Summary
Een methode van intraductale injectie van reagentia voor een op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing in de mamma-ductale boom van muizen voor in vivo beeldvorming en preventie van borstkanker wordt beschreven. Injectie direct in de tepelopening maakt het mogelijk om borstepitheelcellen te richten met minimale collaterale weefselschade.
Abstract
Borstkanker is de meest voorkomende kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte voor vrouwen in de VS. Voor vrouwen met een hoog risico is profylactische mastectomie de meest effectieve primaire preventiestrategie. Profylactische mastectomie is een agressieve chirurgische procedure die de borstepitheelcellen waaruit borstkanker ontstaat, samen met het omliggende weefsel volledig verwijdert. We proberen een minimaal invasieve intraductale procedure te ontwikkelen als alternatief voor profylactische mastectomie om de borstepitheelcellen lokaal te aborteren voordat ze kwaadaardig kunnen worden. Wij en anderen hebben een intraductale toedieningsprocedure ontwikkeld om deze epitheelcellen te bereiken en te behandelen in knaagdiermodellen van borstkanker. Terwijl de borstklier van de muis met een enkele niet-anastomosische ductale boomopening bij de tepel een veel minder complexe en kronkelige architectuur heeft dan de menselijke borst, zijn chemisch geïnduceerde en genetisch gemanipuleerde muismodellen van borstkanker waardevol om proof-of-concept studies van nieuwe preventieve strategieën te produceren. Hier beschrijven we een procedure voor intraductale toediening van een op ethanol gebaseerde ablatieve oplossing met micro-CT / röntgen tantaal-gebaseerd contrastmiddel in de borstmaarmale boom van de muis voor het therapeutische doel van primaire preventie van borstkanker. Intraductale toediening van waterige reagentia (bijv. Cytotoxische verbindingen, siRNA's, AdCre) is eerder beschreven in muismodellen. Daarom richten we onze protocolbeschrijving op methodologische modificaties en unieke experimentele overwegingen voor het optimaliseren van de afgifte van ethanol, voor het minimaliseren van lokale en systemische bijwerkingen van ethanoltoediening en voor in vivo visualisatie van ductale boomvulling via micro-CT / fluoroscopie beeldvorming. Visualisatie van de ductale boom onmiddellijk na injectie van een contrastbevattende oplossing maakt het mogelijk om volledige vulling of niet-succesvolle resultaten zoals ondervulling of overvulling te bevestigen. Deze procedure kan worden toegepast voor de levering en beeldvorming van andere ablatieve verbindingen gericht op het voorkomen van tumorvorming of het lokaal behandelen van tumoren in een vroeg stadium die toegankelijk zijn via de ductale boom.
Introduction
Borstkanker is een veel voorkomende en potentieel dodelijke ziekte met weinig opties beschikbaar voor preventie1. De meest effectieve interventie is profylactische mastectomie; alleen personen met een hoog risico kiezen er echter voor om deze procedure te ondergaan, omdat het een operatie is met grote levensveranderende gevolgen2. De procedure verwijdert volledig de borstepitheelcellen waaruit borstkanker ontstaat, samen met het omliggende weefsel. Dit kan resulteren in fysieke, psychologische en sociale stress voor het individu en ontmoedigt individuen vaak om door te gaan met deze chirurgische ingreep als hun eerste lijn van primaire interventie.
We hebben aangetoond dat toediening van een ablatieve oplossing met 70% ethanol (EtOH) rechtstreeks in de ductale boom effectief is in het doden van borstepitheelcellen met beperkte collaterale weefselschade en bij het voorkomen van borsttumoren in muismodellen3. EtOH wordt al lang klinisch gebruikt als een ablatief of scleroserend middel voor lokale behandeling. Percutane EtOH-injectie wordt gebruikt als een ablatief middel voor niet-reseceerbare levertumoren, renale en bijnierneoplasmata en pancreascysteustumoren4,5,6; voor coeliakie plexus neurolyse om pijn te verminderen7; en voor de behandeling van pseudoaneurysma's van de borst8. Intravasculaire EtOH-injectie wordt gebruikt als een scleroseermiddel om zwelling en vervorming door arterioveneuze malformaties (AVM) te elimineren en voor cosmetische behandeling van spataderen en spataderen9,10,11,12,13. Net als profylactische mastectomie hangt het succes van preventie met lokale toediening van een ablatieve oplossing af van het vermogen om alle borstepitheelcellen waaruit mogelijk kanker zou kunnen ontstaan, volledig te verwijderen. Dit vereist bevestiging dat de ablatieve stof de ductale boom met succes heeft gevuld, waardoor rechtstreeks contact wordt gemaakt met alle borstepitheelcellen. Klinische middelen voor het injecteren van stoffen in de borstklieren en het visualiseren ervan door middel van beeldgeleide fluoroscopie of ductografie zijn direct beschikbaar14,15; daarom zal het mogelijk zijn om zowel een succesvolle levering te leveren als te bevestigen wanneer deze procedure evaluatie in klinische onderzoeken kan rechtvaardigen.
Het aantonen van de haalbaarheid van deze beeldgeleide aanpak bij proefdieren is een belangrijke stap in het vaststellen van de werkzaamheid en translationele haalbaarheid van intraductale (ID) ablatie als preventieve maatregel voor borstkanker. In ons laboratorium hebben we een methode ontwikkeld om alle borstklieren bij muizen met succes te injecteren met een ablatieve oplossing met een contrastmiddel gedurende een kuur van wekelijkse injecties om ervoor te zorgen dat het dier niet bezwijkt aan een overdosis EtOH (Figuur 1, Figuur 2, referentie nrs.3,16). Deze procedure plaatst een naald van 34 G in de tepelopening van een met isofluraan verdoofde muis om de testoplossing te injecteren. Enkele belangrijke verbeteringen van de procedure zijn het gebruik van gasdichte spuiten voor vloeistof en gassen, injectie van hogere volumes per ductale bomen17 en uitgebreide ontstekingsremmende behandeling. De preklinische behandeling van 5 mg/kg carprofen, een NSAID, van 2 d voor tot 7 d na de ID-procedure is in lijn met die van klinische scleroserende therapie voor AVM. Meestal krijgen de patiënten na systemische anesthesie ontstekingsremmende medicijnen, zoals NSAID's, gedurende 2 dagen na de procedure die kunnen worden verlengd om lokale ontstekingen of pijn te verminderen12. Alcoholintoxicatie wordt aanzienlijk verminderd door intraperitoneale injectie van een 5% sucrose-oplossing bij muizen. Met toediening van deze sucrose-oplossing kunnen muizen veilig worden geïnjecteerd met maximaal 160 μL van 70% EtOH (maximaal vier ductale bomen; ongeveer 0,4 g / dL EtOH-gehalte in bloed); dieren volledig hersteld binnen 4 uur na ID-injecties. Voor injectie van meer dan vier klieren bij muizen en/of hogere EtOH-concentraties voeren we sequentiële sessies uit om voldoende hersteltijd te hebben. Alcoholintoxicatie bij vrouwen zou een minder grote zorg zijn vanwege het lagere aandeel alcohol in het lichaamsgewicht. Gezien het aantal ductale bomen in de menselijke borst14,15, ongeveer 16 en het geschatte volume om elke boom duct 18,19 te vullen, zal tot 32 ml van 70% EtOH worden toegediend. Deze hoeveelheid zal veel lager zijn dan de 50 ml van 95% EtOH toegediend in andere klinische procedures4,9. Intraveneuze toediening van thiamine en glucose-oplossing kan worden gebruikt om de effecten van EtOH-intoxicatie verder te minimaliseren, vooral in gevallen waarin een groter totaal volume EtOH mogelijk moet worden geïnjecteerd en / of voor vrouwen met een lagere tolerantie voor alcoholgebruik (bijv. Allelische varianten in alcohol of aldehydedehydrogenasen).
Beeldvorming via micro-CT/fluoroscopie stelt ons in staat om een succesvolle ductale vulling van elke klier te bevestigen (figuur 1, figuur 2, figuur 3). Dit kan worden geregistreerd voor toekomstige analyse, of in het moment worden beoordeeld via real-time fluoroscopie beeldvorming, zoals zou worden gedaan in klinische toepassing, om de totale stralingsbelasting voor het dier te beperken. Om de specifieke kenmerken van deze ablatieve oplossing voor real-time beeldgeleide toediening in vivo verder te verbeteren, hebben we eerder door de FDA goedgekeurd jodiumbevattend contrast vergeleken met een tantaaloxide (TaOx) -bevattend nanodeeltje gesynthetiseerd door het Shapiro-lab3,16. TaOx vertoonde superieure prestaties als micro-CT-contrastmiddel voor het visualiseren van de initiële vulling van de ductale boom (figuur 2, figuur 3). TaOx kan worden gebruikt als referentiecontrast om een meer systematische en longitudinale beoordeling uit te voeren van andere op nanodeeltjes gebaseerde bloedpoolcontrastmiddelen (bijv. Jodium-, bismut- of goudbevattend) en compatibiliteit van TaOx met verschillende concentraties ethylcellulose als geleermiddel20,21.
Protocol
Alle hier beschreven experimenten werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee aan de Michigan State University.
1. Uitgebreide ontstekingsremmende behandeling
- Zorg ervoor dat muizen die injectieoplossingen met EtOH of andere potentiële irriterende stoffen krijgen, worden voorzien van een ontstekingsremmende behandeling vanaf 2 dagen vóór de injectie tot 7 dagen na de injectie. De voorkeursmethode voor dosering is orale toediening via een sucralose-gelbeker die carprofen in een geschikte concentratie bevat.
- Bereid carprofen voor met de vereiste concentratie. Voor dit experiment werd een werkoplossing van 2 mg / ml (stockoplossing is 50 mg / ml) bereid door verdunning in steriel PBS om 0,5 ml te injecteren om een einddosis van 1 mg per kopje te bereiken. Voeg 1% v/v steriele blauwe voedselkleurstof (BFD) toe in plaats van een fractie van de PBS van het totale volume dat nodig is voor verdunning om de volledige menging van het geneesmiddel in de sucralose-gel beter te visualiseren.
- Bereid een kopje voor toevoeging van carprofen volgens de aanbeveling van de fabrikant. Tenzij anders aanbevolen, plaatst u de beker gedurende 15 minuten in een waterbad van 60 °C. Verwijder de bekers en droog ze af om de kans op besmetting te minimaliseren.
- Gebruik 70% EtOH of een EtOH-doekje om het oppervlak van het bekerdeksel schoon te maken en te laten drogen. Gebruik een spuit om de benodigde hoeveelheid carprofenoplossing door het deksel te injecteren. Voor dit experiment wordt 500 μL geïnjecteerd. Bedek de injectieplaats met een sticker en schud krachtig gedurende 15 s.
- Vortex de beker gedurende 15 s en bewaar deze vervolgens voor later gebruik na visuele verificatie van het volledige mengen. Controleer de kopjes op homogeen mengen door te zoeken naar donkerblauwe klonten. Laat de kopjes op kamertemperatuur komen voordat u naar de koelkast gaat voor opslag tot een maand.
OPMERKING: Deze bekers kunnen ook worden bewaard bij kamertemperatuur zodra ze zijn gedoseerd, indien nodig, maar let op de richtlijnen voor de werkzaamheid van het geneesmiddel van de fabrikant. Het dateren van de sticker helpt bij het bijhouden van de injectiedatum zonder het risico te lopen dat een pen of scherpe stift het deksel doorboort.
- Wanneer u klaar bent voor gebruik, veegt u de buitenkant van de beker af met 70% EtOH. Verwijder het deksel en plaats het kopje in de kooi met de muizen. Vervang de bekers om de dag of wanneer ze leeg zijn. Eén kopje zou genoeg moeten zijn voor maximaal vijf muizen gedurende 1-2 dagen.
2. Preoperatieve voorbereiding
OPMERKING: Deze stap vindt 2-3 dagen voorafgaand aan de injectie plaats.
- Verdoof de muis met een isofluraanverdamper (2%-3% isofluraan, 1,5 l/min zuurstof) en breng oogsmeermiddel aan. Handhaaf de anesthesie op 1% -3% isofluraan als dat nodig is tijdens de hele procedure met een neuskegel terwijl u de ademhalingsfrequentie van het dier zorgvuldig controleert.
- Breng het oogglijmiddel aan op de ogen van de muis terwijl u bij de neuskegel bent en plaats de muis vervolgens op zijn rug. Gebruik een applicator met katoenen punt om vrij verkrijgbare ontharingscrème aan te brengen op het tepelgebied (het gebied van de borstklier dat zal worden geïnjecteerd). Wrijf de crème 10-30 s in het gebied met de applicator om de vacht snel los te maken.
OPMERKING: Laat de crème niet langer op het dier zitten dan nodig is en verwijder deze volledig om te voorkomen dat de huid verbrandt. - Gebruik na 10-30 s van de toepassing warm water op gaas om de crème volledig te verwijderen en de vacht van het dier los te maken. Voer ten minste twee tot vier spoelingen uit van het gebied met vers gaas voor het verwijderen van de crème voordat u droogt met een schoon droog gaas na de laatste spoeling. Controleer het gebied van vachtverwijdering om een goede zichtbaarheid en toegang tot de tepels te bevestigen. Herhaal dit indien nodig met ontharingscrème.
- Plaats de muis in een aparte schone, droge herstelkooi op een verwarmingskussen om te herstellen van anesthesie. Observeer de muis totdat deze volledig is hersteld van de anesthesie en breng hem terug naar de thuiskooi.
- Voorzie muizen van een kopje sucralose-geloplossing met carprofen (1 mg / cup) voor pre-dosering van het ontstekingsremmende middel na herstel. Eén kopje kan maximaal vijf muizen tot 2 dagen met carprofen voorzien. Controleer de beker dagelijks en vervang indien nodig, of om de andere dag als het niet volledig wordt geconsumeerd.
3. Intraductale injectie
OPMERKING: Deze stap vindt plaats 2-3 dagen na preoperatieve voorbereiding.
- Bereid 333,3 mM tantaaloxide (TaOx) stamoplossing uit verkregen poederformulering zoals beschreven in16 met behulp van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Gebruik zachte warmte als het poeder niet volledig oplost in de oplossing.
- Maak een ablatieve beeldvormingsoplossing door drie delen voorraad TaOx te mengen met zeven delen 100% EtOH voor een uiteindelijke 70% EtOH 100mM TaOx-oplossing . Voeg 1% v/v blauwe voedselkleurstof toe aan de uiteindelijke oplossing voor ondersteunde visualisatie tijdens de injectie. Bereid een volume voor op basis van de behoefte aan het experiment.
OPMERKING: Klierparen 1 en 5 kunnen tot 30 μL van de oplossing bevatten, terwijl alle andere paren kunnen worden geïnjecteerd met maximaal 50 μL in 9 weken oude of oudere FVB-muizen. - Verdoof de muis met isofluraan zoals bij preoperatieve voorbereiding en verplaats de muis naar de neuskegel zodra deze volledig is verdoofd. Breng oogglijmiddel aan voordat u het dier op zijn rug legt voor de injectie. Bevestig de muis onder de stereoscoop met tape, indien nodig.
- Bereid de spuit voor met het gewenste volume injectie-oplossing. Laad 21-51 μL van de injectieoplossing in een spuit van 50 μL met een naald van 34 G eraan. Laad een extra 1 μL van de oplossing om rekening te houden met de mogelijke lekkage van dat volume nadat de naald uit de tepel is verwijderd.
OPMERKING: Bovenstaande volumes zijn voor de typische procedures die hier worden gepresenteerd. Men kan elk gewenst volume injecteren met dien verstande dat de meeste klieren overvol zullen zijn als ze hoger zijn dan 30 μL of 50 μL in respectievelijk klierparen 1 en 5, of 2-4. Het is nuttig om de naald te vullen met extra volume van de injectieoplossing om te testen op de vrije stroom van de oplossing onmiddellijk voorafgaand aan de injectie. Als u meer dan één borstklier injecteert, vult u meerdere spuiten voor om tijd te besparen. Laat de oplossing echter niet lang in de spuit zitten. - Bereid de tepels voor op de injectie door dode huid te verwijderen die de tepelopening bedekt met een fijne puntige tang.
- Houd de tepel voorzichtig vast met een pincet. Met de schuine kant van de naald zichtbaar, steekt u de naald in de tepelopening totdat de schuine kant volledig is bedekt met begeleidingshulp van fijne punttang. Het kan nodig zijn om de tepel op de naald te trekken in plaats van de naald in de tepel te duwen (tabel 1).
- Zodra de afschuining van de naald volledig is omgeven door de tepel en zich in het hoofdkanaal bevindt, begint u met het injecteren van de oplossing met een constante snelheid van ongeveer 40 μL / min. Vermijd te snel injecteren om ervoor te zorgen dat de ductale boom niet wordt beschadigd. Houd de naald gedurende 30 s in de tepel nadat het volume volledig is geïnjecteerd voordat u de naald met behulp van de tang verwijdert. Dit wordt gedaan om te voorkomen dat de oplossing uit de tepel morst (figuur 2).
- Beoordeel het gebied op tekenen van mislukte injectie. Een koepelvormig uiterlijk kan wijzen op een vetkusseninjectie of trauma aan het gebied.
- Ga verder met het injecteren van de resterende borstklieren.
- Terwijl het dier nog steeds wordt verdoofd, injecteert u 200-250 μL 5% sucrose-oplossing (tot 10 ml / kg) intraperitoneaal om de mogelijke effecten van alcoholintoxicatie te minimaliseren.
4. micro-CT beeldvorming
- Na het injecteren van alle gewenste klieren, verplaats je het dier snel naar het micro-CT-systeem en blijf je de anesthesie handhaven met behulp van de ingebouwde isofluraanverdamper. Het dier kan worden afgeplakt om de beeldvormingspositie te standaardiseren. Het afplakken van elk achterbeen in een verlengde positie helpt bijvoorbeeld om de beenderen van het dier verder van de onderste klieren van belang voor het resulterende beeld te houden.
OPMERKING: De dieren kunnen worden afgebeeld met behulp van verschillende scanparameters voor de visualisatie van de ductale boom als ervoor wordt gezorgd dat een geschikte aanvaardbare levenslange stralingsdosis voor het dier wordt bepaald en de cumulatieve doses dit niveau niet overschrijden. Fluoroscopiefoto's en -video's kunnen worden gegenereerd zonder scans uit te voeren om de blootstelling aan straling verder te verminderen (figuur 2). - Plaats de muis in het juiste gezichtsveld met de voorbeeldfunctie fluoroscopie.
- Voer TaOx-beeldvorming uit van de ductale boom van de muis met een goede resolutie en gelegenheid voor herhaalde standaard (2 min) acquisitiescans. Gebruik de volgende scanparameters: 90 kVp/88 μA; gezichtsveld (FOV), 36 mm; aantal plakjes, 512; plakdikte, 72 μm; voxel resolutie, 72 μm3.
- Verkrijg langere (4 of 14 min) hoge resolutie scans voor een nog betere resolutie bij dieren. Deze zijn aanvaardbaar als terminale procedures vóór euthanasie. Deze zijn echter niet aanvaardbaar voor dieren om in de lengterichting te worden gescand met behulp van dezelfde parameters, omdat dit stralingsziekte zal veroorzaken.
- Na voltooiing van het beeldvormingsprotocol, verwijdert u het dier uit de anesthesie en brengt u het over naar een aparte schone, droge herstelkooi op een verwarmingskussen. Observeer het dier totdat het volledig hersteld is en breng het dan terug naar de thuiskooi. Houd de dieren geïnjecteerd met ablatieve oplossing op carprofen tot 7 dagen na injectie.
- Maak snelle weergaven van gescande afbeeldingen in de micro-CT-software (ingebouwd systeem) om eventuele contrastlekken of gebrek aan vulling (figuur 2) beter te waarderen zonder formele analyse.
- Voer verdere formele beeldanalyse uit voor publicatie of gedetailleerde analyse van scans die indien gewenst segmentatie van het interessegebied mogelijk maken (figuur 3).
OPMERKING: Het belangrijkste verschil tussen deze methoden is de mogelijkheid om alleen de ductale boom te drempelen (formele weergave) versus de noodzaak om de hele afbeelding te drempelen (snelle weergave). Andere metingen en afbeeldingen kunnen worden gegenereerd met behulp van de softwarepakketten om het succes van het vullen van ductale bomen het beste aan te tonen.
5. Beeldanalyse
- Voer rendering van de geïnjecteerde ductale boom uit met behulp van een gespecialiseerd softwarepakket. Om dit te doen, segmenteert u het borstvetkussen met verdere beeldverwerking.
- Als u het vetkussen (donkerder compartiment in vergelijking met de peritoneale holte, de dijbeenspieren en de huid) waarin de interessante ductale boom zich bevindt, wilt segmenteren, selecteert u de optie Spline Trace in het handmatige menu. Traceer de omtrek van het vetkussen bij elke derde gegevensschijf.
- Klik op de optie Objecten doortrekken in het semi-automatische menu om alle getraceerde en niet-getraceerde segmenten in één object te verbinden.
- Selecteer de optie Drempelvolume in het semi-automatische menu om het gewenste HU-bereik in te voeren (300-3.000 HU is een goed startpunt) en klik vervolgens op de knop Drempelweergave om een weergave te maken die alleen het contrast (TaOx) in de ductale boom weergeeft en zacht weefsel elimineert.
- Schakel de knop Weergave in op Weergave als primair om alleen de 3D-weergave weer te geven zonder omringende structuren.
OPMERKING: Extra softwarefuncties maken het mogelijk om metingen te doen van de 3D-weergave (d.w.z. lengte, volume, enz.).
Representative Results
Vrouwelijke muizen hebben vijf paar borstklieren met een enkele ductale boom die zich opent bij de tepelopening22. Aan de uiteinden van de zich ontwikkelende ductale boom bevinden zich de terminale eindknoppen (TEBs), proliferatieve structuren die de groei en vertakking sturen. Na de puberteit, wanneer de verlengingsfase is voltooid, gaan TEB's achteruit en worden functioneel en anatomisch niet te onderscheiden van terminale kanalen of alveolaire knoppen23. Terminale ductale lobulaire eenheden hebben bij mensen een vergelijkbare functie als TEBs bij muizen en zijn de plaatsen waaruit voornamelijk borstkanker ontstaat24,25. We kunnen tot 50 μL 70% EtOH-oplossing injecteren om de gehele ductale boom van thoracale en abdominale borstklieren van 9 weken oude FVB/N, NSG en andere muizenstammen te vullen (Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3, zie referenties3,16). In een typisch experiment kunnen we tot acht borstklieren injecteren met een ablatieve oplossing van 70% EtOH en 100 mM TaOx in twee opeenvolgende ID-procedures gescheiden door 7 dagen om herstel van dieren mogelijk te maken (figuur 2). Dieren worden onmiddellijk na de laatste ID-injectie door micro-CT in beeld gebracht om de succesvolle toediening van de oplossing aan de gehele ductale boom te beoordelen (figuur 2). In onze ervaring zijn de tepels van inguinale klieren geschikt voor injectie bij ongeveer 60% van de dieren en de tepels van cervicale klieren bij ongeveer 40%. Indien geschikt, kunnen we tot 30 μL 70% EtOH-oplossing injecteren om de hele ductale boom van cervicale en inguinale borstklieren te vullen (figuur 2). FVB- en NSG-stammen hebben over het algemeen meer geschikte tepels voor injectie dan C57BL / 6J of gemengde genetische achtergrondstammen. Whole mount dual staining protocol of 3D confocale microscopie zijn goede orthogonale methoden om te bevestigen in hoeverre de ductale boom gevuld was (figuur 3). Deze weefselcorrele analyses zijn compatibel met en kunnen worden uitgevoerd na in vivo beeldvorming. De voor de hand liggende beperking van deze orthogonale methoden is dat ze dierlijke beëindiging vereisen voor weefselverzameling en -analyse; in een optimalisatiefase van een nieuwe ablatieve formulering bieden ze echter onafhankelijke validatie.
Figuur 1: Workflow van intraductale procedure en beeldanalyse. De belangrijkste stappen van de ID-procedure zijn gemarkeerd. Zie de video voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Succesvolle cannulatie en toediening van ablatieve oplossing aan meerdere borstklieren. (A) Representatieve tepelvariatie in FVB- en NSG-muisstammen. Lange tepels zijn gemakkelijker te cannuleren dan korte tepels, terwijl te korte of rudimentaire tepels niet kunnen worden gecannuleerd. Eenmaal gecannuleerd, heeft de grootte van de tepel geen invloed op een succesvolle intraductale levering. (B) Grove anatomische analyse van blauwe kleurstof in een ablatieve oplossing levert ex vivo bewijs van ductale boomvulling en leveringssucces. (C,D) Real-time fluoroscopie en post-image acquisitie 3D micro-CT-weergave bieden in vivo bewijs van leveringssucces. (D) Succesvolle injectie van zowel buik- als inguinale klieren en drie van de vier thoracale klieren (vetkusseninjectie in klier # 2). Schaalbalken komen overeen met 1 mm in afbeeldingen bij verschillende vergrotingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: In vivo en ex vivo demonstratie van ductale boomvulling. 70% EtOH/100 mM TaOx nanodeeltjes/Evans Blue oplossing werd intraductaal geïnjecteerd in de buikmarmale borstklier van de muis en onmiddellijk in beeld gebracht door micro-CT en verwerkt voor dubbele hele mount kleuring. Ductal tree werd gereconstrueerd met behulp van een softwarepakket voor beeldanalyse. De oplossing vult de met karmijn aluin bevlekte ductale boom volledig. Een afzonderlijke klier werd immunos gekleurd voor E-Cadherine (Cdh1), geklaard met Benzylalcohol:Benzylbenzoaat en in beeld gebracht door confocale microscopie zoals beschreven26. De ductale boom werd gereconstrueerd met behulp van beeldanalysesoftware. Pseudo-kleurweergave van confocale afbeelding (d.w.z. zwarte achtergrond naar wit, groen markeringssignaal naar magenta) werd verkregen met de beeldomkeringsfunctie van de beeldbewerkingssoftware. Schaalbalken komen overeen met 1 mm in afbeeldingen bij verschillende vergrotingen. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van referentie nr.3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Uitgeven | Uiterlijk | Oplossing | |||
| Korte tepel (Fig. 2) | Tepel heeft een laag profiel - moeilijk te grijpen | Het is soms gemakkelijker om de huid in de buurt van de tepel te houden en het midden van de tepel met de naald te richten. De naald zal waarschijnlijk onder de huid duiken. Langzaam optrekken kan onthullen dat de tepel iets over de punt van de naald ligt en ruimte geven om hem de rest van de weg op de naald te pakken en te trekken. Wees heel voorzichtig bij het duiken onder de huid over de hoek van de naald. Het is gemakkelijk om per ongeluk een vetkusseninjectie te krijgen door in de verkeerde hoek te steken. | |||
| Dikke tepel | Veel groter dan andere tepels met weinig afpelbare dode huid – gemakkelijk zichtbaar zonder bereik | Zeer eenvoudig om een vetkussen injectie op deze tepels te krijgen. Wees zeer voorzichtig met de hoek van de naald bij het inbrengen in de tepel. | |||
| Injectie met vetkussentje (fig. 2) | Gezwollen rond tepel en mogelijk in tepel zelf - het gemakkelijkst om te zien of kleur wordt toegevoegd aan de injectie-oplossing | Als de tepel opzwelt met de eerste paar ul geïnjecteerd, verwijder dan de naald en probeer opnieuw in te brengen met meer zorg voor de hoek. Begin opnieuw met de injectie en let op verdere zwelling. Als de zwelling aanhoudt, sta dan met de poging. Het is zeer zeldzaam om met succes een tepel te injecteren die is begonnen als een vetkusseninjectie. | |||
| Wonden/korstvorming | Open wond of korstvorming in de buurt van de injectieplaats van EtOH-oplossing | Breng drievoudige antibiotische zalf aan op open wonden, maar laat korstwonden met rust. Het aanbrengen van zalf op korstjes kan de kans vergroten dat dieren de korst storen en verwijderen. Controleer elke 1-2 dagen totdat deze genezen is, afhankelijk van de ernst van de wond. Carprofen moet worden gegeven totdat het genezen is, zelfs als het buiten het normale venster valt. | |||
Tabel 1: Probleemoplossing en nuttige tips.
Discussion
Profylactische mastectomie is momenteel de meest effectieve interventie voor borstkanker, maar het heeft een aantal ernstige negatieve gevolgen. Lokale ablatie van borstepitheelcellen met een op EtOH gebaseerde oplossing is een veelbelovende alternatieve therapie, zoals we hebben aangetoond in een proof-of-concept studie naar het agressieve FVB-Tg-C3(1)-TAg muismodel van borstkanker3. ID-injectie van deze ablatieve oplossing maakt het mogelijk om zich te richten op de borstepitheelcellen waaruit borstkanker ontstaat met beperkte nevenschade. Toevoeging van een röntgencontrastmiddel aan de ablatieve oplossing zorgt voor een beter begrip van de effectiviteit van de oplossing bij preventie, omdat we kunnen zien of elke ductale boom met succes wordt gevuld na injectie (figuur 2B). Het bekijken van geïnjecteerde klieren door fluoroscopie onmiddellijk na injectie weerspiegelt wat waarschijnlijk in de kliniek zal worden gedaan om een succesvolle vulling van de ductale boom te bevestigen. Visuele bevestiging van de levering van de oplossing zal het beste informeren of alle delen van de boom in realtime zijn bereikt. Dit kan het mogelijk maken om verdere injectie uit te voeren om de vulling op dat moment of in een toekomstige sessie te voltooien. Het is van groot belang dat de ablatieve oplossing alle delen van de ductale boom bereikt om ervoor te zorgen dat alle epitheelcellen toegankelijk zijn om te doden (figuur 3). Het achterlaten van levende epitheelcellen in de boom zou de mogelijkheid bieden dat borstkanker nog steeds zou kunnen ontstaan. Het gebruik van contrast in ID-injecties om het succes van de injectie in beeld te brengen, kan ook nuttig zijn voor andere formuleringen. Tabel 1 bevat probleemoplossing en nuttige tips. Andere studies hebben ID-toedieningsprotocollen beschreven voor virale deeltjes (bijv. AdCre, CRISPR-gids RNA's), hormonen, cytotoxische verbindingen, siRNA's en / of targetingmiddelen bij muizen3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ,38, ratten24,32,39,40,41 en konijnen42,43,44,45,46,47. Onafhankelijke klinische studies rapporteerden succesvolle cannulatie van maximaal acht kanalen per borst voor lokale toediening van chemotherapie40,48,49. Het visualiseren van volledige vulling bij het leveren van andere oplossingen gericht op preventie of gericht op behandeling zou om vergelijkbare redenen de moeite waard zijn. De wetenschap dat de oplossing alle takken en terminale uiteinden van de boom heeft bereikt, zal informatief zijn bij het beoordelen van succesvolle preventie of behandeling.
We zijn niet op de hoogte van andere intraductale beeldvormingsmethoden bij muizen33,34 of andere diermodellen47 die de hoge resolutie van TaOx-nanodeeltjes bieden. Van belang is dat TaOx in de muriene ductale boom beter presteert dan door de FDA goedgekeurde contrastmiddelen voor diagnostische ductografie3,16. Naarmate we de ID-ablatieve procedure blijven beoordelen op zijn vermogen om borstkanker te voorkomen, zullen we nauwkeuriger kunnen bepalen uit welke klieren kanker ontstaat met behulp van toegevoegde gegevens die worden gegeven via beeldvorming na ID-levering. Men zou bijvoorbeeld kunnen bepalen of een klier die slechts gedeeltelijk gevuld was, waarschijnlijker is dan een niet-geïnjecteerde klier om te resulteren in tumorvorming, wat het veiligheidsprofiel en de bezorgdheid van mislukte injecties bij een vrouw met een hoog risico aanpakt. Deze techniek heeft enkele beperkingen. Dit is een relatief uitdagende muistechniek die behendigheid en vaardigheid van de operator vereist om elk kanaal te manipuleren en met succes te cannuleren. Elke individuele injectie is een onafhankelijke gebeurtenis, dus mislukte injectie op een of meer klieren kan de interpretatie van het resultaat in gevaar brengen. Gezien de grootte van de muizenmatuurklier en de kwetsbaarheid van de tepel, is fluoroscopie of een soortgelijke beeldgeleidingstechniek niet beschikbaar om in realtime te informeren wanneer de infusie moet worden gestopt. Deze real-time beeldbegeleiding zal een vereiste zijn voor klinische implementatie van lokale levering van een ablatieve oplossing.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Cancer Institute R21 CA226579 en R01 CA258314 subsidies aan LFS en door het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 subsidie aan EMS. We willen het MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core-faciliteit bedanken voor het gebruik van hun beeldvormingssystemen en technische expertise. We willen Dr. Danielle Ferguson bedanken voor het bekijken van de inhoud van de video en de cijfers voor het naleven van de richtlijnen voor dierenwelzijn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Britt, K. L., Cuzick, J., Phillips, K. A. Key steps for effective breast cancer prevention. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 417-436 (2020).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal Gastroenterol. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal Gastroenterol. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the Breast Treated with Percutaneous Ethanol Injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutics Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50692 (2013).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Transactions of Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Res Treat. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Arora, R., et al. Insights from imaging the implanting embryo and the uterine environment in three dimensions. Development. 143 (24), 4749-4754 (2016).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Science Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast- A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 903-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translation Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. The Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. The Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. Biochemistry Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal Visualized Experiments: JoVE. (121), e55209 (2017).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Prevention Research (Philadelphia). 6 (1), 51-58 (2013).
