Summary
프로토콜은 p53 종양 억제 단백질을 예로 사용하여 포유류 세포로부터 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 단계별 방법을 설명합니다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제하였다.
Abstract
유비퀴틴화는 기질 단백질의 안정성뿐만 아니라 국소화 및 기능을 조절하는 번역 후 변형의 한 유형입니다. 유비퀴틴화 과정은 진핵생물에서 세포 내에서 발생하며 거의 모든 기본적인 세포 생물학적 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화된 단백질의 정제는 기질 단백질의 기능을 제어하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 조사를 돕습니다. 여기서, 포유류 세포에서 유비퀴틴화 단백질을 정제하기 위한 단계별 절차가 p53 종양 억제 단백질을 예로 들어 설명된다. 유비퀴틴화된 p53 단백질은 엄격한 비변성 및 변성 조건 하에서 정제하였다. 총 세포 플래그-태그된 p53 단백질을 비변성 조건 하에 항-플래그 항체-접합된 아가로스로 정제하였다. 대안적으로, 총 세포 His-태그된 유비퀴틴화 단백질을 변성 조건 하에 니켈-하전된 수지를 사용하여 정제하였다. 용출액에서 유비퀴틴화된 p53 단백질은 특정 항체로 성공적으로 검출되었습니다. 이 절차를 사용하여 주어진 단백질의 유비퀴틴화 된 형태를 포유류 세포로부터 효율적으로 정제하여 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 역할에 대한 연구를 용이하게합니다.
Introduction
유비퀴틴은 76 개의 아미노산 1,2,3의 진화 적으로 보존 된 단백질입니다. 유비퀴틴은 활성화 (E1), 접합 (E2) 및 리가 아제 (E3) 효소를 포함하는 캐스케이드를 통해 표적 단백질의 라이신 잔기에 공유 결합합니다. 유비퀴틴은 먼저 E1 효소에 의해 활성화 된 다음 E2 접합 효소로 옮겨집니다. 이어서, E3 유비퀴틴 리가 아제는 유비퀴틴-로딩 된 E2 효소 및 기질 단백질 모두와 상호 작용하고, 유비퀴틴의 C- 말단과 기질 1,2,3,4,5의 라이신 잔기 사이의 이소 펩티드 결합의 형성을 매개한다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴 잔기를 기질 단백질 상의 라이신 잔기 또는 그 자체에 부착시켜 단백질 모노유비퀴틴화 또는 폴리유비퀴틴화를 유도하는 것을 포함한다. 이 유비퀴틴화 과정은 진핵생물에서 세포 내에서 발생하며 다양한 생물학적 과정을 조절합니다. 유비퀴틴화는 유비퀴틴-프로테 아좀 시스템 1,2,3,4,5를 통해 기질 단백질의 분해를 초래한다. 또한, 유비퀴틴화는 세포3,5에서 단백질 세포 내 국소화, 단백질 복합체 형성 및 단백질 트래피킹을 조절한다. 기질 단백질에 연결된 유비퀴틴 잔기는 데유비퀴틴화 효소(DUB)에 의해 제거될 수 있습니다6,7. 특히, 유비퀴틴 사슬이 조립되는 다양한 방법은 다양한 생물학적 과정을 조절하는 무수한 수단을 제공합니다 1,5. 기질 단백질 기능을 조절하는 유비퀴틴화의 정확한 역할은 지금까지 불완전하게 이해되고 있습니다. 유비퀴틴화 된 단백질의 정제는 다양한 세포 과정에 대한 단백질 유비퀴틴화의 효과의 해명에 기여한다.
p53 단백질은 가장 중요한 종양 억제 단백질 중 하나이며 거의 모든 인간 암 8,9,10,11에서 유전 적 돌연변이 또는 불 활성화를 나타냅니다. p53 안정성 및 활성은 유비퀴틴화, 인산화, 아세틸화 및 메틸화12,13을 포함하는 번역후 변형에 의해 생체내에서 섬세하게 조절된다. p53 단백질은 다양한 세포에서 6 분에서 40 분 범위의 짧은 반감기를 가지며, 이는 주로 폴리 유비 퀴틴 화 및 후속 프로테아좀 분해10,12로 인해 발생합니다. 마우스 더블분 2 (Mdm2)는 p53의 N 말단에 결합하여 그의 전사 활성12,14,15를 억제하는 p53의 E3 유비퀴틴 리가제이다. Mdm2는 p53의 폴리유비퀴틴화 및 프로테아좀 분해를 촉진하여 안정성을 제어하고 p53의 모노유비퀴틴화를 유도하여 핵 수출12,14,15,16을 촉진합니다. 여기서, 유비퀴틴화 Mdm2 매개 p53은 포유동물 세포로부터 유비퀴틴화 단백질을 정제하는 방법을 구체적으로 소개하기 위한 예로 사용된다. 표적 단백질의 유비퀴틴화 상태에 영향을 미치는 조절자는 포유류 세포에서 과발현되거나 녹다운/녹아웃될 때 이 생체 내 유비퀴틴화 분석을 사용하여 확인할 수 있습니다. 또한, 유비퀴틴화 단백질은 시험관내 탈유비퀴틴화 분석을 위한 기질로서 사용될 수 있다. 유비퀴틴화된 기질을 개별 DUB와 함께 배양하여 표적 단백질에 대한 특정 DUB를 식별하기 위해 고처리량 스크리닝을 수행할 수 있습니다. 유비퀴틴화된 단백질은 세포에서 다운스트림 신호전달 단백질을 모집하는 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 유비퀴틴화된 표적 단백질 복합체는 천연 정제 조건 하에서 순차적 면역침전에 의해 정제될 수 있고 질량 분석법에 의해 확인될 수 있다. 현재 프로토콜은 유비퀴틴화에 의해 조절되는 세포 단백질을 조사하기 위해 광범위하게 사용될 수 있다.
친화성 태그가 부착된 유비퀴틴, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 유비퀴틴 결합 도메인(UBD)의 사용을 포함하는 유비퀴틴화된 단백질을 정제하기 위한 몇 가지 방법이 확립되었습니다17. 여기에서는 포유동물 세포에서 유비퀴틴화 단백질을 정제하기 위한 매개체로 친화성 태그된 유비퀴틴을 사용하는 프로토콜을 제공합니다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 다른 방법들에 비해 이점을 제공한다. 유비퀴틴화 단백질은 강력한 변성제의 존재 하에서 정제되며, 이는 세포 단백질을 선형화하고 단백질-단백질 상호 작용을 방해함으로써 니켈 하전 수지에 대한 비특이적 결합을 감소시킵니다. 대조적으로, 유비퀴틴 항체, 유비퀴틴 결합 단백질 및 분리된 UBD를 매개체로 사용하는 것은 덜 엄격한 조건에서 정제를 수행해야 하기 때문에 표적 단백질에서 결합 파트너를 효과적으로 배제할 수 없습니다. 더욱이, 정제는 또한 이들 매개체를 사용하여 관련없는 단백질의 결합 증가를 유도 할 수있다. 또한, 다양한 유비퀴틴 결합 유형뿐만 아니라 유비퀴틴 결합 단백질 또는 단리된 UBDs(17)에 의한 모노- 및 폴리-유비퀴틴화에 대한 결합 성향이 존재한다. poly-His-tagged 유비퀴틴의 사용은 모든 세포 유비퀴틴화 단백질을 끌어내리는 데 기여합니다. 대안적으로, 시판되는 항-플래그 또는 항-HA 항체-접합된 아가로스의 사용은 비변성 조건 하에서 대규모 플래그- 또는 HA-태그된 표적 단백질을 면역침전시키는 것을 용이하게 한다. 제2 정제 단계는, 예를 들어, 폴리-히스-태그된 유비퀴틴을 표적화하는 니켈-하전된 수지에 의해, 다운스트림 실험을 위해 고순도의 유비퀴틴화된 표적 단백질을 획득하는데 사용될 수 있다. 특히, 에피토프 태깅 정제 전략은 표적 단백질을 효과적으로 면역침전시키기 위해 특정 항체를 획득할 수 없을 때 적응될 수 있다. 마지막으로, 포유류 세포에서 유비퀴틴화 단백질의 정제는 시험관 내 정제와 비교하여 더 많은 생리학적 조건 하에서 표적 단백질의 유비퀴틴 결합 모드를 유지합니다.
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Protocol
참고 : H1299 세포는 중국 과학원의 줄기 세포 은행에서 친절하게 제공했으며 마이코 플라스마 오염에 대해 음성으로 입증되었습니다.
1. 세포 배양
- 초기 배양의 경우, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1% 글루타민 첨가제, 1% 나트륨 피루브산염 및 항생제(100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신)가 보충된 RPMI 1640 배지 10-12mL가 포함된 10cm 페트리 접시에 인간 폐 선암 세포주 H1299의 1 x 106 세포를 넣습니다. 세포를 5%CO2로 가습된 인큐베이터에서 37°C로 유지한다. 세포가 80%-90% 컨플루언스에 도달하는 시기에 따라 2-3일마다 세포를 분할합니다.
- 형질주입 하루 전에, 3개의 페트리 접시에 대해 6-9 x 10 6 세포를 준비하고, 형질주입 동안 70%-90%의 합류를 달성하기 위해 10-12mL의 배지를 함유하는 단일 10cm 페트리 접시에 2-3 x 106 세포를 플레이트한다.
참고: HEK293T 세포는 또한 높은 형질주입 효율 및 단백질 발현 수준으로 인해 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있습니다.
2. 플라스미드 형질감염
- 3개의 15mL 원심분리 튜브에 1.5mL의 감소된 혈청 배지를 추가합니다.
- 형질주입 준비가 된 플라스미드 DNA를 각 튜브에 추가하여 다음과 같이 희석합니다. 튜브 1: 1 μg의 Flag-p53 플라스미드, 12 μg의 빈 벡터; 튜브 2: 1 μg의 Flag-p53 플라스미드, 3 μg의 His-HA-Ub (HH-Ub) 플라스미드, 및 9 μg의 빈 벡터; 튜브 3: 1μg의 Flag-p53 플라스미드, 3μg의 HH-Ub 플라스미드 및 9μg의 Mdm2 플라스미드. 총 0.2μg의 녹색 형광 단백질(GFP) 플라스미드를 각 튜브에 추가하여 형질감염 효율을 모니터링합니다.
참고: 세포에서 효율적인 표적 단백질 발현을 달성하는 데 필요한 최적의 플라스미드 양을 결정하기 위해 파일럿 실험을 수행해야 합니다. - 78μL의 리포좀 형질주입 시약을 다른 원심분리 튜브의 환원된 혈청 배지 4.5mL에 추가하여 리포좀을 희석합니다. 튜브를 튕겨 완전히 혼합하고 실온(RT)에서 5분 동안 그대로 두십시오.
- 희석된 DNA 용액 1.5mL를 포함하는 단계 2.2의 각 튜브에 희석된 리포좀 용액 1.5mL를 추가합니다. 완전히 혼합하고 RT에서 최소 20분 동안 플라스미드를 리포좀과 가교결합시킵니다. 각 형질감염에 대해 1:2(μg:μL)의 플라스미드 DNA:리포좀 비율을 사용합니다.
- 페트리 접시에서 원래 배지를 버리고 각 접시에 9mL의 환원 혈청 배지를 추가합니다. 각 접시에 리포좀-DNA 혼합물 3mL를 넣고 플레이트를 앞뒤로 3배 부드럽게 흔든 다음 플레이트에 혼합물을 고르게 분배하기 위해 좌우로 3배 흔들어 용액을 혼합합니다.
- 세포를 37°C에서 5%CO2로 가습된 배양기에서 배양한다. 4-6 시간 후에 배지를 교체하고 24-36 시간 동안 세포를 계속 배양하십시오.
3. 세포 수집
- 24-36 시간 후, 세포를 10-6 시간 동안 10 μM의 최종 농도로 MG132로 처리한다.
참고: MG132는 26S 프로테아좀 복합체의 단백질 분해 활성을 효율적으로 차단하는 펩타이드 알데히드입니다. 라이신 -48 (K48) 결합 폴리 유비 퀴틴 사슬로 유비퀴틴 화 된 단백질의 양은 세포가 MG132 또는 다른 프로테아좀 억제제로 처리 된 후에 증가 될 수있다. - 배지를 버리고 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 2배(세포가 플러시되지 않도록 주의) 세척하고 혈청학적 피펫으로 세포를 흡인합니다.
- 접시에 PBS 1mL를 넣고 깨끗한 스크레이퍼로 긁어 세포를 제거한 다음 세포 현탁액을 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 700 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수집합니다.
4. 비변성 조건에서 유비퀴틴화된 단백질의 정제
- 사용하기 전에 프로테아제 억제제 칵테일로 새로 보충 된 플래그 용해 완충액 (50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 1 % 트리톤 X-100, 0.2 % 사르 코실 및 10 % 글리세롤)을 준비하십시오.
- 각 튜브의 세포에 800μL의 얼음처럼 차가운 플래그 용해 버퍼를 추가하고 와류 발진기 또는 피펫 건을 사용하여 세포를 혼합한 다음 혼합물을 4°C의 회전 장치에서 30분 동안 배양합니다.
- 혼합물을 초음파의 5-10 짧은 펄스에 적용하십시오. 20 kHZ의 초음파 처리 주파수와 1 초 동안 지속되는 각 펄스로 80 % 진폭으로 얼음에 초음파를 수행하십시오. 혼합물을 4°C에서 분당 40회전(rpm)으로 회전기에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- 초음파 처리 된 샘플을 8,000 x g 에서 4 °C에서 20-30 분 동안 원심 분리합니다. 상청액을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
- 세포 추출물 80 μL (1/10)를 분취하고, 20 μL의 5x 나트륨 도데실 설페이트 (SDS) 로딩 완충액과 혼합한다. 샘플을 98 ° C에서 5 분 동안 끓여서 얼음에서 2 분 동안 식히고 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오. 이러한 샘플을 입력 그룹으로 사용하여 단백질 발현을 모니터링합니다.
- 나머지 세포 추출물에 30μL의 항-Flag M2 항체 접합(Flag/M2) 비드를 추가하고 4°C의 회전 장치에서 최소 4시간 또는 밤새 배양합니다.
- 4°C에서 2분 동안 1,500 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집하였다. 1mL의 얼음처럼 차가운 플래그 용해 완충액을 비드에 추가하고 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다.
- 4°C에서 2분 동안 1,500 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집하였다. 4.7 단계를 4-6 번 반복하십시오.
- 최종 농도 200ng/μL의 플래그 펩타이드 40μL를 비드에 추가하고 4°C의 회전 장치에서 2시간 동안 배양하여 결합된 단백질을 용리합니다.
- 4°C에서 5분 동안 1,500 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.
- 10μL의 5x SDS 로딩 버퍼를 추가하고, 혼합물을 98°C에서 5분 동안 끓이고, 얼음에서 2분 동안 냉각하고, 웨스턴 블로팅을 위해 -20°C에서 보관합니다. 또는 다른 다운스트림 실험을 위해 단계 4.10의 용출액을 -80°C에서 직접 보관하십시오.
참고: 정제된 유비퀴틴화된 단백질의 양은 세포 수와 형질감염된 플라스미드의 양을 증가시킴으로써 확대될 수 있다. 에피토프 태깅 전략은 천연 정제 조건 하에서 유비퀴틴화된 p53에 특이적으로 결합하는 세포 복합체를 정제하도록 적응될 수 있다. Flag-p53, mdm2, 및 HA-유비퀴틴을 공동-발현함으로써, 유비퀴틴화된 p53 단백질 복합체는 포유동물 세포로부터 순차적 플래그 및 HA 항체-접합된 아가로스에 의해 면역침전될 수 있다. 유비퀴틴화 p53 단백질의 결합 파트너를 유지하기 위해, 정제 과정에서 덜 엄격한 BC100 용해 완충액(20mM Tris-HCl(pH 7.9), 100mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.2mM EDTA, 0.2% 트리톤 X-100 및 1x 프로테아제 억제제)을 사용해야 합니다. HA 펩타이드로부터의 용출액은 유비퀴틴화된 p53에 특이적으로 결합하는 모든 파트너를 식별하기 위해 질량 분석법을 거친다.
5. 변성 조건하에서 유비퀴틴화된 단백질의 정제
- 1단계에서 얻은 셀 펠릿에 3.3mL의 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하고 고르게 혼합합니다. 세포 현탁액 100 μL (1/10 부피)를 입력 샘플로서 마이크로 원심분리 튜브에 분취한다.
- 4°C에서 5분 동안 700 x g 에서 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하였다. 입력 샘플에 80μL의 플래그 용해 버퍼를 추가하고 와류 발진기 또는 피펫 건을 사용하여 세포를 혼합하고 1시간 동안 얼음에서 세포를 용해합니다.
- 8,000 x g 에서 4 °C에서 20-30분 동안 원심분리합니다. 상청액 80 μL를 새로운 미세원심분리 튜브에 분취한다.
- 상청액에 20μL의 5x SDS 로딩 버퍼를 첨가하고, 98°C에서 5-10분 동안 끓이고, 얼음에서 2분 동안 냉각하고, 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
- 나머지 900 μL의 세포 현탁액을 700 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠렛을 수집하였다. 1mL의 유비퀴틴 완충액 1 (UB 완충액 1; 6 M 구아니딘-HCI, 0.1 M Na2HPO4, 6.8 mMNaH2PO4, 10 mM 트리스-HCI (pH 8.0) 및 0.2 % 트리톤 X-100, 10 mM β-메르캅토에탄올 및 5 mM 이미다졸)을 세포 펠릿에 첨가하고 세포를 고르게 분배하기 위해 위아래로 피펫팅하여 여러 번 혼합합니다.
참고: 이미다졸의 농도는 니켈-하전된 수지 상의 비특이적 단백질 결합을 감소시키기 위해 5mM에서 20mM까지 다양할 수 있다. 유비퀴틴 완충액에는 구아니딘 하이드로 클로라이드가 포함되어있어 리가 아제와 DUB를 모두 비활성화합니다. β- 메르 캅토 에탄올은 썩은 계란과 비슷한 강하고 불쾌한 냄새가 나는 투명한 무색의 액체입니다. 고농도 용액은 점막, 상부 호흡기, 피부 및 눈에 심각한 손상을 줄 수 있습니다. 장갑과 고글을 착용하고 흄 후드에서 작동하십시오. - 용액이 더 이상 점성이 없을 때까지 세포 용해물을 10-20 라운드의 초음파에 노출시킵니다. 20 kHZ의 초음파 처리 주파수와 1 초 동안 지속되는 각 펄스로 80 % 진폭으로 얼음에 초음파를 수행하십시오. RT에서 20-30분 동안 8,000 x g 로 원심분리하고 상청액을 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
- 상청액에 니켈 충전 수지 30μL를 추가하고 RT에서 4시간 동안 또는 밤새 15rpm으로 설정된 회전기에서 배양합니다. RT에서 2분 동안 1,500 x g 로 원심분리하여 비드를 수집합니다.
- UB 버퍼 1 1mL를 추가하고, RT에서 10분 동안 셰이커에서 회전하면서 배양하고, RT에서 2분 동안 1,500 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집합니다.
- 1mL의 유비퀴틴 완충액 2 (UB 완충액 2; 8 M 우레아, 0.1 M Na2HPO4, 6.8 mMNaH2PO4,10 mM Tris-HCI (pH 8.0), 및 0.2% 트리톤 X-100)를 비드에 첨가하고, RT에서 10분 동안 쉐이커에서 회전하면서 인큐베이션하고, 1,500 x g에서 2분 동안 원심분리하여 비드를 수집한다. 이것을 한 번 더 반복하십시오.
- 비드에 1mL의 PBS를 추가하고, RT에서 10분 동안 셰이커에서 회전하면서 배양하고, RT에서 2분 동안 1,500 x g 에서 원심분리하여 비드를 수집합니다. 이것을 한 번 더 반복하십시오.
- 비드를 RT에서 1시간 동안 0.5M의 최종 농도로 40μL의 이미다졸과 함께 인큐베이션하여 결합된 단백질을 용리시킵니다. RT에서 2분 동안 1,500 x g 로 원심분리합니다.
- 상청액을 깨끗한 미세 원심분리 튜브로 옮기고 10μL의 5x SDS 로딩 버퍼를 추가하고 98°C에서 5분 동안 끓인 다음 얼음에서 2분 동안 냉각하고 웨스턴 블로팅을 위해 -20°C에서 보관합니다. 또는 다른 다운스트림 실험을 위해 처리되지 않은 용출액을 -80°C에 보관하십시오.
6. 웨스턴 블롯팅에 의한 정제된 유비퀴틴화 단백질의 검출
- 단계 4.11 및 5.12로부터의 샘플을 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 해결한 다음, 웨스턴 블롯팅에 의해 니트로셀룰로스 막으로 옮겨18에 기재된 바와 같이 상응하는 항체를 사용하여 표적 단백질을 검출한다.
- 간단히 말해서, TBST 완충액 (15 mM Tris-HCI; pH = 7.6, 4.6 mM Tris-base, 150 mM NaCI, 사용 전에 0.1 % Tween-20으로 새로 보충 됨) 중 5 % 데파트 분유를 함유하는 20 mL의 블로킹 용액에 1 시간 동안 침지시켜 막을 배양한다. 이어서, 1차 항체와 함께 막을 RT에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 각 세트에 대해 다음 항체를 사용하십시오. 모든 1차 항체는 1:1000의 희석으로 사용하였다.
- Flag/M2 아가로스 비드로 면역침전 후 항-p53 단클론 항체로 유비퀴틴화된 p53을 포함한 총 p53 단백질을 검출합니다.
- Flag/M2 아가로스 비드로 면역침전 후 항-HA 항체 또는 항-유비퀴틴 항체로 유비퀴틴화된 p53 단백질을 검출합니다.
- 니켈 충전 레진 풀다운 후 항-p53 단일클론 항체로 유비퀴틴화된 p53 단백질을 검출합니다.
- 니켈 충전 수지 풀다운 후 항-HA 항체 또는 항-유비퀴틴 항체로 총 유비퀴틴화된 단백질을 검출합니다.
- 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 결합 된 2 차 항체로 막을 TBST 완충액으로 각각 5 분 동안 3x 세척 한 후 RT에서 1 시간 동안 배양합니다. 모든 2차 항체를 1:3000의 희석으로 사용하였다. 그런 다음 TBST 버퍼로 멤브레인을 3x 부드럽게 교반하면서 각각 5 분 동안 세척하십시오.
- 화학 발광 이미징 시스템을 시작하여 웨스턴 블로팅의 신호를 감지합니다. 용액 A와 B를 1 : 1의 비율로 혼합하여 HRP 용 기질 용액을 준비하십시오.
- 니트로셀룰로오스 멤브레인을 카메라 옵스큐라의 앞면이 위로 향하게 하고 피펫팅 건을 사용하여 멤브레인에 기질 용액을 고르게 코팅합니다. 자동 노출 절차를 선택하여 화학 발광 신호를 캡처하고 이상적인 신호가 획득 될 때까지 노출 시간을 수동으로 조정하십시오.
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Representative Results
도식도는 플래그 태그 p53(Flag-p53) 및 His/HA 이중 태그 유비퀴틴(HH-Ub) 단백질을 보여줍니다(그림 1A). 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 데 사용되는 절차는 그림 1B에 요약되어 있습니다. Poly-His-태그된 유비퀴틴은 포유동물 세포 내의 표적 단백질에 라이게이션될 수 있다. 유비퀴틴화된 단백질은 비변성 조건에서 Flag/M2 비드로 정제하거나 변성 조건에서 고정화된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)로 정제할 수 있습니다(그림 1B). 유비퀴틴화된 p53을 포함한 총 p53 단백질은 비변성 조건하에서 H1299 세포로부터의 Flag/M2 비드로 면역침전시켰다. 저분자량에서 고분자량까지 번진 밴드로 나타나는 유비퀴틴화 p53 단백질의 신호는 Mdm2가 이들 세포에서 외분비로 발현되었을 때 현저하게 증가하여 유비퀴틴화된 p53 단백질이 세포에서 효과적으로 정제되었음을 시사합니다(그림 2). 다음으로, 세포를 변성 조건 하에서 용해시키고, 전체 세포 유비퀴틴화 단백질을 니켈-하전 수지로 끌어내렸다. 총 세포 단백질은 항-HA 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯에 의해 검출되었고, 유비퀴틴화된 p53 단백질은 항-p53 모노클로날 항체를 사용하여 검출하였다. 결과는 총 유비퀴틴화 단백질 수준은 변하지 않았지만 유비퀴틴화 p53 단백질 수준은 Mdm2가 이들 세포에서 과발현된 후 극적으로 증가했음을 보여주었습니다. 이러한 결과는 유비퀴틴화된 p53을 함유한 총 유비퀴틴 단백질이 변성 조건 하에서 세포 용해물로부터 효과적으로 제거되었음을 나타냅니다(그림 3).
그림 1: 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 데 사용되는 절차의 요약. (A) 플래그 태그 p53 (Flag-p53) 및 His/HA 이중 태그 유비퀴틴 (HH-Ub) 단백질의 개략도. (B) 유비퀴틴화 단백질은 비변성 조건에서 Flag/M2 비드로 정제할 수 있고 변성 조건에서 IMAC로 정제할 수 있습니다. 약어 : His/HA = 폴리히스티딘/헤마글루티닌; Ub = 유비퀴틴; 플래그/M2 비드 = 항-플래그 M2 항체 접합 비드; IMAC = 고정 금속 이온 친화성 크로마토그래피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 유비퀴틴화된 p53 단백질은 비변성 조건에서 정제되었습니다. Flag-p53 발현 플라스미드를 단독으로, HH-Ub로, 또는 Mdm2 및 HH-Ub와 함께 H1299 세포 내로 형질감염시켰다. 총 p53 단백질 및 유비퀴틴화된 형태는 세포 추출물로부터의 Flag/M2 비드에 의해 면역침전되었다. 용출액을 항-p53 (A) 및 항-HA (B) 모노클로날 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. (c) 조세포 추출물(Input)을 항-p53 및 항-Mdm2 단일클론항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. GFP를 로딩 대조군으로 사용하였다. 약어 : HH-Ub = His/HA 이중 태그 유비퀴틴; HA = 헤마글루티닌; 플래그/M2 비드 = 항-플래그 M2 항체 접합 비드; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 유비퀴틴화된 p53 단백질은 변성 조건에서 정제되었습니다. Flag-p53 발현 플라스미드를 단독으로, HH-Ub로, 또는 Mdm2 및 HH-Ub와 함께 H1299 세포 내로 형질감염시켰다. 전체 세포 유비퀴틴화 단백질을 니켈-하전된 수지로 끌어내고, 이어서 항-p53 및 항-HA 단일클론 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. (a) 유비퀴틴화된 p53 단백질은 항-p53 항체를 이용하여 검출하였다. (b) 총 유비퀴틴화된 단백질은 항-HA 항체를 사용하여 검출하였다. (c) 조세포 추출물(Input)을 항-p53 및 항-Mdm2 단일클론항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. GFP를 로딩 대조군으로 사용하였다. 약어 : HH-Ub = His/HA 이중 태그 유비퀴틴; HA = 헤마글루티닌; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
유비퀴틴화는 거의 모든 생리적 및 병리학적 세포 과정에서 중요한 역할을 합니다2. 최근 몇 년 동안 신호 전달 경로에서 유비퀴틴의 분자 역할과 유비퀴틴 시스템의 변화가 어떻게 다른인간 질병을 유발하는지 이해하는 데 큰 진전이 있었습니다2. 유비퀴틴화 단백질의 정제는 이러한 공정에서 유비퀴틴화의 정확한 역할에 대한 통찰력을 제공하는 데 기여합니다. 유비퀴틴-접합 단백질의 혼합물은 비변성 및 변성 조건 하에서 세포로부터 정제될 수 있다. 니켈 수지를 사용하는 IMAC는 변성 조건에서 poly-His-tagged 단백질을 정제하는 데 사용할 수 있습니다. 변성 조건에서 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 목표는 표적 단백질로부터 상호작용 파트너를 버리는 것입니다. 표적 단백질에 결합하는 모든 세포 성분은 변성 조건 하에서 용출로부터 결실될 것이다. 대조적으로, 표적 단백질에 결합하는 일부 세포 단백질은 천연 조건 하에서 용출 상태로 유지될 수 있으며, 이는 다운스트림 실험을 방해할 수 있다. 유비퀴틴화 단백질은 강한 변성제의 존재 하에서도 정제 될 수 있으며, 이는 니켈 수지에 대한 비특이적 단백질 결합을 크게 감소시킵니다. 대조적으로, 그의 유비퀴틴화된 형태를 포함하는 전체 표적 단백질은 비변성 조건 하에서 항체-접합된 아가로스 비드를 사용하는 에피토프 태깅 전략에 의해 정제될 수 있다. 단백질은 덜 엄격한 조건 하에서 정제되었는데, 이는 항체-매개 친화성 정제가 이 과정 동안 사용되었기 때문이다. 표적 단백질 및 이들의 유비퀴틴화된 형태는 단백질- 또는 유비퀴틴-특이적 항체로 검출하였다. HA- 및 Myc-태그된 단백질은 항체-접합된 아가로스 비드와 동일한 절차를 사용하여 편리하게 정제될 수 있다. 특히, 단백질 특이적 항체가 있는 폴리유비퀴틴 사슬을 가진 단백질보다 단일 또는 다중 모노유비퀴틴 사슬을 가진 단백질을 검출하는 것이 더 쉽습니다. 대조적으로, 폴리유비퀴틴 사슬을 갖는 단백질은 유비퀴틴-특이적 항체에 의해 보다 용이하게 인식될 수 있다.
유비퀴틴화 단백질을 효과적으로 정제하기 위해서는 포유류 세포에서 표적 단백질의 발현 수준이 높아야 합니다. 강력한 CMV 프로모터를 갖는 발현 벡터를 사용하여 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 달성할 수 있다. 또한, E3 유비퀴틴 리가아제 및 유비퀴틴은 표적 단백질과 함께 동시 발현될 수 있다. 그것은 단백질에 유비퀴틴 잔기를 더 효과적으로 첨가할 것이다. 26S 프로테아좀의 활성은 세포에 유비퀴틴화된 단백질을 축적하기 위해 소분자 억제제에 의해 차단될 수 있다. 유비퀴틴화 된 단백질이 수지에 효과적으로 결합하도록하려면 세포 추출물을 간단히 초음파 처리하여 DNA 복합체를 파괴하여 용액을 점성이 없게 만들어야합니다. 비특이적 결합을 줄이려면 변성 조건에서 낮은 농도의 이미다졸을 용해 완충액에 첨가해야 합니다. 매우 높은 분자량을 갖는 유비퀴틴화 단백질은 변성 및 재 접힘 절차 후에 수지와 묶기가 더 쉽습니다. 용출의 효율성을 높이려면 더 높은 농도의 이미다졸을 사용하십시오. 용리 효율이 여전히 매우 낮은 경우 SDS Laemmli 로딩 완충액에서 직접 끓여서 유비퀴틴화된 단백질을 용리하십시오. 수지에 결합된 대부분의 유비퀴틴화된 단백질은 이 강력한 변성 완충액에서 용리될 수 있습니다. 유비퀴틴화된 단백질의 더 높은 순도를 달성하기 위해, 2단계 친화성 정제가 적용될 수 있다. 비변성 조건에서 Flag/M2 면역침전 후, 니켈 충전 수지에 의한 두 번째 단계 정제를 사용하여 His-태그된 유비퀴틴화 단백질을 끌어내리고 비유비퀴틴화 기질을 제거할 수 있습니다. 대조적으로, 변성 조건 하에 니켈-대전된 수지 풀다운 후, 제2 친화성 정제 단계는 항-플래그 또는 항-HA 항체 접합된 아가로스 비드에 의한 에피토프 태깅 전략을 사용하여 표적 단백질을 면역침전시키도록 적응될 수 있다.
우리는 이 연구에서 소규모 정제를 수행했기 때문에 유비퀴틴화된 단백질을 검출하기 위해 은 염색이나 Coomassie 염색 대신 더 민감한 면역 블로팅을 사용했습니다. 사실, 일부 세포 단백질은 세포에서 쉽게 유비퀴틴화되지만, 단백질의 작은 부분만이 유비퀴틴 부분과 라이게이션될 수 있다. 은 염색 또는 쿠마시 염색으로 이러한 단백질을 성공적으로 검출하려면 대규모 정제를 수행해야 합니다. 유비퀴틴화된 단백질의 순도를 증가시키기 위해, 제2 친화성 정제 단계도 수행되어야 한다. 이 프로토콜을 통해 정제된 유비퀴틴화 단백질이 다운스트림 분석의 요구 사항을 완전히 충족하기 때문에 이러한 실험을 수행하지 않았습니다. 예를 들어, 유비퀴틴화에 의해 조절되는 표적 단백질에 대한 특정 DUB를 식별하기 위해서는 대량의 유비퀴틴화된 표적 단백질을 정제해야 합니다. 이들 단백질은 포유동물 세포로부터 정제된 개별 DUBS를 유비퀴틴화 완충액에서 배양할 수 있다. 이 시험관 내 고처리량 스크리닝을 통해 포유류 세포에서 표적 단백질에 특이적인 DUB를 식별할 수 있습니다.
이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 유비퀴틴화된 단백질은 표적 단백질의 극히 작은 부분을 차지하며, 다량의 유비퀴틴화된 표적 단백질을 정제하기가 어렵다. 높은 정제 효율을 달성하기 위해 세포에서 단백질 발현을 확장하십시오. 대안은 더 많은 유비퀴틴화 단백질을 얻기 위해 시험관 내 유비퀴틴화 반응을 수행하는 것입니다. 일부 단백질은 포유동물 세포에서 고도로 발현되기 어렵고, 이는 더 많은 양의 유비퀴틴화된 단백질을 정제하는 데 또 다른 제한을 둡니다. 마지막으로, 현재 프로토콜은 플라스미드 DNA를 사용하여 과발현되는 태그된 단백질의 정제로 제한됩니다. 표적 단백질의 발현 수준은 내인성 표적 단백질의 발현 수준보다 높습니다. 표적 단백질의 내인성 유비퀴틴화 상태를 평가하기 위해, 유비퀴틴화된 형태의 단백질은 세포로부터의 표적 단백질-특이적 항체에 의해 직접 면역침전될 수 있다. 항-유비퀴틴 항체는 표적 단백질의 유비퀴틴화 상태를 결정하는데 사용될 수 있다. 그러나, 일부 상황 하에서, 더 낮은 발현 수준, 표적 단백질의 더 낮은 유비퀴틴화 수준, 또는 특정 항체의 더 낮은 면역침전 효율은 포유동물 세포로부터의 내인성 표적 단백질의 유비퀴틴화 상태의 검출을 제한할 수 있다. 현재 프로토콜은 대신 실험 시스템을 제공할 수 있습니다.
p53 종양 억제 단백질은 정상 세포 8,9,10,11의 악성 형질전환을 예방하는 데 중요한 역할을 합니다. p53의 안정성은 세포에서 유비퀴틴화 매개 분해에 의해 엄격하게 조절됩니다. Mdm2는 E3 유비퀴틴 리가아제로서 작용하여 용량 의존적 방식으로 p53 모노- 및 폴리유비퀴틴화를 촉진한다16. 여기서, 유비퀴틴화된 p53 단백질은 Mdm2 과발현의 존재하에 포유동물 세포에서 변성 및 비변성 조건 하에서 정제되었다. 모노유비퀴틴화된 p53 단백질은 항-p53 모노클로날 항체로 우선적으로 검출된 반면, 폴리유비퀴틴화된 형태는 유비퀴틴-특이적 항체로 쉽게 검출되었다. 폴리유비퀴틴화된 형태의 수준은 세포에서 Mdm2의 발현을 상승시킴으로써 효과적으로 증가될 수 있다. 이 논문은 단백질 기능 조절에서 유비퀴틴화의 역할을 밝히기 위해 유비퀴틴화 단백질의 제조를 위한 이상적인 실험 시스템을 제공합니다. 유비퀴틴화 단백질은 표적 단백질에 대한 특정 DUB를 식별하고 신호 전달에서 다양한 유형의 유비퀴틴 사슬, 예를 들어 K48 및 K63 연결 사슬의 역할을 밝히는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 단백질-단백질 상호 작용 및 단백질 복합체 형성에서 유비퀴틴화의 역할을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81972624)의 DL 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | Proteasome inhibitor |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
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