Summary
En metod för intraduktrisk injektion av reagenser för en etanol-baserade ablativ lösning på musen bröst duktal träd för in vivo imaging och bröstcancer förebyggande beskrivs. Injektion direkt i bröstvårtans öppning gör det möjligt att rikta in sig på bröst epitelceller med minimala skador på vävnad.
Abstract
Bröstcancer är den vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död för kvinnor i USA. För högriskkvinnor är profylaktisk mastektomi den mest effektiva primära förebyggande strategin. Profylaktisk mastektomi är ett aggressivt kirurgiskt ingrepp som helt tar bort de bröst epitelceller från vilka bröstcancer uppstår tillsammans med den omgivande vävnaden. Vi försöker utveckla en minimalt invasiv intradukttal förfarande som ett alternativ till profylaktisk mastektomi att lokalt ablatera bröst epitelial cellerna innan de kan bli maligna. Vi och andra har utvecklat en intraduktrisk leverans förfarande för att nå och behandla dessa epitelial celler i gnagare modeller av bröstcancer. Medan mus bröstkörteln med en enda icke-anastomosed duktal trädöppning vid bröstvårtan har en mycket mindre komplex och plågsam arkitektur än det mänskliga bröstet, kemiskt inducerad och genetiskt konstruerade musmodeller av bröstcancer är värdefulla för att producera proof-of-concept studier av nya förebyggande strategier. Här beskriver vi ett förfarande för intraduktrisk leverans av en etanol-baserade ablativ lösning som innehåller micro-CT/röntgen tantal-baserade kontrastmedel inom musen bröst duktal träd för terapeutiska ändamålet primära förebyggande av bröstcancer. Intradukttal leverans av vattenhaltiga reagenser (t.ex. cytotoxiska föreningar, siRNAs, AdCre) har tidigare beskrivits i musmodeller. Således fokuserar vi vår protokollbeskrivning på metodologiska modifieringar och unika experimentella överväganden för att optimera leverans av etanol, för att minimera lokala och systemiska biverkningar av etanoladministration och för in vivo visualisering av duktal trädfyllning via mikro-CT / fluoroskopi imaging. Visualisering av duktalträdet omedelbart efter injektion av en kontrasthaltiga lösning möjliggör bekräftelse av fullständig fyllning eller misslyckade resultat som underfyllning eller överfyllning. Denna procedur kan tillämpas för leverans och avbildning av andra ablativa föreningar som syftar till antingen förhindra tumör bildas eller lokalt behandla tidiga tumörer tillgängliga via duktal träd.
Introduction
Bröstcancer är en vanlig och potentiellt dödlig sjukdom med få alternativ tillgängliga för förebyggande1. Den mest effektiva interventionen är profylaktisk mastektomi; Emellertid, endast högrisk individer väljer att genomgå denna procedur eftersom det är en operation med stora livsförändrande konsekvenser2. Förfarandet tar helt bort de bröst epitelceller från vilka bröstcancer uppstår tillsammans med den omgivande vävnaden. Detta kan resultera i fysisk, psykisk och social stress för individen, och ofta avskräcker individer från att fortsätta med detta kirurgiska ingrepp som sin första rad av primära ingripande.
Vi har visat att leverans av en ablativ lösning som innehåller 70% etanol (EtOH) direkt i duktal träd är effektivt för att döda bröst epitelial celler med begränsad säkerhet vävnad skador och att förebygga bröst tumörer i mus modeller3. EtOH har länge använts kliniskt som ablativt eller skleroserande medel för lokal behandling. Perkutan EtOH injektion används som ett ablativt medel för ouppnåeliga levertumörer, njur- och binjurenematörplasmer och bukspottskörteln cystic tumörer4,5,6; för celiac plexus neurolys för att minska smärta7; och för behandling av bröst pseudoaneurysms8. Intravaskulära EtOH injektion används som skleroserande medel för att eliminera svullnad och deformation från arteriovenous missbildningar (AVM), och för kosmetisk behandling av spindelvener och åderbråck9,10,11,12,13. Liksom profylaktisk mastektomi beror framgången med förebyggande med lokal leverans av en ablativ lösning på förmågan att helt ta bort alla bröst epitelceller från vilka cancer potentiellt kan uppstå. Detta kräver bekräftelse på att det ablativa ämnet framgångsrikt har fyllt duktalträdet och därmed kontaktat alla bröst epitelceller direkt. Kliniska medel för att injicera ämnen i bröstkörtlarna och visualisera dem genom bildstyrd fluoroskopi eller duktografi är lätt tillgängliga14,15. Därför kommer det att vara möjligt att både leverera och bekräfta framgångsrik leverans när detta förfarande kan motivera utvärdering i kliniska prövningar.
Att påvisa genomförbarheten av denna bildstyrda metod i laboratoriedjur är ett viktigt steg för att fastställa effektiviteten och translationell genomförbarhet av intraduktal (ID) ablation som en förebyggande åtgärd för bröstcancer. I vårt laboratorium har vi utvecklat en metod för att framgångsrikt injicera alla bröstkörtlar hos möss med en ablativ lösning som innehåller ett kontrastmedel under en veckoinjektion för att säkerställa att djuret inte ger efter för en överdos av EtOH (figur 1, figur 2, referensnr. 3,16). Denna procedur placerar en 34 G nål inuti bröstvårtans öppning av en isofluran-sövd mus för att injicera testlösningen. Några viktiga förbättringar av förfarandet inkluderar användning av gastäta sprutor för vätska och gaser, injektion av högre volymer per duktal träd17 och utökad antiinflammatorisk behandling. Den prekliniska behandlingen av 5 mg/kg carprofen, ett NSAID, från 2 d före till 7 d efter ID-förfarandet är i linje med den kliniska sklerosbehandlingen för AVM. Vanligtvis, efter systemisk anestesi, patienterna får antiinflammatoriska läkemedel, såsom NSAID, i 2 dagar efter ingreppet som kan förlängas för att mildra eventuell lokal inflammation eller smärta12. Alkoholförgiftning mildras avsevärt genom intraperitoneal injektion av en 5% sackaroslösning hos möss. Med administrering av denna sackaroslösning kan möss injiceras säkert med upp till 160 μL av 70% EtOH (upp till fyra duktalträd; ca 0,4 g/dL EtOH-innehåll i blod); djur som helt återhämtat sig inom 4 timmar efter ID-injektioner. För injektion av mer än fyra körtlar hos möss och/eller högre EtOH koncentrationer, utför vi sekventiella sessioner för att tillåta tillräckligt med återhämtningstid. Alkoholförgiftning hos kvinnor skulle vara ett mindre problem på grund av den lägre andelen alkoholmängd till kroppsvikt. Med tanke på antalet duktalträd i mänskliga bröst14,15, cirka 16, och uppskattad volym för att fylla varje trädkanal18,19, kommer upp till 32 ml 70% EtOH att administreras. Denna mängd kommer att vara mycket lägre än 50 ml 95% EtOH administreras i andra kliniska förfaranden4,9. Intravenös administrering av tiamin- och glukoslösning kan användas för att ytterligare minimera effekterna av EtOH-förgiftning, särskilt i fall där en större total volym EtOH kan behöva injiceras och/eller för kvinnor som har en lägre tolerans mot alkoholkonsumtion (t.ex. allelicvarianter i alkohol eller aldehyddehydrogenaser).
Avbildning via mikro-CT/fluoroskopi gör det möjligt för oss att bekräfta framgångsrik duktal fyllning av varje körtel (figur 1, figur 2, figur 3). Detta kan registreras för framtida analys, eller bedömas i ögonblicket via fluoroskopiavbildning i realtid, som skulle göras vid klinisk tillämpning, för att begränsa den totala strålningsbördan som åläggs djuret. För att ytterligare förbättra specifika egenskaper hos denna ablativa lösning för bildstyrd leverans i realtid in vivo jämförde vi tidigare FDA-godkänd jodinnehållande kontrast till en tantaloxid (TaOx)-innehållande nanopartikel som syntetiserats av Shapiro lab3,16. TaOx visade överlägsen prestanda som ett mikro-CT kontrastmedel för att visualisera den första fyllningen av duktal träd (figur 2, figur 3). TaOx kan användas som referenskontrast för att utföra en mer systematisk och longitudinell bedömning av andra nanopartikelbaserade kontrastmedel i blodpoolen (t.ex. jod-, vismut- eller guldhaltigt) och kompatibilitet hos TaOx med olika koncentrationer av etylcellulosa som geleringsmedel20,21.
Protocol
Alla experiment som beskrivs här utfördes enligt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Michigan State University.
1. Utökad antiinflammatorisk behandling
- Se till att möss som får injektionslösningar som innehåller EtOH eller andra potentiella irriterande ämnen förses med antiinflammatorisk behandling från 2 dagar före injektion till 7 dagar efter injektionen. Den föredragna doseringsmetoden är oral leverans genom en sukralosgelkopp som innehåller carprofen vid en lämplig koncentration.
- Förbered carprofen med önskad koncentration. För detta experiment framställdes en arbetslösning på 2 mg/ml (Stocklösning är 50 mg/ml) genom utspädning i steril PBS för att injicera 0, 5 ml för att uppnå en slutlig dos på 1 mg per kopp. Tillsätt 1% v/v sterilt blått matfärgämne (BFD) i stället för en bråkdel av PBS av den totala volymen som behövs för utspädning för att bättre visualisera fullständig blandning av läkemedlet i sukralosgelen.
- Förbered en kopp för carprofen-tillsats enligt tillverkarens rekommendation. Om inget annat rekommenderas, placera koppen i 60 °C vattenbad i 15 min. Ta bort kopparna och torka av dem för att minimera risken för förorening.
- Använd 70% EtOH eller en EtOH-torka för att rengöra ytan på kopplocket och låt torka. Använd en spruta för att injicera den nödvändiga mängden carprofenlösning genom locket. För detta experiment injiceras 500 μL. Täck injektionsstället med ett klistermärke och skaka kraftigt i 15 s.
- Virvel koppen för 15 s, och sedan lagra för senare användning efter visuellt verifierad fullständig blandning. Kontrollera kopparna för homogen blandning genom att leta efter mörkblå klumpar. Låt kopparna komma till rumstemperatur innan du flyttar till kylskåpet för förvaring upp till en månad.
OBS: Dessa koppar kan också förvaras i rumstemperatur när de har doserings, om det behövs, men var noga med att vara uppmärksam på läkemedelseffektivitetsvägledning från tillverkaren. Att datera klistermärket hjälper till att hålla reda på injektionsdatumet utan att riskera en penna eller en skarp markör som punkterar locket.
- När du är klar att använda, torka av utsidan av koppen med 70% EtOH. Skala av locket och placera koppen i buret med mössen. Byt ut kopparna varannan dag eller när de är tomma. En kopp bör räcka för upp till fem möss i 1-2 dagar.
2. Preoperativ förberedelse
OBS: Detta steg kommer att ske 2-3 dagar före injektionen.
- Bedöva musen med en isofluranförångare (2%-3% isofluran, 1,5 L/min syre) och applicera ögonsmörjmedel. Håll anestesi vid 1%-3% isofluran efter behov under hela proceduren med en noskon samtidigt som du noggrant övervakar djurets andningshastighet.
- Applicera ögonsmörjmedlet på musögonen medan du sitter vid noskonen och placera sedan musen på ryggen. Använd en bomullsspetsad applikator för att applicera receptfri depilatorisk kräm på bröstvårtan (det område av bröstkörteln som kommer att injiceras). Gnid in grädden i området i 10-30 s med applikatorn för att hjälpa till att lossa pälsen snabbt.
OBS: Lämna inte krämen på djuret längre än nödvändigt och ta bort helt för att undvika att bränna huden. - Efter 10-30 s av applikationen, använd varmt vatten på gasväv för att helt ta bort grädden och lossa pälsen från djuret. Utför minst två till fyra sköljningar av området med färsk gasväv för gräddborttagning innan du torkar med en ren torr gasväv efter den slutliga sköljningen. Kontrollera området för pälsborttagning för att bekräfta god sikt och tillgång till bröstvårtorna. Upprepa med depilatorisk krämapplikation om det behövs.
- Placera musen i en separat ren, torr återhämtningsbur på en värmeplatta för att återhämta sig från anestesi. Observera musen tills den har återhämtat sig helt från anestesi och returnera den till hemburen.
- Förse mössen med en kopp sukralosgellösning som innehåller carprofen (1 mg/kopp) för fördosering av det antiinflammatoriska medlet efter återhämtning. En kopp kan ge upp till fem möss med carprofen i upp till 2 dagar. Kontrollera koppen dagligen och byt ut vid behov, eller varannan dag om den inte är helt förbrukad.
3. Intraduktiv injektion
OBS: Detta steg kommer att inträffa 2-3 dagar efter preoperativ förberedelse.
- Förbered 333,3 mM tantaloxid (TaOx) buljonglösning från upphandlad pulverformulering enligt beskrivningen i 16 med hjälp av fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Använd mild värme om pulvret inte löses upp helt i lösningen.
- Gör en ablativ avbildningslösning genom att blanda tre delar lager TaOx med sju delar 100% EtOH för en slutlig 70% EtOH 100mM TaOx lösning. Tillsätt 1% v/v blått matfärgämne till den slutliga lösningen för stödd visualisering under injektionen. Förbered en volym baserat på behovet av experimentet.
OBS: Körtelparen 1 och 5 kan rymma upp till 30 μL av lösningen medan alla andra par kan injiceras med upp till 50 μL hos 9 veckors ålder eller äldre FVB-möss. - Bedöva musen med isofluran som i preoperativ förberedelse och flytta musen till noskonen när den är helt bedövad. Applicera ögonsmörjmedel innan du placerar djuret på ryggen för injektionen. Fäst musen under stereoskopet med tejp om det behövs.
- Förbered sprutan med önskad injektionslösning. Ladda 21-51 μL av injektionslösningen i en 50 μL spruta med en 34 G nål fastsatt. Ladda ytterligare 1 μL av lösningen för att ta hänsyn till det potentiella läckaget av den volymen efter att nålen har tagits bort från nippeln.
OBS: Volymerna ovan är för de typiska procedurer som presenteras här. Man kan injicera vilken volym som helst som önskas med förståelsen att de flesta körtlar kommer att överfyllas om man går över 30 μL respektive 50 μL i körtelpar 1 respektive 5, eller 2-4. Det är bra att fylla nålen med ytterligare volym av injektionslösningen för att testa för lösningens fria flöde omedelbart före injektionen. Om du injicerar mer än en bröstkörtel, förfyll flera sprutor för att spara tid. Lämna dock inte lösningen i sprutan länge. - Förbered bröstvårtorna för injektionen genom att ta bort eventuell död hud som täcker bröstvårtans öppning med fina spetsiga tångar.
- Håll nippeln försiktigt med pincett. Med nålens avfasning synlig, sätt in nålen i nippelöppningen tills avfasningen är helt täckt med vägledning från fina tippade tångar. Det kan vara nödvändigt att dra upp bröstvårtan på nålen i stället för att trycka in nålen i bröstvårtan (tabell 1).
- När nålfasningen är helt omgiven av nippeln och är i huvudkanalen, börja injicera lösningen med en jämn hastighet av cirka 40 μL/min. Undvik att injicera för snabbt för att säkerställa att duktalträdet inte skadas. Håll nålen i bröstvårtan i 30 s efter att volymen är helt injicerad innan du tar bort nålen med hjälp av tången. Detta görs för att undvika att lösningen rinner ut ur bröstvårtan (bild 2).
- Utvärdera området för tecken på misslyckad injektion. Ett kupolutseende kan tyda på en fettkudde injektion eller trauma till området.
- Fortsätt att injicera de återstående bröstkörtlarna.
- Medan djuret fortfarande bedövas, injicera 200-250 μL 5% sackaroslösning (upp till 10 ml/kg) intraperitoneally för att minimera de potentiella effekterna av alkoholförgiftning.
4. Mikro-CT-avbildning
- Efter att ha injicerat alla önskade körtlar, flytta djuret snabbt till mikro-CT-systemet och fortsätt att upprätthålla anestesi med hjälp av den inbyggda isofluranförångaren. Djuret kan tejpas för att standardisera bildåtergivningspositionen. Till exempel hjälper tejpning av varje bakben i ett förlängt läge till att hålla djurets benben längre från de nedre körtlarna av intresse för den resulterande bilden.
OBS: Djuren kan avbildas med hjälp av olika skanningsparametrar för visualisering av dukträdet om man är noga med att fastställa en lämplig acceptabel livstidsdos av strålning för djuret och de kumulativa doserna inte överstiger denna nivå. Fluoroskopi stillbilder och videor kan genereras utan att skannas för att ytterligare minska strålningsexponeringen (figur 2). - Placera musen i lämpligt synfält med funktionen för förhandsgranskning av fluoroskopi.
- Utför TaOx-avbildning av musdkottalträdet med god upplösning och möjlighet till upprepade standard (2 min) förvärvsskanningar. Använd följande skanningsparametrar: 90 kVp/88 μA; synfält (FOV), 36 mm; antal skivor, 512; skiva tjocklek, 72 μm; voxelupplösning, 72 μm3.
- Skaffa längre (4 eller 14 min) högupplösta skanningar för ännu bättre upplösning hos djur. Dessa är godtagbara som terminala förfaranden före dödshjälp. Dessa är dock inte godtagbara för djur att skannas längsgående med samma parametrar som det kommer att orsaka strålningssjuka.
- Efter att bildprotokollet har slutförts, avlägsna djuret från anestesi och överför till en separat ren, torr återhämtningsbur på en värmeplatta. Observera djuret tills det är helt återställt och returnera det sedan till hemburet. Håll djuren injicerade med ablativ lösning på carprofen till 7 dagar efter injektionen.
- Gör snabba återgivningar av alla skannade bilder i mikro-CT-programvaran (inbyggt system) för att bättre uppskatta eventuella kontrastläckor eller brist på fyllning (figur 2) utan formell analys.
- Utför ytterligare formell bildanalys för publicering eller detaljerad analys av skanningar som möjliggör segmentering av intresseområdet om så önskas (figur 3).
OBS: Den primära skillnaden mellan dessa metoder kommer att vara möjligheten att tröskel endast duktalträdet (formell återgivning) jämfört med att behöva tröskel hela bilden (snabb återgivning). Andra mätningar och bilder kan genereras med hjälp av programvarupaketen för att på bästa sätt visa framgången med duktal trädfyllning.
5. Bildanalys
- Utför rendering av det injicerade duktalträdet med hjälp av ett specialiserat programvarupaket. För att göra detta, segmentera ut bröstfettplattan med ytterligare bildbehandling.
- Om du vill segmentera fettkudden (mörkare fack jämfört med peritoneal hålighet, lårbensmuskler och hud) där duktalträdet av intresse finns, välj alternativet Spline Trace på den manuella menyn. Spåra fettkuddens kontur vid var tredje datasegment.
- Klicka på alternativet Sprid objekt från den halvautomatiska menyn för att ansluta alla spårade och odelade segment till ett enda objekt.
- Välj alternativet Tröskelvärdesvolym på den halvautomatiska menyn för att mata in önskat HU-intervall (300-3 000 HU är en bra utgångspunkt) och klicka sedan på knappen Tröskelåtergivning för att skapa en återgivning som bara visar kontrasten (TaOx) i duktalträdet och eliminerar mjukvävnad.
- Växla knappen Visa till Återgivning som primär om du bara vill visa 3D-återgivningen utan omgivande strukturer.
OBS: Ytterligare programvarufunktioner gör det möjligt att mäta 3D-återgivningen (dvs. längd, volym osv.).
Representative Results
Honmöss har fem par bröstkörtlar med ett enda duktalträd som öppnas vid bröstvårtan orifice22. Vid spetsarna på det utvecklande duktalträdet finns de slutliga ändknopparna (TEB), proliferativa strukturer som styr tillväxt och förgrening. Efter puberteten när förlängningsfasen är klar, återgår TEBs och blir funktionellt och anatomiskt oskiljbara från terminalkanaler eller alveolar knoppar23. Terminala duktal lobulär enheter tjänar en liknande funktion hos människor som TEBs gör hos möss och är de platser från vilka bröstcancer främst uppstår24,25. Vi kan injicera upp till 50 μL 70% EtOH-lösning för att fylla hela duktalträdet i bröst- och buktjurar hos 9 veckor gamla FVB/N, NSG och andra musstammar (figur 1, figur 2, figur 3, se referenser3,16). I ett typiskt experiment kan vi injicera upp till åtta bröstkörtlar med en ablativ lösning på 70% EtOH och 100 mM TaOx i två på varandra följande ID-förfaranden separerade med 7 dagar för att möjliggöra djuråtervinning (figur 2). Djuren avbildas med mikro-CT omedelbart efter den sista injektionen iD för att bedöma framgångsrik leverans av lösningen till hela dukträdet (figur 2). Enligt vår erfarenhet är bröstvårtorna av inguinallymfknutor körtlar lämpliga för injektion i cirka 60% av djuren och bröstvårtorna i livmoderhalskörtlarna i ca 40%. När det är lämpligt kan vi injicera upp till 30 μL 70% EtOH-lösning för att fylla hela duktalträdet i livmoderhals- och inguinallymfknutor (figur 2). FVB- och NSG-stammar uppvisar i allmänhet mer lämpliga bröstvårtor för injektion än C57BL/6J eller blandade genetiska bakgrundsstammar. Hela montering dubbel färgning protokoll eller 3D confocal mikroskopi är bra ortogonala metoder för att bekräfta i vilken utsträckning duktal träd fylldes (figur 3). Dessa vävnad-korrelera analyser är kompatibla med och kan utföras efter in vivo imaging. Den uppenbara begränsningen av dessa ortogonala metoder är att de kräver djuravslut för vävnadsuppsamling och analys; Men i en optimeringsfas av en ny ablativ formulering ger de oberoende validering.
Bild 1: Arbetsflöde för intradukttal procedur och bildanalys. Viktiga steg i ID-proceduren markeras. Se videon för mer information. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Framgångsrik kannulation och leverans av ablativ lösning till flera bröstkörtlar. A) Representativ nippelvariation i musstammarna FVB och NSG. Långa bröstvårtor är lättare att kanylera än korta bröstvårtor, medan för korta eller vestigiala bröstvårtor inte kanyleras. När du kanyleras påverkar storleken på bröstvårtan inte framgångsrik intraduktal leverans. (B) Grov anatomisk analys av blått färgämne i en ablativ lösning ger ex vivo bevis på duktal trädfyllning och leveransframgång. (C,D) Fluoroskopi i realtid och 3D-mikro-CT-återgivning i realtid ger in vivo-bevis på leveransframgång. (D) Framgångsrik injektion av både buk- och inguinalkörtlar och tre av fyra bröstkörtlar (fettkudde injektion i körtel #2). Skalningsstaplar motsvarar 1 mm i bilder vid olika förstoring. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: In vivo - och ex vivo-demonstration av duktal trädfyllning. 70% EtOH/100 mM TaOx nanopartiklar/Evans Blå lösning injicerades intraduktally i musen buken bröstkörteln och omedelbart avbildas av micro-CT och bearbetas för dubbla hela montering färgning. Duktal träd rekonstruerades med hjälp av en bild analys programvara paket. Lösningen fyller helt det karminalumfärgade dukträdet. En separat körtel var immunstained för E-Cadherin (Cdh1), rensas med hjälp av Benzyl Alcohol:Benzyl Benzoate och avbildas av confocal mikroskopi som beskrivs26. Duktal träd rekonstruerades med hjälp av bild analys programvara. Pseudofärgningsåtergivning av konfokal bild (dvs. svart bakgrund till vit, grön markörsignal till magenta) erhölls med bildinvertfunktionen hos bildredigeringsprogramvaran. Skalningsstaplar motsvarar 1 mm i bilder vid olika förstoring. Denna siffra har ändrats från referens nr 3. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Utfärda | Utseende | Lösning | |||
| Kort nippel (Bild 2) | Bröstvårtan har låg profil – svårt att greppa | Det är ibland lättare att hålla huden nära bröstvårtan och rikta in sig på mitten av bröstvårtan med nålen. Nålen kommer sannolikt att dyka under huden. Att dra upp långsamt kan avslöja att bröstvårtan är något över nålens spets och ge utrymme att ta tag i och dra den resten av vägen på nålen. Var mycket försiktig när du dyker under huden om nålens vinkel. Det är lätt att oavsiktligt få en fettkudde injektion genom att sticka i fel vinkel. | |||
| Fett bröstvårta | Mycket större än andra bröstvårtor med liten skalade död hud – lätt synlig utan omfång | Mycket lätt att få en fett pad injektion på dessa bröstvårtor. Var mycket försiktig med nålens vinkel när du sätter in i bröstvårtan. | |||
| Fettkudde injektion (Bild 2) | Svullen runt bröstvårtan och eventuellt i själva bröstvårtan – lättast att se om färg läggs till injektionslösningen | Om bröstvårtan sväller med de första ul injiceras, ta bort nålen och försök att sätta in igen med mer försiktighet. Börja injektionen igen och se upp för ytterligare svullnad. Om svullnaden fortsätter, överge försöket. Det är mycket sällsynt att framgångsrikt injicera en bröstvårta som har börjat som en fettkudde injektion. | |||
| Sår/skabbning | Öppet sår eller skabbning nära injektionsstället för EtOH-lösning | Applicera trippel antibiotikasalva på öppna sår men lämna skabbade sår ifred. Att applicera salva på scabs kan öka sannolikheten att djuret kommer att störa scab och ta bort den. Kontrollera var 1-2 dag tills den är läkt beroende på svårighetsgraden av såret. Carprofen ska ges tills den är läkt även om den är bortom det normala fönstret. | |||
Tabell 1: Felsökning och användbara tips.
Discussion
Profylaktisk mastektomi är för närvarande den mest effektiva interventionen för bröstcancer, men det har några allvarliga negativa effekter. Lokal ablation av bröst epitelial celler med en EtOH-baserad lösning är en lovande alternativ terapi som vi visade i en proof-of-concept studie på den aggressiva FVB-Tg-C3(1)-TAg mus modell av bröstcancer3. ID-injektion av denna ablativa lösning möjliggör inriktning av de bröst epitelceller från vilka bröstcancer uppstår med begränsad säkerhet skada. Tillägg av ett röntgenkontrastmedel till den ablativa lösningen möjliggör ökad förståelse för lösningens effektivitet vid förebyggande, eftersom vi kan se om varje duktalträd är framgångsrikt fyllt efter injektion (figur 2B). Att visa injicerade körtlar genom fluoroskopi omedelbart efter injektion speglar vad som sannolikt kommer att göras i kliniken för att bekräfta framgångsrik fyllning av duktalträdet. Visuell bekräftelse av lösningsleveransen informerar bäst om alla delar av trädet har nåtts i realtid. Detta kan göra det möjligt att utföra ytterligare injektion för att slutföra fyllningen vid den tidpunkten eller i en framtida session. Det är av stor vikt att ablativ lösning når alla delar av dukträdet för att säkerställa att alla epitelceller kan nås för avlivning (figur 3). Att lämna levande epitelceller i trädet skulle möjliggöra möjligheten att bröstcancer fortfarande kan uppstå. Använda kontrast i ID injektioner för att bild framgång av injektionen kan också vara användbart för andra formuleringar. Tabell 1 innehåller felsökning och användbara tips. Andra studier har beskrivit ID-leveransprotokoll för viruspartiklar (t.ex. AdCre, CRISPR guide RNAs), hormoner, cytotoxiska föreningar, siRNAs och/eller målmedel hos möss3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 38, råttor24,32,39,40,41 och kaniner42,43,44,45,46,47. Oberoende kliniska studier rapporterade framgångsrika cannulation av upp till åtta kanaler per bröst för lokal leverans av kemoterapi40,48,49. Att visualisera full fyllning när man levererar andra lösningar som syftar till förebyggande eller inriktad på behandling skulle vara värt av liknande skäl. Vetskapen om att lösningen har nått alla grenar och terminala ändar av trädet kommer att vara informativ för att bedöma framgångsrik förebyggande eller behandling.
Vi känner inte till några andra intraduktala avbildningsmetoder hos möss33,34 eller andra djurmodeller47 som ger hög upplösning av TaOx nanopartiklar. Observera att TaOx i murin duktalträdet överträffar FDA-godkända kontrastmedel för diagnostisk dukografi3,16. När vi fortsätter att bedöma ID-ablativproceduren för dess förmåga att förhindra bröstcancer, kommer vi att kunna bestämma mer exakt från vilka körtlar cancer uppstår med hjälp av ytterligare data som ges genom avbildning efter ID-leverans. Till exempel kan man avgöra om en körtel som bara var delvis fylld är mer sannolikt än en icke-injicerad körtel att resultera i tumörbildning, som adresserar säkerhetsprofilen och oron för misslyckade injektioner på en högriskkvinna. Denna teknik har vissa begränsningar. Detta är en relativt utmanande musteknik som kräver fingerfärdighet och skicklighet hos operatören för att manipulera och framgångsrikt kanylera varje kanal. Varje enskild injektion är en oberoende händelse så misslyckad injektion på en eller flera körtlar kan äventyra resultat tolkning. Med tanke på storleken på mkörteln och skörheten i bröstvårtan är fluoroskopi eller liknande bildvägledningsteknik inte tillgänglig för att informera i realtid när infusionen ska stoppas. Denna realtidsbild-vägledning kommer att vara ett krav för klinisk implementering av lokal leverans av en ablativ lösning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av National Cancer Institute R21 CA226579 och R01 CA258314 bidrag till LFS och av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 bidrag till EMS. Vi vill tacka MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core-anläggningen för användning av deras bildsystem och tekniska expertis. Vi vill tacka Dr. Danielle Ferguson för att ha granskat innehållet i videon och siffrorna för efterlevnaden av djurskyddsriktlinjerna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Britt, K. L., Cuzick, J., Phillips, K. A. Key steps for effective breast cancer prevention. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 417-436 (2020).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal Gastroenterol. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal Gastroenterol. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the Breast Treated with Percutaneous Ethanol Injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutics Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50692 (2013).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Transactions of Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Res Treat. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Arora, R., et al. Insights from imaging the implanting embryo and the uterine environment in three dimensions. Development. 143 (24), 4749-4754 (2016).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Science Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast- A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 903-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translation Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. The Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. The Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. Biochemistry Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal Visualized Experiments: JoVE. (121), e55209 (2017).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Prevention Research (Philadelphia). 6 (1), 51-58 (2013).
