Imaging chimico multiplex basato sulla microscopia a dispersione Raman stimolata a banda larga

La microscopia Raman è una potente tecnica di imaging che fornisce ricche mappe chimiche misurando lo scattering Raman¹, un processo radiativo anelastico che ha origine da molecole che vibrano in risposta alla luce incidente ^2,3. Ogni pixel di una mappa Raman contiene uno spettro che trasporta informazioni dirette sulla composizione chimica e sulla struttura del campione, risultando in immagini con contrasto vibrazionale intrinseco. Ad oggi, la microscopia Raman è il punto di riferimento per gli studi di microspettroscopia delle vibrazioni molecolari in quanto nessun'altra tecnica di imaging può produrre immagini con elevata specificità chimica e alta risoluzione spaziale⁴. Nonostante la sua eccezionale specificità chimica, l'efficienza di generazione dello scattering Raman è bassa, richiedendo tempi di permanenza dei pixel prolungati o eccitazione ad alta potenza, portando, rispettivamente, a bassi tassi di acquisizione e incompatibilità con campioni sensibili.

Questa singola carenza di microscopia Raman ha portato i ricercatori ad applicare lo scattering Raman coerente ^5,6,7,8,9 come fonte di contrasto per la microscopia. Si tratta di un processo ottico non lineare che migliora la risposta vibrazionale di diversi (fino a sette) ordini di grandezza, consentendo così l'imaging chimico ad alta velocità 10,11,12,13. In particolare, le due tecniche di scattering Raman coerenti più impiegate sono lo scattering Raman anti-Stokes (CARS)¹⁴ e lo scattering Raman stimolato (SRS)¹⁵. A differenza di CARS, SRS mostra una dipendenza lineare dalla concentrazione di molecole risonanti. È immune allo sfondo non consonante, un effetto non lineare estraneo a qualsiasi transizione vibrazionale ma distorsivo alle forme lorentziane caratteristiche degli spettri Raman delle vibrazioni molecolari^16,17. Pertanto, la microscopia SRS produce informazioni Raman autentiche che consentono l'analisi quantitativa diretta delle immagini.

SRS è un processo ottico non lineare di terzo ordine che fornisce informazioni dirette sui legami chimici di un campione. Ha origine dalla sovrapposizione spaziotemporale di due campi ottici generalmente nella regione spettrale del vicino infrarosso, vale a dire la pompa e lo Stokes a frequenza ω_pu e ω_S, rispettivamente 10,11,18. Questa sovrapposizione genera un battito alla Ω di detuning della frequenza di Stokes della pompa = ω_{pu-ω S}. Quando Ω corrisponde a una vibrazione molecolare Ω_R, la molecola risuona, causando un trasferimento di energia coerente tra i campi luminosi e la molecola. Di conseguenza, la molecola raggiunge uno stato vibrazionalmente eccitato. Questo processo può essere monitorato misurando l'annichilazione dei fotoni della pompa (un segnale noto come perdita di Raman stimolata [SRL]) o l'amplificazione concomitante dei fotoni di Stokes (un processo noto come guadagno Raman stimolato [SRG]). SRG e SRL sono piccoli segnali (ΔI) che si trovano sopra uno sfondo intenso e fluttuante (I). Poiché i valori tipici del segnale SRS (ΔI/I) sono nell'intervallo 10-6-10-4, il rumore laser può facilmente oscurarlo. Per mitigare gli effetti dannosi del rumore laser sul rapporto segnale-rumore (SNR) e di conseguenza sulla velocità di imaging, il rilevamento SRS si basa su tecniche di trasferimento della modulazione (ad esempio, amplificatori lock-in, circuiti risonanti o mediatori box-car) ad alte frequenze di modulazione (>1 MHz), dove il rumore laser raggiunge i suoi valori minimi 15,19,20.

La microscopia SRS convenzionale impiega una pompa a banda stretta (≈10 cm⁻¹) e impulsi Stokes per produrre immagini chimiche a una singola frequenza vibrazionale, consentendo l'imaging a velocità video con tempi di permanenza dei pixel a partire da ≈100 ns^21,22. Tuttavia, poiché la microscopia SRS a banda stretta forma mappe chimiche scansionando sequenzialmente il campione solo a poche frequenze vibrazionali, le sue informazioni sono limitate^{a 23}. Le immagini SRS con uno o due contrasti vibrazionali potrebbero non essere sufficienti per differenziare le specie chimiche con bande Raman sovrapposte, specialmente all'interno di sistemi eterogenei. Pertanto, il microscopio paradigmatico SRS a banda stretta non sfrutta appieno il potenziale di SRS, perché indagare una manciata di frequenze vibrazionali ostacola la sua specificità chimica e trascura la ricchezza di informazioni codificate all'interno degli spettri vibrazionali. Inoltre, la scansione sequenziale del campione a frequenze diverse si traduce in tempi di permanenza dei pixel estesi che possono innescare il fotodanno e impedire una rigorosa coregistrazione spaziale tra immagini consecutive, portando a artefatti di movimento.

Contrariamente alla sua controparte a banda stretta, la microscopia SRS a banda larga recupera uno spettro vibrazionale per pixel ad ogni scansione del campione 10,12,24. Pertanto, l'SRS a banda larga fornisce immagini iperspettrali con una rigorosa coregistrazione spaziale di diversi contrasti vibrazionali, consentendo un'analisi rigorosa dei dati. Questo non solo rivela i costituenti chimici del campione attraverso gli spettri Raman, ma aiuta anche a determinare le loro concentrazioni relative. A seconda di come vengono acquisiti gli spettri, la microscopia SRS a banda larga è classificata come SRS iperspettrale o SRS multiplex. Nella SRS iperspettrale, lo spettro SRS per punto scansionato del campione viene acquisito in sequenza (cioè, viene recuperato spazzando la frequenza di detuning Ω), costruendo uno spettro SRS impilando insieme i segnali SRS a turni Raman consecutivi. Lo spettro Raman viene misurato simultaneamente in diverse modalità vibrazionali in multiplex SRS. Pertanto, l'approccio SRS multiplex combina un impulso a banda stretta modulato con un impulso a banda larga per pilotare il segnale SRS a frequenze diverse e utilizza un rilevatore multicanale con una sensibilità paragonabile a quella di SRS a banda stretta per rilevare gli spettri SRS.

Questo documento presenta un protocollo per produrre mappe chimiche di campioni eterogenei utilizzando la microscopia SRS multiplex. Uno schema del microscopio SRS impiegato in questo protocollo è raffigurato in Figura 1 e descritto in dettaglio altrove 25,26,27. In breve, un laser a fibra Yb bloccato in modalità commerciale, che produce impulsi 140 fs centrati a 1040 nm, con una potenza media di 10 W e una frequenza di ripetizione di 80 MHz, guida il microscopio SRS a banda larga. Uno splitter a fascio polarizzatore (PBS) separa il fascio fondamentale in due rami. Per produrre gli impulsi stokes a banda stretta, un ramo con 4 W del fascio fondamentale viene inviato a un etalon che genera un fascio a banda stretta (≈15 ^cm-1), che viene poi modulato a 1,6 MHz con un modulatore ottico acustico (AOM). La frazione rimanente con 6 W del fascio fondamentale è raddoppiata in frequenza con un cristallo di triborato di litio (LBO) di 2,8 mm di spessore, tagliato per la corrispondenza di fase di tipo I (θ = 90°, φ = 13,8°). La seconda generazione armonica risultante a 520 nm viaggia verso una cavità piegata a X per pompare un oscillatore ottico parametrico (OPO), un dispositivo che utilizza un cristallo LBO di 3,0 mm di spessore (corrispondenza di fase di tipo I, θ = 90 °, φ = 9,8 °) come mezzo attivo per fornire una radiazione ottica a banda larga sintonizzabile all'interno della regione spettrale 680-910 nm (Figura 2). Questi impulsi a banda larga fungono da pompa negli esperimenti SRS e si propagano a un compressore prismatico per precompensare gli effetti di dispersione indotti dall'obiettivo del microscopio.

Dopo la fase di compressione, una piastra d'onda λ/2, combinata con una piastra birifrangente YVO₄ , produce due repliche polarizzate ortogonalmente la cui sottrazione elettronica sul piano di rilevamento annulla il rumore della pompa a banda larga. Uno specchio dicroico combina la pompa e i fasci di Stokes e li invia a un microscopio verticale. Un obiettivo ad immersione in acqua con un'apertura numerica (NA) di 1,27 focalizza la luce sul campione, mentre un obiettivo ad immersione in olio con un NA di 1,4 lo raccoglie. Prima della fase di rilevamento, un filtro a passaggio corto (SPF) rimuove lo Stokes modulato, mentre un reticolo di diffrazione operante in configurazione Littrow disperde la pompa a banda larga trasmessa. Un secondo PBS₂ separa le repliche della pompa e un obiettivo le focalizza su due array di fotodiodi. I segnali provenienti da questi array di fotodiodi vengono sottratti elettronicamente e inviati a un amplificatore di blocco multicanale (M-LIA) costruito in casa. Il segnale demodulato viene quindi normalizzato dalle letture in corrente continua (DC) di uno degli array di fotodiodi, producendo così lo spettro SRL.

Come esperimento esemplare, immaginiamo miscele di diversi noti scatterer Raman, ognuno con uno spettro Raman unico. Pertanto, il protocollo inizia descrivendo come preparare i campioni di riferimento. Mentre rileviamo SRL, continuiamo a spiegare come ottenere impulsi Stokes a banda stretta e impostare la sorgente ottica che eroga gli impulsi della pompa a banda larga (≈250 ^cm-1), vale a dire, l'OPO costruito in casa. Il protocollo mostra l'allineamento e l'ottimizzazione dei fasci ottici, descrivendo parametri critici come la potenza e gli spettri dello Stokes a banda stretta e della pompa a banda larga. Il protocollo descrive in dettaglio il percorso ottico della pompa a banda larga perché richiede particolari elementi ottici. Spiega anche come trovare la sovrapposizione spaziotemporale tra gli impulsi pompa-Stokes e mostra un modo pratico per determinare il rumore di intensità relativa (RIN), che a sua volta aiuta a definire la migliore frequenza di modulazione per gli esperimenti SRS. Quindi, spieghiamo il principio di funzionamento e la calibrazione della catena di rilevamento. Infine, il protocollo mostra il processo di acquisizione dei dati, la chemiometria e la pipeline di elaborazione delle immagini.

1. Preparazione del campione

NOTA: Questo protocollo descrive il recupero delle mappe di concentrazione e degli spettri SRS caratteristici di miscele chimicamente eterogenee.

1. Per preparare il campione, estrarre 2 μL da una sospensione acquosa di microsfere di polimetilmetacrilato (PMMA) (vedere la Tabella dei materiali) e versare la frazione di 2 μL su un coperchio del microscopio.
   1. Con una punta della pipetta pulita, estrarre 2 μL da una sospensione acquosa di microsfere di polistirene (PS) e combinarla con la sospensione in PMMA sul coperchio. Utilizzando una punta della pipetta, mescolare delicatamente la sospensione e lasciarla asciugare per 24 ore.
      NOTA: è importante abbinare attentamente la concentrazione delle sospensioni di microsfere per evitare quantità sproporzionate di microsfere sulla superficie del campione. Il diametro delle perle PS e PMMA è rispettivamente di 10 e 6 μm. Queste dimensioni permettono di dimostrare l'elevata risoluzione spaziale del microscopio senza compromettere l'efficienza generazionale di SRS.
2. Sopra lo strato piatto e bianco di perline che apparirà quando l'acqua si asciuga, aggiungere 20 μL di dimetilsolfossido (DMSO) e poi 20 μL di olio d'oliva puro.
3. Applicare lo smalto per unghie sui bordi di un secondo coverslip del microscopio. Posizionare il coverslip sulla miscela, con lo smalto rivolto verso il basso, applicando una pressione sufficiente per sigillarlo. Lasciare asciugare.
   NOTA: la Figura 3 mostra risultati esemplari ottenuti con questi passaggi. Se adeguatamente sigillato, questo campione dovrebbe durare fino a tre mesi.

2. Ottimizzazione della pompa e delle travi Stokes

1. Accendi il laser e lascia che raggiunga l'equilibrio termico. Applicare una dispersione di ritardo di gruppo negativo (GDD) di GDD = -6.000 fs² al fascio fondamentale.
   NOTA: questo valore GDD è fondamentale per pilotare correttamente l'OPO ed è ottimale per questa configurazione, ma probabilmente varierà nei diversi sistemi. Il GDD negativo può essere introdotto attraverso coppie di grigliati, compressori prismatici o modellatori di impulsi basati su modulatori di luce spaziale²⁸.
2. Dividere il laser fondamentale con un beamsplitter polarizzante (PBS₁) in due rami. Per ottenere gli impulsi stokes a banda stretta, guidare un ramo con 4 W a un etalon. Ruotare leggermente l'etalon fino a ottenere una stretta linea spettrale e centrata al picco dello spettro degli impulsi (vedere la curva rossa in Figura 2).
   NOTA: Questo etalon ha una finezza effettiva di 29 e un intervallo spettrale libero di 29,8 nm a 1.040 nm.
3. Per ottenere impulsi di Stokes modulati, inviare il fascio a banda stretta a un modulatore acusto-ottico.
   NOTA: come mostrato nella Figura 4A, il fascio diffratto del primo ordine sperimenta una modulazione del 100%, mentre l'ordine zero solo del 50%. Pertanto, è preferibile utilizzare il primo ordine per evitare di illuminare il campione con un forte fascio non modulato che potrebbe indurre il fotodanno del campione senza generare alcun segnale SRS.
   1. Per ottimizzare l'efficienza di modulazione, modificare la distanza tra gli obiettivi f₁ e f₂ (Figura 4B). Misurare il fascio modulato con un fotodiodo e registrarne il profilo con un oscilloscopio.
   2. Modificare la distanza tra f₁ e f₂ fino a raggiungere il massimo contrasto tra l'ampiezza e la linea di base delle letture dell'oscilloscopio.
      NOTA: Questa coppia di lenti non funziona come un collimatore, ma piuttosto crea un punto focale efficace sul cristallo dell'AOM.
   3. Posizionare una terza lente f₃ per mettere a punto la vita del fascio di Stokes, consentendo di modificare il volume di interazione sul piano focale del microscopio e, di conseguenza, di ottimizzare il segnale SRS.
      NOTA: Il fascio di Stokes è stato modulato a 1,6 MHz in questo protocollo.
4. Focalizzare i restanti 6 W della potenza ottica del fascio fondamentale su un cristallo di triborato di litio (LBO) (LBO_1, θ = 90°, φ = 13,8°) per raddoppiare in frequenza il fascio fondamentale attraverso la seconda generazione armonica (SHG) (Figura 5A).
   1. Per massimizzare l'efficienza SHG, ruotare leggermente il cristallo, variando l'angolo di φ (Figura 5B). Ottimizza LBO₁ per ottenere almeno 2,5 W di SHG.
5. Regolare l'angolo di φ di LBO₂ per massimizzare l'efficienza di generazione del fascio di segnale.
   NOTA: le lunghezze focali degli obiettivi f₁, f₂ e f₃ sono state scelte con cura per abbinare in modalità il fascio SHG con la cavità OPO. Pertanto, le lunghezze focali di questi obiettivi varieranno in diverse configurazioni. A causa della dispersione residua nella cavità OPO, un leggero cambiamento nella lunghezza della cavità induce uno spostamento dello spettro del fascio di segnale.
   1. Regolare la lunghezza della cavità per ottenere uno spettro di pompa che, insieme allo Stokes a banda stretta a 1.040 nm, può produrre un detuning di frequenza entro 1.373-5.090 ^cm-1. Questa gamma copre le vibrazioni nella regione spettrale di allungamento CH (2.800-3.050 ^cm-1). Vedere gli spettri blu nella Figura 2.
6. Per compensare gli effetti di dispersione indotti dall'obiettivo del microscopio di eccitazione, inviare la pompa a banda larga a un compressore prismatico. Immettere la pompa nel prisma A attraverso il suo apice e guidare la pompa dispersa verso l'apice del prisma B. Definire la quantità di dispersione negativa necessaria, quindi impostare la distanza tra gli apici L dei prismi di conseguenza.
   NOTA: la Figura 6 mostra la disposizione dei prismi²⁹. In questo caso, la compensazione è stata fissata per GDD ≈ -12.800 fs²; quindi L = 1,26 m.
   1. Usa prismi tagliati a Brewster.
      1. Assicurarsi che la polarizzazione del fascio della pompa si trovi all'interno dei piani triangolari dei prismi (facce non lucidate superiore/inferiore).
      2. Assicurarsi che l'angolo di incidenza θ_in del fascio della pompa corrisponda all'angolo di Brewster.
      3. Assicurarsi che la faccia di uscita del prisma A sia parallela alla faccia di ingresso del prisma B.
   2. Per stimare il GDD dell'impulso a banda larga da compensare, misurare il segnale SRS ad una singola lunghezza d'onda λ₁, registrando il ritardo temporale τ₁ tra pompa-Stokes al quale si ottiene il massimo SRS(λ₁). Ripetere questa procedura per una seconda lunghezza d'onda λ₂, registrando nuovamente il ritardo temporale τ₂ al quale l'SRS(λ₂) era massimo.
      NOTA: Poiché il GDD è definito come la derivata del ritardo del gruppo rispetto alla frequenza angolare, le suddette misurazioni consentono la stima del GDD del fascio a banda larga (Eq [1]).
      (1)
7. Utilizzando una piastra d'onda λ/2, impostare la polarizzazione del fascio della pompa a 45°. Guidare la pompa polarizzata su una piastra YVO₄ con una lunghezza di 13,3 mm, impostando l'asse veloce di questo cristallo birifrangente verticale.
   NOTA: Viaggiando attraverso la piastra YVO₄ , gli impulsi della pompa saranno divisi in due repliche polarizzate ortogonalmente che si propagano in modo collineare ma mantenendo un ritardo Δt ≈ 10 ps tra di loro. Questo ritardo è una funzione dello spessore e degli indici di rifrazione del cristallo birifrangente. Di seguito, le repliche della pompa con lo stesso stato di polarizzazione degli impulsi di Stokes saranno chiamate "segnale" mentre quelle con uno stato ortogonale come "riferimento". I dettagli di questa tecnica, chiamata rilevamento bilanciato in linea, sono stati descritti in precedenza³⁰.
8. Combina la pompa e i raggi Stokes con uno specchio dicroico e allineali con cura usando un paio di fori stenopeici fluorescenti, assicurandoti che entrambi si propaghino in modo collinoso. Attenuare i fasci e utilizzare un obiettivo per focalizzarli su un fotodiodo veloce (almeno 100 MHz di larghezza di banda).
   1. Blocca la pompa e misura i singoli impulsi stokes con un oscilloscopio digitale ad alta larghezza di banda. Utilizzare il segnale di trigger del laser come sorgente di clock per le misurazioni dell'oscilloscopio. Determinare il valore medio al quale la tensione del fotodiodo raggiunge il suo massimo.
   2. Bloccare il raggio di Stokes e ripetere questa procedura per gli impulsi della pompa. Aumentare o ridurre il percorso ottico del fascio della pompa (Stokes) fino a quando i suoi impulsi arrivano all'incirca nello stesso momento degli impulsi stokes (pompa).
      NOTA: Questo dovrebbe garantire una precisione di pochi millimetri al massimo nella corrispondenza della differenza di percorso ottico tra i due bracci.
   3. Rimuovere il fotodiodo e posizionare un cristallo non lineare con un angolo di taglio adatto per la generazione di somma-frequenza (SFG) tra i fotoni della pompa-Stokes.
      NOTA: Il cristallo non lineare utilizzato qui è stato tagliato per la corrispondenza di fase di tipo I, θ = 90 °, φ = 9,8 °. L'asse ottico del cristallo non lineare dovrebbe essere parallelo alla polarizzazione degli impulsi di Stokes e del segnale.
   4. Rendere i fasci pompa/Stokes leggermente non collegiali e spostare la linea di ritardo fino all'SFG, un segnale che, a causa della corrispondenza di fase, si trova tra gli SHG della pompa e i fasci di Stokes. Se il segnale non viene trovato, verificare la sovrapposizione spaziale dei due fasci sul cristallo.
      NOTA: l'SFG è spostato in blu e deve essere facilmente visibile ad occhio nudo.
   5. In caso di difficoltà impreviste, posizionare un filtro passa-basso per rimuovere la pompa e Stokes e i rispettivi SHG e misurare l'SFG con uno spettrometro (Figura 7A). Trova il ritardo temporale al quale l'SFG raggiunge la sua massima intensità, un valore che determina la sovrapposizione spazio-temporale ideale richiesta per la generazione di segnali non lineari e fissa la linea di ritardo lì (Figura 7B).
9. Misurare i profili del fascio con una telecamera calibrata. In alternativa, utilizzare una scheda a infrarossi e stimare i diametri a occhio. Utilizzare due telescopi, uno per la pompa e un altro per il fascio di Stokes. Con questi telescopi, cerca di abbinare i diametri del fascio all'apertura posteriore dell'obiettivo di eccitazione.
   NOTA: questa procedura garantirà la massima risoluzione spaziale del setup.
   1. Una volta ottenuto il segnale SRS, utilizzare il telescopio sul fascio della pompa per modificarne il diametro, variandone la gamma di Rayleigh e, di conseguenza, il volume di interazione al fuoco del microscopio. Fermarsi quando viene raggiunto il massimo SRS.
10. Utilizzare un fotodiodo per misurare l'intensità del fascio della pompa (Stokes) e, con la responsività del fotodiodo, calcolare la potenza media che incide sull'area attiva del rivelatore.
    1. Se si utilizza un fotodiodo ad alta larghezza di banda, collegare un filtro passa-basso elettronico per ottenere solo il componente costante o CC. Per misurare δP(f), collegare l'uscita di un fotodiodo ad alta larghezza di banda (scollegare il filtro passa-basso) all'ingresso di un amplificatore lock-in. Memorizza l'uscita lock-in a diverse frequenze di demodulazione e usa la responsività del fotodiodo per convertire da V a W.
       NOTA: gli amplificatori lock-in commerciali sono dotati di strumenti integrati per misurare δP(f) (ad esempio, Zurich Instruments incorporata in LabOne a Frequency Sweeper³¹).
    2. Dopo aver misurato il RIN dei fasci, spegnere il laser e misurare il rumore elettronico (cioè il RIN calcolato senza alcuna luce sui rilevatori).
       NOTA: A condizione che il RIN sia limitato dalle fluttuazioni del laser e non dal rumore di tiro, questa misurazione scura aiuterà a diagnosticare la strumentazione utilizzata per le misurazioni; se il rumore elettronico è alto quanto il RIN del laser, questo non può essere utilizzato per misurare il RIN del laser; potrebbe essere necessario utilizzare amplificatori a rumore ultrabasso per ridurre il rumore elettronico.
    3. Se il RIN è limitato dal rumore di tiro e non dalla fluttuazione del laser, far brillare più potenza ottica sul rilevatore. Vedere la Figura 8.

3. Impostazione del rilevamento spettrale per l'imaging SRS

1. Guidare la pompa e i fasci di Stokes al microscopio.
2. Posizionare il campione discusso nella sezione 1 e trovare una regione senza perline per aiutare ad allineare il raggio della pompa. Utilizzando una telecamera, misurare il profilo riflesso del fascio Stokes (pompa) mentre si blocca la pompa (Stokes). Regolare le posizioni dei punti laser con gli specchi subito prima del microscopio.
   NOTA: per ottenere la più alta generazione di SRS, dovrebbero sovrapporsi perfettamente. La figura 9 mostra (A) la pompa, (B) Stokes e (C) entrambi i fasci perfettamente sovrapposti al piano focale del microscopio.
3. Rendi confocali gli obiettivi di eccitazione e raccolta.
   NOTA: l'uso di obiettivi corretti all'infinito significa che focalizzare la pompa sul piano del campione si tradurrà in un raggio collimato all'apertura posteriore dell'obiettivo di raccolta.
   1. Mettere un filtro a passo corto per rimuovere lo Stokes modulato e guidare il raggio della pompa verso la griglia. Posizionare una lente dopo la griglia per focalizzare il raggio disperso sui rilevatori.
      NOTA: L'equazione del reticolo aiuterà a determinare la dispersione lineare (cioè, quanti nm per mm sul piano del rivelatore con una lente di una data lunghezza focale f³²). L'equazione del reticolo mette in relazione la periodicità del solco d del reticolo, l'angolo di incidenza α, l'angolo di diffrazione β, la lunghezza d'onda diffratta λ e l'ordine di diffrazione m (Eq [2]).
      (2)
4. Per un rilevamento bilanciato, misurare lo spettro del riferimento e le repliche del segnale che si propagano lungo il fascio della pompa.
   NOTA: Il profilo spaziale del fascio della pompa dopo la griglia è una linea che comprende i diversi componenti spettrali della pompa a banda larga lungo la sua lunghezza. Ogni componente spettrale della linea della pompa sarà focalizzato a distanza f da una lente sferica (vedere i passaggi 3.1-3.2).
   1. Per evitare di tagliare la pompa dispersa, posizionare la lente sferica il più vicino possibile alla griglia. Metti un PBS subito dopo la lente sferica per separare le repliche della pompa.
      NOTA: Qui, è stato utilizzato uno splitter a fascio cubo polarizzante perché questo tipo di polarizzatore non rimescola la polarizzazione del fascio della pompa. Inoltre, separa efficacemente le diverse repliche della pompa e può essere abbastanza grande da evitare di tagliare la pompa a banda larga. Il PBS rifletterà la replica del segnale (s-polarizzata) e trasmetterà la replica di riferimento (p-polarizzata).
   2. Con una coppia di specchietti retrovisori, guidare il segnale e fare riferimento ai rispettivi rilevatori (Figura 1).
      NOTA: nella configurazione bilanciata ideale, le repliche di segnale e riferimento devono avere la stessa potenza ottica.
   3. Per rimuovere il rumore nel fascio della pompa, correlare i canali dell'array di fotodiodi che misurano il segnale con le loro controparti nel rilevatore di riferimento. Quindi, assicurarsi che l'n^esimo fotodiodo del segnale e gli array di fotodiodi di riferimento misurino la potenza ottica della stessa componente spettrale del segnale e delle repliche di riferimento.
      NOTA: la Figura 8 mostra spettri RIN esemplari.
5. Per garantire la corrispondenza spettrale tra i due array di fotodiodi, posizionare una piccola fessura o un diaframma tra la griglia e il PBS per filtrare spazialmente la pompa dispersa. Clip tutti i componenti spettrali tranne uno delle repliche della pompa per centrare i raggi trasmessi sull'n^° rivelatore degli array di fotodiodi di riferimento e di segnale. Utilizzare gli specchietti retrovisori dello sterzo menzionati per regolare la correlazione dei diversi canali di rilevamento.
6. A questo punto, avviare la microscopia SRS. Per fare ciò, modulare lo Stokes, la scansione raster del campione e acquisire il trasferimento di modulazione sullo spettro della pompa (ΔI) con il corrispondente spettro DC (I) per ottenere lo spettro SRS normalizzato (ΔI / I) da ciascun pixel. Produrre matrici tridimensionali le cui righe (x) e colonne (y) contengono le posizioni scansionate del campione. Su ogni vettore (z) ortogonale al piano x-y, memorizzare uno spettro SRS.
   NOTA: la Figura 12 mostra la struttura dei dati iperspettrali SRS.
   1. Impostare la potenza del fascio di Stokes a 65 mW e quella del fascio della pompa a banda larga a 20 mW. Imposta un tempo di integrazione ideale per gli esperimenti.
      NOTA: Qui, il tempo di integrazione è stato di 44 μs; tuttavia, il tempo di permanenza dei pixel era di 1 ms a causa dello scanner piezoelettrico lento.

4. Chemiometria dei dati SRS iperspettrali

1. Utilizzare l'analisi della risoluzione della curva multivariata per districare i diversi costituenti chimici del campione. Scarica la GUI dal link in Tauler, de Juan e Jaumot³³.
   NOTA: Qui, il programma MATLAB MCR-ALS (Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares) sviluppato da Tauler e colleghi è stato utilizzato ^34,35. Per le applicazioni di MCR-ALS ai dati SRS, fare riferimento a ^36,37; per discussioni dettagliate sull'algoritmo, fare riferimento a ³⁸.
2. In MATLAB, rimodella il cubo di dati iperspettrali SRS in una matrice D con le relative righe contenenti gli spettri SRS. Supponiamo che l'ipercubo SRL spiegato D sia una combinazione lineare della concentrazione C e dei profili spettrali S dei costituenti chimici del campione (cioè D = CS ^T + E, dove E è una matrice che contiene l'errore sperimentale e l'apice ^T indica la trasposizione della matrice).
3. Ottenere i componenti principali dei dati per separare C e S. Come è noto a priori che il campione discusso nella sezione 1 contiene quattro specie, vale a dire DMSO, olio d'oliva, PMMA e PS, configurare il programma per cercare quattro specie più un'altra per tenere conto del rumore di fondo. Se c'è un campione diverso con un numero maggiore o inferiore di specie, configurare il programma di conseguenza.
   NOTA: Il programma effettua una decomposizione a valore singolare dei dati spettrali, utilizzandoli come ipotesi iniziali degli spettri puri S.
   1. In alternativa, alimentare il programma con una matrice contenente le tracce spettrali conosciute (ad esempio, gli spettri Raman spontanei delle sostanze).
      NOTA: Utilizzando le stime iniziali degli spettri puri, il programma calcolerà C = DS(S^TS)⁻¹ e S^T = (C^TC)⁻¹C^TD. I nuovi valori di C e S sono ottimizzati con un algoritmo alternato dei minimi quadrati.
4. Poiché SRS è un segnale non negativo, vincolare l'algoritmo dei minimi quadrati alternati per fornire solo valori positivi.
   NOTA: Il C e S ottimizzati permetteranno di costruire una nuova matrice D*= CS^T, un set di dati che il programma confronterà con i dati originali D. Il programma esegue automaticamente l'iterazione di questi passaggi fino a quando la differenza tra D* e D non è inferiore a un valore di soglia arbitrario che può essere definito.
5. Traccia C e S per acquisire immagini chimiche e spettri caratteristici dei costituenti chimici del campione.

La Figura 3 mostra risultati esemplari ottenuti utilizzando questo protocollo con PS, PMMA e olio d'oliva. Questa rotazione di LBO1 cambierà l'indice di rifrazione sperimentato dal campo SHG, modificandone direttamente la velocità di fase. Quando la velocità di fase del campo SHG corrisponde a quella della polarizzazione non lineare indotta in LBO1, il campo generato non linearmente e la polarizzazione non lineare saranno in fase, portando a un'intensa radiazione SHG. In altre parole, la modifica dell'angolo di φ di LBO1 consentirà all'utente di raggiungere la condizione di corrispondenza di fase ideale per SHG. Poiché qui viene utilizzato un cristallo di corrispondenza di fase di tipo I, la polarizzazione del fascio SHG sarà ortogonale a quella del fascio fondamentale (Figura 5B).

La Figura 8 mostra il RIN delle sorgenti ottiche utilizzate in questo protocollo e il limite shot-noise, che è una conseguenza della natura quantistica di elettroni e fotoni che pone un limite fondamentale al rumore laser. Il RIN limitato shot-noise viene calcolato con come mostrato da Eq (3).

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Dove h è la costante di Planck e ν è la frequenza ottica. Pertanto, il rumore di tiro fornisce linee guida utili per la progettazione elettronica.

La Figura 11A e la Figura 11C mostrano dati esemplari di spettri bilanciati e sbilanciati. Naturalmente, gli effetti del rilevamento bilanciato influiscono sui risultati finali degli esperimenti, vale a dire le mappe chimiche. La Figura 11B e la Figura 11D mostrano immagini composite rispettivamente nelle condizioni sbilanciate e bilanciate. Implementare con successo il protocollo descritto aiuterà a identificare e localizzare i diversi costituenti chimici di un campione eterogeneo ed estrarre i loro spettri SRS caratteristici. Sottoponendo i dati iperspettrali della Figura 12 all'analisi chemiometrica si ottiene la Figura 13. La Figura 13A mostra un composito delle mappe di concentrazione dei diversi costituenti chimici del campione, mentre la Figura 13B mostra i loro spettri SRS caratteristici. Si noti che i dati mostrati nella Figura 13A non solo consentono all'utente di identificare facilmente i diversi componenti del campione, ma anche di eseguire analisi più quantitative. Ad esempio, utilizzando le mappe di concentrazione, potremmo calcolare la media della concentrazione frazionaria di ciascuna specie chimica: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS e 22% olio d'oliva.

Figura 1: Schema del microscopio SRS a banda larga utilizzato in questo protocollo. Abbreviazioni: PBSx = beamsplitter polarizzante; SHG = modulo di seconda generazione armonica; OPO = oscillatore parametrico ottico; AOM = modulatore ottico acousto; SPF = filtro a passaggio corto; M-LIA: Amplificatore lock-in multicanale; DM = specchio dicroico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Spettri della pompa a banda larga sintonizzabile (blu) e delle travi Stokes a banda stretta (rossa). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagine a campo luminoso del campione chimicamente eterogeneo. Si noti che la microscopia convenzionale non consente di distinguere i diversi costituenti. Barra della scala = 100 μm. Abbreviazioni: PS = polistirolo; PMMA = polimetilmetacrilato; DMSO = dimetilsolfossido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Modulazione degli impulsi di Stokes a banda stretta. (A) La traccia blu trasparente mostra lo 0° fascio diffratto, mentre quello nero mostra il corrispondente 1° ordine. (B) Configurazione ottica per ottimizzare l'efficienza di modulazione del fascio diffratto di 1° ordine e messa a punto della dimensione dello spot del fascio di Stokes prima di arrivare all'obiettivo di eccitazione. Abbreviazioni: AOM = modulatore ottico acousto; fx = lunghezza focale dell'obiettivo X. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Processi ottici non lineari necessari per guidare l'OPO. (A) Geometria dell'interazione SHG. Due fotoni fondamentali a ω1 portano il sistema materiale a un livello virtuale ad alta energia, da dove il sistema materiale salta verso il basso allo stato fondamentale, emettendo un fotone a ωSHG. (B) Schema dell'esperimento SHG. (C) Uno schema delle configurazioni SHG e OPO. (D) Geometria dell'interazione DFG. Unfotone SHG ω è diviso in fotoni di segnale (segnale ω) e folle (ωIdler). Un guadagno del fascio di segnale si ottiene alimentando i fotoni del segnale e facendoli risuonare nella cavità. (E) Schema dell'esperimento DFG. Abbreviazioni: SMx = specchio sferico (R = 75 mm); OPO = oscillatore parametrico ottico; SHG = modulo di seconda generazione armonica; DFG = generazione differenza-frequenza; LBO = triborato di litio; OC = condensatore d'olio; DM = specchio dicroico; fx = lunghezza focale dell'obiettivo X. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Geometria del compressore prismatico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Generazione di frequenza somma per ottimizzare la sovrapposizione spazio-temporale. (A) SFG tra la pompa e Stokes e i rispettivi SHG che impattano su uno schermo. Qui, una lente ha focalizzato la pompa e i raggi Stokes sul cristallo, mentre un filtro passa-basso li ha rimossi. (B) Intensità dell'SFG tra pompa e Stokes in funzione del ritardo temporale. Impostate il tempo zero della configurazione SRS nella posizione che massimizza l'SFG. L'asimmetria della correlazione incrociata in B è dovuta al profilo temporale causato dall'etalon sul fascio di Stokes. Abbreviazioni: SFG = generazione somma-frequenza; SHG = modulo di seconda generazione armonica; SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Spettri RIN. La banda evidenziata in verde mostra la migliore regione spettrale per gli esperimenti SRS. La modulazione del fascio stokes a qualsiasi frequenza all'interno di questa banda garantisce che gli effetti del rumore laser sul segnale SRS saranno i più bassi possibili. Abbreviazioni: RIN = rumore di intensità relativa; SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Profili del fascio. (A) Pompa, (B) Stokes e (C) pompa e Stokes. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Geometria presunta per un reticolo a dispersione e un rivelatore a matrice di fotodiodi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11. Gli effetti del rilevamento bilanciato. Effetti su spettri (A, C) e immagini chimiche (B, D). I compositi mostrati nei pannelli (B) e (D) sono i risultati finali degli esperimenti (cioè dopo l'analisi chemiometrica dei dati iperspettrali. Vedere la sezione 4 del protocollo per i dettagli). Barre della scala = 10 μm. Abbreviazione: SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 12: Un ipercubo SRS rappresentativo acquisito con microscopia SRS a banda larga. Il piano x-y memorizza le coordinate delle posizioni scansionate, mentre ogni vettore lungo z registra uno spettro SRS. Abbreviazione: SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 13: Analisi chemiometrica dei dati SRS iperspettrali. (A) Composito delle mappe di concentrazione dei diversi costituenti del campione. B) Spettri caratteristici delle specie chimiche. In entrambi i pannelli, giallo: olio d'oliva, blu: DMSO, ciano: PS e arancione: PMMA. Barra della scala = 20 μm (A). Abbreviazioni: SRS = spettroscopia di scattering Raman stimolata; PS = polistirolo; PMMA = polimetilmetacrilato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

G. C. dichiara il coinvolgimento con la società Cambridge Raman Imaging, che mira a commercializzare la tecnologia di microscopia SRS a banda larga. Gli altri autori non dichiarano conflitti di interesse.