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Cancer Research

Administration intracanalaire et visualisation aux rayons X d’une solution ablative à base d’éthanol pour la prévention et le traitement local du cancer du sein dans des modèles murins

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63457
Automatic Translation
1,2, 1,3, 1,2, 1,4, 2,5, 2,6, 7,8, 9,10, 11, 2,6, 1,2
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Department of Pharmacology & Toxicology, College of Veterinary Medicine, Michigan State University, 4College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, 5Advanced Materials Characterization Laboratory/Materials Research Center, Missouri University of Science and Technology, 6Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Advanced Molecular Imaging Facility, Michigan State University, 7Department of Obstetrics Gynecology and Reproductive Biology, College of Human Medicine, Michigan State University, 8Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering, Michigan State University, 9Van Andel Research Institute, 10Miltenyi Biotec, 11Veterinary Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Summary

Une méthode d’injection intracanalaire de réactifs pour une solution ablative à base d’éthanol dans l’arbre canalaire mammaire de la souris pour l’imagerie in vivo et la prévention du cancer du sein est décrite. L’injection directement dans l’ouverture du mamelon permet de cibler les cellules épithéliales mammaires avec un minimum de dommages aux tissus collatéraux.

Abstract

Le cancer du sein est le cancer le plus répandu et la deuxième cause de décès lié au cancer chez les femmes aux États-Unis. Pour les femmes à haut risque, la mastectomie prophylactique est la stratégie de prévention primaire la plus efficace. La mastectomie prophylactique est une intervention chirurgicale agressive qui élimine complètement les cellules épithéliales mammaires à partir desquelles le cancer du sein provient avec les tissus environnants. Nous cherchons à développer une procédure intracanalaire mini-invasive comme alternative à la mastectomie prophylactique pour ablation locale des cellules épithéliales mammaires avant qu’elles ne deviennent malignes. Nous et d’autres avons développé une procédure d’administration intracanalaire pour atteindre et traiter ces cellules épithéliales dans des modèles de rongeurs du cancer du sein. Alors que la glande mammaire de la souris avec un seul arbre canalaire non anastomisé s’ouvrant au niveau du mamelon a une architecture beaucoup moins complexe et tortueuse que le sein humain, des modèles murins de cancer du sein induits chimiquement et génétiquement modifiés sont précieux pour produire des études de preuve de concept de nouvelles stratégies préventives. Ici, nous décrivons une procédure d’administration intracanalaire d’une solution ablative à base d’éthanol contenant un agent de contraste à base de micro-CT / rayons X à base de tantale dans l’arbre canalaire mammaire de la souris à des fins thérapeutiques de prévention primaire du cancer du sein. L’administration intracanalaire de réactifs aqueux (p. ex. composés cytotoxiques, siRNA, AdCre) a déjà été décrite dans des modèles murins. Ainsi, nous concentrons notre description de protocole sur les modifications méthodologiques et les considérations expérimentales uniques pour optimiser l’administration d’éthanol, pour minimiser les effets secondaires locaux et systémiques de l’administration d’éthanol et pour la visualisation in vivo du remplissage des arbres canalaires par imagerie micro-CT / fluoroscopie. La visualisation de l’arbre canalaire immédiatement après l’injection d’une solution contenant du contraste permet de confirmer le remplissage complet ou les résultats infructueux tels que le sous-remplissage ou le surremplissage. Cette procédure peut être appliquée pour l’administration et l’imagerie d’autres composés ablatifs visant soit à prévenir la formation de tumeurs, soit à traiter localement les tumeurs à un stade précoce accessibles via l’arbre canalaire.

Introduction

Le cancer du sein est une maladie courante et potentiellement mortelle avec peu d’options disponibles pour la prévention1. L’intervention la plus efficace est la mastectomie prophylactique; cependant, seules les personnes à haut risque choisissent de subir cette procédure, car il s’agit d’une chirurgie ayant des conséquences majeures qui changent leur vie2. La procédure élimine complètement les cellules épithéliales mammaires à partir desquelles le cancer du sein provient avec les tissus environnants. Cela peut entraîner un stress physique, psychologique et social pour l’individu, et dissuade souvent les individus de procéder à cette intervention chirurgicale comme première ligne d’intervention primaire.

Nous avons démontré que l’administration d’une solution ablative contenant 70% d’éthanol (EtOH) directement dans l’arbre canalaire est efficace pour tuer les cellules épithéliales mammaires avec des dommages tissulaires collatéraux limités et pour prévenir les tumeurs mammaires chez les modèles murins3. L’EtOH a longtemps été utilisé cliniquement comme agent ablatif ou sclérosant pour le traitement local. L’injection percutanée d’EtOH est utilisée comme agent ablatif pour les tumeurs hépatiques non résécables, les néoplasmes rénaux et surrénaliens et les tumeurs kystiques pancréatiques4,5,6; pour la neurolyse du plexus cœliaque afin de réduire la douleur7; et pour le traitement des pseudoanévrismes mammaires8. L’injection intravasculaire d’EtOH est utilisée comme agent sclérosant pour éliminer l’enflure et la déformation des malformations artérioveineuses (MAV), et pour le traitement cosmétique des varicosités et des varices9,10,11,12,13. Comme la mastectomie prophylactique, le succès de la prévention avec l’administration locale d’une solution ablative dépend de la capacité d’éliminer complètement toutes les cellules épithéliales mammaires à partir desquelles le cancer pourrait potentiellement survenir. Cela nécessite la confirmation que la substance ablative a rempli avec succès l’arbre canalaire, contactant ainsi directement toutes les cellules épithéliales mammaires. Des moyens cliniques d’injecter des substances dans les glandes mammaires et de les visualiser par fluoroscopie ou ductographie guidée par l’image sont facilement disponibles14,15; par conséquent, il sera possible à la fois de livrer et de confirmer la livraison réussie lorsque cette procédure peut justifier une évaluation dans les essais cliniques.

Démontrer la faisabilité de cette approche guidée par l’image chez les animaux de laboratoire est une étape clé dans l’établissement de l’efficacité et de la faisabilité translationnelle de l’ablation intracanalaire (ID) en tant que mesure préventive du cancer du sein. Dans notre laboratoire, nous avons mis au point une méthode pour injecter avec succès toutes les glandes mammaires chez la souris avec une solution ablative contenant un agent de contraste au cours d’injections hebdomadaires afin de s’assurer que l’animal ne succombe pas à un surdosage d’EtOH (Figure 1, Figure 2, référence nos 3,16). Cette procédure place une aiguille de 34 G à l’intérieur de l’ouverture du mamelon d’une souris anesthésiée à l’isoflurane pour injecter la solution d’essai. Certaines améliorations clés de la procédure comprennent l’utilisation de seringues étanches aux gaz pour les liquides et les gaz, l’injection de volumes plus élevés par arbre canalaire17 et un traitement anti-inflammatoire prolongé. Le traitement préclinique de 5 mg/kg de carprofène, un AINS, de 2 j avant à 7 j après la procédure d’IDENTIFICATION est conforme à celui du traitement sclérosant clinique pour la. En règle générale, après une anesthésie systémique, les patients reçoivent des médicaments anti-inflammatoires, tels que des AINS, pendant 2 jours après la procédure qui peuvent être prolongés pour atténuer toute inflammation ou douleur locale12. L’intoxication alcoolique est considérablement atténuée par l’injection intrapéritonéale d’une solution de saccharose à 5% chez la souris. Avec l’administration de cette solution de saccharose, les souris peuvent être injectées en toute sécurité avec jusqu’à 160 μL de 70% d’EtOH (jusqu’à quatre arbres canalaires; environ 0,4 g / dL de teneur en EtOH dans le sang); animaux complètement récupérés dans les 4 heures suivant les injections d’ID. Pour l’injection de plus de quatre glandes chez la souris et / ou des concentrations d’EtOH plus élevées, nous effectuons des séances séquentielles pour permettre un temps de récupération suffisant. L’intoxication alcoolique chez les femmes serait une préoccupation moindre en raison de la plus faible proportion d’alcool par rapport au poids corporel. Compte tenu du nombre d’arbres canalaires dans le sein humain14,15, environ 16, et du volume estimé pour remplir chaque conduit d’arbre18,19, jusqu’à 32 mL de 70% d’EtOH seront administrés. Cette quantité sera bien inférieure aux 50 mL d’EtOH à 95 % administrés dans d’autres procédures cliniques4,9. L’administration intraveineuse de thiamine et de solution de glucose pourrait être utilisée pour minimiser davantage les effets de l’intoxication à l’EtOH, en particulier dans les cas où un plus grand volume total d’EtOH peut devoir être injecté et / ou chez les femmes qui ont une tolérance plus faible à la consommation d’alcool (par exemple, des variantes alléliques dans l’alcool ou l’aldéhyde déshydrogénases).

L’imagerie par micro-tomodensitométrie/fluoroscopie nous permet de confirmer le remplissage canalaire réussi de chaque glande (Figure 1, Figure 2, Figure 3). Cela peut être enregistré pour une analyse future, ou évalué sur le moment via l’imagerie fluoroscopique en temps réel, comme cela serait fait en application clinique, afin de limiter la charge de rayonnement globale imposée à l’animal. Afin d’améliorer encore les caractéristiques spécifiques de cette solution ablative pour une livraison guidée par image en temps réel in vivo, nous avons précédemment comparé le contraste contenant de l’iode approuvé par la FDA à une nanoparticule contenant de l’oxyde de tantale (TaOx) synthétisée par le laboratoire Shapiro3,16. TaOx a montré des performances supérieures en tant qu’agent de contraste micro-CT pour visualiser le remplissage initial de l’arbre canalaire (Figure 2, Figure 3). TaOx peut être utilisé comme contraste de référence pour effectuer une évaluation plus systématique et longitudinale d’autres agents de contraste sanguins à base de nanoparticules (par exemple, l’iode, le bismuth ou l’or) et la compatibilité du TaOx avec différentes concentrations d’éthylcellulose comme agent gélifiant20,21.

Protocol

Toutes les expériences décrites ici ont été menées selon des protocoles approuvés par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État du Michigan.

1. Traitement anti-inflammatoire prolongé

  1. Assurez-vous que les souris recevant des solutions injectables contenant de l’EtOH ou d’autres irritants potentiels reçoivent un traitement anti-inflammatoire de 2 jours avant l’injection à 7 jours après l’injection. La méthode de dosage préférée est l’administration orale par une tasse de gel de sucralose contenant du carprofène à une concentration appropriée.
  2. Préparez le carprofène avec la concentration requise. Pour cette expérience, une solution de travail de 2 mg/mL (la solution mère est de 50 mg/mL) a été préparée en diluant dans du PBS stérile pour injecter 0,5 mL afin d’obtenir une dose finale de 1 mg par tasse. Ajouter 1% v / v de colorant alimentaire bleu stérile (BFD) à la place d’une fraction du PBS du volume total nécessaire à la dilution afin de mieux visualiser le mélange complet du médicament dans le gel de sucralose.
  3. Préparez une tasse pour l’ajout de carprofène conformément à la recommandation du fabricant. Sauf recommandation contraire, placez la tasse au bain-marie à 60 °C pendant 15 min. Retirez les gobelets et séchez-les pour minimiser les risques de contamination.
    1. Utilisez 70% d’EtOH ou une lingette EtOH pour nettoyer la surface du couvercle de la tasse et laisser sécher. Utilisez une seringue pour injecter la quantité nécessaire de solution de carprofène à travers le couvercle. Pour cette expérience, 500 μL sont injectés. Couvrir le site d’injection avec un autocollant et agiter vigoureusement pendant 15 s.
    2. Vortex la tasse pendant 15 s, puis stocker pour une utilisation ultérieure après avoir vérifié visuellement le mélange complet. Vérifiez les tasses pour un mélange homogène en recherchant des touffes bleu foncé. Laissez les tasses arriver à la température ambiante avant de passer au réfrigérateur pour un stockage jusqu’à un mois.
      REMARQUE: Ces tasses peuvent également être conservées à température ambiante une fois dosées, si nécessaire, mais prenez soin de faire attention aux conseils d’efficacité des médicaments du fabricant. La datation de l’autocollant aide à garder une trace de la date d’injection sans risquer qu’un stylo ou un marqueur pointu perfore le couvercle.
  4. Lorsqu’il est prêt à l’emploi, essuyez l’extérieur de la tasse avec 70% d’EtOH. Retirez le couvercle et placez la tasse dans la cage avec les souris. Remplacez les tasses tous les deux jours ou lorsqu’elles sont vides. Une tasse devrait suffire pour jusqu’à cinq souris pendant 1-2 jours.

2. Préparation préopératoire

REMARQUE: Cette étape aura lieu 2-3 jours avant l’injection.

  1. Anesthésier la souris à l’aide d’un vaporisateur d’isoflurane (2% -3% d’isoflurane, 1,5 L / min d’oxygène) et appliquer un lubrifiant pour les yeux. Maintenir l’anesthésie à 1% -3% d’isoflurane au besoin tout au long de la procédure avec un cône de nez tout en surveillant attentivement la fréquence respiratoire de l’animal.
  2. Appliquez le lubrifiant pour les yeux sur les yeux de la souris au niveau du cône du nez, puis positionnez la souris sur le dos. Utilisez un applicateur à pointe de coton pour appliquer une crème dépilatoire en vente libre sur la zone du mamelon (la zone de la glande mammaire qui sera injectée). Frottez la crème dans la zone pendant 10 à 30 s avec l’applicateur pour aider à desserrer la fourrure rapidement.
    REMARQUE: Ne laissez pas la crème sur l’animal plus longtemps que nécessaire et retirez-la complètement pour éviter de brûler la peau.
  3. Après 10-30 s de l’application, utilisez de l’eau tiède sur de la gaze pour retirer complètement la crème et desserrer la fourrure de l’animal. Effectuez au moins deux à quatre rinçages de la zone avec de la gaze fraîche pour l’élimination de la crème avant de sécher avec une gaze sèche propre après le rinçage final. Vérifiez la zone d’enlèvement de la fourrure pour confirmer une bonne visibilité et un bon accès aux mamelons. Répétez avec l’application de crème dépilatoire si nécessaire.
  4. Placez la souris dans une cage de récupération propre et sèche séparée sur un coussin chauffant pour récupérer de l’anesthésie. Observez la souris jusqu’à ce qu’elle se soit complètement remise de l’anesthésie et retournez-la dans la cage de la maison.
  5. Fournir aux souris une tasse de solution de gel de sucralose contenant du carprofène (1 mg / tasse) pour le pré-dosage de l’agent anti-inflammatoire après la récupération. Une tasse peut fournir jusqu’à cinq souris avec du carprofène pendant 2 jours. Vérifiez la tasse tous les jours et remplacez-la au besoin, ou tous les deux jours si elle n’est pas complètement consommée.

3. Injection intracanalaire

REMARQUE: Cette étape se produira 2-3 jours après la préparation préopératoire.

  1. Préparer une solution mère d’oxyde de tantale (TaOx) de 333,3 mM à partir de la formulation en poudre obtenue telle que décrite en 16 à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Utilisez une chaleur douce si la poudre ne se dissout pas complètement dans la solution.
  2. Faites une solution d’imagerie ablative en mélangeant trois parties de TaOx avec sept parties 100% EtOH pour une solution finale 70% EtOH 100mM TaOx . Ajouter 1% v/v de colorant alimentaire bleu à la solution finale pour une visualisation assistée pendant l’injection. Préparez un volume en fonction des besoins de l’expérience.
    REMARQUE: Les paires de glandes 1 et 5 peuvent contenir jusqu’à 30 μL de la solution tandis que toutes les autres paires peuvent être injectées avec jusqu’à 50 μL chez les souris FVB âgées de 9 semaines ou plus.
  3. Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane comme dans la préparation préopératoire et déplacez la souris vers le cône du nez une fois complètement anesthésiée. Appliquez du lubrifiant pour les yeux avant de placer l’animal sur le dos pour l’injection. Fixez la souris sous le stéréoscope à l’aide d’un ruban adhésif, si nécessaire.
  4. Préparez la seringue avec le volume souhaité de solution injectable. Charger 21-51 μL de la solution injectable dans une seringue de 50 μL avec une aiguille de 34 G attachée. Chargez 1 μL supplémentaire de la solution pour tenir compte de la fuite potentielle de ce volume après le retrait de l’aiguille du mamelon.
    REMARQUE: Les volumes ci-dessus sont pour les procédures typiques présentées ici. On peut injecter n’importe quel volume désiré en sachant que la plupart des glandes seront surchargées si elles dépassent 30 μL ou 50 μL dans les paires de glandes 1 et 5, ou 2-4, respectivement. Il est utile de remplir l’aiguille avec un volume supplémentaire de la solution injectable pour tester la libre circulation de la solution immédiatement avant l’injection. Si vous injectez plus d’une glande mammaire, préremplissez plusieurs seringues pour gagner du temps. Cependant, ne laissez pas la solution dans la seringue longtemps.
  5. Préparez les mamelons pour l’injection en enlevant toute peau morte qui recouvre l’ouverture du mamelon avec de fines pinces pointues.
  6. Tenez doucement le mamelon avec une pince à épiler. Avec le biseau de l’aiguille visible, insérez l’aiguille dans l’ouverture du mamelon jusqu’à ce que le biseau soit entièrement recouvert avec l’aide d’une pince à pointe fine. Il peut être nécessaire de tirer le mamelon sur l’aiguille plutôt que de pousser l’aiguille dans le mamelon (tableau 1).
  7. Une fois que le biseau de l’aiguille est complètement entouré par le mamelon et se trouve dans le conduit principal, commencez à injecter la solution à un taux régulier d’environ 40 μL / min. Évitez d’injecter trop rapidement pour vous assurer que l’arbre canalaire n’est pas endommagé. Gardez l’aiguille dans le mamelon pendant 30 s après l’injection complète du volume avant de retirer l’aiguille à l’aide de la pince. Ceci est fait pour éviter que la solution ne se répande hors du mamelon (Figure 2).
    1. Évaluez la zone pour tout signe d’injection infructueuse. Une apparence en forme de dôme peut indiquer une injection de coussinet adipeux ou un traumatisme dans la région.
    2. Procéder à l’injection des glandes mammaires restantes.
  8. Pendant que l’animal est encore anesthésié, injecter 200-250 μL de solution de saccharose à 5% (jusqu’à 10 mL / kg) par voie intrapéritonéale pour minimiser les effets potentiels de l’intoxication alcoolique.

4. imagerie micro-CT

  1. Après avoir injecté toutes les glandes souhaitées, déplacez rapidement l’animal vers le système de micro-tomodensitométrie et continuez à maintenir l’anesthésie à l’aide du vaporisateur isoflurane incorporé. L’animal peut être scotché pour normaliser la position d’imagerie. Par exemple, le fait de coller chaque patte postérieure dans une position étendue aide à garder les os de la jambe de l’animal plus loin des glandes inférieures d’intérêt dans l’image résultante.
    REMARQUE: Les animaux peuvent être imagés à l’aide de différents paramètres de balayage pour la visualisation de l’arbre canalaire si l’on prend soin de déterminer une dose de rayonnement acceptable appropriée à vie pour l’animal et que les doses cumulatives ne dépassent pas ce niveau. Des photos et des vidéos de fluoroscopie peuvent être générées sans effectuer de scans pour réduire davantage l’exposition aux rayonnements (Figure 2).
  2. Positionnez la souris dans le champ de vision approprié avec la fonction de prévisualisation par fluoroscopie.
  3. Effectuez une imagerie TaOx de l’arbre canalaire de la souris avec une bonne résolution et la possibilité de scans d’acquisition standard répétés (2 min). Utilisez les paramètres de balayage suivants : 90 kVp/88 μA ; champ de vision (FOV), 36 mm; nombre de tranches, 512; épaisseur de la tranche, 72 μm; résolution voxel, 72 μm3.
    1. Acquérez des scans haute résolution plus longs (4 ou 14 min) pour une résolution encore meilleure chez les animaux. Celles-ci sont acceptables comme procédures terminales avant l’euthanasie. Ceux-ci ne sont toutefois pas acceptables pour les animaux à scanner longitudinalement en utilisant les mêmes paramètres car cela causera la maladie des radiations.
  4. Une fois le protocole d’imagerie terminé, retirez l’animal de l’anesthésie et transférez-le dans une cage de récupération propre et sèche séparée sur un coussin chauffant. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli, puis retournez-le dans la cage de la maison. Gardez les animaux injectés avec une solution ablative sur le carprofène jusqu’à 7 jours après l’injection.
  5. Effectuez des rendus rapides de toutes les images numérisées dans le logiciel micro-CT (système intégré) pour mieux apprécier les fuites de contraste ou le manque de remplissage (Figure 2) sans analyse formelle.
  6. Effectuer une analyse d’image formelle supplémentaire pour la publication ou une analyse détaillée des numérisations qui permettent de segmenter la zone d’intérêt si vous le souhaitez (Figure 3).
    REMARQUE: La principale différence entre ces méthodes sera la possibilité de seuilr uniquement l’arbre canalaire (rendu formel) par rapport à la nécessité de seuilr l’image entière (rendu rapide). D’autres mesures et images peuvent être générées à l’aide des progiciels pour démontrer au mieux le succès du remplissage des arbres canalaires.

5. Analyse d’images

  1. Effectuer le rendu de l’arbre canalaire injecté à l’aide d’un progiciel spécialisé. Pour ce faire, segmentez le coussinet adipeux mammaire avec un traitement d’image supplémentaire.
    1. Pour segmenter le coussinet graisseux (compartiment plus foncé par rapport à la cavité péritonéale, aux muscles fémoraux et à la peau) dans lequel se trouve l’arbre canalaire d’intérêt, sélectionnez l’option Trace de spline dans le menu manuel. Tracez le contour du coussinet de graisse à chaque tranche de données sur trois.
    2. Cliquez sur l’option Propager les objets dans le menu semi-automatique pour connecter toutes les tranches tracées et non tracées en un seul objet.
  2. Sélectionnez l’option Volume de seuil dans le menu semi-automatique pour saisir la plage hu souhaitée (300-3 000 HU est un bon point de départ), puis cliquez sur le bouton Rendu de seuil pour créer un rendu qui affiche uniquement le contraste (TaOx) dans l’arbre canalaire et élimine les tissus mous.
  3. Basculez le bouton Affichage sur Format associé comme principal pour afficher uniquement le format associé 3D sans structures environnantes.
    REMARQUE: Des fonctionnalités logicielles supplémentaires permettent d’effectuer des mesures du rendu 3D (longueur, volume, etc.).

Representative Results

Les souris femelles ont cinq paires de glandes mammaires avec un seul arbre canalaire qui s’ouvre à l’orifice du mamelon22. Aux extrémités de l’arbre canalaire en développement se trouvent les bourgeons terminaux (TEB), des structures prolifératives qui dirigent la croissance et la ramification. Après la puberté, lorsque la phase d’élongation est terminée, les TEB régressent et deviennent fonctionnellement et anatomiquement indiscernables des canaux terminaux ou des bourgeons alvéolaires23. Les unités lobulaires canalaires terminales remplissent une fonction similaire chez l’homme que les TEB chez la souris et sont les sites d’où provient principalement le cancer du sein24,25. Nous pouvons injecter jusqu’à 50 μL de solution d’EtOH à 70 % pour remplir tout l’arbre canalaire des glandes mammaires thoraciques et abdominales de FVB/N, NSG et d’autres souches de souris âgées de 9 semaines (Figure 1, Figure 2, Figure 3, voir références3,16). Dans une expérience typique, nous pouvons injecter jusqu’à huit glandes mammaires avec une solution ablative de 70% d’EtOH et 100 mM de TaOx dans deux procédures d’identification consécutives séparées par 7 jours pour permettre la récupération de l’animal (Figure 2). Les animaux sont photographiés par micro-tomodensitométrie immédiatement après la dernière injection d’ID afin d’évaluer la livraison réussie de la solution à l’ensemble de l’arbre canalaire (Figure 2). D’après notre expérience, les mamelons des glandes inguinales conviennent à l’injection chez environ 60% des animaux et les mamelons des glandes cervicales dans environ 40%. Lorsque cela convient, nous pouvons injecter jusqu’à 30 μL de solution d’EtOH à 70% pour remplir tout l’arbre canalaire des glandes mammaires cervicales et inguinales (Figure 2). Les souches FVB et NSG présentent généralement des mamelons plus appropriés pour l’injection que les souches C57BL/6J ou les souches de fond génétique mixte. Le protocole de double coloration à montage entier ou la microscopie confocale 3D sont de bonnes méthodes orthogonales pour confirmer dans quelle mesure l’arbre canalaire a été rempli (Figure 3). Ces analyses corrélées tissulaires sont compatibles avec l’imagerie in vivo et peuvent être effectuées après celle-ci. La limite évidente de ces méthodes orthogonales est qu’elles nécessitent une terminaison animale pour la collecte et l’analyse des tissus; cependant, dans une phase d’optimisation d’une nouvelle formulation ablative, ils fournissent une validation indépendante.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail de la procédure intracanalaire et de l’analyse d’images. Les étapes clés de la procédure d’identification sont mises en évidence. Veuillez consulter la vidéo pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Canulation réussie et livraison de solution ablative à plusieurs glandes mammaires. (A) Variété représentative du mamelon dans les souches de souris FVB et NSG. Les mamelons longs sont plus faciles à canuler que les mamelons courts, tandis que les mamelons trop courts ou vestigiaux ne peuvent pas être canulés. Une fois canulé, la taille du mamelon n’affecte pas la réussite de l’accouchement intracanalaire. (B) L’analyse anatomique globale du colorant bleu dans une solution ablative fournit des preuves ex vivo du remplissage et du succès de l’administration des arbres canalaires. (C,D) La fluoroscopie en temps réel et le rendu micro-CT 3D post-acquisition d’images fournissent des preuves in vivo du succès de la livraison. (D) Injection réussie des glandes abdominales et inguinales et de trois glandes thoraciques sur quatre (injection de coussinet adipeux dans la glande n ° 2). Les barres d’échelle correspondent à 1 mm dans les images à différents grossissements. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Démonstration in vivo et ex vivo du remplissage des arbres canalaires. 70% de nanoparticules EtOH / 100 mM TaOx / solution Evans Blue ont été injectées par voie intracanalaire dans la glande mammaire abdominale de la souris et immédiatement imagées par micro-CT et traitées pour une double coloration de montage entier. L’arbre canalaire a été reconstruit à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. La solution remplit entièrement l’arbre canalaire taché d’alun de carmin. Une glande distincte a été immunocolorée pour l’E-Cadhérine (Cdh1), éliminée à l’aide d’alcool benzylique:benzoate de benzyle et imagée par microscopie confocale comme décrit26. L’arbre canalaire a été reconstruit à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Le rendu pseudo-colorimétrique de l’image confocale (c.-à-d. fond noir à blanc, signal marqueur vert à magenta) a été obtenu avec la fonction d’inversion d’image du logiciel de retouche d’image. Les barres d’échelle correspondent à 1 mm dans les images à différents grossissements. Ce chiffre a été modifié par rapport à la référence n° 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Émettre Apparence Solution
Mamelon court (Fig. 2) Le mamelon a un profil bas - difficile à saisir Il est parfois plus facile de tenir la peau près du mamelon et de cibler le centre du mamelon avec l’aiguille. L’aiguille plongera probablement sous la peau. Tirer lentement vers le haut peut révéler que le mamelon est légèrement au-dessus de la pointe de l’aiguille et donner de la place pour l’attraper et le tirer le reste du chemin sur l’aiguille. Soyez très prudent lorsque vous plongez sous la peau sur l’angle de l’aiguille. Il est facile d’obtenir par inadvertance une injection de coussinet de graisse en poignardant au mauvais angle.
Mamelon gras Beaucoup plus gros que les autres mamelons avec peu de peau morte pelable – facilement visible sans portée Très facile d’obtenir une injection de coussinet de graisse sur ces mamelons. Soyez très prudent quant à l’angle de l’aiguille lors de l’insertion dans le mamelon.
Injection de coussinets adipeux (Fig. 2) Enflé autour du mamelon et peut-être dans le mamelon lui-même – plus facile à voir si la couleur est ajoutée à la solution injectable Si le mamelon gonfle avec les premiers ul injectés, retirez l’aiguille et essayez d’insérer à nouveau avec plus de soin et en prenant soin de l’angle. Recommencez l’injection et surveillez l’enflure supplémentaire. Si l’enflure persiste, abandonnez la tentative. Il est très rare d’injecter avec succès un mamelon qui a commencé comme une injection de coussinet adipeux.
Plaies/croûtes Plaie ouverte ou croûte près du site d’injection de la solution d’EtOH Appliquez une pommade antibiotique triple sur les plaies ouvertes, mais laissez les plaies croûtées seules. L’application d’une pommade sur les croûtes peut augmenter la probabilité que l’animal dérange la croûte et l’enlève. Vérifiez tous les 1-2 jours jusqu’à ce qu’il soit guéri en fonction de la gravité de la plaie. Le carprofène doit être administré jusqu’à ce qu’il soit guéri, même s’il est au-delà de la fenêtre normale.

Tableau 1 : Dépannage et conseils utiles.

Discussion

La mastectomie prophylactique est actuellement l’intervention la plus efficace pour le cancer du sein, mais elle a de graves répercussions négatives. L’ablation locale des cellules épithéliales mammaires avec une solution à base d’EtOH est une thérapie alternative prometteuse, comme nous l’avons démontré dans une étude de preuve de concept sur le modèle murin agressif FVB-Tg-C3(1)-TAg du cancer du sein3. L’injection ID de cette solution ablative permet de cibler les cellules épithéliales mammaires d’où provient le cancer du sein avec des dommages collatéraux limités. L’ajout d’un agent de contraste à rayons X à la solution ablative permet de mieux comprendre l’efficacité de la solution en matière de prévention, car nous pouvons voir si chaque arbre canalaire est rempli avec succès après l’injection (Figure 2B). L’observation des glandes injectées par fluoroscopie immédiatement après l’injection reflète ce qui sera probablement fait à la clinique pour confirmer le remplissage réussi de l’arbre canalaire. La confirmation visuelle de la livraison de la solution indiquera mieux si toutes les parties de l’arbre ont été atteintes en temps réel. Cela pourrait permettre d’effectuer une injection supplémentaire pour compléter le remplissage à ce moment-là ou lors d’une séance ultérieure. Il est très important que la solution ablative atteigne toutes les parties de l’arbre canalaire pour s’assurer que toutes les cellules épithéliales peuvent être accessibles pour tuer (Figure 3). Laisser derrière soi des cellules épithéliales vivantes dans l’arbre permettrait la possibilité que le cancer du sein puisse encore survenir. L’utilisation du contraste dans les injections d’ID pour imager le succès de l’injection pourrait également être utile pour d’autres formulations. Le tableau 1 fournit des conseils de dépannage et des conseils utiles. D’autres études ont décrit les protocoles d’administration d’ID pour les particules virales (par exemple, AdCre, LES ARN guides CRISPR), les hormones, les composés cytotoxiques, les siRNA et / ou les agents de ciblage chez la souris3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ,38, rats24,32,39,40,41 et lapins42,43,44,45,46,47. Des études cliniques indépendantes ont rapporté une canulation réussie de jusqu’à huit canaux par sein pour l’administration locale de chimiothérapie40,48,49. Visualiser le remplissage complet lors de la livraison d’autres solutions visant à la prévention ou orientées vers le traitement serait utile pour des raisons similaires. Le fait de savoir que la solution a atteint toutes les branches et extrémités terminales de l’arbre sera instructif pour évaluer la prévention ou le traitement réussi.

Nous ne connaissons aucune autre méthode d’imagerie intracanalaire chez la souris33,34 ou d’autres modèles animaux47 qui offrent la haute résolution des nanoparticules de TaOx. Il convient de noter que TaOx dans l’arbre canalaire murin surpasse les agents de contraste approuvés par la FDA pour la ductographie diagnostique3,16. Alors que nous continuons d’évaluer la procédure ablative ID pour sa capacité à prévenir le cancer du sein, nous serons en mesure de déterminer plus précisément à partir de quelles glandes le cancer provient à l’aide de données supplémentaires fournies par imagerie après l’accouchement ID. Par exemple, on pourrait déterminer si une glande qui n’a été que partiellement remplie est plus susceptible qu’une glande non injectée d’entraîner la formation d’une tumeur, ce qui répond au profil de sécurité et à la préoccupation des injections infructueuses sur une femme à haut risque. Cette technique a certaines limites. Il s’agit d’une technique de souris relativement difficile qui nécessite de la dextérité et des compétences de l’opérateur pour manipuler et canuler avec succès chaque conduit. Chaque injection individuelle est un événement indépendant, donc une injection infructueuse sur une ou plusieurs glandes peut compromettre l’interprétation des résultats. Compte tenu de la taille de la glande mammaire murine et de la fragilité du mamelon, la fluoroscopie ou une technique similaire de guidage par image n’est pas disponible pour indiquer en temps réel quand arrêter la perfusion. Ce guidage d’image en temps réel sera une exigence pour la mise en œuvre clinique de la livraison locale d’une solution ablative.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu, en partie, par les subventions R21 CA226579 et R01 CA258314 du National Cancer Institute à LFS et par la subvention R01 EB029418 de l’Institut national d’imagerie biomédicale et de bioingénierie à EMS. Nous tenons à remercier l’installation centrale d’imagerie quantitative des sciences de la santé (IQ) de l’Institut MSU pour l’utilisation de ses systèmes d’imagerie et de son expertise technique. Nous tenons à remercier la Dre Danielle Ferguson d’avoir examiné le contenu de la vidéo et les chiffres concernant le respect des lignes directrices sur le bien-être des animaux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AnalyzeDirect v12.0 Caliper n/a For micro-CT image processing
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL Allivet 50647 For anti-inflammatory treatment
Evans blue Sigma E2129-50G For injection visualization
Hot water bath Toolots Yidu_HH-S2 For preparing carprofen cups
Imaris Bitplane n/a For confocal image processing
MediGel Sucralose Cups ClearH2O 74-02-5022 For delivery of carprofen
Model 1705 RN Syringe, 50μL Hamilton 7655-01 For intraductal injection
Photoshop 2021 Adobe n/a For image processing
Quantum GX2 microCT Imaging System Perkin Elmer CLS149276 For micro-CT image acquisition
Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) Hamilton 207434 For intraductal injection
Stereo Microscope SZM Series AmScope SM-4TPZ-144 For intraductal injection
Sterile blue food dye McCormick 930641 For injection visualization
Sterile phosphate buffered saline (PBS) ThermoFisher 14190250 For solution preparation
Stickers DOT Scientific DOTSCI-C50 For preparing carprofen cups
Sucrose Calbiochem 8550-5KG For intraductal injection
Syringes Fisher 14-826-79 For preparing carprofen cups
Vortex VWR 10153-834 For preparing carprofen cups
Warming pump/pad(s) Braintree Scientific HTP-1500 120V; AP-R 26E For intraductal injection/preoperative preparation

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References

  1. Britt, K. L., Cuzick, J., Phillips, K. A. Key steps for effective breast cancer prevention. Nature Reviews Cancer. 20 (8), 417-436 (2020).
  2. Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
  3. Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
  4. Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
  5. Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal Gastroenterol. 18 (10), 1003-1008 (2012).
  6. Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal Gastroenterol. 19 (22), 3397-3403 (2013).
  7. Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
  8. Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the Breast Treated with Percutaneous Ethanol Injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
  9. Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutics Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
  10. Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
  11. Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
  12. Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
  13. Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
  14. Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
  15. Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
  16. Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
  17. Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50692 (2013).
  18. King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
  19. Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
  20. Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
  21. Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Transactions of Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
  22. Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
  23. Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
  24. Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Res Treat. 73 (1), 75-83 (2002).
  25. Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
  26. Arora, R., et al. Insights from imaging the implanting embryo and the uterine environment in three dimensions. Development. 143 (24), 4749-4754 (2016).
  27. Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Science Translational Medicine. 6 (217), (2014).
  28. de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
  29. Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast- A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 903-913 (2019).
  30. Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
  31. Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research and Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
  32. Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
  33. Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
  34. Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
  35. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
  36. Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51171 (2014).
  37. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59502 (2019).
  38. Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e4030 (2012).
  39. Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
  40. Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translation Medicine. 3 (106), (2011).
  41. Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
  42. Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. The Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
  43. Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. The Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
  44. Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. Biochemistry Journal. 115 (5), 58 (1969).
  45. Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
  46. Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
  47. Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal Visualized Experiments: JoVE. (121), e55209 (2017).
  48. Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
  49. Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Prevention Research (Philadelphia). 6 (1), 51-58 (2013).

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Cancer Research numéro 182 arbre canalaire intracanalaire glande mammaire ductographie ablation chimique procédure guidée par image
Administration intracanalaire et visualisation aux rayons X d’une solution ablative à base d’éthanol pour la prévention et le traitement local du cancer du sein dans des modèles murins
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Kenyon, E., Zaluzec, E. K., Powell,… More

Kenyon, E., Zaluzec, E. K., Powell, K., Volk, M., Chakravarty, S., Hix, J., Arora, R., Westerhuis, J. J., Kiupel, M., Shapiro, E. M., Sempere, L. F. Intraductal Delivery and X-ray Visualization of Ethanol-Based Ablative Solution for Prevention and Local Treatment of Breast Cancer in Mouse Models. J. Vis. Exp. (182), e63457, doi:10.3791/63457 (2022).

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