Summary
Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zur Reinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen aus Zellen gereinigt.
Abstract
Ubiquitination ist eine Art posttranslationale Modifikation, die nicht nur die Stabilität, sondern auch die Lokalisation und Funktion eines Substratproteins reguliert. Der Ubiquitinierungsprozess findet intrazellulär in Eukaryoten statt und reguliert fast alle grundlegenden zellbiologischen Prozesse. Die Reinigung ubiquitinierter Proteine hilft bei der Untersuchung der Rolle der Ubiquitinierung bei der Steuerung der Funktion von Substratproteinen. Hier wird ein schrittweises Verfahren zur Reinigung ubiquitinierter Proteine in Säugetierzellen am Beispiel des Tumorsuppressorproteins p53 beschrieben. Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter strengen nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen gereinigt. Das gesamte zelluläre Flag-markierte p53-Protein wurde mit Anti-Flag-Antikörper-konjugierter Agarose unter nicht denaturierenden Bedingungen gereinigt. Alternativ wurde das gesamte zelluläre His-markierte ubiquitinierte Protein unter Verwendung von nickelgeladenem Harz unter Denaturierungsbedingungen gereinigt. Ubiquitinierte p53-Proteine in den Eluaten wurden erfolgreich mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Mit diesem Verfahren können die ubiquitinierten Formen eines bestimmten Proteins effizient von Säugetierzellen gereinigt werden, was Studien über die Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Proteinfunktion erleichtert.
Introduction
Ubiquitin ist ein evolutionär konserviertes Protein aus 76 Aminosäuren 1,2,3. Ubiquitin bindet kovalent Lysinreste an Zielproteine durch Kaskaden mit aktivierenden (E1), konjugierenden (E2) und Ligase (E3) Enzymen. Ubiquitin wird zunächst durch das Enzym E1 aktiviert und dann auf die E2-konjugierenden Enzyme übertragen. Anschließend interagieren E3-Ubiquitin-Ligasen sowohl mit Ubiquitin-beladenen E2-Enzymen als auch mit Substratproteinen und vermitteln die Bildung einer Isopeptidbindung zwischen dem C-Terminal von Ubiquitin und einem Lysinrest im Substrat 1,2,3,4,5. Ubiquitinierung beinhaltet die Anlagerung von Ubiquitin-Einheiten an Lysinreste auf Substratproteinen oder an sich selbst, was zu Proteinmonoubiquitinierung oder Polyubiquitinierung führt. Dieser Ubiquitinierungsprozess findet intrazellulär in Eukaryoten statt und reguliert eine Vielzahl biologischer Prozesse. Die Ubiquitinierung führt zum Abbau von Substratproteinen über das Ubiquitin-Proteasom-System 1,2,3,4,5. Darüber hinaus moduliert die Ubiquitinierung die subzelluläre Proteinlokalisation, die Proteinkomplexbildung und den Proteintransport in Zellen 3,5. Ubiquitin-Einheiten, die an Substratproteine gebunden sind, können durch deubiquitinierende Enzyme (DUBs) entfernt werden6,7. Insbesondere bieten die verschiedenen Arten, in denen Ubiquitinketten zusammengesetzt sind, eine Vielzahl von Möglichkeiten, verschiedene biologische Prozesse zu regulieren 1,5. Die genaue Rolle der Ubiquitinierung bei der Regulierung der Substratproteinfunktion ist bisher unvollständig verstanden. Die Aufreinigung ubiquitinierter Proteine trägt zur Aufklärung der Auswirkungen der Proteinubiquitinierung auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse bei.
Das p53-Protein ist eines der wichtigsten Tumorsuppressorproteine und weist bei fast allen menschlichen Krebserkrankungen genetische Mutationen oder Inaktivierungen auf 8,9,10,11. P53-Stabilität und -Aktivität werden in vivo durch posttranslationale Modifikationen, einschließlich Ubiquitinierung, Phosphorylierung, Acetylierung und Methylierung12,13, empfindlich reguliert. Das p53-Protein hat eine kurze Halbwertszeit von 6 min bis 40 min in verschiedenen Zellen, die hauptsächlich aus seiner Polyubiquitinierung und dem anschließenden proteasomalen Abbau resultiert10,12. Maus double minute 2 (Mdm2) ist eine E3-Ubiquitin-Ligase von p53, die an den N-Terminus von p53 bindet, um ihre Transkriptionsaktivität12,14,15 zu hemmen. Mdm2 fördert die Polyubiquitinierung und den proteasomalen Abbau von p53, um seine Stabilität zu kontrollieren, und induziert die Monoubiquitinierung von p53, um seinen nuklearen Export zu erleichtern12,14,15,16. Hier wird am Beispiel der Mdm2-vermittelten p53-Ubiquitinierung eine Methode zur Aufreinigung ubiquitinierter Proteine aus Säugetierzellen im Detail vorgestellt. Die Regulatoren, die den Ubiquitinierungsstatus von Zielproteinen beeinflussen, können mit diesem In-vivo-Ubiquitinierungsassay identifiziert werden, wenn sie in Säugetierzellen überexprimiert oder niedergeschlagen/ausgeschaltet werden. Darüber hinaus können ubiquitinierte Proteine als Substrate für In-vitro-Deubiquitinierungstests verwendet werden. Ein Hochdurchsatz-Screening kann durchgeführt werden, um spezifische DUBs für Zielproteine zu identifizieren, indem ubiquitinierte Substrate mit einzelnen DUBs inkubiert werden. Ubiquitinierte Proteine können als Gerüst fungieren, um nachgeschaltete Signalproteine in Zellen zu rekrutieren. Ein ubiquitinierter Zielproteinkomplex kann durch sequentielle Immunpräzipitation unter nativen Reinigungsbedingungen gereinigt und massenspektrometrisch identifiziert werden. Das aktuelle Protokoll kann umfassend verwendet werden, um die zellulären Proteine zu untersuchen, die durch Ubiquitinierung reguliert werden.
Es wurden mehrere Methoden zur Reinigung ubiquitinierter Proteine etabliert, darunter die Verwendung von affinitätsmarkiertem Ubiquitin, Ubiquitin-Antikörpern, Ubiquitin-bindenden Proteinen und isolierten Ubiquitin-bindenden Domänen (UBDs)17. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das affinitätsmarkiertes Ubiquitin als Mediator verwendet, um ubiquitinierte Proteine in Säugetierzellen zu reinigen. Die Verwendung von poly-His-getaggtem Ubiquitin bietet Vorteile gegenüber den anderen Methoden. Ubiquitinierte Proteine werden in Gegenwart starker Denaturierungsmittel gereinigt, was die unspezifische Bindung an nickelgeladenes Harz reduziert, indem zelluläre Proteine linearisiert und Protein-Protein-Interaktionen gestört werden. Im Gegensatz dazu kann die Verwendung von Ubiquitin-Antikörpern, Ubiquitin-bindenden Proteinen und isolierten UBDs als Mediatoren Bindungspartner nicht effektiv vom Zielprotein ausschließen, da die Reinigung unter weniger strengen Bedingungen durchgeführt werden muss. Darüber hinaus kann die Reinigung auch zu einer erhöhten Bindung von nicht verwandten Proteinen mit diesen Mediatoren führen. Darüber hinaus besteht eine Bindungsneigung für verschiedene Ubiquitin-Verknüpfungstypen sowie Mono- und Polyubiquitinierung durch Ubiquitin-bindende Proteine oder isolierte UBDs17. Die Verwendung von Poly-His-markiertem Ubiquitin trägt dazu bei, alle zellulären ubiquitinierten Proteine herunterzuziehen. Alternativ erleichtert die Verwendung kommerziell erhältlicher Anti-Flag- oder Anti-HA-Antikörper-konjugierter Agarose die Immunpräzipitation großflächiger Flag- oder HA-markierter Zielproteine unter nicht-denaturierenden Bedingungen. Ein zweiter Reinigungsschritt, beispielsweise durch nickelgeladenes Harz, das auf poly-His-markiertes Ubiquitin abzielt, kann verwendet werden, um ubiquitinierte Zielproteine mit hoher Reinheit für nachgeschaltete Experimente zu gewinnen. Insbesondere kann eine Epitop-Tagging-Reinigungsstrategie angepasst werden, wenn ein spezifischer Antikörper nicht erworben werden kann, um Zielproteine effektiv zu immunpräzipitieren. Schließlich behält die Reinigung ubiquitinierter Proteine in Säugetierzellen im Vergleich zur Reinigung in vitro den Ubiquitin-Bindungsmodus von Zielproteinen unter physiologischeren Bedingungen bei.
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Protocol
HINWEIS: H1299-Zellen wurden freundlicherweise von der Stammzellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften zur Verfügung gestellt und erwiesen sich als negativ für Mykoplasmenkontamination.
1. Zellkultur
- Für die Erstkultur 1 x 106 Zellen der menschlichen Lungenadenokarzinom-Zelllinie, H1299, in eine 10 cm Petrischale mit 10-12 ml RPMI 1640 Medium geben, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Glutaminzusatz, 1% Natriumpyruvat und Antibiotika (100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin). Halten Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2. Teilen Sie die Zellen alle 2-3 Tage, je nachdem, wann sie 80% -90% Konfluenz erreichen.
- Bereiten Sie einen Tag vor der Transfektion 6-9 x 10 6 Zellen für drei Petrischalen vor und legen Sie 2-3 x 106 Zellen in eine einzelne 10 cm Petrischale mit 10-12 ml Medium, um einen Zusammenfluss von 70% -90% während der Transfektion zu erreichen.
HINWEIS: HEK293T-Zellen können aufgrund ihrer hohen Transfektionseffizienz und Proteinexpression auch zur Reinigung ubiquitinierter Proteine verwendet werden.
2. Plasmidtransfektion
- Fügen Sie 1,5 ml reduziertes Serummedium in drei 15-ml-Zentrifugenröhrchen hinzu.
- Fügen Sie jedem Röhrchen transfektionsbereite Plasmid-DNA hinzu, um Verdünnungen wie folgt vorzunehmen. Röhre 1: 1 μg Flag-p53-Plasmid, 12 μg leerer Vektor; Röhre 2: 1 μg Flag-p53-Plasmid, 3 μg His-HA-Ub (HH-Ub)-Plasmid und 9 μg leerer Vektor; Röhrchen 3: 1 μg Flag-p53-Plasmid, 3 μg HH-Ub-Plasmid und 9 μg Mdm2-Plasmid. Fügen Sie jedem Röhrchen insgesamt 0,2 μg grün fluoreszierendes Protein (GFP)-Plasmid hinzu, um die Transfektionseffizienz zu überwachen.
HINWEIS: Ein Pilotexperiment sollte durchgeführt werden, um die optimalen Mengen an Plasmiden zu bestimmen, die benötigt werden, um eine effiziente Zielproteinexpression in Zellen zu erreichen. - Fügen Sie 78 μL Liposomentransfektionsreagenz zu 4,5 ml reduziertem Serummedium in einem anderen Zentrifugenröhrchen hinzu, um die Liposomen zu verdünnen. Mischen Sie gründlich durch Schnippen der Tube und lassen Sie sie 5 min bei Raumtemperatur (RT) stehen.
- 1,5 ml der verdünnten Liposomenlösung in jedes Röhrchen aus Schritt 2.2 geben, das 1,5 ml der verdünnten DNA-Lösung enthält. Mischen Sie die Plasmide gründlich und vernetzen Sie sie mit den Liposomen für mindestens 20 min bei RT. Verwenden Sie für jede Transfektion ein Plasmid-DNA:Liposomen-Verhältnis von 1:2 (μg:μL).
- Verwerfen Sie das Originalmedium aus den Petrischalen und geben Sie 9 ml reduziertes Serummedium in jede Schale. Fügen Sie 3 ml der Liposom-DNA-Mischung zu jeder Schale hinzu und mischen Sie die Lösung, indem Sie die Platte 3x und dann 3x links und rechts 3x hin und her schütteln, um die Mischung gleichmäßig in der Platte zu verteilen.
- Kultur der Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2. Ersetzen Sie das Medium nach 4-6 h und kultivieren Sie die Zellen für 24-36 h.
3. Zellsammlung
- Nach 24-36 h behandeln Sie die Zellen mit MG132 in einer Endkonzentration von 10 μM für 4-6 h.
HINWEIS: MG132 ist ein Peptidaldehyd, der die proteolytische Aktivität des 26S-Proteasom-Komplexes effizient blockiert. Die Mengen an Proteinen, die mit Lysin-48 (K48)-verknüpften Polyubiquitinketten ubiquitiniert werden, können erhöht werden, nachdem Zellen mit MG132 oder anderen Proteasom-Inhibitoren behandelt wurden. - Entsorgen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen 2x (achten Sie darauf, die Zellen nicht auszuspülen) mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und saugen Sie die Zellen mit serologischen Pipetten ab.
- Geben Sie 1 ml PBS in die Schale, entfernen Sie die Zellen durch Schaben mit einem sauberen Schaber und geben Sie die Zellsuspension in Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 700 x g für 5 min, um Zellpellets zu sammeln.
4. Reinigung ubiquitinierter Proteine unter nichtdenaturierenden Bedingungen
- Bereiten Sie den Flag-Lysepuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 137 mM NaCl, 10 mM NaF, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1% Triton X-100, 0,2% Sarkosyl und 10% Glycerin) frisch mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail vor Gebrauch vor.
- Fügen Sie 800 μL eiskalten Flag-Lysepuffer zu den Zellen in jedem Röhrchen hinzu, mischen Sie die Zellen mit einem Wirbeloszillator oder einer Pipettenpistole und inkubieren Sie die Mischung dann auf einem Rotator bei 4 °C für 30 min.
- Die Mischung 5-10 kurzen Ultraschallimpulsen aussetzen. Führen Sie die Ultraschallbehandlung auf dem Eis mit einer Beschallungsfrequenz von 20 kHZ und 80% Amplitude durch, wobei jeder Impuls 1 s dauert. Das Gemisch auf einem Rotator bei 40 Umdrehungen pro Minute (U/min) bei 4 °C für 30 min inkubieren.
- Zentrifugieren Sie die Ultraschallproben bei 8.000 x g für 20-30 min bei 4 °C. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Aliquot 80 μL (1/10) des Zellextrakts und mischen Sie mit 20 μL 5x Natriumdodecylsulfat (SDS) Ladepuffer. Die Proben 5 min bei 98 °C kochen, 2 min auf Eis abkühlen lassen und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern. Verwenden Sie diese Proben als Eingabegruppe, um die Proteinexpression zu überwachen.
- 30 μL Anti-Flag M2-Antikörper-konjugierte (Flag/M2) Kügelchen zu den verbleibenden Zellextrakten geben und auf einem Rotator bei 4 °C für mindestens 4 h oder über Nacht inkubieren.
- Zentrifugieren bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C, um die Perlen zu sammeln. Fügen Sie 1 ml eiskalten Flag-Lysepuffer zu den Perlen hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umdrehen.
- Zentrifugieren bei 1.500 x g für 2 min bei 4 °C, um die Perlen zu sammeln. Wiederholen Sie Schritt 4.7 für 4-6 Mal.
- 40 μL Flag-Peptide in einer Endkonzentration von 200 ng/μL zu den Beads geben und auf einem Rotator bei 4 °C für 2 h inkubieren, um die gebundenen Proteine zu eluieren.
- Zentrifugieren bei 1.500 x g für 5 min bei 4 °C. Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
- Fügen Sie 10 μL 5x SDS-Ladepuffer hinzu, kochen Sie die Mischung bei 98 °C für 5 min, kühlen Sie sie 2 min auf Eis und lagern Sie sie bei -20 °C für Western Blotting. Alternativ lagern Sie das Eluat aus Schritt 4.10 direkt bei -80 °C für andere nachgeschaltete Experimente.
HINWEIS: Die Menge der gereinigten ubiquitinierten Proteine kann erhöht werden, indem die Anzahl der Zellen und die Menge der transfizierten Plasmide erhöht werden. Eine Epitop-Tagging-Strategie kann angepasst werden, um zelluläre Komplexe zu reinigen, die spezifisch an ubiquitiniertes p53 unter nativen Reinigungsbedingungen binden. Durch die gleichzeitige Exprimierung von Flag-p53, mdm2 und HA-Ubiquitin kann der ubiquitinierte p53-Proteinkomplex durch sequentielle Flag- und HA-Antikörper-konjugierte Agarose aus Säugetierzellen immunpräzipitiert werden. Um die Bindungspartner von ubiquitinierten p53-Proteinen zu erhalten, sollte der weniger strenge BC100-Lysepuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 100 mM NaCl, 10% Glycerin, 0,2 mM EDTA, 0,2% Triton X-100 und 1x Proteaseinhibitor) während des Reinigungsprozesses verwendet werden. Das Eluat aus dem HA-Peptid wird einer Massenspektrometrie unterzogen, um alle Partner zu identifizieren, die spezifisch an ubiquitiniertes p53 binden.
5. Reinigung ubiquitinierter Proteine unter Denaturierungsbedingungen
- 1 ml eiskaltes PBS zu den in Schritt 3.3 erhaltenen Zellpellets geben und gleichmäßig mischen. Aliquot 100 μL (1/10 Vol.) der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen als Eingangsprobe.
- Zentrifugieren bei 700 x g für 5 min bei 4 °C, um die Zellpellets zu sammeln. Fügen Sie 80 μL Flag-Lysepuffer zur Eingangsprobe hinzu, mischen Sie die Zellen mit einem Wirbeloszillator oder einer Pipettenpistole und lysieren Sie die Zellen 1 h lang auf Eis.
- Zentrifugieren bei 8.000 x g für 20-30 min bei 4 °C. Aliquot 80 μL des Überstands in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
- 20 μL 5x SDS-Ladepuffer in den Überstand geben, bei 98 °C 5-10 min kochen, 2 min auf Eis abkühlen lassen und bis zum Gebrauch bei -20 °C lagern.
- Zentrifugieren Sie die restlichen 900 μL der Zellsuspension bei 700 x g für 5 min bei 4 °C, um das Zellpellet zu sammeln. 1 ml Ubiquitinpuffer 1 (UB-Puffer 1; 6 M Guanidin-HCI, 0,1 M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) und 0,2% Triton X-100, frisch ergänzt mit 10 mM β-Mercaptoethanol und 5 mM Imidazol) zu den Zellpellets geben und mehrmals durch Pipettieren auf und ab mischen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
HINWEIS: Die Konzentration von Imidazol kann von 5 mM bis 20 mM variieren, um die unspezifische Proteinbindung an das nickelgeladene Harz zu verringern. Der Ubiquitin-Puffer enthält Guanidinhydrochlorid, das sowohl Ligasen als auch DUBs inaktiviert. β-Mercaptoethanol ist eine klare, farblose Flüssigkeit mit einem starken, unangenehmen Geruch, ähnlich wie faule Eier. Eine hochkonzentrierte Lösung verursacht schwere Schäden an der Schleimhaut, den oberen Atemwegen, der Haut und den Augen. Tragen Sie Handschuhe und Schutzbrille und operieren Sie im Abzug. - Unterziehen Sie die Zelllysate 10-20 Runden Ultraschall, bis die Lösung nicht mehr viskos ist. Führen Sie die Ultraschallbehandlung auf dem Eis mit einer Beschallungsfrequenz von 20 kHZ und 80% Amplitude durch, wobei jeder Impuls 1 s dauert. Zentrifugieren Sie bei 8.000 x g für 20-30 min bei RT und überführen Sie den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 30 μL nickelgeladenes Harz zum Überstand hinzu und inkubieren Sie auf einem Rotator bei 15 U/min für 4 h oder über Nacht bei RT. Zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 2 min bei RT, um die Perlen zu sammeln.
- Fügen Sie 1 ml UB-Puffer 1 hinzu, inkubieren Sie mit Rotation in einem Shaker für 10 Minuten bei RT und zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 2 Minuten bei RT, um die Perlen zu sammeln.
- 1 ml Ubiquitinpuffer 2 (UB-Puffer 2; 8 M Harnstoff, 0,1M Na2HPO4, 6,8 mM NaH2PO4, 10 mM Tris-HCI (pH 8,0) und 0,2% Triton X-100) zu den Perlen geben, mit Rotation in einem Shaker für 10 min bei RT inkubieren und bei 1.500 x g für 2 min zentrifugieren, um die Perlen zu sammeln. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Zu den Perlen 1 ml PBS hinzufügen, mit Rotation in einem Shaker für 10 min bei RT inkubieren und bei 1.500 x g für 2 min bei RT zentrifugieren, um die Perlen zu sammeln. Wiederholen Sie dies noch einmal.
- Elue gebundene Proteine durch Inkubieren der Beads mit 40 μL Imidazol in einer Endkonzentration von 0,5 M für 1 h bei RT. Zentrifuge bei 1.500 x g für 2 min bei RT.
- Den Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen geben, 10 μL 5x SDS-Ladepuffer hinzufügen, bei 98 °C für 5 min kochen, 2 min auf Eis abkühlen lassen und bei -20 °C für Western Blotting lagern. Alternativ können Sie das unverarbeitete Eluat bei -80 °C für andere nachgeschaltete Experimente lagern.
6. Nachweis von gereinigten ubiquitinierten Proteinen durch Western Blotting
- Die Proben aus den Schritten 4.11 und 5.12 werden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) gelöst und dann durch Western Blotting auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, um Zielproteine unter Verwendung der entsprechenden Antikörper wie beschrieben18 nachzuweisen.
- Kurz gesagt, inkubieren Sie die Membran durch Eintauchen in 20 ml Blocklösung, die 5% Milchpulver enthält, in TBST-Puffer (15 mM Tris-HCI; pH = 7,6, 4,6 mM Tris-Base, 150 mM NaCI, frisch ergänzt mit 0,1% Tween-20 vor Gebrauch) bei RT für 1 h. Dann inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörpern bei RT für 2 h oder über Nacht bei 4 °C. Verwenden Sie die folgenden Antikörper für jeden Satz. Alle primären Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet.
- Nachweis des gesamten p53-Proteins, einschließlich ubiquitiniertem p53, mit einem monoklonalen Anti-p53-Antikörper nach Immunpräzipitation mit Flag/M2-Agaroseperlen.
- Nachweis ubiquitinierter p53-Proteine mit einem Anti-HA-Antikörper oder Anti-Ubiquitin-Antikörper nach Immunpräzipitation mit Flag/M2-Agaroseperlen.
- Nachweis ubiquitinierter p53-Proteine mit einem monoklonalen Anti-p53-Antikörper nach nickelgeladenem Harzpulldown.
- Nachweis des gesamten ubiquitinierten Proteins mit einem Anti-HA-Antikörper oder Anti-Ubiquitin-Antikörper nach einem nickelgeladenen Harz-Pulldown.
- Inkubieren Sie die Membran mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörpern bei RT für 1 h nach 3x Waschen mit TBST-Puffer für jeweils 5 min. Alle sekundären Antikörper wurden in einer Verdünnung von 1:3000 verwendet. Dann waschen Sie die Membran mit TBST-Puffer 3x für jeweils 5 min mit leichtem Rühren.
- Starten Sie das Chemilumineszenz-Bildgebungssystem, um Signale von Western Blotting zu erkennen. Die Substratlösung wird für HRP vorbereitet, indem die Lösungen A und B im Verhältnis 1:1 gemischt werden.
- Legen Sie die Nitrozellulosemembran mit der Vorderseite nach oben in die Camera Obscura, und beschichten Sie die Substratlösung mit einer Pipettierpistole gleichmäßig auf der Membran. Wählen Sie das automatische Belichtungsverfahren, um Chemilumineszenzsignale zu erfassen, und passen Sie die Belichtungszeit manuell an, bis ein ideales Signal erfasst wird.
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Representative Results
Das schematische Diagramm zeigt die Flag-tagged p53 (Flag-p53) und His/HA double-tagged ubiquitin (HH-Ub) Proteine (Abbildung 1A). Die Verfahren zur Reinigung ubiquitinierter Proteine sind in Abbildung 1B zusammengefasst. Poly-His-markiertes Ubiquitin kann zu Zielproteinen in Säugetierzellen ligiert werden. Ubiquitinierte Proteine können mit Flag/M2-Beads unter nichtdenaturierenden Bedingungen oder durch immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie (IMAC) unter Denaturierungsbedingungen gereinigt werden (Abbildung 1B). Das gesamte p53-Protein, einschließlich ubiquitiniertem p53, wurde mit Flag/M2-Perlen aus H1299-Zellen unter nicht denaturierenden Bedingungen immunpräzipiert. Das Signal des ubiquitinierten p53-Proteins, das als verschmierte Bande von niedrigem bis hohem Molekulargewicht erscheint, war deutlich erhöht, als Mdm2 in diesen Zellen ektopisch exprimiert wurde, was darauf hindeutet, dass das ubiquitinierte p53-Protein effektiv aus Zellen gereinigt wurde (Abbildung 2). Als nächstes wurden die Zellen unter denaturierenden Bedingungen lysiert, und das gesamte zelluläre ubiquitinierte Protein wurde mit nickelgeladenem Harz nach unten gezogen. Das gesamte zelluläre Protein wurde durch Western Blotting unter Verwendung eines monoklonalen Anti-HA-Antikörpers nachgewiesen und das ubiquitinierte p53-Protein wurde unter Verwendung eines monoklonalen Anti-p53-Antikörpers nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass der gesamte ubiquitinierte Proteinspiegel unverändert war, aber der ubiquitinierte p53-Proteinspiegel dramatisch erhöht war, nachdem Mdm2 in diesen Zellen überexprimiert wurde. Diese Ergebnisse zeigten, dass Gesamtubiquitinproteine, die ubiquitiniertes p53 enthielten, unter Denaturierungsbedingungen effektiv aus Zelllysaten gezogen wurden (Abbildung 3).
Abbildung 1: Eine Zusammenfassung der Verfahren zur Reinigung ubiquitinierter Proteine. (A) Schematische Darstellung der Flag-markierten p53 (Flag-p53) und His/HA doppelmarkierten Ubiquitin (HH-Ub) Proteine. (B) Ubiquitinierte Proteine können mit Flag/M2-Perlen unter nichtdenaturierenden Bedingungen und mit IMAC unter Denaturierungsbedingungen gereinigt werden. Abkürzungen: His/HA = Polyhistidin/Hämagglutinin; Ub = Ubiquitin; Flag/M2-Perlen = Anti-Flag-M2-Antikörper-konjugierte Perlen; IMAC = Immobilisierte Metallionenaffinitätschromatographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter nicht-denaturierenden Bedingungen gereinigt. Das Flag-p53-Expressionsplasmid wurde allein, mit HH-Ub oder mit Mdm2 und HH-Ub in H1299-Zellen transfiziert. Die gesamten p53-Proteine und ubiquitinierten Formen wurden durch Flag/M2-Perlen aus Zellextrakten immunpräzipitiert. Das Eluat wurde einem Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53(A)- und Anti-HA(B)-Antikörpern unterzogen. (C) Die Rohzellextrakte (Input) wurden einem Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53- und Anti-Mdm2-Antikörpern unterzogen. Als Ladesteuerung kam GFP zum Einsatz. Abkürzungen: HH-Ub = His/HA double-tagged ubiquitin; HA = Hämagglutinin; Flag/M2-Perlen = Anti-Flag-M2-Antikörper-konjugierte Perlen; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Ubiquitinierte p53-Proteine wurden unter denaturierenden Bedingungen gereinigt. Das Flag-p53-Expressionsplasmid wurde allein, mit HH-Ub oder mit Mdm2 und HH-Ub in H1299-Zellen transfiziert. Die gesamten zellulären ubiquitinierten Proteine wurden mit nickelgeladenem Harz heruntergezogen und dann einem Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53- und Anti-HA-Antikörpern unterzogen. (A) Ubiquitiniertes p53-Protein wurde mit einem Anti-p53-Antikörper nachgewiesen. (B) Das gesamte ubiquitinierte Protein wurde mit einem Anti-HA-Antikörper nachgewiesen. (C) Die Rohzellextrakte (Input) wurden einem Western Blotting mit monoklonalen Anti-p53- und Anti-Mdm2-Antikörpern unterzogen. Als Ladesteuerung kam GFP zum Einsatz. Abkürzungen: HH-Ub = His/HA double-tagged ubiquitin; HA = Hämagglutinin; GFP = grün fluoreszierendes Protein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Ubiquitinierung spielt bei fast allen physiologischen und pathologischen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle2. In den letzten Jahren wurden große Fortschritte beim Verständnis der molekularen Rolle von Ubiquitin in Signalwegen gemacht und wie Veränderungen im Ubiquitin-System zu verschiedenen menschlichen Krankheiten führen2. Die Aufreinigung ubiquitinierter Proteine trägt dazu bei, Einblicke in die genaue Rolle der Ubiquitinierung in diesen Prozessen zu erhalten. Die Mischungen von Ubiquitin-konjugierten Proteinen können unter nichtdenaturierenden und denaturierenden Bedingungen aus Zellen gereinigt werden. IMAC mit Nickelharzen kann verwendet werden, um poly-His-markierte Proteine unter Denaturierungsbedingungen zu reinigen. Ziel der Reinigung ubiquitinierter Proteine unter Denaturierungsbedingungen ist es, die Interaktionspartner aus Zielproteinen zu verwerfen. Alle zellulären Komponenten, die an die Zielproteine binden, werden unter denaturierenden Bedingungen aus der Elution entfernt. Im Gegensatz dazu können einige zelluläre Proteine, die an Zielproteine binden, unter nativen Bedingungen in der Elution gehalten werden, was die nachgeschalteten Experimente stören kann. Ubiquitinierte Proteine können auch in Gegenwart starker Denaturierungsmittel gereinigt werden, was die unspezifische Proteinbindung an Nickelharze stark verringert. Im Gegensatz dazu können die gesamten Zielproteine, einschließlich ihrer ubiquitinierten Formen, durch Epitop-Tagging-Strategien unter Verwendung von Antikörper-konjugierten Agaroseperlen unter nicht-denaturierenden Bedingungen gereinigt werden. Proteine wurden unter weniger strengen Bedingungen gereinigt, da während dieses Prozesses eine Antikörper-vermittelte Affinitätsreinigung verwendet wurde. Die Zielproteine und ihre ubiquitinierten Formen wurden mit protein- oder ubiquitinspezifischen Antikörpern nachgewiesen. HA- und Myc-markierte Proteine können mit dem gleichen Verfahren bequem mit Antikörper-konjugierten Agarosekügelchen gereinigt werden. Insbesondere ist es einfacher, Proteine mit einzelnen oder mehreren Monoubiquitinketten zu erkennen als solche mit Polyubiquitinketten mit proteinspezifischen Antikörpern. Im Gegensatz dazu können Proteine mit Polyubiquitin-Ketten leichter an Ubiquitin-spezifischen Antikörpern erkannt werden.
Um ubiquitinierte Proteine effektiv zu reinigen, sollte das Expressionsniveau der Zielproteine in Säugetierzellen hoch sein. Expressionsvektoren mit starken CMV-Promotoren können verwendet werden, um eine hohe Proteinexpression in Zellen zu erreichen. Darüber hinaus können E3-Ubiquitin-Ligase und Ubiquitin mit den Zielproteinen koexprimiert werden. Es wird den Proteinen effektivere Ubiquitin-Einheiten hinzufügen. Die Aktivität von 26S-Proteasom kann durch niedermolekulare Inhibitoren blockiert werden, um ubiquitinierte Proteine in Zellen anzureichern. Damit ubiquitinierte Proteine effektiv an das Harz binden, sollten Zellextrakte kurz beschallt werden, um den DNA-Komplex zu stören, um die Lösung nicht viskos zu machen. Um die unspezifische Bindung zu verringern, sollte dem Lysepuffer unter Denaturierungsbedingungen eine geringe Konzentration von Imidazol zugesetzt werden. Die ubiquitinierten Proteine mit sehr hohem Molekulargewicht lassen sich nach dem Denaturierungs- und Rückfaltungsverfahren leichter mit dem Harz verbinden. Um die Effizienz der Elution zu erhöhen, versuchen Sie, eine höhere Konzentration von Imidazol zu verwenden. Wenn die Effizienz der Elution immer noch extrem niedrig war, versuchen Sie, die ubiquitinierten Proteine zu eluieren, indem Sie direkt im SDS Laemmli-Ladepuffer sieden. Die meisten ubiquitinierten Proteine, die an das Harz gebunden sind, können in diesem starken Denaturierungspuffer eluiert werden. Um eine höhere Reinheit ubiquitinierter Proteine zu erreichen, kann eine zweistufige Affinitätsreinigung angepasst werden. Nach der Flag/M2-Immunpräzipitation unter nicht denaturierenden Bedingungen kann ein zweiter Schritt der Reinigung durch nickelgeladenes Harz verwendet werden, um His-markiertes ubiquitiniertes Protein herunterzuziehen und nicht ubiquitinierte Substrate loszuwerden. Im Gegensatz dazu kann nach dem Pulldown von nickelgeladenem Harz unter Denaturierungsbedingungen ein zweiter Affinitätsreinigungsschritt angepasst werden, um die Zielproteine unter Verwendung der Epitop-Tagging-Strategie durch Anti-Flag- oder Anti-HA-Antikörper-konjugierte Agaroseperlen zu immunpräzipitieren.
Wir haben empfindlicheres Immunoblotting anstelle von Silberfärbung oder Coomassie-Färbung verwendet, um ubiquitinierte Proteine nachzuweisen, da wir in dieser Studie einen kleinen Reinigungsmaßstab durchgeführt haben. Obwohl einige zelluläre Proteine leicht in Zellen ubiquitiniert werden können, kann nur ein kleiner Teil der Proteine mit Ubiquitineinheiten ligiert werden. Um diese Proteine erfolgreich durch Silberfärbung oder Coomassie-Färbung nachzuweisen, sollte eine großflächige Reinigung durchgeführt werden. Um die Reinheit der ubiquitinierten Proteine zu erhöhen, sollte auch ein zweiter Affinitätsreinigungsschritt durchgeführt werden. Wir haben diese Experimente nicht durchgeführt, da ubiquitinierte Proteine, die durch dieses Protokoll gereinigt wurden, die Anforderungen an nachgeschaltete Analysen vollständig erfüllen. Um beispielsweise spezifische DUBs für ein durch Ubiquitinierung reguliertes Zielprotein zu identifizieren, müssen wir eine große Menge ubiquitinierter Zielproteine reinigen. Diese Proteine können mit einzelnen DUBs inkubiert werden, die aus Säugetierzellen in einem Deubiquitinierungspuffer gereinigt werden. Durch dieses In-vitro-Hochdurchsatz-Screening können wir DUBs identifizieren, die spezifisch für ein Zielprotein in Säugetierzellen sind.
Es gibt mehrere Einschränkungen der Technik. Die ubiquitinierten Proteine machen einen sehr kleinen Teil der Zielproteine aus, es ist schwierig, eine große Menge an ubiquitinierten Zielproteinen zu reinigen. Versuchen Sie, die Proteinexpression in Zellen zu erhöhen, um eine hohe Reinigungseffizienz zu erreichen. Eine Alternative besteht darin, eine In-vitro-Ubiquitinierungsreaktion durchzuführen, um mehr ubiquitinierte Proteine zu erhalten. Einige Proteine sind in den Säugetierzellen schwer stark exprimierbar, was eine weitere Einschränkung für die Reinigung höherer Mengen ubiquitinierter Proteine darstellt. Schließlich beschränkt sich das aktuelle Protokoll auf die Reinigung von markierten Proteinen, die mit Plasmid-DNA überexprimiert werden. Die Expressionsniveaus der Zielproteine sind höher als die der endogenen Zielproteine. Um den endogenen Ubiquitinierungsstatus eines Zielproteins zu beurteilen, können die Proteine mit ihren ubiquitinierten Formen direkt durch Zielprotein-spezifische Antikörper aus Zellen immunpräzipitiert werden. Anti-Ubiquitin-Antikörper können verwendet werden, um den Ubiquitinierungsstatus des Zielproteins zu bestimmen. Unter bestimmten Umständen können jedoch das niedrigere Expressionsniveau, das niedrigere Ubiquitinierungsniveau des Zielproteins oder die geringere Immunpräzipitationseffizienz spezifischer Antikörper den Nachweis des Ubiquitinierungsstatus der endogenen Zielproteine aus Säugetierzellen einschränken. Das aktuelle Protokoll kann stattdessen ein experimentelles System bereitstellen.
Das Tumorsuppressorprotein p53 spielt eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung der bösartigen Transformation normaler Zellen 8,9,10,11. Die Stabilität von p53 wird durch Ubiquitinierungs-vermittelten Abbau in Zellen streng reguliert. Mdm2 wirkt als E3-Ubiquitin-Ligase, um die p53-Mono- und Polyubiquitinierung dosisabhängig zu fördern16. Hier wurden ubiquitinierte p53-Proteine unter denaturierenden und nicht-denaturierenden Bedingungen in Säugetierzellen in Gegenwart von Mdm2-Überexpression gereinigt. Die monoubiquitinierten p53-Proteine wurden bevorzugt mit monoklonalen Anti-p53-Antikörpern nachgewiesen, während die polyubiquitinierten Formen mit Ubiquitin-spezifischen Antikörpern leicht nachgewiesen werden konnten. Der Gehalt an polyubiquitinierten Formen kann effektiv erhöht werden, indem die Expression von Mdm2 in Zellen erhöht wird. Diese Arbeit bietet ein ideales experimentelles System für die Herstellung von ubiquitinierten Proteinen, um die Rolle der Ubiquitinierung bei der Modulation der Proteinfunktion aufzuklären. Ubiquitinierte Proteine können verwendet werden, um spezifische DUBs für ein Zielprotein zu identifizieren und die Rolle verschiedener Arten von Ubiquitinketten, zum Beispiel der K48- und K63-verknüpften Ketten, bei der Signalübertragung aufzudecken. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Rolle der Ubiquitinierung bei der Protein-Protein-Interaktion und Proteinkomplexbildung zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (81972624) an D.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercaptoethanol | Sangon Biotech | M6250 | |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE healthcare | NA931 | Secondary antibdoy |
| Amersham ECL Rat IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE healthcare | NA935 | Secondary antibdoy |
| Anti-Flag M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | FLAG/M2 beads |
| Anti-GFP monocolonal antibody | Santa cruz | sc-9996 | Primary antibody |
| Anti-HA High Affinity | Roche | 11867423001 | Primary antibody |
| Anti-Mdm2 monocolonal antibody (SMP14) | Santa cruz | sc-965 | Primary antibody |
| Anti-p53 monocolonal antibody (DO-1) | Santa cruz | sc-126 | Primary antibody |
| EDTA | Sigma-Alddich | E5134 | solvent |
| Fetal Bovine Serum | VivaCell | C04001-500 | FBS |
| FLAG Peptide | Sigma-Alddich | F3290 | Prepare elution buffer |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | supplement |
| Guanidine-HCI | Sangon Biotech | A100287-0500 | solvent |
| H1299 | Stem Cell Bank, Chinese Academy of Sciences | ||
| Image Lab | Bio-rad | software | |
| Immidazole | Sangon Biotech | A500529-0100 | solvent |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| Lipofectamine 2000 reagents | Invitrogen | 11668019 | Transfection reagent |
| MG132 | MedChemExpress | HY-13259 | Proteasome inhibitor |
| Na2HPO4 | Sangon Biotech | A501727-0500 | solvent |
| NaCl | Sangon Biotech | A610476-0005 | solvent |
| NaF | Sigma-Alddich | 201154 | solvent |
| NaH2PO4 | Sangon Biotech | A501726-0500 | solvent |
| Ni-NTA Agarose | QIAGEN | 30230 | nickel-charged resin |
| Nitrocellulose Blotting membrane | GE healthcare | 10600002 | 0.45 µm pore size |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985-070 | Transfection medium |
| PBS | Corning | 21-040-cv | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Sangon Biotech | E607011-0100 | antibiotic |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| RPMI 1640 | Biological Industries | 01-100-1ACS | medium |
| Sarkosyl | Sigma-Alddich | L5777 | solvent |
| SDS Loading Buffer | Beyotime | P0015L | |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | supplement |
| Tris-base | Sangon Biotech | A501492-0005 | solvent |
| Tris-HCI | Sangon Biotech | A610103-0250 | solvent |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A110694-0500 | reagent |
| Tween-20 | Sangon Biotech | A100777-0500 | supplement |
| Ultra High Sensitive Chemiluminescence Imaging System | Bio-rad | ChemiDoc XRS+ | |
| Urea | Sangon Biotech | A510907-0500 | solvent |
References
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