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Biochemistry

स्तनधारी कोशिकाओं से यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन का शुद्धिकरण

Published: March 21, 2022 doi: 10.3791/63602
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Translational Medicine, The Affiliated Zhangjiagang Hospital of Soochow University

Summary

प्रोटोकॉल एक उदाहरण के रूप में पी 53 ट्यूमर सप्रेसर प्रोटीन का उपयोग करके स्तनधारी कोशिकाओं से सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक चरण-दर-चरण विधि का वर्णन करता है। यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को कठोर गैर-विकृत और विकृत स्थितियों के तहत कोशिकाओं से शुद्ध किया गया था।

Abstract

सर्वव्यापी एक प्रकार का पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन है जो न केवल स्थिरता को नियंत्रित करता है बल्कि एक सब्सट्रेट प्रोटीन के स्थानीयकरण और कार्य को भी नियंत्रित करता है। यूकेरियोट्स में सर्वव्यापी प्रक्रिया इंट्रासेल्युलर रूप से होती है और लगभग सभी बुनियादी सेलुलर जैविक प्रक्रियाओं को नियंत्रित करती है। सर्वव्यापी प्रोटीन का शुद्धिकरण सब्सट्रेट प्रोटीन के कार्य को नियंत्रित करने में सर्वव्यापी की भूमिका की जांच में सहायता करता है। यहां, स्तनधारी कोशिकाओं में सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया को एक उदाहरण के रूप में पी 53 ट्यूमर शमन प्रोटीन के साथ वर्णित किया गया है। यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को कठोर गैर-विकृत और विकृत स्थितियों के तहत शुद्ध किया गया था। कुल सेलुलर फ्लैग-टैग किए गए पी 53 प्रोटीन को गैर-विकृत परिस्थितियों में एंटी-फ्लैग एंटीबॉडी-संयुग्मित अगारोस के साथ शुद्ध किया गया था। वैकल्पिक रूप से, कुल सेलुलर हिस-टैग किए गए यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को विकृत परिस्थितियों में निकल-चार्ज राल का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। एलुएट्स में यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ सफलतापूर्वक पता लगाया गया था। इस प्रक्रिया का उपयोग करके, किसी दिए गए प्रोटीन के सर्वव्यापी रूपों को स्तनधारी कोशिकाओं से कुशलतापूर्वक शुद्ध किया जा सकता है, जिससे प्रोटीन फ़ंक्शन को विनियमित करने में सर्वव्यापी भूमिकाओं पर अध्ययन की सुविधा मिलती है।

Introduction

यूबिकिटिन 76 अमीनो एसिड 1,2,3 का एक क्रमिक रूप से संरक्षित प्रोटीन है। यूबिकिटिन सहसंयोजक रूप से सक्रिय (ई 1), वैवाहिक (ई 2), और लिगेज (ई 3) एंजाइमों से जुड़े कैस्केड के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन पर लाइसिन अवशेषों को बांधता है। यूबिकिटिन को पहले ई 1 एंजाइम द्वारा सक्रिय किया जाता है और फिर इसे ई 2 वैवाहिक एंजाइमों में स्थानांतरित किया जाता है। इसके बाद, ई 3 यूबिकिटिन लिगेस यूबिकिटिन-लोडेड ई 2 एंजाइम और सब्सट्रेट प्रोटीन दोनों के साथ बातचीत करते हैं और यूबिकिटिन के सी-टर्मिनल और सब्सट्रेट 1,2,3,4,5 में लाइसिन अवशेषके बीच एक आइसोपेप्टाइड बंधन के गठन की मध्यस्थता करते हैं। सर्वव्यापी में सब्सट्रेट प्रोटीन पर या स्वयं पर लाइसिन अवशेषों के लिए यूबिकिटिन मोइट्स का लगाव शामिल है, जिससे प्रोटीन मोनोसर्वेशन या पॉलीविकिटिनेशन होता है। यह सर्वव्यापी प्रक्रिया यूकेरियोट्स में इंट्रासेल्युलर रूप से होती है और जैविक प्रक्रियाओं की एक बड़ी विविधता को नियंत्रित करती है। सर्वव्यापी परिणाम के परिणामस्वरूप यूबिकिटिन-प्रोटीसम सिस्टम 1,2,3,4,5 के माध्यम से सब्सट्रेट प्रोटीन का क्षरण होता है। इसके अलावा, सर्वव्यापी प्रोटीन उपकोशिकीय स्थानीयकरण, प्रोटीन कॉम्प्लेक्स गठन और कोशिकाओं में प्रोटीन तस्करी को नियंत्रित करता है 3,5. सब्सट्रेट प्रोटीन से जुड़े यूबिकिटिन मोइट्स को एंजाइम (डीयूबी) 6,7 को निष्क्रिय करके हटाया जा सकता है। विशेष रूप से, विभिन्न तरीकों से जिसमें यूबिकिटिन श्रृंखलाओं को इकट्ठा किया जाता है, विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए असंख्य साधन प्रदान करते हैं। सब्सट्रेट प्रोटीन फ़ंक्शन को विनियमित करने में सर्वव्यापी की सटीक भूमिका अब तक पूरी तरह से समझ में नहीं आई है। सर्वव्यापी प्रोटीन का शुद्धिकरण विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं पर प्रोटीन के प्रभावों के स्पष्टीकरण में योगदान देता है।

पी 53 प्रोटीन सबसे महत्वपूर्ण ट्यूमर शमन प्रोटीन में से एक है और लगभग सभी मानव कैंसर 8,9,10,11 में आनुवंशिक उत्परिवर्तन या निष्क्रियता प्रदर्शित करता है। पी 53 स्थिरता और गतिविधि को विवो में पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों द्वारा नाजुक रूप से विनियमित किया जाता है, जिसमें सर्वव्यापी, फॉस्फोराइलेशन, एसिटिलीकरण और मिथाइलेशन12,13 शामिल हैं। पी 53 प्रोटीन का विभिन्न कोशिकाओं में 6 मिनट से 40 मिनट तक का एक छोटा आधा जीवन होता है, जो मुख्य रूप से इसके पॉलीसर्विसंक्रमण और बाद में प्रोटियासोमल गिरावट10,12 के परिणामस्वरूप होता है। माउस डबल मिनट 2 (एमडीएम 2) पी 53 का एक ई 3 यूबिकिटिन लिगेज है जो अपनी ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि12,14,15 को रोकने के लिए पी 53 के एन-टर्मिनस से बांधता है। एमडीएम 2 अपनी स्थिरता को नियंत्रित करने के लिए पी 53 के पॉलीविरूपण और प्रोटीसोमल क्षरण को बढ़ावा देता है और अपने परमाणु निर्यात 12,14,15,16 को सुविधाजनक बनाने के लिए पी 53 के मोनोसर्वीकरण को प्रेरित करता है। यहां, एमडीएम 2-मध्यस्थता पी 53 का उपयोग स्तनधारी कोशिकाओं से सर्वव्यापी प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए एक विधि को विस्तार से पेश करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन की सर्वव्यापी स्थिति को प्रभावित करने वाले नियामकों को विवो सर्वव्यापी परख में इसका उपयोग करके पहचाना जा सकता है जब उन्हें स्तनधारी कोशिकाओं में अतिरंजित या गिरा दिया जाता है। इसके अलावा, सर्वव्यापी प्रोटीन का उपयोग इन विट्रो डिओविकिशन परख के लिए सब्सट्रेट के रूप में किया जा सकता है। अलग-अलग डीयूबी के साथ सर्वव्यापी सब्सट्रेट्स को इनक्यूबेट करके लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट डीयूबी की पहचान करने के लिए एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग की जा सकती है। यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन कोशिकाओं में डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग प्रोटीन की भर्ती के लिए एक मचान के रूप में कार्य कर सकते हैं। एक सर्वव्यापी लक्ष्य प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को देशी शुद्धिकरण स्थितियों के तहत अनुक्रमिक इम्यूनोप्रेसिपेशन द्वारा शुद्ध किया जा सकता है और मास-स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना जा सकता है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग व्यापक रूप से सर्वव्यापी द्वारा विनियमित सेलुलर प्रोटीन की जांच के लिए किया जा सकता है।

यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए कई तरीके स्थापित किए गए हैं, जिनमें आत्मीयता-टैग किए गए यूबिकिटिन, यूबिकिटिन एंटीबॉडी, यूबिकिटिन-बाइंडिंग प्रोटीन और पृथक यूबिकिटिन-बाइंडिंग डोमेन (यूबीडी) 17 का उपयोग शामिल है। यहां, हम स्तनधारी कोशिकाओं में सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए मध्यस्थ के रूप में आत्मीयता-टैग किए गए यूबिकिटिन का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। पॉली-हिज़-टैग किए गए यूबिकिटिन का उपयोग अन्य तरीकों पर फायदे प्रदान करता है। यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को मजबूत विकृतियों की उपस्थिति में शुद्ध किया जाता है, जो सेलुलर प्रोटीन को रैखिक बनाकर और प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को बाधित करके निकल-चार्ज राल के लिए गैर-विशिष्ट बंधन को कम करता है। इसके विपरीत, मध्यस्थों के रूप में यूबिकिटिन एंटीबॉडी, यूबिकिटिन-बाइंडिंग प्रोटीन और पृथक यूबीडी का उपयोग लक्ष्य प्रोटीन से बाध्यकारी भागीदारों को प्रभावी ढंग से बाहर नहीं कर सकता है क्योंकि शुद्धिकरण को कम कठोर परिस्थितियों में किया जाना चाहिए। इसके अलावा, शुद्धिकरण से इन मध्यस्थों का उपयोग करके असंबंधित प्रोटीन के बंधन में वृद्धि हो सकती है। इसके अलावा, विभिन्न यूबिकिटिन लिंकेज प्रकारों के साथ-साथ यूबिकिटिन-बाइंडिंग प्रोटीन या पृथक यूबीडी17 द्वारा मोनो- और पॉली-सर्वव्यापी के लिए एक बाध्यकारी प्रवृत्ति है। पॉली-हिज-टैग किए गए यूबिकिटिन का उपयोग सभी सेलुलर सर्वव्यापी प्रोटीन को नीचे खींचने में योगदान देता है। वैकल्पिक रूप से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटी-फ्लैग या एंटी-एचए एंटीबॉडी-संयुग्मित अगारोस का उपयोग गैर-विकृत परिस्थितियों में बड़े पैमाने पर फ्लैग- या एचए-टैग किए गए लक्ष्य प्रोटीन को इम्यूनोप्रेसिटेट करना आसान बनाता है। एक दूसरा शुद्धिकरण चरण, उदाहरण के लिए, पॉली-हिज-टैग किए गए यूबिकिटिन को लक्षित करने वाले निकल-चार्ज राल द्वारा, डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए उच्च शुद्धता के साथ सर्वव्यापी लक्ष्य प्रोटीन प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। विशेष रूप से, एक एपिटोप टैगिंग शुद्धिकरण रणनीति को अनुकूलित किया जा सकता है जब एक विशिष्ट एंटीबॉडी को इम्यूनोप्रेसिपिटेट लक्ष्य प्रोटीन को प्रभावी ढंग से प्राप्त नहीं किया जा सकता है। अंत में, स्तनधारी कोशिकाओं में सर्वव्यापी प्रोटीन का शुद्धिकरण, विट्रो में शुद्धिकरण की तुलना में, अधिक शारीरिक परिस्थितियों में लक्ष्य प्रोटीन के यूबिकिटिन लिंकेज मोड को बरकरार रखता है।

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Protocol

नोट: एच 1299 कोशिकाओं को स्टेम सेल बैंक, चीनी विज्ञान अकादमी द्वारा प्रदान किया गया था और माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए नकारात्मक साबित हुआ था।

1. सेल संस्कृति

  1. प्रारंभिक संस्कृति के लिए, मानव फेफड़े के एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन, एच 1299 की 10-12 एमएल आरपीएमआई 1640 मध्यम के साथ 10 सेमी पेट्री डिश में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% ग्लूटामाइन योजक, 1% सोडियम पाइरूवेट और एंटीबायोटिक्स (100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) के साथ पूरक है। 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। कोशिकाओं को हर 2-3 दिनों में विभाजित करें, जब वे 80% -90% कंफ्लुएंसी तक पहुंचते हैं।
  2. अभिकर्मक से एक दिन पहले, तीन पेट्री व्यंजनों के लिए6-9 x 10 6 कोशिकाएं तैयार करें और अभिकर्मक के दौरान 70% -90% का संगम प्राप्त करने के लिए 10-12 एमएल माध्यम वाले एकल 10 सेमी पेट्री डिश में 2-3 x 106 कोशिकाओं को प्लेट करें।
    नोट: एचईके 293 टी कोशिकाओं का उपयोग उनके उच्च अभिकर्मक दक्षता और प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर के कारण सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए भी किया जा सकता है।

2. प्लास्मिड अभिकर्मक

  1. तीन 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में 1.5 एमएल कम सीरम माध्यम जोड़ें।
  2. निम्नानुसार कमजोर पड़ने के लिए प्रत्येक ट्यूब में अभिकर्मक के लिए तैयार प्लास्मिड डीएनए जोड़ें। ट्यूब 1: फ्लैग-पी 53 प्लास्मिड का 1 μg, खाली वेक्टर का 12 μg; ट्यूब 2: फ्लैग-पी 53 प्लास्मिड का 1 μg, His-HA-UB (HH-Ub) प्लास्मिड का 3 μg, और खाली वेक्टर का 9 μg; ट्यूब 3: फ्लैग-पी 53 प्लास्मिड का 1 μg, एचएच-यूबी प्लास्मिड का 3 μg, और एमडीएम 2 प्लास्मिड का 9 μg। अभिकर्मक दक्षता की निगरानी के लिए प्रत्येक ट्यूब में कुल 0.2 μg ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) प्लास्मिड जोड़ें।
    नोट: कोशिकाओं में कुशल लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्लास्मिड की इष्टतम मात्रा निर्धारित करने के लिए एक पायलट प्रयोग किया जाना चाहिए।
  3. लिपोसोम को पतला करने के लिए एक अन्य सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 4.5 एमएल कम सीरम माध्यम में 78 μL लिपोसोम अभिकर्मक जोड़ें। ट्यूब को फ्लिक करके अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट तक खड़े रहने दें।
  4. चरण 2.2 से प्रत्येक ट्यूब में पतला लिपोसोम समाधान के 1.5 एमएल जोड़ें जिसमें पतला डीएनए समाधान का 1.5 एमएल है। प्लास्मिड को अच्छी तरह से मिलाएं और आरटी में कम से कम 20 मिनट के लिए लिपोसोम के साथ क्रॉसलिंक करें। प्रत्येक अभिकर्मक के लिए प्लास्मिड डीएनए: लिपोसोम अनुपात 1: 2 (μg: μL) का उपयोग करें।
  5. पेट्री व्यंजनों से मूल माध्यम को त्याग दें और प्रत्येक डिश में 9 एमएल कम सीरम माध्यम जोड़ें। प्रत्येक डिश में लिपोसोम-डीएनए मिश्रण के 3 एमएल जोड़ें और प्लेट को धीरे-धीरे आगे और पीछे 3x हिलाते हुए घोल मिलाएं, और फिर प्लेट में मिश्रण के वितरण के लिए बाएं और दाएं 3x।
  6. कोशिकाओं को 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर मेंकल्चर करें। 4-6 घंटे के बाद माध्यम को बदलें और 24-36 घंटे के लिए कोशिकाओं को कल्चर करना जारी रखें।

3. सेल संग्रह

  1. 24-36 घंटे के बाद, 4-6 घंटे के लिए 10 μM की अंतिम एकाग्रता पर MG132 के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
    नोट: एमजी 132 एक पेप्टाइड एल्डिहाइड है जो कुशलतापूर्वक 26 एस प्रोटियासम कॉम्प्लेक्स की प्रोटियोलिटिक गतिविधि को अवरुद्ध करता है। लाइसिन -48 (के 48) से जुड़े पॉलीयूबिकिटिन श्रृंखलाओं के साथ प्रोटीन की मात्रा एमजी 132 या अन्य प्रोटियासम अवरोधकों के साथ कोशिकाओं के इलाज के बाद बढ़ाई जा सकती है।
  2. माध्यम को त्याग दें, कोशिकाओं को 2x (कोशिकाओं को बाहर न निकालने का ध्यान रखते हुए) बर्फ-ठंडे फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ धोएं, और कोशिकाओं को सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ एस्पिरेट करें।
  3. डिश में 1 एमएल पीबीएस जोड़ें, एक साफ स्क्रैपर के साथ स्क्रैप करके कोशिकाओं को हटा दें, और सेल निलंबन को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें। सेल छर्रों को इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए 700 x g पर सेंट्रीफ्यूज।

4. गैर-विकृत परिस्थितियों में सर्वव्यापी प्रोटीन का शुद्धिकरण

  1. फ्लैग लाइसिस बफर (50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.9), 137 एमएम एनएसीएल, 10 एमएम एनएएफ, 1 एमएम एथिलीन डायमाइन टेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए), 1% ट्राइटन एक्स -100, 0.2% सरकोसाइल और 10% ग्लिसरॉल) को उपयोग से पहले प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल के साथ ताजा पूरक तैयार करें।
  2. प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं में 800 μL आइस-कोल्ड फ्लैग लाइसिस बफर जोड़ें, एक भंवर ऑसिलेटर या पिपेट गन का उपयोग करके कोशिकाओं को मिलाएं, और फिर मिश्रण को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेटर पर इनक्यूबेट करें।
  3. मिश्रण को अल्ट्रासोनिकेशन की 5-10 संक्षिप्त दालों के अधीन करें। 20 kHZ और 80% आयाम की सोनिकेशन आवृत्ति पर बर्फ पर अल्ट्रासोनिकेशन करें, जिसमें प्रत्येक पल्स 1 सेकंड तक चलती है। मिश्रण को 40 चक्कर प्रति मिनट (आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. अल्ट्रासोनिकेटेड नमूनों को 20-30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. सेल निकालने का एलिकोट 80 μL (1/10) और 5x सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) लोडिंग बफर के 20 μL के साथ मिलाएं। नमूने को 5 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, 2 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें, और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रोटीन अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए इनपुट समूह के रूप में इन नमूनों का उपयोग करें।
  6. शेष सेल अर्क में एंटी-फ्लैग एम 2 एंटीबॉडी-संयुग्मित (फ्लैग / एम 2) मोतियों के 30 μL जोड़ें और कम से कम 4 घंटे या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पर इनक्यूबेट करें।
  7. मोतियों को इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। मोतियों में 1 एमएल आइस-कोल्ड फ्लैग लाइसिस बफर जोड़ें और ट्यूब को कई बार इनवर्ट करके मिलाएं।
  8. मोतियों को इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज। चरण 4.7 को 4-6 बार दोहराएँ।
  9. मोतियों में 200 ng/μL की अंतिम सांद्रता पर 40 μL फ्लैग पेप्टाइड्स जोड़ें और बंधे हुए प्रोटीन को हटाने के लिए 2 घंटे के लिए 4 °C पर एक घूर्णन पर इनक्यूबेट करें।
  10. सेंट्रीफ्यूज 1,500 x g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। सुपरनैटेंट को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  11. 5x SDS लोडिंग बफर का 10 μL जोड़ें, मिश्रण को 5 मिनट के लिए 98 °C पर उबालें, 2 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें, और पश्चिमी सोख्ता के लिए -20 °C पर स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, अन्य डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए चरण 4.10 से सीधे -80 डिग्री सेल्सियस पर एलुएट स्टोर करें।
    नोट: शुद्ध यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन की मात्रा को कोशिकाओं की संख्या और प्लास्मिड की मात्रा में वृद्धि करके बढ़ाया जा सकता है। एक एपिटोप टैगिंग रणनीति को सेलुलर परिसरों को शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो विशेष रूप से देशी शुद्धिकरण स्थितियों के तहत सर्वव्यापी पी 53 से जुड़ते हैं। फ्लैग-पी 53, एमडीएम 2, और एचए-यूबिकिटिन को सह-व्यक्त करके, स्तनधारी कोशिकाओं से अनुक्रमिक फ्लैग और एचए एंटीबॉडी-संयुग्मित अगारोस द्वारा सर्वव्यापी पी 53 प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को इम्यूनोप्रेसिपिटेट किया जा सकता है। शुद्धिकरण की प्रक्रिया के दौरान कम कठोर BC100 लाइसिस बफर (20 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10% ग्लिसरॉल, 0.2 mM EDTA, 0.2% ट्राइटन X-100, और 1x प्रोटीज अवरोधक) का उपयोग किया जाना चाहिए। एचए पेप्टाइड से एलुएट को मास स्पेक्ट्रोमेट्री के अधीन किया जाता है ताकि उन सभी भागीदारों की पहचान की जा सके जो विशेष रूप से सर्वव्यापी पी 53 से जुड़ते हैं।

5. विकृत परिस्थितियों में सर्वव्यापी प्रोटीन का शुद्धिकरण

  1. चरण 3.3 में प्राप्त सेल छर्रों में 1 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस जोड़ें और समान रूप से मिलाएं। इनपुट नमूने के रूप में माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन का एलिकोट 100 μL (1/10 वॉल्यूम)।
  2. सेल छर्रों को इकट्ठा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 x g पर सेंट्रीफ्यूज। इनपुट नमूने में 80 μL फ्लैग लाइसिस बफर जोड़ें, एक भंवर ऑसिलेटर या पिपेट गन का उपयोग करके कोशिकाओं को मिलाएं, और कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए बर्फ पर रखें।
  3. सेंट्रीफ्यूज 8,000 x g पर 20-30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सुपरनैटेंट के 80 μL का एलिकोट करें।
  4. सतह पर तैरने वाले में 5x SDS लोडिंग बफर का 20 μL जोड़ें, 5-10 मिनट के लिए 98 °C पर उबालें, 2 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें, और उपयोग होने तक -20 °C पर स्टोर करें।
  5. सेल पेलेट को इकट्ठा करने के लिए 5 मिनट के लिए 700 x g पर सेल निलंबन के शेष 900 μL को सेंट्रीफ्यूज करें। सेल के छर्रों में 1 एमएल यूबिकिटिन बफर 1 (यूबी बफर 1; 6 एम गुआनिडाइन-एचसीआई, 0.1 एम ना2एचपीओ4, 6.8 एमएम एनएएच2पीओ4, 10 एमएम ट्राइस-एचसीआई (पीएच 8.0), और 0.2% ट्राइटन एक्स -100 जोड़ें, जो 10 एमएम β-मर्काप्टोएथेनॉल और 5 एमएम इमिडाज़ोल के साथ ताजा पूरक हैं।
    नोट: निकल-चार्ज राल पर निरर्थक प्रोटीन बंधन को कम करने के लिए इमिडाज़ोल की एकाग्रता 5 एमएम से 20 एमएम तक भिन्न हो सकती है। यूबिकिटिन बफर में गुआनिडाइन हाइड्रोक्लोराइड होता है, जो लिगेज और डीयूबी दोनों को निष्क्रिय कर देता है। β-मर्दीपोएथेनॉल सड़े हुए अंडे के समान एक मजबूत, अप्रिय गंध के साथ एक स्पष्ट, रंगहीन तरल है। एक उच्च एकाग्रता समाधान श्लेष्म झिल्ली, ऊपरी श्वसन पथ, त्वचा और आंखों को गंभीर नुकसान पहुंचाएगा। दस्ताने और चश्मे पहनें और फ्यूम हुड में काम करें।
  6. सेल लाइसेट को अल्ट्रासोनिकेशन के 10-20 राउंड के अधीन करें जब तक कि समाधान अब चिपचिपा न हो। 20 kHZ और 80% आयाम की सोनिकेशन आवृत्ति पर बर्फ पर अल्ट्रासोनिकेशन करें, जिसमें प्रत्येक पल्स 1 सेकंड तक चलती है। आरटी में 20-30 मिनट के लिए 8,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और सुपरनैटेंट को एक नए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. सतह पर तैरने वाले राल में 30 μL निकल-चार्ज राल जोड़ें और 4 घंटे या रात भर RT पर 15 rpm पर एक घूर्णन सेट पर इनक्यूबेट करें।
  8. मोतियों को इकट्ठा करने के लिए 1 एमएल यूबी बफर 1 जोड़ें, आरटी में 10 मिनट के लिए शेकर में रोटेशन के साथ इनक्यूबेट करें, और आरटी में 2 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  9. मोतियों में 1 एमएल यूबिकिटिन बफर 2 (यूबी बफर 2; 8 एम यूरिया, 0.1 एम एनए2एचपीओ4, 6.8 एमएम एनएएच2पीओ4, 10 एमएम ट्राइस-एचसीआई (पीएच 8.0), और 0.2% ट्राइटन एक्स -100) जोड़ें, आरटी पर 10 मिनट के लिए शेकर में रोटेशन के साथ इनक्यूबेट करें, और मोतियों को इकट्ठा करने के लिए 2 मिनट के लिए 1,500 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें। इसे एक बार फिर दोहराएं।
  10. मोतियों में, 1 एमएल पीबीएस जोड़ें, आरटी में 10 मिनट के लिए शेकर में रोटेशन के साथ इनक्यूबेट करें, और मोती इकट्ठा करने के लिए आरटी में 2 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। इसे एक बार फिर दोहराएं।
  11. आरटी में 1 घंटे के लिए 0.5 एम की अंतिम सांद्रता पर 40 μL इमिडाज़ोल के साथ मोतियों को इंजेक्ट करके प्रोटीन को बांधा जाता है।
  12. सुपरनैटेंट को एक साफ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, 5x SDS लोडिंग बफर का 10 μL जोड़ें, 5 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर उबालें, 2 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें, और पश्चिमी सोख्ता के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, अन्य डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर असंसाधित एलुएट स्टोर करें।

6. पश्चिमी सोख्ता द्वारा शुद्ध सर्वव्यापी प्रोटीन का पता लगाना

  1. सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) द्वारा चरण 4.11 और 5.12 से नमूनों को हल करें, और फिर उन्हें पश्चिमी सोख्ता द्वारा नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित करें ताकिवर्णित एंटीबॉडी का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाया जा सके।
  2. संक्षेप में, 1 घंटे के लिए आरटी पर टीबीएसटी बफर (15 एमएम ट्राइस-एचसीआई; पीएच = 7.6, 4.6 एमएम ट्राइस-बेस, 150 एमएम एनएसीआई, उपयोग से पहले 0.1% ट्वीन -20 के साथ ताजा पूरक) में 5% डिफैट मिल्क पाउडर युक्त 20 एमएल ब्लॉकिंग घोल में डुबोकर झिल्ली को इनक्यूबेट करें। फिर, 2 घंटे के लिए या रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर आरटी पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें। प्रत्येक सेट के लिए निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग करें। सभी प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग 1: 1000 के कमजोर पड़ने पर किया गया था।
    1. फ्लैग/एम2 अगारोस बीड्स के साथ इम्यूनोप्रेसिटेशन के बाद एंटी-पी53 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ कुल पी53 प्रोटीन का पता लगाएं, जिसमें यूबिकिटिनेटेड पी53 भी शामिल है।
    2. फ्लैग/एम2 अगारोस बीड्स के साथ इम्यूनोप्रेसिटेशन के बाद एंटी-एचए एंटीबॉडी या एंटी-यूबिकिटिन एंटीबॉडी के साथ सर्वव्यापी पी 53 प्रोटीन का पता लगाएं।
    3. निकल-चार्ज राल पुलडाउन के बाद एंटी-पी 53 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ सर्वव्यापी पी 53 प्रोटीन का पता लगाएं।
    4. निकल-चार्ज राल पुलडाउन के बाद एंटी-एचए एंटीबॉडी या एंटी-यूबिकिटिन एंटीबॉडी के साथ कुल सर्वव्यापी प्रोटीन का पता लगाएं।
  3. 5 मिनट के लिए टीबीएसटी बफर के साथ 3x धोने के बाद 1 घंटे के लिए आरटी पर हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) -संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें। सभी द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग 1: 3000 के कमजोर पड़ने पर किया गया था। फिर, झिल्ली को टीबीएसटी बफर 3x के साथ 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ धोएं।
  4. पश्चिमी सोख्ता से संकेतों का पता लगाने के लिए केमिलुमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम शुरू करें। 1: 1 के अनुपात में समाधान ए और बी को मिलाकर एचआरपी के लिए सब्सट्रेट समाधान तैयार करें।
  5. कैमरे में नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को फेस अप करें और पाइपिंग गन का उपयोग करके झिल्ली पर समान रूप से सब्सट्रेट समाधान को कोट करें। केमिलुमिनेसेंट सिग्नल को कैप्चर करने के लिए स्वचालित एक्सपोज़र प्रक्रिया का चयन करें और मैन्युअल रूप से एक्सपोज़र समय को समायोजित करें जब तक कि एक आदर्श सिग्नल प्राप्त न हो जाए।

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Representative Results

योजनाबद्ध आरेख फ्लैग-टैग किए गए पी 53 (फ्लैग-पी 53) और हिस / एचए डबल-टैग्ड यूबिकिटिन (एचएच-यूबी) प्रोटीन (चित्रा 1 ए) दिखाता है। सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं को चित्रा 1 बी में संक्षेप ति किया गया है। स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन को लक्षित करने के लिए पॉली-हिज-टैग किए गए यूबिकिटिन को लिगेट किया जा सकता है। यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को नॉनडिनेचरिंग स्थितियों के तहत फ्लैग / एम 2 मोतियों के साथ या विकृत परिस्थितियों में स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (आईएमएसी) द्वारा शुद्ध किया जा सकता है (चित्रा 1 बी)। कुल पी 53 प्रोटीन, जिसमें यूबिकिटिनेटेड पी 53 भी शामिल है, को गैर-विकृत परिस्थितियों में एच 1299 कोशिकाओं से फ्लैग / एम 2 मोतियों के साथ इम्यूनोप्रेसिपिटेट किया गया था। यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन से संकेत, जो कम से उच्च आणविक भार तक एक स्मीयर बैंड के रूप में दिखाई देता है, स्पष्ट रूप से बढ़ गया था जब एमडीएम 2 को इन कोशिकाओं में अस्थानिक रूप से व्यक्त किया गया था, यह सुझाव देते हुए कि सर्वव्यापी पी 53 प्रोटीन को कोशिकाओं से प्रभावी ढंग से शुद्ध किया गया है (चित्रा 2)। इसके बाद, कोशिकाओं को विकृत परिस्थितियों में रखा गया था, और कुल सेलुलर सर्वव्यापी प्रोटीन को निकल-चार्ज राल के साथ नीचे खींचा गया था। कुल सेलुलर प्रोटीन का पता पश्चिमी सोख्ता द्वारा एंटी-एचए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके लगाया गया था और एंटी-पी 53 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन का पता लगाया गया था। परिणामों से पता चला कि कुल सर्वव्यापी प्रोटीन स्तर अपरिवर्तित था, लेकिन इन कोशिकाओं में एमडीएम 2 के अतिरंजित होने के बाद सर्वव्यापी पी 53 प्रोटीन स्तर नाटकीय रूप से बढ़ गया था। इन परिणामों ने संकेत दिया कि यूबिकिटिनेटेड पी 53 युक्त कुल यूबिकिटिन प्रोटीन को प्रभावी रूप से विकृत परिस्थितियों में सेल लाइसेट से नीचे खींच लिया गया था (चित्रा 3)।

Figure 1
चित्र 1: सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रियाओं का सारांश। (A) फ्लैग-टैग किए गए p53 (Flag-p53) और His/HA डबल-टैग्ड यूबिकिटिन (HH-Ub) प्रोटीन का योजनाबद्ध आरेख। (बी) यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को गैर-विकृत परिस्थितियों में फ्लैग / एम 2 मोतियों के साथ और आईएमएसी द्वारा विकृत परिस्थितियों में शुद्ध किया जा सकता है। संक्षिप्तरूप: हिस / एचए = पॉलीहिस्टिडीन / हेमग्लूटिनिन; यूबी = यूबिकिटिन; ध्वज / एम 2 मोती = एंटी-फ्लैग एम 2 एंटीबॉडी-संयुग्मित मोती; IMAC = स्थिर धातु आयन आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को गैर-विकृत परिस्थितियों में शुद्ध किया गया था। फ्लैग-पी 53 अभिव्यक्ति प्लास्मिड को अकेले एचएच-यूबी के साथ, या एमडीएम 2 और एचएच-यूबी के साथ एच 1299 कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था। सेल अर्क से फ्लैग /एम 2 मोतियों द्वारा कुल पी 53 प्रोटीन और सर्वव्यापी रूपों को इम्यूनोप्रेसिपिटेट किया गया था। एलुएट को एंटी-पी 53 (ए) और एंटी-एचए (बी) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉटिंग के अधीन किया गया था। (ग) कच्चे सेल के अर्क (इनपुट) को एंटी-पी53 और एंटी-एमडीएम2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉटिंग के अधीन किया गया था। जीएफपी का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। संक्षिप्तरूप: एचएच-यूबी = हिस / एचए डबल-टैग्ड यूबिकिटिन; एचए = हेमग्लूटिनिन; ध्वज / एम 2 मोती = एंटी-फ्लैग एम 2 एंटीबॉडी-संयुग्मित मोती; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को विकृत परिस्थितियों में शुद्ध किया गया था। फ्लैग-पी 53 अभिव्यक्ति प्लास्मिड को अकेले एचएच-यूबी के साथ, या एमडीएम 2 और एचएच-यूबी के साथ एच 1299 कोशिकाओं में स्थानांतरित किया गया था। कुल सेलुलर यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को निकल-चार्ज राल के साथ नीचे खींचा गया था और फिर एंटी-पी 53 और एंटी-एचए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी सोख्ता के अधीन किया गया था। (ए) एंटी-पी 53 एंटीबॉडी का उपयोग करके यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन का पता लगाया गया था। (बी) एंटी-एचए एंटीबॉडी का उपयोग करके कुल सर्वव्यापी प्रोटीन का पता लगाया गया था। (ग) कच्चे सेल के अर्क (इनपुट) को एंटी-पी53 और एंटी-एमडीएम2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉटिंग के अधीन किया गया था। जीएफपी का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। संक्षिप्तरूप: एचएच-यूबी = हिस / एचए डबल-टैग्ड यूबिकिटिन; एचए = हेमग्लूटिनिन; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

लगभग सभी शारीरिक और पैथोलॉजिकल सेलुलर प्रक्रियाओं में सर्वव्यापी महत्वपूर्ण भूमिकानिभाता है। हाल के वर्षों में, सिग्नलिंग मार्गों में यूबिकिटिन की आणविक भूमिका को समझने में बड़ी प्रगति हुई है और यूबिकिटिन प्रणाली में परिवर्तन विभिन्न मानव रोगों का कारण कैसे बनताहै। सर्वव्यापी प्रोटीन का शुद्धिकरण इन प्रक्रियाओं में सर्वव्यापी की सटीक भूमिकाओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में योगदान देता है। यूबिकिटिन-संयुग्मित प्रोटीन के मिश्रण को गैर-विकृत और विकृत स्थितियों के तहत कोशिकाओं से शुद्ध किया जा सकता है। निकेल रेजिन का उपयोग करके आईएमएसी का उपयोग विकृत परिस्थितियों में पॉली-हिज-टैग किए गए प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए किया जा सकता है। विकृत परिस्थितियों के तहत सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने का लक्ष्य लक्ष्य प्रोटीन से बातचीत भागीदारों को त्यागना है। लक्ष्य प्रोटीन से बंधे सभी सेलुलर घटकों को विकृत स्थितियों के तहत क्षालन से हटा दिया जाएगा। इसके विपरीत, लक्षित प्रोटीन के लिए बाध्यकारी कुछ सेलुलर प्रोटीन को देशी परिस्थितियों में क्षालन में रखा जा सकता है, जो डाउनस्ट्रीम प्रयोगों में हस्तक्षेप कर सकता है। मजबूत विकृतियों की उपस्थिति में भी यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को शुद्ध किया जा सकता है, जो निकल रेजिन के लिए गैर-विशिष्ट प्रोटीन बंधन को बहुत कम कर देता है। इसके विपरीत, कुल लक्ष्य प्रोटीन, जिसमें उनके सर्वव्यापी रूप शामिल हैं, को गैर-विकृत परिस्थितियों में एंटीबॉडी-संयुग्मित अगारोस मोतियों का उपयोग करके एपिटोप टैगिंग रणनीतियों द्वारा शुद्ध किया जा सकता है। प्रोटीन को कम कठोर परिस्थितियों में शुद्ध किया गया था क्योंकि इस प्रक्रिया के दौरान एंटीबॉडी-मध्यस्थता आत्मीयता शुद्धिकरण का उपयोग किया गया था। लक्ष्य प्रोटीन और उनके सर्वव्यापी रूपों को प्रोटीन- या यूबिकिटिन-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पता लगाया गया था। एचए- और माइक-टैग किए गए प्रोटीन को एंटीबॉडी-संयुग्मित अगारोस मोतियों के साथ एक ही प्रक्रिया का उपयोग करके आसानी से शुद्ध किया जा सकता है। विशेष रूप से, प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पॉलीयूबिकिटिन श्रृंखलाओं वाले लोगों की तुलना में एकल या एकाधिक मोनोयूबिकिटिन श्रृंखलाओं वाले प्रोटीन का पता लगाना आसान है। इसके विपरीत, पॉलीयूबिकिटिन श्रृंखलाओं वाले प्रोटीन को यूबिकिटिन-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा अधिक आसानी से पहचाना जा सकता है।

प्रभावी रूप से सर्वव्यापी प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं में लक्ष्य प्रोटीन का अभिव्यक्ति स्तर उच्च होना चाहिए। मजबूत सीएमवी प्रमोटरों के साथ अभिव्यक्ति वैक्टर का उपयोग कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, ई 3 यूबिकिटिन लिगेज और यूबिकिटिन को लक्ष्य प्रोटीन के साथ सह-व्यक्त किया जा सकता है। यह प्रोटीन में अधिक प्रभावी ढंग से यूबिकिटिन मोइटीज जोड़ देगा। कोशिकाओं में सर्वव्यापी प्रोटीन जमा करने के लिए 26 एस प्रोटीसम की गतिविधि को छोटे अणु अवरोधक द्वारा अवरुद्ध किया जा सकता है। यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को प्रभावी ढंग से राल से बांधने के लिए, समाधान को गैर-चिपचिपा बनाने के लिए डीएनए कॉम्प्लेक्स को बाधित करने के लिए सेल अर्क को संक्षेप में सोनिक किया जाना चाहिए। गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए, इमिडाज़ोल की कम सांद्रता को विकृत स्थितियों के तहत लाइसिस बफर में जोड़ा जाना चाहिए। बहुत अधिक आणविक भार वाले सर्वव्यापी प्रोटीन को विकृत करने और पुन: फोल्डिंग प्रक्रिया के बाद राल के साथ जोड़ना आसान होता है। क्षालन की क्षमता बढ़ाने के लिए, इमिडाज़ोल की उच्च सांद्रता का उपयोग करने का प्रयास करें। यदि क्षालन की क्षमता अभी भी बेहद कम थी, तो सीधे एसडीएस लैमली लोडिंग बफर में उबालकर सर्वव्यापी प्रोटीन को अलग करने का प्रयास करें। राल से बंधे अधिकांश सर्वव्यापी प्रोटीन को इस मजबूत विकृत बफर में रखा जा सकता है। सर्वव्यापी प्रोटीन की उच्च शुद्धता प्राप्त करने के लिए, दो-चरणीय आत्मीयता शुद्धिकरण को अनुकूलित किया जा सकता है। गैर-विकृत परिस्थितियों में फ्लैग / एम 2 इम्यूनोप्रेसिटेशन के बाद, निकल-चार्ज राल द्वारा दूसरे चरण के शुद्धिकरण का उपयोग हिस-टैग किए गए यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को नीचे खींचने और गैर-सर्वव्यापी सब्सट्रेट्स से छुटकारा पाने के लिए किया जा सकता है। इसके विपरीत, विकृत स्थिति के तहत निकल-चार्ज राल पुल-डाउन के बाद, एंटी-फ्लैग या एंटी-एचए एंटीबॉडी संयुग्मित अगारोस बीड्स द्वारा एपिटोप टैगिंग रणनीति का उपयोग करके लक्ष्य प्रोटीन को इम्यूनोप्रेसिटेट करने के लिए एक दूसरा आत्मीयता शुद्धिकरण चरण अनुकूलित किया जा सकता है।

हमने सर्वव्यापी प्रोटीन का पता लगाने के लिए चांदी के धुंधला होने या कूमासी धुंधला होने के बजाय अधिक संवेदनशील इम्यूनोब्लोटिंग का उपयोग किया है क्योंकि हमने इस अध्ययन में शुद्धिकरण का एक छोटा सा प्रदर्शन किया था। वास्तव में, हालांकि कुछ सेलुलर प्रोटीन कोशिकाओं में आसानी से सर्वव्यापी होते हैं, प्रोटीन का केवल एक छोटा सा हिस्सा यूबिकिटिन मोइटीज के साथ जुड़ा हो सकता है। चांदी के दाग या कूमासी धुंधला करके इन प्रोटीनों का सफलतापूर्वक पता लगाने के लिए, बड़े पैमाने पर शुद्धिकरण किया जाना चाहिए। सर्वव्यापी प्रोटीन की शुद्धता बढ़ाने के लिए, एक दूसरा आत्मीयता शुद्धिकरण चरण भी किया जाना चाहिए। हमने इन प्रयोगों का प्रदर्शन नहीं किया क्योंकि इस प्रोटोकॉल के माध्यम से शुद्ध किए गए सर्वव्यापी प्रोटीन पूरी तरह से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की आवश्यकता को पूरा करते हैं। उदाहरण के लिए, सर्वव्यापी द्वारा विनियमित लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट डीयूबी की पहचान करने के लिए, हमें बड़ी मात्रा में सर्वव्यापी लक्ष्य प्रोटीन को शुद्ध करने की आवश्यकता है। इन प्रोटीनों को स्तनधारी कोशिकाओं से शुद्ध किए गए व्यक्तिगत डीयूबी के साथ एक डिओबिनेशन बफर में इनक्यूबेट किया जा सकता है। इस इन विट्रो उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग द्वारा, हम स्तनधारी कोशिकाओं में लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट डीयूबी की पहचान कर सकते हैं।

तकनीक की कई सीमाएं हैं। सर्वव्यापी प्रोटीन लक्ष्य प्रोटीन के बहुत छोटे हिस्से के लिए जिम्मेदार हैं, बड़ी मात्रा में सर्वव्यापी लक्ष्य प्रोटीन को शुद्ध करना मुश्किल है। उच्च शुद्धि दक्षता प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति को बढ़ाने का प्रयास करें। एक विकल्प अधिक सर्वव्यापी प्रोटीन प्राप्त करने के लिए एक इन विट्रो सर्वव्यापी प्रतिक्रिया करना है। स्तनधारी कोशिकाओं में कुछ प्रोटीनों को अत्यधिक व्यक्त करना मुश्किल होता है, जो उच्च मात्रा में यूबिकिटिनेटेड प्रोटीन को शुद्ध करने पर एक और सीमा लगाता है। अंत में, वर्तमान प्रोटोकॉल टैग किए गए प्रोटीन के शुद्धिकरण तक सीमित है जो प्लास्मिड डीएनए का उपयोग करके अतिरंजित होते हैं। लक्ष्य प्रोटीन का अभिव्यक्ति स्तर अंतर्जात लक्ष्य प्रोटीन की तुलना में अधिक है। एक लक्ष्य प्रोटीन की अंतर्जात सर्वव्यापी स्थिति का आकलन करने के लिए, उनके सर्वव्यापी रूपों के साथ प्रोटीन को कोशिकाओं से लक्ष्य प्रोटीन-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा सीधे इम्यूनोप्रेसिटेट किया जा सकता है। लक्ष्य प्रोटीन की सर्वव्यापी स्थिति निर्धारित करने के लिए एंटी-यूबिकिटिन एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, कुछ परिस्थितियों में, निम्न अभिव्यक्ति स्तर, लक्ष्य प्रोटीन का निम्न सर्वव्यापी स्तर, या विशिष्ट एंटीबॉडी की कम इम्यूनोप्रेसिटेशन दक्षता स्तनधारी कोशिकाओं से अंतर्जात लक्ष्य प्रोटीन की सर्वव्यापी स्थिति का पता लगाने को सीमित कर सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल इसके बजाय एक प्रयोगात्मक प्रणाली प्रदान कर सकता है।

पी 53 ट्यूमर सप्रेसर प्रोटीन सामान्य कोशिकाओं 8,9,10,11 के घातक परिवर्तन को रोकने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। पी 53 की स्थिरता को कोशिकाओं में सर्वव्यापी-मध्यस्थता गिरावट द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है। एमडीएम 2 खुराक-निर्भर तरीके से पी 53 मोनो- और पॉलीसर्विस को बढ़ावा देने के लिए ई 3 यूबिकिटिन लिगेज के रूप में कार्य करताहै। यहां, एमडीएम 2 ओवरएक्प्रेशन की उपस्थिति में स्तनधारी कोशिकाओं में विकृत और गैर-विकृत स्थितियों के तहत यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को शुद्ध किया गया था। मोनोयूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन को अधिमानतः एंटी-पी 53 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ पाया गया था, जबकि पॉलीयूबिकिटिनेटेड रूपों को यूबिकिटिन-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ आसानी से पता लगाया गया था। कोशिकाओं में एमडीएम 2 की अभिव्यक्ति को बढ़ाकर पॉलीयूबिकिटिनेटेड रूपों के स्तर को प्रभावी ढंग से बढ़ाया जा सकता है। यह पेपर प्रोटीन फ़ंक्शन को संशोधित करने में सर्वव्यापी की भूमिका को स्पष्ट करने के लिए सर्वव्यापी प्रोटीन की तैयारी के लिए एक आदर्श प्रयोगात्मक प्रणाली प्रदान करता है। एक लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट डीयूबी की पहचान करने और सिग्नलिंग में विभिन्न प्रकार की यूबिकिटिन श्रृंखलाओं की भूमिकाओं को प्रकट करने के लिए यूबिकिटिन प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, के 48- और के 63-लिंक्ड चेन। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन कॉम्प्लेक्स गठन में सर्वव्यापी भूमिकाओं की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81972624) से डीएल को अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
β-mercaptoethanol Sangon Biotech M6250
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE healthcare NA931 Secondary antibdoy
Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE healthcare NA935 Secondary antibdoy
Anti-Flag M2 Affinity Gel Sigma-Aldrich A2220 FLAG/M2 beads
Anti-GFP monocolonal antibody Santa cruz sc-9996 Primary antibody
Anti-HA High Affinity Roche 11867423001 Primary antibody
Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) Santa cruz sc-965 Primary antibody
Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) Santa cruz sc-126 Primary antibody
EDTA Sigma-Alddich E5134 solvent
Fetal Bovine Serum VivaCell C04001-500 FBS
FLAG Peptide Sigma-Alddich F3290 Prepare elution buffer
GlutaMAX Gibco 35050-061 supplement
Guanidine-HCI Sangon Biotech A100287-0500 solvent
H1299 Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences
Image Lab Bio-rad software
Immidazole Sangon Biotech A500529-0100 solvent
Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate Millipore WBKLS0500
Lipofectamine 2000 reagents Invitrogen 11668019 Transfection reagent
MG132 MedChemExpress HY-13259 Proteasome inhibitor
Na2HPO4 Sangon Biotech A501727-0500 solvent
NaCl Sangon Biotech A610476-0005 solvent
NaF Sigma-Alddich 201154 solvent
NaH2PO4 Sangon Biotech A501726-0500 solvent
Ni-NTA Agarose QIAGEN 30230 nickel-charged resin
Nitrocellulose Blotting membrane GE healthcare 10600002 0.45 µm pore size
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985-070 Transfection medium
PBS Corning 21-040-cv
Penicillin-Streptomycin Solution Sangon Biotech E607011-0100 antibiotic
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8340
RPMI 1640 Biological Industries 01-100-1ACS medium
Sarkosyl Sigma-Alddich L5777 solvent
SDS Loading Buffer Beyotime P0015L
Sodium Pyruvate Gibco 11360-070 supplement
Tris-base Sangon Biotech A501492-0005 solvent
Tris-HCI Sangon Biotech A610103-0250 solvent
Triton X-100 Sangon Biotech A110694-0500 reagent
Tween-20 Sangon Biotech A100777-0500 supplement
Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System Bio-rad ChemiDoc XRS+
Urea Sangon Biotech A510907-0500 solvent

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References

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जैव रसायन अंक 181
स्तनधारी कोशिकाओं से यूबिकिटिनेटेड पी 53 प्रोटीन का शुद्धिकरण
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Wu, D., He, M., Li, D. Purification… More

Wu, D., He, M., Li, D. Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (181), e63602, doi:10.3791/63602 (2022).

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