di singola colonia successiva alla prima coltivazione su mezzi solidi, è possibile raccogliere diverse singole colonie per ottenere genotipi aggiuntivi. Il piccolo volume di terreno utilizzato per campione aiuta a ridurre al minimo questa limitazione di campionamento rispetto ai metodi che utilizzavano maggiori quantità di terreno per campione.

L'uso di questo protocollo ad alta produttività ed efficiente in termini di lavoro per l'isolamento di lieviti e muffe aumenterà il numero di individui all'interno della popolazione del suolo utilizzando meno sforzo per campione. L'aumento del potere statistico fornirà un quadro migliore delle comunità di lievito coltivabili all'interno del suolo e contribuirà a caratterizzare le popolazioni del suolo di A. fumigatus.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) e McMaster University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

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References

  1. Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
  2. Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
  3. Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  4. Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
  5. Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
  6. Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
  7. Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
  8. Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. The Yeasts: A Taxonomic Study. , Elsevier. (2011).
  9. Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
  10. Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
  11. Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
  12. Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
  13. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
  14. Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
  15. Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
  16. Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
  17. Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
  18. Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
  19. Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
  20. Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
  21. Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
  22. Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
  23. Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
  24. de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
  25. Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
  26. Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
  27. Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
  28. Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
  29. Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
  30. De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
  31. Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  32. Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
  33. Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
  34. Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
  35. Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
  36. Wang, H. -C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).

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Isolamento di lieviti e muffe coltivabili dai terreni per studiare la struttura della popolazione fungina
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Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

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