Summary
생체 내 이미징 및 유방암 예방을 위한 마우스 유방 덕트 트리에 대한 에탄올 계 성 절제용용 시약의 내분사 주입 방법이 설명되어 있다. 젖꼭지 개구부에 직접 주사하면 최소한의 부수적 인 조직 손상으로 유방 상피 세포를 대상으로 할 수 있습니다.
Abstract
유방암은 미국에 있는 여자를 위한 암 관련 죽음의 가장 널리 퍼진 암 그리고 두 번째 주요한 원인입니다. 고위험 여성의 경우 예방 유방 절제술은 가장 효과적인 기본 예방 전략입니다. 예방 유방 절제술은 유방암이 주변 조직과 함께 발생하는 유방 상피 세포를 완전히 제거하는 공격적인 외과 적 수술입니다. 우리는 예방 유방 절제술의 대안으로 최소 침습 적 인 자궁 내 절차를 개발하여 유방 상피 세포를 로컬로 제거하여 악성이 될 수 있습니다. 우리와 그 외는 유방암의 설치류 모형에 있는 이 상피 세포에 도달하고 취급하기 위하여 관장 전달 절차를 개발했습니다. 젖꼭지에서 단일 비 해부학 덕트 트리 개구부를 가진 마우스 유방 선은 인간 유방 보다는 훨씬 적게 복잡하고 고문한 건축을 가지고 있는 동안, 유방암의 화학적으로 유도되고 유전으로 조작된 마우스 모형은 새로운 예방 전략의 개념 증명 연구 결과를 생성하는 귀중한. 여기서, 우리는 유방암의 1 차적인 예방의 치료 목적을 위해 마우스 유방 덕트 나무 내의 마이크로 CT/X 선 탄탈록 기지를 둔 조영제를 포함하는 에탄올 계 단면용액의 자궁 내 전달을 위한 절차를 기술합니다. 수성 시약의 내막 전달(예를 들어, 세포독성 화합물, siRNAs, AdCre)은 이전에 마우스 모델에 설명되어 왔다. 따라서, 우리는 에탄올의 전달을 최적화하고, 에탄올 투여의 국소 및 전신 부작용을 최소화하고, 마이크로 CT/형광검사 영상을 통해 덕트 트리 충전의 생체 내 시각화를 위한 방법론적 수정 및 독특한 실험적 고려 사항에 대한 프로토콜 설명을 집중합니다. 콘트라스트 함유 솔루션을 주입한 직후 덕트 트리의 시각화를 통해 충진 또는 과충과 같은 완전한 충진 또는 실패한 결과를 확인할 수 있습니다. 이 절차는 종양 형성을 방지하거나 덕트 트리를 통해 접근 할 수있는 초기 단계 종양을 로컬로 치료하는 것을 목표로 다른 절제 화합물의 전달 및 이미징을 신청할 수 있습니다.
Introduction
유방암은 예방에 사용할 수있는 몇 가지 옵션을 가진 일반적이고 잠재적으로 치명적인 질병입니다1. 가장 효과적인 개입은 예방 유방 절제술입니다. 그러나, 만 고위험 개인은 주요 생활 변화 결과 수술이기 때문에이 절차를 수행하기로 결정2. 절차는 완전히 주변 조직과 함께 유방암이 발생하는 유방 상피 세포를 제거합니다. 이 개인에 대 한 물리적, 심리적, 사회적 스트레스 귀착될 수 있습니다., 그리고 종종 기본 개입의 그들의 첫 번째 라인으로이 외과 수술을 진행에서 개인을 단념.
우리는 덕트 트리에 직접 70 % 에탄올 (EtOH)을 포함하는 절제 용액의 전달이 제한된 부수적 조직 손상으로 유방 상피 세포를 죽이고 마우스 모델3에서 유방 종양을 예방하는 데 효과적이라는 것을 입증했습니다3. EtOH는 오랫동안 현지 치료를 위한 절제 또는 경화제로 임상적으로 사용되어 왔습니다. 경피 EtOH 주사는 절제할 수 없는 간 종양, 신장 및 부신 생물, 췌장 낭포성 종양4,5,6에 대한 부호제로서 사용된다; 체강 신경 정 해 통증을 줄이기 위해 신경 정 해에 대 한7; 유방 의사 동맥 을 치료하기위한 8. 내트라바스 내 EtOH 주사는 동맥 기형 (AVM)에서 붓기와 변형을 제거하고 거미 정맥류및 정맥류 정맥류9,10,11,12,13의 화장품 치료를 위해 경화제로 사용됩니다. 예방 유방 절제술과 마찬가지로, 암이 잠재적으로 발생할 수있는 모든 유방 상피 세포를 완전히 제거하는 능력에 달려 있는 절제적 용액의 현지 전달로 예방의 성공은 달려 있습니다. 이것은 절제물질이 성공적으로 덕트 트리를 채웠다는 확인이 필요하며, 따라서 모든 유방 상피 세포에 직접 접촉합니다. 유방 땀샘 내의 물질을 주입하고 이미지 유도 형광소 또는 덕트그래피에 의해 이를 시각화하는 임상 적 수단은 쉽게 사용할 수 14,15; 따라서, 이 절차가 임상 시험에서 평가를 보증할 수 있을 때 성공적인 납품을 전달하고 확인하는 것이 모두 가능할 것이다.
실험실 동물에서 이 화상 유도 접근의 타당성을 입증하는 것은 유방암을 위한 예방 측정으로 자궁 내 (ID) 절제의 효험 그리고 번역 타당성을 확립하는 중요한 단계입니다. 우리의 실험실에서, 우리는 성공적으로 동물이 EtOH의 과다 복용에 굴복하지 않도록 주간 주사의 과정을 통해 조영제를 포함하는 절제 용액으로 마우스에 있는 모든 유방 땀샘을 주입하는 방법을 개발했습니다 (그림 1, 도 2, 참조 Nos.3,16). 이 절차는 시험 용액을 주입하기 위해 이소플루란 마취 마우스의 젖꼭지 개구부 내부에 34 G 바늘을 배치합니다. 절차의 몇 가지 주요 개선은 액체와 가스에 대한 가스 밀착 주사기의 사용, 덕트 나무 당 높은 볼륨의 주입17, 확장 항 염증 처리를 포함한다. ID 시술 후 2d에서 7d까지 의 전임상 치료는 AVM에 대한 임상 경화 요법과 일치합니다. 전형적으로, 전신 마취 후에, 환자는 어떤 국소 염증 또는 고통을 완화하기 위하여 연장될 수 있는 2 일 후에 절차, 비 스테로이드 성 소염 진통제와 같은 항염증제 약물을 수신합니다12. 알코올 중독은 마우스에서 5% 자당 용액의 복막 내 주입에 의해 현저히 완화된다. 이 자당 용액의 투여로 마우스는 최대 160 μL의 70 % EtOH (최대 4 개의 덕트 트리; 혈액에 EtOH 함량의 약 0.4 g /dL)로 안전하게 주입 될 수 있습니다. 동물은 ID 주사 후 4 시간 이내에 완전히 회복되었습니다. 쥐 및/또는 더 높은 EtOH 농도에서 4개 이상의 땀샘을 주입하기 위해, 우리는 충분한 회복 시간을 허용하기 위해 순차적인 세션을 수행합니다. 여자에 있는 알콜 중독은 체중에 알콜 량의 더 낮은 비율로 인해 더 적은 관심사일 것입니다. 인간 유방14,15의 덕트 나무의 수를 감안할 때, 약 16, 각 나무 덕트를 채우기 위해 추정 된 부피18,19, 최대 32 mL의 70% EtOH가 투여될 것이다. 이 양은 다른 임상 절차4,9에서 투여된 95% EtOH의 50mL보다 훨씬 낮을 것이다. 티아민과 포도당 용액의 정맥 투여는 EtOH 중독의 효과를 더 최소화하는 데 사용될 수 있으며, 특히 EtOH의 총 부피가 알코올 소비에 대한 내성이 낮은 여성(예: 알코올 또는 알데히드 탈수소의 동종 변형)을 주입해야 할 수도 있습니다.
마이크로 CT/형광법 검사를 통한 이미징을 통해 각 선의 성공적인 덕트 충진을 확인할 수 있습니다(그림 1, 그림 2, 그림 3). 이것은 동물에 부과된 전반적인 방사선 부담을 제한하기 위하여 임상 응용에서 행해질 것과 같이, 실시간 형광고 화상 진찰을 통해 순간에 기록될 수 있습니다. 생체 내에서 실시간 이미지 유도 전달을 위한 이 절제솔루션의 특정 특징을 더욱 개선하기 위해, 이전에는 FDA승인요오드 함유 요오드를 샤피로 연구소3,16에서 합성한 탄탈륨 산화물(TaOx)함유 나노입자와 비교했습니다. TaOx는 덕트 트리의 초기 충전을 시각화하기 위한 마이크로 CT 조영제로서 우수한 성능을 보였다(도 2, 도 3). TaOx는 다른 나노입자 계 혈투풀 조영제(예를 들어 요오드, 비스무트 또는 금 함유)와 탄광의 상이한 농도의 TaOx의 호환성을 보다 체계적이고 세로적인 평가를 수행하기 위해 기준 대조로서 사용될 수 있다20,21.
Protocol
여기에 설명 된 모든 실험은 미시간 주립 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다.
1. 항염증 제 치료 확대
- EtOH 또는 기타 잠재적 자극제를 함유한 주사 용액을 받는 마우스가 주사 후 2일에서 7일까지 항염증제 치료를 제공하도록 하십시오. 바람직한 도징 방법은 적절한 농도에서 카프로펜을 함유하는 수크랄로스 젤 컵을 통한 경구 전달이다.
- 필요한 농도로 카프로펜을 준비합니다. 이 실험을 위해, 2 mg/mL(스톡 용액은 50 mg/mL)의 작업 용액은 0.5 mL을 주입하여 컵 당 1 mg의 최종 투여량을 달성하기 위해 멸균 PBS로 희석하여 제조하였다. 희석에 필요한 총 부피의 PBS 의 일부에 1 % v /v 멸균 블루 식품 염료 (BFD)를 추가하여 약물의 완전한 혼합을 sucralose 젤로 더 잘 시각화하십시오.
- 제조업체의 권장 사항에 따라 카프로펜 을 추가할 컵을 준비하십시오. 달리 권장하지 않는 한 컵을 60 °C 수조에 15 분 동안 놓습니다. 컵을 제거하고 오염의 가능성을 최소화하기 위해 그들을 건조.
- 70% EtOH 또는 EtOH 닦아 컵 뚜껑의 표면을 청소 하 고 건조 할 수 있도록. 주사기를 사용하여 뚜껑을 통해 필요한 양의 카프로펜 용액을 주입하십시오. 이 실험을 위해 500 μL이 주입됩니다. 주사 부위를 스티커로 덮고 15s용으로 힘차게 흔들어 줍니다.
- 컵을 15 초 동안 소용돌이한 다음 시각적으로 완전한 혼합을 확인한 후 나중에 사용할 수 있습니다. 진한 파란색 덩어리를 찾아 균일한 혼합컵을 확인하십시오. 최대 1개월까지 보관하기 위해 냉장고로 이동하기 전에 컵을 실온으로 이동하도록 허용합니다.
참고: 이 컵은 필요한 경우 한 번 투약하면 실온에서 보관할 수 있지만 제조업체의 약물 효능 지침에주의를 기울이십시오. 스티커를 데이트하면 뚜껑을 뚫는 펜이나 날카로운 마커를 위험에 빠뜨리지 않고 주사 날짜를 추적하는 데 도움이 됩니다.
- 사용할 준비가 되면 70% EtOH로 컵 의 외관을 닦아냅니다. 뚜껑을 벗겨 쥐와 함께 케이지에 컵을 넣습니다. 매일 또는 비어있을 때 컵을 교체하십시오. 1컵은 1-2일 동안 최대 5마리의 마우스에 충분해야 합니다.
2. 수술 전 준비
참고: 이 단계는 주입 2-3 일 전에 발생합니다.
- 이소플루란 기화기(2%-3%, 산소 1.5L/분)를 사용하여 마우스를 마취하고 눈 윤활유를 적용합니다. 동물의 호흡 속도를 주의 깊게 모니터링하면서 코 콘으로 시술 내내 필요에 따라 1 %-3 %의 이소플루란에서 마취를 유지하십시오.
- 코 콘에있는 동안 마우스 눈에 눈 윤활제를 적용한 다음 마우스를 뒷면에 배치합니다. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 젖꼭지 부위(주입될 유방 선 의 영역)에 카운터 디필레토리 크림을 바르습니다. 어플리케이터로 크림을 10-30초 간 문질러 모피를 빠르게 풀어줍니다.
참고: 크림을 필요 이상으로 동물에 두지 말고 피부를 태우지 않도록 완전히 제거하십시오. - 10-30년대 의 적용 후, 거즈에 따뜻한 물을 사용하여 크림을 완전히 제거하고 동물에서 털을 풀어주세요. 크림 제거를 위한 신선한 거즈로 이 지역의 2~4개 헹구기를 한 후 깨끗한 드라이 거즈로 건조시드합니다. 모피 제거 영역을 확인하여 좋은 가시성과 젖꼭지에 대한 액세스를 확인하십시오. 필요한 경우 디필 크림 응용 프로그램과 함께 반복하십시오.
- 마우스를 별도의 깨끗하고 건조한 복구 케이지에 놓고 마취에서 회복합니다. 그것은 완전히 마취에서 회복 될 때까지 마우스를 관찰하고 홈 케이지에 반환합니다.
- 회수 후 항염증제의 사전 투약에 대한 카프로펜(1 mg/cup)을 함유한 수크랄로스 젤 용액 1컵을 마우스에게 제공한다. 1컵은 최대 2일 동안 최대 5마리의 마우스를 카프로펜으로 제공할 수 있습니다. 매일 컵을 확인하고 필요에 따라 또는 완전히 소비되지 않은 경우 매일 교체하십시오.
3. 내막 주사
참고: 이 단계는 수술 전 준비 후 2-3일 후에 발생합니다.
- 인산완충식염(PBS)을 이용하여 16년에 설명된 바와 같이 조달된 분말 제형으로부터 333.3m 탄탈륨 산화물(TaOx) 스톡 용액을 준비한다. 파우더가 용액에 완전히 녹지 않으면 부드러운 따뜻함을 사용하십시오.
- 최종 70% EtOH 100m TaOx 용액에 7부 100% EtOH와 3개의 부품 재고 TaOx를 혼합하여 단계적 이미징 솔루션을 만드세요. 주입 중 보조 시각화를 위한 최종 솔루션에 1% v/v 블루 푸드 염료를 추가합니다. 실험의 필요성에 따라 볼륨을 준비합니다.
참고: Gland 쌍 1 및 5는 용액의 최대 30 μL을 보유할 수 있으며 다른 모든 쌍은 9주 이상 FVB 마우스에서 최대 50μL로 주입될 수 있습니다. - 수술 전 준비에서와 같이 이소플루란으로 마우스를 마취하고 마우스를 완전히 마취하면 코 콘으로 이동합니다. 주사를 위해 동물을 등에 놓기 전에 눈 윤활유를 바르습니다. 필요한 경우 테이프를 사용하여 입체 범위 아래에 마우스를 고정합니다.
- 주사 용액의 원하는 부피로 주사기를 준비합니다. 34G 바늘이 부착된 50 μL 주사기에 주입 용액의 21-51 μL을 적재합니다. 바늘이 젖꼭지에서 제거 된 후 해당 부피의 잠재적 누출을 설명하기 위해 용액의 추가 1 μL을로드합니다.
참고: 위의 볼륨은 여기에 제시된 일반적인 절차에 대한 것입니다. 하나는 대부분의 땀샘이 각각 1과 5, 또는 2-4 쌍에서 30 μL 또는 50 μL 이상으로 가는 경우 초과 채워질 것이라는 이해와 함께 원하는 임의의 부피를 주입할 수 있습니다. 주사 직전에 용액의 자유로운 흐름을 테스트하기 위해 주사 용액의 추가 부피로 바늘을 채우는 것이 도움이 된다. 하나 이상의 유방 동맥을 주입하는 경우, 시간을 절약하기 위해 여러 주사기를 미리 작성합니다. 그러나 용액을 오랫동안 주사기에 두지 마십시오. - 젖꼭지 개구부를 미세 한 뾰족한 집게로 덮는 죽은 피부를 제거하여 주입을위한 젖꼭지를 준비하십시오.
- 젖꼭지를 핀셋으로 부드럽게 잡습니다. 바늘의 벨이 보이면, 미세 한 팁 집게의 지침 도움으로 벨이 완전히 덮일 때까지 젖꼭지 개구부에 바늘을 삽입하십시오. 젖꼭지를 젖꼭지로 밀어 넣는 대신 젖꼭지를 바늘로 끌어 올려야 할 수도 있습니다 (표 1).
- 바늘 벨이 젖꼭지에 완전히 둘러싸여 있고 주 덕트에 있으면 약 40 μL/min의 일정한 속도로 용액을 주입하기 시작합니다. 덕트 트리가 손상되지 않도록 너무 빨리 주입하지 마십시오. 집게를 사용하여 바늘을 제거하기 전에 볼륨이 완전히 주입 된 후 30 s의 젖꼭지에 바늘을 유지하십시오. 이것은 젖꼭지에서 유출되는 용액을 피하기 위해 수행됩니다 (그림 2).
- 실패한 주입의 흔적에 대한 영역을 평가. 돔형 외관은 지방 패드 주입 또는 외상을 나타낼 수 있습니다.
- 나머지 유방 땀샘을 주입진행합니다.
- 동물이 여전히 마취되는 동안, 알코올 중독의 잠재적 인 효과를 최소화하기 위해 5 % 자당 용액 (최대 10 mL / kg)의 200-250 μL을 주입하십시오.
4. 마이크로 CT 이미징
- 원하는 모든 땀샘을 주입한 후, 동물을 마이크로 CT 시스템으로 신속하게 이동하고 통합된 이소플루란 기화기를 사용하여 마취를 계속 유지한다. 상기 동물은 이미징 위치를 표준화하기 위해 테이핑될 수 있다. 예를 들어, 각 뒷다리를 확장 된 위치에 테이핑하면 동물의 다리 뼈가 결과 이미지에 대한 관심의 낮은 땀샘에서 더 멀리 유지하는 데 도움이됩니다.
참고: 동물은 동물에 대한 적절한 수명 방사선 량을 결정하고 누적 투여량이 이 수준을 초과하지 않는 경우 덕트 트리의 시각화를 위한 상이한 스캔 파라미터를 사용하여 이미지를 촬영할 수 있다. 형광법 스틸 및 비디오는 방사선 노출을 더욱 줄이기 위해 스캔을 수행하지 않고 생성 될 수 있습니다 (그림 2). - 불소 검사 미리 보기 기능을 사용 하 여 적절한 시야에 마우스를 배치합니다.
- 반복 표준 (2 분) 획득 스캔에 대한 좋은 해상도와 기회와 마우스 덕트 트리의 TaOx 이미징을 수행합니다. 다음 스캔 매개 변수를 사용하십시오: 90 kVp/88 μA; 시야(FOV), 36mm; 슬라이스 수, 512; 슬라이스 두께, 72 μm; 복셀 해상도, 72 μm3.
- 동물의 더 나은 해상도를 위해 더 이상 (4 분 또는 14 분) 고해상도 스캔을 획득하십시오. 이들은 안락사 전에 터미널 절차로 허용됩니다. 그러나 이들은 방사선 병을 일으키는 원인이 될 것과 같은 매개 변수를 사용하여 세로로 검사되는 동물이 허용되지 않습니다.
- 이미징 프로토콜 이완료 후 마취에서 동물을 제거하고 가열 패드에 별도의 깨끗하고 건조한 복구 케이지로 옮길 수 있습니다. 완전히 회복 될 때까지 동물을 관찰한 다음 홈 케이지로 돌아갑니다. 주입 후 7 일까지 카프로펜에 절제 용액을 주입 한 동물을 유지하십시오.
- 공식 분석 없이 대비 누출 또는 충전 부족(그림 2)을 더 잘 인식하기 위해 마이크로 CT 소프트웨어(내장 시스템) 내의 스캔된 이미지를 빠르게 변환합니다.
- 원하는 경우 관심 영역의 세분화를 허용하는 스캔의 게시 또는 세부 분석을 위해 추가 형식 이미지 분석을 수행합니다(그림 3).
참고: 이러한 메서드 간의 주요 차이점은 전체 이미지(빠른 변환)를 임계값으로 임계값을 유지해야 하는 덕트 트리(형식 변환)만 임계값을 임계값으로 설정합니다. 다른 측정 및 이미지는 덕트 트리 충진의 성공을 가장 잘 입증하기 위해 소프트웨어 패키지를 사용하여 생성될 수 있습니다.
5. 이미지 분석
- 특수 소프트웨어 패키지를 사용하여 주입된 덕트 트리렌더링을 수행합니다. 이렇게하려면 추가 이미지 처리로 매머 지방 패드를 분류하십시오.
- 관심있는 덕트 트리가 포함되어있는 지방 패드 (복막 구멍, 대퇴 근육 및 피부에 비해 어두운 구획)을 분할하려면 수동 메뉴에서 스플리라인 추적 옵션을 선택하십시오. 세 번째 데이터 슬라이스마다 지방 패드 윤곽선을 추적합니다.
- 반자동 메뉴에서 배포 객체 옵션을 클릭하여 추적되지 않은 모든 조각을 단일 개체에 연결합니다.
- 반자동 메뉴에서 임계값 볼륨 옵션을 선택하여 원하는 HU 범위(300-3,000 HU는 좋은 출발점)를 입력한 다음 임계값 변환 버튼을 클릭하여 덕트 트리 내에서 콘트라스트(TaOx)만 표시하고 연조직을 제거하는 변환을 만듭니다.
- 뷰 버튼을 기본으로 전환하여 주변 구조 없이3D 변환만 볼 수 있습니다.
참고: 추가 소프트웨어 기능을 사용하면 3D 변환(예: 길이, 볼륨 등)으로 측정할 수 있습니다.
Representative Results
암컷 마우스는 젖꼭지 orifice22에서 열리는 단 하나 덕트 트리와 유방 땀샘의 5 쌍을 가지고 있습니다. 개발 덕트 트리의 끝에서 말단 끝 싹 (TEBs), 직접 성장과 분기증을 증식 구조입니다. 신장 단계가 완료되면 사춘기 후, TEBs회귀하고 기능적으로 및 해부학적으로 말단 덕트 또는 폐포 싹23과 구별할 수 없게된다. 말기 덕트 소엽 단위는 TEB가 마우스에서 하는 것과 같이 인간에서 유사한 기능을 봉사하고 유방암이 주로 생기는 사이트입니다24,25. 우리는 9 주 된 FVB / N, NSG 및 기타 마우스 균주의 흉부 및 복부 유방 땀샘의 전체 덕트 트리를 채우기 위해 70 % EtOH 용액의 최대 50 μL을 주입 할 수 있습니다 (그림 1, 그림 2, 도 3, 참조 참조3,16 참조 참조). 일반적인 실험에서는 동물 회복을 위해 7일까지 분리된 2회 연속 ID 절차에서 70%의 EtOH 및 100mM TaOx의 절제용용액으로 최대 8개의 유방땀샘을 주입할 수 있다(그림 2). 동물은 마지막 ID 주입 직후 마이크로 CT에 의해 이미지되어 전체 덕트 트리에 대한 용액의 성공적인 전달을 평가합니다(그림 2). 우리의 경험에서, 잉게날 땀샘의 젖꼭지는 약 40%에서 동물의 약 60% 및 자궁 경관선의 젖꼭지에 있는 주입에 적합합니다. 적합한 경우, 자궁 경부 및 잉게인 유방 땀샘의 전체 덕트 트리를 채우기 위해 70 % EtOH 용액의 최대 30 μL을 주입 할 수 있습니다 (그림 2). FVB 및 NSG 균주는 일반적으로 C57BL/6J 또는 혼합 유전 배경 균주 보다 주사에 대 한 더 적합한 젖꼭지를 제시. 전체 마운트 이중 염색 프로토콜 또는 3D 공초점 현미경 검사는 덕트 트리가 어느 정도 채워졌는지 확인하는 좋은 직교 방법이다(도 3). 이러한 조직 상관 관계 분석은 생체 내 이미징 후에 호환되며 수행할 수 있습니다. 이러한 직교 방법의 명백한 한계는 조직 수집 및 분석을 위해 동물 종결이 필요하다는 것입니다. 그러나, 새로운 절제의 최적화 단계에서, 그들은 독립적 인 유효성 검사를 제공합니다.
그림 1: 인트라덕트 절차 및 이미지 분석 워크플로우. ID 절차의 주요 단계가 강조 표시됩니다. 자세한 내용은 비디오를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 여러 유방 땀샘에 대한 절제용액의 성공적인 캐피레이션 및 전달. (A) FVB 및 NSG 마우스 균주에서 대표적인 젖꼭지 변종. 긴 젖꼭지는 짧은 젖꼭지보다 캐뉼러가 더 쉬운 반면, 너무 짧거나 흔적이 있는 젖꼭지는 캔핑할 수 없습니다. 일단 캐뉼러, 젖꼭지의 크기는 성공적인 장관 전달에 영향을 미치지 않습니다. (B) 절제용액에서 청색 염료의 총 해부학적 분석은 덕트 트리 충진 및 전달 성공의 전 생체 증거를 제공합니다. (C,D) 실시간 형광법 및 사후 이미지 수집 3D 마이크로 CT 변환은 전달 성공의 생체 내 증거를 제공합니다. (D) 복부와 잉게인샘을 성공적으로 주입하고, 4개의 흉부 선 중 3개(땀샘에서 지방 패드 주입 #2). 스케일 바는 다른 배율에서 이미지의 1mm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 덕트 트리 충전의 생체 내 및 전 생체 내 데모. 70% EtOH/100 mM TaOx 나노 입자/에반스 블루 용액은 마우스 복부 유방 선에 침입하여 즉시 마이크로 CT에 의해 이미지화되어 이중 전체 마운트 염색을 위해 처리하였다. 덕트 트리는 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 재구성되었습니다. 용액은 완전히 카민 명반 얼룩 덕트 트리를 채웁니다. 벤질 알코올:벤질 벤조아테를 사용하여 지워지고 설명된 바와 같이 공초점 현미경검사법에 의해 이미지된 E-Cadherin(Cdh1)에 대해 별도의 동맥이 면역염색되었다. 덕트 트리는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 재구성되었습니다. 공초점 이미지(즉, 흑백, 녹색 마커 신호에서 마젠타에 대한 검은 색 배경)의 의사 색칠 렌더링은 이미지 편집 소프트웨어의 이미지 반전 기능으로 얻어졌다. 스케일 바는 다른 배율에서 이미지의 1mm에 해당합니다. 이 그림은 참조 번호 3에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 출판하다 | 외관 | 용액 | |||
| 짧은 젖꼭지 (도 2) | 젖꼭지는 낮은 프로필을 가지고 - 잡기 어렵다 | 젖꼭지 근처에 피부를 잡고 바늘로 젖꼭지의 중심을 표적으로 하는 것이 때로는 쉽습니다. 바늘은 아마 피부 아래 다이빙 것입니다. 천천히 위로 당기는 것은 바늘의 끝 위에 약간 있는 젖꼭지를 드러내고 바늘에 그것의 나머지 를 잡아 당길 여유를 줄 수 있습니다. 바늘의 각도에 대해 피부 아래 다이빙 할 때 매우 조심하십시오. 실수로 잘못된 각도에서 찔러 지방 패드 주입을 얻을 수 있습니다. | |||
| 뚱뚱한 젖꼭지 | 벗겨지지 않는 죽은 피부를 가진 다른 젖꼭지보다 훨씬 더 큰 - 범위없이 쉽게 볼 수 있습니다. | 이 젖꼭지에 지방 패드 주입을 얻을 매우 쉽습니다. 젖꼭지에 삽입 할 때 바늘의 각도에 대해 매우 신중하십시오. | |||
| 지방 패드 주입 (도 2) | 젖꼭지 주위와 젖꼭지 자체에 부어 - 색상이 주입 솔루션에 추가되는지 확인하는 것이 가장 쉬운 | 젖꼭지가 처음 몇 ul 주입으로 붓는 경우, 바늘을 제거하고 각도로 더 주의를 기울여 다시 삽입하려고합니다. 주사를 다시 시작하고 추가 붓기를 조심하십시오. 붓기가 계속되면 시도를 포기하십시오. 그것은 성공적으로 지방 패드 주입으로 시작 된 젖꼭지를 주입 하는 것은 매우 드문. | |||
| 상처/딱지 | EtOH 용액의 주입 부위 근처에서 상처 나 딱 지재 | 상처를 열려면 삼중 항생제 연고를 바르지만 딱지 상처를 혼자 남겨 둡니다. 딱지에 연고를 바르면 동물이 딱지를 귀찮게하고 제거 할 가능성을 증가시킬 수 있습니다. 상처의 심각도에 따라 치유 될 때까지 1-2 일마다 확인하십시오. 카프로펜은 정상 창을 넘어도 치유될 때까지 주어져야 합니다. | |||
표 1: 문제 해결 및 유용한 팁.
Discussion
예방 유방 절제술은 현재 유방암을 위한 가장 효과적인 내정간섭입니다, 그러나 몇몇 심각한 부정적인 충격이 있습니다. EtOH 기반 용액을 가진 유방 상피 세포의 국소 절제는 우리가 유방암의 공격적인 FVB-Tg-C3 (1)-TAg 마우스 모형에 개념 증명 연구 결과에서 입증된 바와 같이 유망한 대체 요법입니다3. 이 절제용액의 ID 주사는 유방암이 제한된 부수적 손상으로 발생하는 유방 상피 세포의 표적화할 수 있게 합니다. 절제용액에 X선 조영제를 첨가하면 각 덕트 트리가 주입 후 성공적으로 채워졌는지 여부를 확인할 수 있으므로 예방 시 용액의 효과를 향상시킬 수 있습니다(그림 2B). 형광법에 의해 주입 된 땀샘을 보는 것은 즉시 주입 후 거울을 통해 경하 나무의 성공적인 충진을 확인하기 위해 클리닉에서 수행 될 가능성이 있는 작업을 수행합니다. 솔루션 제공에 대한 시각적 확인은 트리의 모든 부분이 실시간으로 도달했는지 여부를 가장 잘 알 수 있습니다. 이 시간에 또는 향후 세션에서 충전을 완료 하기 위해 추가 주입을 수행할 수 있습니다. 모든 상피 세포가 살인에 접근할 수 있도록 덕트 트리의 모든 부분에 도달하는 것은 매우 중요합니다(그림 3). 나무 안에 살아있는 상피 세포를 남겨두면 유방암이 여전히 발생할 수 있다는 가능성을 허용할 것입니다. 주사의 화상 성공에 ID 주사의 콘트라스트를 활용하는 것도 다른 제형에 유용할 수 있다. 표 1에서는 문제 해결 및 유용한 팁을 제공합니다. 다른 연구는 바이러스 성 입자에 대 한 ID 전달 프로토콜을 설명 (예를 들어, AdCre, CRISPR 가이드 RNA), 호르몬, 세포 독성 화합물, siRNAs 및/또는 마우스에서 표적 에이전트 3,16,27,28,29,29,31,32,34,35,36,36,37 38, rats24,32,39,40,41, 토끼 42,43,44,45,46,47. 독립적인 임상 연구는 화학요법의 현지 납품을 위한 유방 당 최대 8개의 덕트의 성공적인 통조림을 보고했습니다40,48,49. 예방을 목적으로 하거나 치료를 위해 준비된 다른 솔루션을 제공할 때 전체 충전을 시각화하는 것은 비슷한 이유로 가치가 있습니다. 솔루션이 나무의 모든 가지 및 터미널 끝에 도달했다는 지식은 성공적인 예방 또는 치료를 평가하는 데 도움이 될 것입니다.
우리는 TaOx 나노 입자의 고해상도를 감당할 수 있는 mice33,34 또는 그밖 동물 모형47에 있는 어떤 그밖 내traductal 화상 진찰 방법을 인식하지 못합니다. 참고, 뮤린 덕트 트리의 TaOx는 진단 덕트그래피3,16에 대한 FDA 승인 조영제보다 능가합니다. 유방암 예방 능력에 대한 ID 절제 절차를 계속 평가함에 따라, 우리는 ID 전달 후 이미징을 통해 제공되는 추가 데이터의 도움으로 땀샘암이 발생하는 것을 보다 정확하게 확인할 수 있을 것입니다. 예를 들면, 하나는 부분적으로 채워진 선이 고위험 여자에 있는 실패한 주사의 안전 장및 관심사를 해결하는 종양 형성귀착되기 위하여 비 주입된 동맥 보다는 확률이 높다는 것을 결정할 수 있었습니다. 이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이것은 각 덕트를 조작하고 성공적으로 캐너레이하는 운영자의 손재주및 숙련도가 필요한 비교적 어려운 마우스 기술입니다. 각 개별 주사는 독립적인 이벤트 이므로 하나 이상의 땀 샘에 실패 한 주입 결과 해석을 손상 시킬 수 있습니다. 뮤린 유방 선의 크기와 젖꼭지의 취약성, 불소 또는 유사한 이미지 유도 기술은 주입을 중지 할 때 실시간으로 알 릴 수 없습니다. 이 실시간 이미지 지침은 절제된 용액의 로컬 전달의 임상 구현을 위한 요구 사항이 될 것입니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로, 국립 암 연구소 R21 CA226579 및 R01 CA258314 LFS에 보조금과 국립 생물 의학 이미징 및 생물 공학 R01 EB01 EB029418 EMS에 보조금을 지원했다. 우리는 그들의 화상 진찰 시스템 및 기술 전문 지식을 사용하기 위한 양적 (IQ) 건강 과학 및 공학 영상 핵심 시설에 대한 MSU 연구소에게 감사드립니다. 다니엘 퍼거슨 박사에게 비디오 의 내용과 동물 복지 지침을 준수한 수치를 검토해 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
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