Summary
O protocolo descreve um método passo-a-passo para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos usando a proteína supressora de tumor p53 como exemplo. As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas a partir de células sob rigorosas condições de não desnaturação e desnaturação.
Abstract
A ubiquitinação é um tipo de modificação pós-translacional que regula não apenas a estabilidade, mas também a localização e a função de uma proteína de substrato. O processo de ubiquitinação ocorre intracelularmente em eucariotas e regula quase todos os processos biológicos celulares básicos. A purificação de proteínas ubiquitinadas auxilia na investigação do papel da ubiquitinação no controle da função das proteínas do substrato. Aqui, um procedimento passo-a-passo para purificar proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos é descrito com a proteína supressora de tumor p53 como exemplo. As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas sob rigorosas condições de não desnaturação e desnaturação. A proteína p53 total celular marcada com Flag foi purificada com agarose conjugada com anticorpos anti-Flag em condições não desnaturantes. Alternativamente, a proteína ubiquitinada celular total marcada com His foi purificada usando resina carregada de níquel sob condições de desnaturação. As proteínas p53 ubiquitinadas nos eluídos foram detectadas com sucesso com anticorpos específicos. Usando este procedimento, as formas ubiquitinadas de uma determinada proteína podem ser eficientemente purificadas a partir de células de mamíferos, facilitando estudos sobre os papéis da ubiquitinação na regulação da função da proteína.
Introduction
A ubiquitina é uma proteína conservada evolutivamente de 76 aminoácidos 1,2,3. A ubiquitina liga-se covalentemente aos resíduos de lisina nas proteínas-alvo através de cascatas que envolvem enzimas ativadoras (E1), conjugantes (E2) e ligase (E3). A ubiquitina é ativada pela primeira vez pela enzima E1 e é então transferida para as enzimas conjugadoras E2. Posteriormente, os ligases de ubiquitina E3 interagem com enzimas E2 carregadas de ubiquitina e proteínas de substrato e mediam a formação de uma ligação isopeptídica entre o terminal C da ubiquitina e um resíduo de lisina no substrato 1,2,3,4,5. A ubiquitinação envolve a ligação de metades de ubiquitina a resíduos de lisina em proteínas do substrato ou a si mesma, levando à monoubiquitinação ou poliubiquitinação de proteínas. Este processo de ubiquitinação ocorre intracelularmente em eucariotas e regula uma grande variedade de processos biológicos. A ubiquitinação resulta na degradação de proteínas do substrato através do sistema ubiquitina-proteassoma 1,2,3,4,5. Além disso, a ubiquitinação modula a localização subcelular de proteínas, a formação de complexos proteicos e o tráfico de proteínas nas células 3,5. Parcelas de ubiquitina ligadas a proteínas de substrato podem ser removidas por enzimas desubiquitinantes (DUBs)6,7. Notavelmente, as diferentes maneiras pelas quais as cadeias de ubiquitina são montadas fornecem uma miríade de meios para regular vários processos biológicos 1,5. Os papéis exatos da ubiquitinação na regulação da função proteica do substrato permanecem incompletamente compreendidos até agora. A purificação de proteínas ubiquitinadas contribui para a elucidação dos efeitos da ubiquitinação de proteínas em uma variedade de processos celulares.
A proteína p53 é uma das mais importantes proteínas supressoras de tumor e apresenta mutações genéticas ou inativação em quase todos os cânceres humanos 8,9,10,11. A estabilidade e a atividade do p53 são delicadamente reguladas in vivo por modificações pós-traducionais, incluindo ubiquitinação, fosforilação, acetilação e metilação12,13. A proteína p53 tem uma meia-vida curta variando de 6 min a 40 min em várias células, o que resulta principalmente de sua poliubiquitinação e subsequente degradação proteassômica10,12. O duplo minuto 2 do rato (Mdm2) é uma ligase de ubiquitina E3 de p53 que se liga ao N-terminal de p53 para inibir sua atividade transcricional12,14,15. O Mdm2 promove a poliubiquitinação e degradação proteassômica do p53 para controlar sua estabilidade e induz a monoubiquitinação do p53 para facilitar sua exportação nuclear12,14,15,16. Aqui, a ubiquitinação p53 mediada por Mdm2 é usada como exemplo para introduzir um método para a purificação de proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos em detalhes. Os reguladores que influenciam o status de ubiquitinação das proteínas-alvo podem ser identificados usando este ensaio de ubiquitinação in vivo quando são superexpressos ou derrubados / nocauteados em células de mamíferos. Além disso, proteínas ubiquitinadas podem ser usadas como substratos para o ensaio de desubiquitinação in vitro. Uma triagem de alto rendimento pode ser realizada para identificar DUBs específicos para proteínas-alvo, incubando substratos ubiquitinados com DUBs individuais. As proteínas ubiquitinadas podem atuar como um andaime para recrutar proteínas de sinalização a jusante nas células. Um complexo proteico-alvo ubiquitinado pode ser purificado por imunoprecipitação sequencial em condições de purificação nativas e identificado por espectrometria de massa. O protocolo atual pode ser amplamente utilizado para investigar as proteínas celulares reguladas pela ubiquitinação.
Vários métodos têm sido estabelecidos para purificar proteínas ubiquitinadas, que incluem o uso de ubiquitina marcada com afinidade, anticorpos ubiquitina, proteínas ligadoras de ubiquitina e domínios isolados de ligação à ubiquitina (UBDs)17. Aqui, fornecemos um protocolo usando ubiquitina marcada com afinidade como mediador para purificar proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos. O uso de ubiquitina poli-His-tagged oferece vantagens sobre os outros métodos. As proteínas ubiquitinadas são purificadas na presença de desnaturantes fortes, o que reduz a ligação inespecífica à resina carregada de níquel, linearizando as proteínas celulares e interrompendo as interações proteína-proteína. Em contraste, o uso de anticorpos de ubiquitina, proteínas de ligação à ubiquitina e UBDs isoladas como mediadores não pode efetivamente excluir parceiros de ligação da proteína-alvo porque a purificação precisa ser realizada sob condições menos rigorosas. Além disso, a purificação também pode levar ao aumento da ligação de proteínas não relacionadas usando esses mediadores. Além disso, há uma propensão de ligação para vários tipos de ligação de ubiquitina, bem como mono e poli-ubiquitinação por proteínas ligadoras de ubiquitina ou UBDs isoladas17. O uso de ubiquitina poli-His-etiquetada contribui para puxar para baixo todas as proteínas ubiquitinadas celulares. Alternativamente, o uso de agarose conjugada com anticorpos anti-Flag ou anti-HA comercialmente disponíveis facilita a imunoprecipitação de proteínas-alvo marcadas com Flag ou HA em larga escala em condições não desnaturantes. Uma segunda etapa de purificação, por exemplo, por resina carregada de níquel visando ubiquitina poli-His-marcada, pode ser usada para adquirir proteínas-alvo ubiquitinadas com alta pureza para experimentos a jusante. Notavelmente, uma estratégia de purificação de marcação de epítopos pode ser adaptada quando um anticorpo específico não pode ser adquirido para imunoprecipitar proteínas-alvo de forma eficaz. Finalmente, a purificação de proteínas ubiquitinadas em células de mamíferos, em comparação com a purificação in vitro, mantém o modo de ligação da ubiquitina das proteínas-alvo sob condições mais fisiológicas.
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Protocol
NOTA: As células H1299 foram gentilmente fornecidas pelo Banco de Células-Tronco da Academia Chinesa de Ciências e provaram ser negativas para a contaminação por micoplasma.
1. Cultura celular
- Para a cultura inicial, coloque 1 x 106 células de linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar humano, H1299 em uma placa de Petri de 10 cm com 10-12 mL de meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), aditivo de glutamina a 1%, piruvato de sódio a 1% e antibióticos (100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina). Manter as células a 37 °C numa incubadora humidificada com 5% de CO2. Divida as células a cada 2-3 dias, dependendo de quando elas atingem 80% a 90% de confluência.
- Um dia antes da transfecção, prepare 6-9 x 10 6 células para três placas de Petri e placa 2-3 x 106 células em uma única placa de Petri de 10 cm contendo 10-12 mL de meio para alcançar uma confluência de 70%-90% durante a transfecção.
NOTA: As células HEK293T também podem ser usadas para purificar proteínas ubiquitinadas devido à sua alta eficiência de transfecção e nível de expressão de proteínas.
2. Transfecção de plasmídeos
- Adicionar 1,5 mL de meio sérico reduzido em três tubos de centrífuga de 15 mL.
- Adicione DNA plasmidial pronto para transfecção a cada tubo para fazer diluições da seguinte forma. Tubo 1: 1 μg de plasmídeo Flag-p53, 12 μg de vetor vazio; Tubo 2: 1 μg de plasmídeo Flag-p53, 3 μg de plasmídeo His-HA-Ub (HH-Ub) e 9 μg de vetor vazio; Tubo 3: 1 μg de plasmídeo Flag-p53, 3 μg de plasmídeo HH-Ub e 9 μg de plasmídeo Mdm2. Adicione um total de 0,2 μg de plasmídeo de proteína verde fluorescente (GFP) a cada tubo para monitorar a eficiência da transfecção.
NOTA: Um experimento piloto deve ser realizado para determinar as quantidades ideais de plasmídeos necessários para alcançar a expressão eficiente de proteínas-alvo nas células. - Adicionar 78 μL de reagente de transfecção de lipossomas a 4,5 mL de meio sérico reduzido em outro tubo de centrífuga para diluir lipossomas. Misture bem mexendo o tubo e deixe repousar durante 5 minutos à temperatura ambiente (RT).
- Adicionar 1,5 ml da solução de lipossoma diluída em cada tubo a partir da etapa 2.2 contendo 1,5 ml da solução de ADN diluída. Misture bem e faça a ligação cruzada dos plasmídeos com os lipossomas por pelo menos 20 minutos no RT. Use uma proporção de DNA plasmídico: lipossomo de 1:2 (μg:μL) para cada transfecção.
- Descarte o meio original das placas de Petri e adicione 9 mL de meio sérico reduzido em cada prato. Adicione 3 mL da mistura lipossoma-DNA a cada prato e misture a solução agitando suavemente a placa para frente e para trás 3x, e depois para a esquerda e para a direita 3x para distribuição uniforme da mistura na placa.
- Cultivar as células em incubadora umidificado a 37 °C com 5% de CO2. Substitua o meio após 4-6 h e continue a cultivar as células por 24-36 h.
3. Coleta de células
- Após 24-36 h, tratar as células com MG132 a uma concentração final de 10 μM por 4-6 h.
NOTA: MG132 é um peptídeo aldeído que bloqueia eficientemente a atividade proteolítica do complexo proteassoma 26S. As quantidades de proteínas ubiquitinadas com cadeias de poliubiquitina ligadas à lisina-48 (K48) podem ser aumentadas depois que as células são tratadas com MG132 ou outros inibidores de proteassoma. - Descarte o meio, lave as células 2x (tomando cuidado para não lavar as células) com solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) e aspirar as células com pipetas sorológicas.
- Adicione 1 mL de PBS ao prato, remova as células raspando com um raspador limpo e transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga. Centrífuga a 700 x g durante 5 min para recolher pellets celulares.
4. Purificação de proteínas ubiquitinadas em condições não desnaturantes
- Prepare o tampão de lise Flag (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM de ácido etileno diamina tetraacético (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% sarkosil e 10% glicerol) recém-suplementado com coquetel inibidor de protease antes do uso.
- Adicionar 800 μL de tampão de lise Flag gelado às células de cada tubo, misturar as células utilizando um oscilador de vórtice ou uma pistola de pipeta e, em seguida, incubar a mistura num rotador a 4 °C durante 30 minutos.
- Sujeite a mistura a 5-10 pulsos breves de ultra-sonicação. Execute a ultrassonografia no gelo a uma frequência de sonicação de 20 kHZ e 80% de amplitude com cada pulso durando 1 s. Incubar a mistura num rotador a 40 rotações por minuto (rpm) a 4 °C durante 30 minutos.
- Centrifugar as amostras ultra-sonizadas a 8.000 x g durante 20-30 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
- Aliquot 80 μL (1/10) do extracto celular e misturar com 20 μL de 5x tampão de carga de dodecil sulfato de sódio (SDS). Ferver as amostras a 98 °C durante 5 min, arrefecer no gelo durante 2 min e conservar a -20 °C até à utilização. Use essas amostras como o grupo de entrada para monitorar a expressão de proteínas.
- Adicionar 30 μL de grânulos conjugados com anticorpos anti-Flag M2 (Flag/M2) aos restantes extractos celulares e incubar num rotador a 4 °C durante, pelo menos, 4 h ou durante a noite.
- Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C para recolher as contas. Adicione 1 mL de tampão de lise Flag gelado às contas e misture invertendo o tubo várias vezes.
- Centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C para recolher as contas. Repita a etapa 4.7 por 4-6 vezes.
- Adicionar 40 μL de péptidos Flag a uma concentração final de 200 ng/μL às esferas e incubar num rotador a 4 °C durante 2 h para eluír as proteínas ligadas.
- Centrífuga a 1.500 x g durante 5 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 10 μL de 5x tampão de carga SDS, ferver a mistura a 98 °C durante 5 min, arrefecer no gelo durante 2 min e armazenar a -20 °C para Western blotting. Em alternativa, armazenar o eluato da etapa 4.10 directamente a -80 °C para outras experiências a jusante.
NOTA: A quantidade de proteínas ubiquitinadas purificadas pode ser aumentada aumentando o número de células e as quantidades de plasmídeos transfectados. Uma estratégia de marcação de epítopos pode ser adaptada para purificar complexos celulares que se ligam especificamente à p53 ubiquitinada sob condições de purificação nativas. Ao co-expressar Flag-p53, mdm2 e HA-ubiquitina, o complexo proteico p53 ubiquitinado pode ser imunoprecipitado por agarose conjugada com anticorpos Flag e HA sequenciais de células de mamíferos. Para manter os parceiros de ligação das proteínas p53 ubiquitinadas, o tampão de lise BC100 menos rigoroso (Tris-HCl de 20 mM (pH 7,9), NaCl de 100 mM, glicerol a 10%, EDTA de 0,2 mM, Triton X-100 a 0,2% e inibidor de protease 1x) deve ser usado durante o processo de purificação. O eluato do peptídeo HA é submetido a espectrometria de massa para identificar todos os parceiros que se ligam especificamente ao p53 ubiquitinado.
5. Purificação de proteínas ubiquitinadas em condições de desnaturação
- Adicionar 1 ml de PBS gelado aos pellets celulares obtidos no passo 3.3 e misturar uniformemente. Aliquota de 100 μL (1/10 volume) da suspensão celular em um tubo de microcentrífuga como amostra de entrada.
- Centrifugar a 700 x g durante 5 min a 4 °C para recolher os pellets celulares. Adicione 80 μL de tampão de lise Flag à amostra de entrada, misture as células usando um oscilador de vórtice ou uma pistola de pipeta e lise as células no gelo por 1 h.
- Centrífuga a 8.000 x g durante 20-30 min a 4 °C. Aliquota de 80 μL do sobrenadante em um novo tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 20 μL de 5x tampão de carga SDS ao sobrenadante, ferver a 98 °C durante 5-10 min, arrefecer no gelo durante 2 min e conservar a -20 °C até à utilização.
- Centrifugar os restantes 900 μL da suspensão celular a 700 x g durante 5 minutos a 4 °C para recolher o pellet celular. Adicione 1 mL de tampão de ubiquitina 1 (tampão UB 1; 6 M de guanidina-HCI, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) e0,2% de Triton X-100, recém-suplementado com 10 mM β-mercaptoetanol e 5 mM de imidazol) aos pellets de células e misture várias vezes pipetando para cima e para baixo para distribuir uniformemente as células.
NOTA: A concentração de imidazol pode variar de 5 mM a 20 mM para diminuir a ligação proteica inespecífica na resina carregada de níquel. O tampão de ubiquitina contém cloridrato de guanidina, que inativa tanto os ligases quanto os DUBs. β-mercaptoetanol é um líquido claro e incolor com um odor forte e desagradável semelhante aos ovos podres. Uma solução de alta concentração causará sérios danos à membrana mucosa, trato respiratório superior, pele e olhos. Use luvas e óculos de proteção e opere no exaustor. - Sujeite os lisados celulares a 10-20 rodadas de ultrassom até que a solução não seja mais viscosa. Execute a ultrassonografia no gelo a uma frequência de sonicação de 20 kHZ e 80% de amplitude com cada pulso durando 1 s. Centrifugar a 8.000 x g por 20-30 min em RT e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
- Adicionar 30 μL de resina carregada de níquel ao sobrenadante e incubar em um rotador ajustado a 15 rpm por 4 h ou durante a noite em RT. Centrífuga a 1.500 x g por 2 min em RT para coletar as contas.
- Adicionar 1 mL de tampão UB 1, incubar com rotação em agitador por 10 min no RT e centrifugar a 1.500 x g por 2 min no RT para coletar as contas.
- Adicionar 1 mL de tampão ubiquitina 2 (tampão UB 2; 8 M de ureia, 0,1 M Na 2 HPO 4, 6,8 mM NaH 2 PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) e 0,2% Triton X-100) às contas, incubar com rotação em agitador por 10 min no RT e centrifugar a 1.500 x g por2min para coletar as contas. Repita isso mais uma vez.
- Às contas, adicionar 1 mL de PBS, incubar com rotação em agitador por 10 min no RT e centrifugar a 1.500 x g por 2 min no RT para coletar as contas. Repita isso mais uma vez.
- Proteínas ligadas ao eluto incubando as esferas com 40 μL de imidazol a uma concentração final de 0,5 M por 1 h no RT. Centrífuga a 1.500 x g por 2 min no RT.
- Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo, adicione 10 μL de 5x tampão de carga SDS, ferva a 98 °C por 5 min, esfrie no gelo por 2 min e armazene a -20 °C para Western blotting. Em alternativa, armazenar o eluato não transformado a -80 °C para outras experiências a jusante.
6. Detecção de proteínas ubiquitinadas purificadas por Western blotting
- Resolver as amostras das etapas 4.11 e 5.12 por eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e, em seguida, transferi-las para uma membrana de nitrocelulose por Western blotting para detectar proteínas-alvo usando os anticorpos correspondentes, conforme descrito18.
- Em resumo, incubar a membrana imergindo em 20 mL de solução bloqueadora contendo 5% de leite em pó defat em tampão TBST (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, recém-suplementado com 0,1% Tween-20 antes do uso) no RT por 1 h. Em seguida, incubar a membrana com anticorpos primários no RT por 2 h ou durante a noite a 4 °C. Use os seguintes anticorpos para cada conjunto. Todos os anticorpos primários foram utilizados com diluição de 1:1000.
- Detectar proteína p53 total, incluindo p53 ubiquitinada, com um anticorpo monoclonal anti-p53 após imunoprecipitação com contas de agarose Flag/M2.
- Detectar proteínas p53 ubiquitinadas com um anticorpo anti-HA ou anticorpo anti-ubiquitina após imunoprecipitação com grânulos de agarose Flag/M2.
- Detecte proteínas p53 ubiquitinadas com um anticorpo monoclonal anti-p53 após a retirada de resina carregada de níquel.
- Detecte a proteína ubiquitinada total com um anticorpo anti-HA ou anticorpo anti-ubiquitina após a retirada de resina carregada de níquel.
- Incubar a membrana com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) em RT por 1 h após lavagem 3x com tampão TBST por 5 min cada. Todos os anticorpos secundários foram utilizados com diluição de 1:3000. Em seguida, lave a membrana com tampão TBST 3x por 5 min cada um com agitação suave.
- Inicie o sistema de imagem de quimioluminescência para detectar sinais de Western blotting. Preparar a solução de substrato para a HRP misturando as soluções A e B numa proporção de 1:1.
- Coloque a membrana de nitrocelulose na câmera obscura virada para cima e cubra a solução de substrato uniformemente na membrana usando uma pistola de pipetagem. Selecione o procedimento de exposição automática para capturar sinais quimioluminescentes e ajuste manualmente o tempo de exposição até que um sinal ideal seja adquirido.
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Representative Results
O diagrama esquemático mostra as proteínas p53 (Flag-p53) e His/HA double-tagged ubiquitina (HH-Ub) (Figura 1A). Os procedimentos utilizados para purificar proteínas ubiquitinadas estão resumidos na Figura 1B. A ubiquitina com etiqueta Poly-His pode ser ligada a proteínas-alvo em células de mamíferos. As proteínas ubiquitinadas podem ser purificadas com esferas Flag/M2 em condições não desnaturantes ou por cromatografia imobilizada de afinidade de íons metálicos (IMAC) em condições de desnaturação (Figura 1B). A proteína p53 total, incluindo a p53 ubiquitinada, foi imunoprecipitada com esferas Flag/M2 de células H1299 em condições não desnaturantes. O sinal da proteína p53 ubiquitinada, que aparece como uma banda manchada de baixo a alto peso molecular, foi acentuadamente aumentado quando a Mdm2 foi expressa ectopicamente nessas células, sugerindo que a proteína p53 ubiquitinada foi efetivamente purificada das células (Figura 2). Em seguida, as células foram lisadas sob condições de desnaturação, e a proteína ubiquitinada celular total foi puxada para baixo com resina carregada de níquel. A proteína celular total foi detectada por Western blotting usando um anticorpo monoclonal anti-HA e a proteína p53 ubiquitinada foi detectada usando um anticorpo monoclonal anti-p53. Os resultados mostraram que o nível de proteína ubiquitinada total permaneceu inalterado, mas o nível de proteína p53 ubiquitinada aumentou drasticamente após a superexpressão de Mdm2 nessas células. Esses resultados indicaram que as proteínas ubiquitina totais contendo p53 ubiquitinado foram efetivamente retiradas dos lisados celulares sob condições de desnaturação (Figura 3).
Figura 1: Um resumo dos procedimentos utilizados para purificar proteínas ubiquitinadas. (A) Diagrama esquemático das proteínas p53 (Flag-p53) e His/HA double-tagged ubiquitina (HH-Ub). (B) As proteínas ubiquitinadas podem ser purificadas com grânulos Flag/M2 em condições não desnaturantes e por IMAC em condições de desnaturação. Abreviaturas: His/HA = polihistidina/hemaglutinina; Ub = ubiquitina; Grânulos Flag/M2 = grânulos conjugados com anticorpos anti-Flag M2; IMAC = cromatografia imobilizada de afinidade de íons metálicos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas em condições não desnaturantes. O plasmídeo de expressão de Flag-p53 foi transfectado isoladamente, com HH-Ub, ou com Mdm2 e HH-Ub em células H1299. As proteínas p53 totais e as formas ubiquitinadas foram imunoprecipitadas por esferas de Flag/M2 de extratos celulares. O eluato foi submetido a Western blotting com anticorpos monoclonais anti-p53 (A) e anti-HA (B). (C) Os extratos de células brutas (Input) foram submetidos a Western blotting com anticorpos monoclonais anti-p53 e anti-Mdm2. A GFP foi utilizada como controle de carga. Abreviaturas: HH-Ub = His/HA ubiquitina duplamente marcada; AH = hemaglutinina; Grânulos Flag/M2 = grânulos conjugados com anticorpos anti-Flag M2; GFP = proteína verde fluorescente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: As proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas em condições de desnaturação. O plasmídeo de expressão de Flag-p53 foi transfectado isoladamente, com HH-Ub, ou com Mdm2 e HH-Ub em células H1299. As proteínas ubiquitinadas celulares totais foram puxadas para baixo com resina carregada de níquel e foram então submetidas a Western blotting com anticorpos monoclonais anti-p53 e anti-HA. (A) A proteína p53 ubiquitinada foi detectada usando um anticorpo anti-p53. (B) A proteína ubiquitinada total foi detectada usando um anticorpo anti-HA. (C) Os extratos de células brutas (Input) foram submetidos a Western blotting com anticorpos monoclonais anti-p53 e anti-Mdm2. A GFP foi utilizada como controle de carga. Abreviaturas: HH-Ub = His/HA ubiquitina duplamente marcada; AH = hemaglutinina; GFP = proteína verde fluorescente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A ubiquitinação desempenha um papel crítico em quase todos os processos celulares fisiológicos e patológicos2. Nos últimos anos, grandes progressos têm sido feitos na compreensão do papel molecular da ubiquitina nas vias de sinalização e como as mudanças no sistema de ubiquitina levam a diferentes doenças humanas2. A purificação de proteínas ubiquitinadas contribui para fornecer informações sobre os papéis exatos da ubiquitinação nesses processos. As misturas de proteínas conjugadas com ubiquitina podem ser purificadas a partir de células em condições não desnaturantes e desnaturantes. IMAC usando resinas de níquel pode ser usado para purificar proteínas poli-His-etiquetadas sob condições de desnaturação. O objetivo de purificar proteínas ubiquitinadas sob condições de desnaturação é descartar os parceiros de interação das proteínas-alvo. Todos os componentes celulares que se ligam às proteínas-alvo serão eliminados da eluição em condições de desnaturação. Em contraste, algumas proteínas celulares que se ligam às proteínas-alvo podem ser mantidas na eluição sob condições nativas, o que pode interferir com os experimentos a jusante. As proteínas ubiquitinadas podem ser purificadas mesmo na presença de desnaturantes fortes, o que diminui muito a ligação de proteínas inespecíficas às resinas de níquel. Em contraste, as proteínas-alvo totais, incluindo suas formas ubiquitinadas, podem ser purificadas por estratégias de marcação de epítopos usando contas de agarose conjugadas com anticorpos em condições não desnaturantes. As proteínas foram purificadas sob condições menos rigorosas porque a purificação de afinidade mediada por anticorpos foi usada durante esse processo. As proteínas-alvo e suas formas ubiquitinadas foram detectadas com anticorpos específicos de proteínas ou ubiquitinas. As proteínas marcadas com HA e Myc podem ser convenientemente purificadas usando o mesmo procedimento com contas de agarose conjugadas com anticorpos. Notavelmente, é mais fácil detectar proteínas com cadeias de monoubiquitina únicas ou múltiplas do que aquelas com cadeias de poliubiquitina com anticorpos específicos de proteínas. Em contraste, proteínas com cadeias de poliubiquitina podem ser mais facilmente reconhecidas por anticorpos específicos de ubiquitina.
Para purificar eficazmente as proteínas ubiquitinadas, o nível de expressão das proteínas-alvo deve ser elevado nas células dos mamíferos. Vetores de expressão com fortes promotores de CMV podem ser usados para alcançar altos níveis de expressão de proteínas nas células. Além disso, a ubiquitina ligase E3 e a ubiquitina podem ser co-expressas com as proteínas-alvo. Ele irá adicionar metades de ubiquitina de forma mais eficaz para as proteínas. A atividade do proteassoma 26S pode ser bloqueada por inibidores de moléculas pequenas, a fim de acumular proteínas ubiquitinadas nas células. Para fazer com que as proteínas ubiquitinadas se liguem efetivamente à resina, os extratos celulares devem ser brevemente sonicados para interromper o complexo de DNA para tornar a solução não viscosa. Para diminuir a ligação inespecífica, uma baixa concentração de imidazol deve ser adicionada ao tampão de lise em condições de desnaturação. As proteínas ubiquitinadas com peso molecular muito elevado são mais fáceis de amarrar com a resina após o procedimento de desnaturação e redobramento. A fim de aumentar a eficiência da eluição, tente usar uma maior concentração de imidazol. Se as eficiências da eluição ainda forem extremamente baixas, tente eluír as proteínas ubiquitinadas fervendo diretamente no tampão de carga SDS Laemmli. A maioria das proteínas ubiquitinadas ligadas à resina pode ser eluída neste forte tampão desnaturante. Para alcançar uma maior pureza de proteínas ubiquitinadas, uma purificação de afinidade de duas etapas pode ser adaptada. Após a imunoprecipitação de Flag/M2 em condições não desnaturantes, uma segunda etapa de purificação por resina carregada de níquel pode ser usada para reduzir a proteína ubiquitinada marcada com His e se livrar de substratos não ubiquitinados. Em contraste, após a retirada da resina carregada de níquel sob condição de desnaturação, uma segunda etapa de purificação de afinidade pode ser adaptada para imunoprecipitar as proteínas-alvo usando a estratégia de marcação de epítopos por esferas de agarose conjugadas com anticorpos anti-Flag ou anti-HA.
Usamos imunoblotting mais sensível em vez de coloração de prata ou coloração Coomassie para detectar proteínas ubiquitinadas porque realizamos uma pequena escala de purificação neste estudo. De fato, embora algumas proteínas celulares sejam facilmente ubiquitinadas nas células, apenas uma pequena parte das proteínas pode ser ligada a metades de ubiquitina. Para detectar com sucesso essas proteínas por coloração de prata ou coloração de Coomassie, uma grande escala de purificação deve ser realizada. Para aumentar a pureza das proteínas ubiquitinadas, uma segunda etapa de purificação de afinidade também deve ser feita. Não realizamos esses experimentos porque as proteínas ubiquitinadas purificadas através deste protocolo atendem completamente ao requisito de análises a jusante. Por exemplo, a fim de identificar DUBs específicos para uma proteína-alvo regulada pela ubiquitinação, precisamos purificar uma grande quantidade de proteínas-alvo ubiquitinadas. Essas proteínas podem ser incubadas com DUBs individuais purificados de células de mamíferos em um tampão de desubiquitinação. Por meio dessa triagem in vitro de alto rendimento, podemos identificar DUBs específicos para uma proteína-alvo em células de mamíferos.
Existem várias limitações da técnica. As proteínas ubiquitinadas representam uma parte muito pequena das proteínas-alvo, é difícil purificar uma grande quantidade de proteínas-alvo ubiquitinadas. Tente aumentar a expressão de proteínas nas células, a fim de alcançar uma alta eficiência de purificação. Uma alternativa é realizar uma reação de ubiquitinação in vitro para adquirir mais proteínas ubiquitinadas. Algumas proteínas são difíceis de serem altamente expressas nas células de mamíferos, o que coloca outra limitação na purificação de maiores quantidades de proteínas ubiquitinadas. Finalmente, o protocolo atual é limitado à purificação de proteínas marcadas que são superexpressas usando DNA plasmídico. Os níveis de expressão das proteínas-alvo são superiores aos das proteínas-alvo endógenas. Para avaliar o estado de ubiquitinação endógena de uma proteína-alvo, as proteínas com suas formas ubiquitinadas podem ser diretamente imunoprecipitadas por anticorpos específicos de proteína-alvo das células. Os anticorpos anti-ubiquitina podem ser usados para determinar o status de ubiquitinação da proteína alvo. No entanto, em algumas circunstâncias, o menor nível de expressão, o menor nível de ubiquitinação da proteína-alvo ou a menor eficiência de imunoprecipitação de anticorpos específicos podem limitar a detecção do status de ubiquitinação das proteínas-alvo endógenas de células de mamíferos. O protocolo atual pode fornecer um sistema experimental.
A proteína supressora tumoral p53 desempenha um papel crítico na prevenção da transformação maligna de células normais 8,9,10,11. A estabilidade da p53 é rigidamente regulada pela degradação mediada pela ubiquitinação nas células. A Mdm2 atua como uma ligase de ubiquitina E3 para promover a mono e a poliubiquitinação da p53 de forma dose-dependente16. Aqui, as proteínas p53 ubiquitinadas foram purificadas sob condições de desnaturação e não desnaturação em células de mamíferos na presença de superexpressão de Mdm2. As proteínas monoubiquitinadas p53 foram preferencialmente detectadas com anticorpos monoclonais anti-p53, enquanto as formas poliubiquitinadas foram facilmente detectadas com anticorpos específicos de ubiquitina. Os níveis de formas poliubiquitinadas podem ser efetivamente aumentados elevando a expressão de Mdm2 nas células. Este trabalho fornece um sistema experimental ideal para a preparação de proteínas ubiquitinadas, a fim de elucidar o papel da ubiquitinação na modulação da função proteica. As proteínas ubiquitinadas podem ser usadas para identificar DUBs específicos para uma proteína-alvo e para revelar os papéis de diferentes tipos de cadeias de ubiquitina, por exemplo, as cadeias ligadas a K48 e K63, na sinalização. Este protocolo pode ser usado para investigar os papéis da ubiquitinação na interação proteína-proteína e na formação de complexos proteicos.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81972624) para D.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | Proteasome inhibitor |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
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