Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Multiplex kemisk billeddannelse baseret på bredbåndsstimuleret Raman Scattering Mikroskopi

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/63709
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1,2
1Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano, 2Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

Vi præsenterer en protokol til erhvervelse af kemiske billeder med bredbåndsstimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi. Baseret på et SRS-mikroskop, der fungerer med differentiel multikanals-lock-in-detektion, beskriver protokollen prøveforberedelsen, justeringen af SRS-apparatet og kemometri for at adskille forskellige bestanddele af kemisk heterogene prøver.

Abstract

Stimuleret Raman scattering (SRS) mikroskopi er en ikke-lineær optisk teknik til etiketfri kemisk billeddannelse. Dette analytiske værktøj leverer kemiske kort med høj hastighed og høj rumlig opløsning af tynde prøver ved direkte at forhøre deres molekylære vibrationer. I sin standardimplementering er SRS-mikroskopi smalbånd og danner billeder med kun en enkelt vibrationsfrekvens ad gangen. Denne tilgang hindrer imidlertid ikke kun SRS's kemiske specificitet, men forsømmer også det væld af information, der er kodet inden for vibrationsspektre.

Disse begrænsninger kan overvindes ved hjælp af bredbånds-SRS, en implementering, der er i stand til at udtrække et vibrationsspektrum pr. Pixel af billedet parallelt. Dette leverer hyperspektrale data, der, når de kombineres med kemometrisk analyse, maksimerer mængden af information, der hentes fra prøven. Bredbånds-SRS forbedrer således systemets kemiske specificitet, hvilket muliggør kvantitativ bestemmelse af koncentrationen af de forskellige bestanddele i en prøve. Her rapporterer vi en protokol til kemisk billeddannelse med bredbånds-SRS-mikroskopi, baseret på et hjemmebygget SRS-mikroskop, der fungerer med en brugerdefineret differentiel multikanals-lock-in-forstærkerdetektion. Det diskuterer prøveforberedelse, justering af SRS-apparatet og kemometrisk analyse. Ved at erhverve vibrationelle Raman-spektre illustrerer protokollen, hvordan man identificerer forskellige kemiske arter i en blanding og bestemmer deres relative koncentrationer.

Introduction

Raman mikroskopi er en kraftfuld billeddannelsesteknik, der leverer rige kemiske kort ved at måle Raman spredning1, en uelastisk strålingsproces, der stammer fra molekyler, der vibrerer som reaktion på indfaldende lys 2,3. Hver pixel på et Raman-kort indeholder et spektrum, der bærer direkte information om prøvens kemiske sammensætning og struktur, hvilket resulterer i billeder med iboende vibrationskontrast. Til dato er Raman-mikroskopi referencesynspunktet for mikrospektroskopistudier af molekylære vibrationer, da ingen anden billeddannelsesteknik kan producere billeder med både høj kemisk specificitet og høj rumlig opløsning4. På trods af sin fremragende kemiske specificitet er produktionseffektiviteten af Raman-spredning lav, hvilket kræver enten forlængede pixelopløbstider eller højeffektexcitation, hvilket fører til henholdsvis lave erhvervelsesrater og uforenelighed med følsomme prøver.

Denne ene mangel på Raman mikroskopi førte forskere til at anvende sammenhængende Raman spredning 5,6,7,8,9 som en kilde til kontrast for mikroskopi. Dette er en ikke-lineær optisk proces, der forbedrer vibrationsresponsen med flere (op til syv) størrelsesordener, hvilket muliggør højhastigheds kemisk billeddannelse 10,11,12,13. Især er de to mest anvendte sammenhængende Raman-spredningsteknikker sammenhængende anti-Stokes Raman-spredning (CARS)14 og stimuleret Raman-spredning (SRS)15. I modsætning til CARS viser SRS en lineær afhængighed af koncentrationen af resonansmolekyler. Det er immunt over for den ikke-ultralydsbaggrund, en ikke-lineær effekt, der ikke er relateret til nogen vibrationsovergang, men forvrængende for de Lorentziske former, der er karakteristiske for Raman-spektrene i de molekylære vibrationer16,17. SRS-mikroskopi giver således autentisk Raman-information, der muliggør direkte kvantitativ billedanalyse.

SRS er en tredje ordens, ikke-lineær, optisk proces, der giver direkte information om de kemiske bindinger af en prøve. Det stammer fra den spatiotemporale superposition af to optiske felter generelt i det nær-infrarøde spektrale område, nemlig pumpen og Stokes ved frekvens ωpu og ωS, henholdsvis 10,11,18. Denne superposition genererer et slag ved pump-Stokes-frekvensen, der detuning Ω = ωpu-ω S. Når Ω matcher en molekylær vibration ΩR, resonerer molekylet, hvilket forårsager en sammenhængende energioverførsel mellem lysfelterne og molekylet. Som et resultat når molekylet en vibrationsforet tilstand. Denne proces kan overvåges ved at måle enten udslettelse af pumpefotoner (et signal kendt som stimuleret Raman-tab [SRL]) eller samtidig forstærkning af Stokes-fotoner (en proces kendt som stimuleret Raman-gevinst [SRG]). SRG og SRL er små signaler (ΔI), der sidder oven på en intens og svingende baggrund (I). Da typiske værdier for SRS-signalet (ΔI/I) ligger i området 10-6-10-4, kan laserstøjen let skjule det. For at afbøde laserstøjens skadelige virkninger på signal-støj-forholdet (SNR) og dermed på billedhastigheden er SRS-detektion afhængig af moduleringsoverførselsteknikker (f.eks. lock-in-forstærkere, resonanskredsløb eller kassevognsgennemsnit) ved høje moduleringsfrekvenser (>1 MHz), hvor laserstøjen når sine minimumsværdier 15,19,20.

Konventionel SRS-mikroskopi anvender smalbåndspumpe (≈10 cm-1) og Stokes-impulser til at producere kemiske billeder med en enkelt vibrationsfrekvens, hvilket muliggør videohastighedsbilleddannelse med pixelopgangstider så lave som ≈100 ns21,22. Men fordi smalbånds SRS-mikroskopi danner kemiske kort ved sekventielt at scanne prøven ved kun få vibrationsfrekvenser, er dens information begrænset23. SRS-billeder med en eller to vibrationskontraster er muligvis ikke tilstrækkelige til at skelne mellem kemiske arter med overlappende Raman-bånd, især inden for heterogene systemer. Derfor udnytter det paradigmatiske smalbånds SRS-mikroskop ikke SRS's fulde potentiale, fordi undersøgelse af en håndfuld vibrationsfrekvenser hindrer dets kemiske specificitet og forsømmer den rigdom af information, der er kodet inden for vibrationsspektre. Desuden resulterer sekventiel scanning af prøven ved forskellige frekvenser i udvidede pixelopholdstider, der kan udløse fotoskader og forhindre streng rumlig koregistration mellem på hinanden følgende billeder, hvilket fører til bevægelsesartefakter.

I modsætning til sin smalbåndsmodstykke henter bredbånds-SRS-mikroskopi et vibrationsspektrum pr. pixel ved hver prøvescanning 10,12,24. Således giver bredbånds-SRS hyperspektral billeddannelse med streng rumlig korregistrering af forskellige vibrationskontraster, hvilket muliggør streng dataanalyse. Dette afslører ikke kun de kemiske bestanddele af prøven gennem Raman spektre, men hjælper også med at bestemme deres relative koncentrationer. Afhængigt af hvordan spektrene erhverves, klassificeres bredbånds-SRS-mikroskopi enten som hyperspektral SRS eller multiplex SRS. I hyperspektral SRS erhverves SRS-spektret pr. scannet punkt i prøven sekventielt (dvs. det hentes ved at feje frekvensdeuningen Ω) og opbygge et SRS-spektrum ved at stable SRS-signalerne sammen ved på hinanden følgende Raman-skift. Raman-spektret måles samtidigt ved flere vibrationstilstande i multiplex SRS. Således kombinerer multiplex SRS-tilgangen en moduleret smalbåndspuls med en bredbåndspuls til at drive SRS-signalet ved forskellige frekvenser og bruger en flerkanalsdetektor med en følsomhed, der kan sammenlignes med smalbånds-SRS til at detektere SRS-spektrene.

Dette papir præsenterer en protokol til fremstilling af kemiske kort over heterogene prøver ved hjælp af multiplex SRS-mikroskopi. Et skema over SRS-mikroskopet, der anvendes i denne protokol, er afbildet i figur 1 og beskrevet detaljeret andetsteds 25,26,27. Kort fortalt driver en kommerciel tilstandslåst Yb-fiberlaser, der producerer 140 fs-impulser centreret ved 1040 nm, med 10 W gennemsnitlig effekt og en gentagelseshastighed på 80 MHz, bredbånds-SRS-mikroskopet. En polariserende strålesplitter (PBS) adskiller den grundlæggende stråle i to grene. For at producere smalbånds stokespulserne sendes en gren med 4 W af den grundlæggende stråle til en etalon, der genererer en smalbåndsstråle (≈15 cm-1), som derefter moduleres ved 1,6 MHz med en akustisk optisk modulator (AOM). Den resterende fraktion med 6 W af den grundlæggende stråle er frekvens-fordoblet med en 2,8 mm tyk lithiumtriborat (LBO) krystal, skåret til type I fasematchning (θ = 90 °, φ = 13,8 °). Den resulterende anden harmoniske generation ved 520 nm bevæger sig til et X-foldet hulrum for at pumpe en optisk parametrisk oscillator (OPO), en enhed, der bruger en 3,0 mm tyk LBO-krystal (type I-fasematchning, θ = 90 °, φ = 9,8 °) som aktivt medium til at levere en bredbåndsoptisk stråling, der kan indstilles inden for 680-910 nm spektralområdet (figur 2). Disse bredbåndsimpulser tjener som pumpe i SRS-eksperimenterne og formerer sig til en prismekompressor for at kompensere for spredningseffekterne induceret af mikroskopmålet.

Efter kompressionstrinnet producerer en λ/2-bølgeplade kombineret med en YVO 4-dobbeltrefringent plade to ortogonalt polariserede replikaer, hvis elektroniske subtraktion ved detektionsplanet annullerer støjen fra bredbåndspumpen. Et dikroisk spejl kombinerer pumpen og Stokes-bjælkerne og sender dem til et opretstående mikroskop. Et vandnedsænkningsmål med en numerisk blænde (NA) på 1,27 fokuserer lyset på prøven, mens et olienedsænkningsmål med en NA på 1,4 samler det. Før detektionstrinnet fjerner et kortpasfilter (SPF) de modulerede Stokes, mens et diffraktionsgitter, der fungerer i Littrow-konfiguration, spreder den transmitterede bredbåndspumpe. En anden PBS2 adskiller pumpereplikaerne, og et objektiv fokuserer dem på to fotodiodearrays. Signalerne fra disse fotodiodearrays trækkes elektronisk fra og sendes til en hjemmebygget multikanals lock-in-forstærker (M-LIA). Det demodulerede signal normaliseres derefter ved jævnstrømsaflæsningerne (DC) af et af fotodiodearraysene og producerer således SRL-spektret.

Som et eksemplarisk eksperiment afbilder vi blandinger af flere velkendte Raman-spredere, hver med et unikt Raman-spektrum. Protokollen starter således med at beskrive, hvordan referenceprøverne skal udarbejdes. Når vi registrerer SRL, fortsætter vi med at forklare, hvordan man opnår smalbånds Stokes-impulser og opretter den optiske kilde, der leverer bredbåndspumpeimpulserne (≈250 cm-1), nemlig den hjemmebyggede OPO. Protokollen viser justeringen og optimeringen af de optiske stråler og beskriver kritiske parametre som effekt og spektre af smalbånds stokes og bredbåndspumpen. Protokollen beskriver detaljeret bredbåndspumpens optiske vej, fordi den kræver specielle optiske elementer. Det forklarer også, hvordan man finder den spatiotemporale overlapning mellem pumpe-Stokes-impulser og viser en praktisk måde at bestemme den relative intensitetsstøj (RIN), som igen hjælper med at definere den bedste moduleringsfrekvens for SRS-eksperimenter. Derefter forklarer vi arbejdsprincippet og kalibreringen af detektionskæden. Endelig viser protokollen dataindsamlingsprocessen, kemometri og billedbehandlingsrørledningen.

Protocol

1. Prøveforberedelse

BEMÆRK: Denne protokol beskriver hentningen af koncentrationskortene og karakteristiske SRS-spektre af kemisk heterogene blandinger.

  1. For at forberede prøven ekstraheres 2 μL fra en vandig suspension af polymethylmethacrylatmikroperler (PMMA) (se materialetabellen) og hældes 2 μL-fraktionen på et mikroskopdæksler.
    1. Med en ren pipettespids ekstraheres 2 μL fra en vandig suspension af polystyren (PS) mikroperler og kombineres med PMMA-suspensionen på dækslipset. Bland forsigtigt suspensionen ved hjælp af en pipettespids og lad den tørre i 24 timer.
      BEMÆRK: Det er vigtigt nøje at matche koncentrationen af mikroperlesuspensionerne for at undgå uforholdsmæssigt store mængder af mikroperlerne på prøveoverfladen. Diameteren af PS- og PMMA-perlerne er henholdsvis 10 og 6 μm. Disse dimensioner gør det muligt at demonstrere mikroskopets høje rumlige opløsning uden at gå på kompromis med SRS's genereringseffektivitet.
  2. Oven på det flade, hvide lag perler, der vises, når vandet tørrer af, tilsættes 20 μL dimethylsulfoxid (DMSO) og derefter 20 μL ren olivenolie.
  3. Påfør neglelak på kanterne af et andet mikroskopdæksler. Placer dæksedlen på blandingen med neglelakken nedad, og påfør nok tryk til at forsegle den. Lad det tørre.
    BEMÆRK: Figur 3 viser eksemplariske resultater opnået med disse trin. Hvis den er korrekt forseglet, skal denne prøve vare op til tre måneder.

2. Optimering af pumpe- og Stokes-bjælker

  1. Tænd for laseren, og lad den nå termisk ligevægt. Anvend en negativ gruppeforsinkelsesspredning (GDD) af GDD = -6.000 fs2 på den grundlæggende stråle.
    BEMÆRK: Denne GDD-værdi er afgørende for en vellykket kørsel af OPO'en og er optimal til denne opsætning, men vil sandsynligvis variere i forskellige systemer. Negativ GDD kan introduceres gennem gitterpar, prismekompressorer eller pulsformere baseret på rumlige lysmodulatorer28.
  2. Opdel den grundlæggende laser med en polariserende strålesplitter (PBS1) i to grene. For at få smalbåndet Stokes pulser skal du lede en gren med 4 W til en etalon. Drej etalonen let, indtil der opnås en smal spektrallinje og centreret i toppen af pulsspektret (se den røde kurve i figur 2).
    BEMÆRK: Denne etalon har en effektiv finesse på 29 og et fritspektralområde på 29,8 nm ved 1,040 nm.
  3. For at opnå modulerede Stokes-impulser skal du sende smalbåndsstrålen til en acousto-optisk modulator.
    BEMÆRK: Som vist i figur 4A oplever den første ordens diffrakterede stråle 100% modulering, mens nul-ordenen kun 50%. Derfor foretrækkes det at anvende den første orden for at undgå at belyse prøven med en stærk umoduleret stråle, der kan fremkalde prøvefotoskader uden at generere noget SRS-signal.
    1. For at optimere moduleringseffektiviteten skal du ændre afstanden mellem objektiver f1 og f2 (figur 4B). Mål den modulerede stråle med en fotodiode og optag dens profil med et oscilloskop.
    2. Skift afstanden mellem f1 og f2 , indtil der opnås maksimal kontrast mellem amplituden og basislinjen for oscilloskopaflæsningerne.
      BEMÆRK: Dette par linser fungerer ikke som en kollimator, men skaber snarere et effektivt brændpunkt ved AOM'ens krystal.
    3. Placer en tredje linse f3 for at finjustere taljen på Stokes-strålen, så interaktionsvolumenet ved mikroskopets brændplan kan ændres og følgelig optimere SRS-signalet.
      BEMÆRK: Stokes-strålen blev moduleret ved 1,6 MHz i denne protokol.
  4. Fokuser de resterende 6 W af den optiske effekt af den grundlæggende stråle på en lithiumtriborat (LBO) krystal (LBO1, θ = 90 °, φ = 13,8 °) for at frekvens-fordoble den grundlæggende stråle gennem anden harmonisk generation (SHG) (figur 5A).
    1. For at maksimere SHG-effektiviteten skal du dreje krystallen let og variere φ vinkel (figur 5B). Optimer LBO1 for at få mindst 2,5 W SHG.
  5. Juster LBO2's φ vinkel for at maksimere signalstrålens genereringseffektivitet.
    BEMÆRK: Brændvidderne på objektiverne f1, f2 og f3 blev nøje udvalgt til at matche SHG-strålen med OPO-hulrummet. Brændvidderne på disse linser vil således variere i forskellige opsætninger. På grund af den resterende dispersion i OPO-hulrummet inducerer en lille ændring i hulrumslængden en forskydning af signalstrålens spektrum.
    1. Juster hulrumslængden for at få et pumpespektrum, der sammen med smalbåndet Stokes ved 1.040 nm kan producere en frekvensdeuning inden for 1.373-5.090 cm-1. Dette område dækker vibrationerne i CH-spektralområdet (2.800-3.050 cm-1). Se de blå spektre i figur 2.
  6. For at kompensere for de spredningseffekter, der induceres af excitationsmikroskopmålet, skal du sende bredbåndspumpen til en prismekompressor. Indtast pumpen i prisme A gennem dens spids, og led den dispergerede pumpe mod toppen af prisme B. Definer mængden af negativ dispersion, der er nødvendig, og indstil derefter afstanden mellem prismernes apices L i overensstemmelse hermed.
    BEMÆRK: Figur 6 viser prismernes arrangement29. I dette tilfælde blev kompensationen fastsat for GDD ≈ -12.800 fs2; derfor L = 1,26 m.
    1. Brug Brewster-cut prismer.
      1. Sørg for, at polariseringen af pumpestrålen ligger inden for prismernes trekantede planer (top/bund upolerede flader).
      2. Sørg for, at indfaldsvinklen θin på pumpestrålen svarer til Brewster-vinklen.
      3. Sørg for, at prisme A's udgangsside er parallel med prisme B's indgangsside.
    2. For at estimere GDD for bredbåndspulsen, der skal kompenseres, måles SRS-signalet ved en enkelt bølgelængde λ1 og registrerer tidsforsinkelsen τ1 mellem pump-Stokes, hvor den maksimale SRS (λ1) opnås. Gentag denne procedure for en anden bølgelængde λ2, og registrer igen tidsforsinkelsen τ2 , hvor SRS(λ2) var maksimal.
      BEMÆRK: Da GDD er defineret som derivatet af gruppeforsinkelsen med hensyn til vinkelfrekvensen, tillader de ovennævnte målinger estimering af bredbåndsstrålens GDD (Eq [1]).
      Equation 1(1)
  7. Brug en λ/2 bølgeplade til at indstille polariseringen af pumpestrålen til 45°. Før den polariserede pumpe til en YVO4-plade med en længde på 13,3 mm, og sæt den hurtige akse af denne torefringent krystal lodret.
    BEMÆRK: Når man rejser gennem YVO4-pladen , opdeles pumpeimpulserne i to ortogonalt polariserede replikaer, der formerer sig kollinært, men holder en forsinkelse Δt ≈ 10 ps mellem dem. Denne forsinkelse er en funktion af tykkelsen og brydningsindekserne for den birefringente krystal. Herefter vil pumpereplikaerne med samme polarisationstilstand som Stokes-impulserne blive kaldt "signal", mens de med en ortogonal tilstand som "reference". Detaljerne i denne teknik, kaldet inline balanced detection, er blevet beskrevet tidligere30.
  8. Kombiner pumpen og Stokes-bjælkerne med et dikroisk spejl, og juster dem forsigtigt ved hjælp af et par fluorescerende pinholes, hvilket sikrer, at begge formerer sig kollinært. Dæmp strålerne og brug et objektiv til at fokusere dem på en hurtig (mindst 100 MHz båndbredde) fotodiode.
    1. Bloker pumpen, og mål enkelte Stokes-impulser med et digitalt oscilloskop med høj båndbredde. Brug laserens triggersignal som urkilde til målinger af oscilloskopet. Bestem den gennemsnitlige værdi, hvor fotodiodespændingen når sit maksimum.
    2. Bloker Stokes-strålen, og gentag denne procedure for pumpeimpulserne. Forøg eller reducer pumpens (Stokes) stråles optiske vej, indtil dens impulser ankommer omtrent samtidig med Stokes (pumpe) impulser.
      BEMÆRK: Dette skal garantere en præcision på maksimalt et par millimeter i matchningen af den optiske stiforskel mellem de to arme.
    3. Fjern fotodioden, og anbring en ikke-lineær krystal med en passende skærevinkel til sumfrekvensgenerering (SFG) mellem pumpe-Stokes-fotoner.
      BEMÆRK: Den ikke-lineære krystal, der anvendes her, blev skåret til fasematchning af type I, θ = 90 °, φ = 9,8 °. Den optiske akse af den ikke-lineære krystal skal være parallel med polariseringen af Stokes og signalimpulser.
    4. Gør pumpen / Stokes-bjælkerne lidt ikke-kølinede, og flyt forsinkelseslinjen indtil SFG, et signal, der på grund af fasematchning er mellem pumpens SHG'er og Stokes-bjælkerne. Hvis signalet ikke findes, skal du kontrollere den rumlige overlapning af de to stråler på krystallen.
      BEMÆRK: SFG er blåforskudt og skal være let synlig for det blotte øje.
    5. I tilfælde af uventede vanskeligheder skal du placere et lavpasfilter for at fjerne pumpen og Stokes og deres respektive SHG'er og måle SFG med et spektrometer (figur 7A). Find den tidsforsinkelse, hvor SFG når sin maksimale intensitet, en værdi, der bestemmer den ideelle spatiotemporal overlapning, der kræves til ikke-lineær signalgenerering, og fastgør forsinkelseslinjen der (figur 7B).
  9. Mål stråleprofilerne med et kalibreret kamera. Alternativt kan du bruge et infrarødt kort og estimere diametrene med øjet. Brug to teleskoper, et til pumpen og et andet til Stokes-strålen. Med disse teleskoper skal du prøve at matche strålediametrene med den bageste blænde af excitationsmålet.
    BEMÆRK: Denne procedure garanterer den maksimale rumlige opløsning af opsætningen.
    1. Når SRS-signalet er opnået, skal du bruge teleskopet på pumpestrålen til at finjustere dens diameter og variere dens Rayleigh-rækkevidde og følgelig interaktionsvolumenet i mikroskopets fokus. Stop, når den maksimale SRS er opnået.
  10. Brug en fotodiode til at måle intensiteten af pumpens (Stokes) stråle, og beregn med fotodiodens responsivitet den gennemsnitlige effekt Equation 2 , der påvirker detektorens aktive område.
    1. Hvis du bruger en fotodiode med høj båndbredde, skal du tilslutte et elektronisk lavpasfilter for kun at få konstant- eller DC-komponenten. For at måle δP(f) skal du slutte udgangen fra en fotodiode med høj båndbredde (frakoble lavpasfilteret) til indgangen til en fastlåsningsforstærker. Opbevar lock-in-outputtet Equation 3 ved forskellige demodulationsfrekvenser, og brug fotodiodens responsivitet til at konvertere fra V til W.
      BEMÆRK: Kommercielle lock-in-forstærkere har indbyggede værktøjer til måling af δP(f) (f.eks. Zürich-instrumenter, der er inkorporeret i LabOne a Frequency Sweeper31).
    2. Efter måling af strålernes RIN skal du slukke for laseren og måle den elektroniske støj (dvs. RIN beregnet uden lys på detektorer).
      BEMÆRK: Forudsat at RIN er begrænset af laserudsvingene og ikke af skudstøjen, vil denne mørke måling hjælpe med at diagnosticere den instrumentering, der anvendes til målingerne; hvis den elektroniske støj er lige så høj som laserens RIN, kan denne ikke bruges til at måle laserens RIN; Det kan være en god brug for forstærkere at reducere den elektroniske støj.
    3. Hvis RIN er begrænset af skudstøjen og ikke af laserfluktuationen, skal du skinne mere optisk effekt på detektoren. Se figur 8.

3. Opsætning af spektraldetektion til SRS-billeddannelse

  1. Før pumpen og Stokes-strålerne til mikroskopet.
  2. Anbring den prøve, der er omtalt i afsnit 1, og find et område uden perler for at hjælpe med at justere pumpestrålen. Brug et kamera til at måle den reflekterede profil af Stokes (pumpe) strålen, mens pumpen (Stokes) blokeres. Juster positionerne af laserpletterne med spejlene lige før mikroskopet.
    BEMÆRK: For at få den højeste SRS-generation skal de overlappe perfekt. Figur 9 viser (A) pumpen, (B) Stokes og (C) begge stråler overlappede perfekt ved mikroskopets brændplan.
  3. Gør excitations- og indsamlingsmålene konfokale.
    BEMÆRK: Brugen af uendeligt korrigerede mål betyder, at fokusering af pumpen på prøveplanet vil resultere i en kollimeret stråle ved den bageste blænde på opsamlingsmålet.
    1. Sæt et kortpasfilter for at fjerne de modulerede Stokes og lede pumpestrålen til gitteret. Placer et objektiv efter gitteret for at fokusere den spredte stråle på detektorerne.
      BEMÆRK: Gitterligningen hjælper med at bestemme den lineære dispersion (dvs. hvor mange nm pr. mm på detektorplanet med en linse med en given brændvidde f32). Gitterligningen vedrører gitterets rilleperiokalitet d , indfaldsvinklen α, diffraktionsvinklen β, den diffrakterede bølgelængde λ og diffraktionsrækkefølgen m (Eq [2]).
      Equation 4 (2)
  4. For afbalanceret detektion måles referencespektret og signalreplikaerne, der formerer sig langs pumpestrålen.
    BEMÆRK: Pumpestrålens rumlige profil efter gitteret er en linje, der omfatter bredbåndspumpens forskellige spektrale komponenter langs dens længde. Hver spektralkomponent i pumpeledningen vil blive fokuseret på afstand f af en sfærisk linse (se trin 3.1-3.2).
    1. For at undgå at klippe den dispergerede pumpe skal du placere den sfæriske linse så tæt som muligt på gitteret. Sæt en PBS lige efter den sfæriske linse for at adskille pumpereplikaerne.
      BEMÆRK: Her blev en polariserende terningstrålesplitter brugt, fordi denne form for polarisator ikke forvrænger polariseringen af pumpestrålen. Det adskiller også effektivt de forskellige pumpereplikaer og kan være stort nok til at undgå at klippe bredbåndspumpen. PBS vil afspejle signalreplikaen (s-polariseret) og transmittere referencerepliken (p-polariseret).
    2. Med et par styrespejle skal du styre signalet og henvise til deres respektive detektorer (figur 1).
      BEMÆRK: I den ideelle afbalancerede konfiguration skal signal- og referencereplikaerne have samme optiske effekt.
    3. For at fjerne støjen i pumpestrålen skal du korrelere kanalerne i fotodiodearrayet, der måler signalet, med deres modstykker i referencedetektoren. Sørg derfor for, at signal- og referencefotodiodearrays måler den optiske effekt af den samme spektrale komponent i signalet og referencereplikationerne.
      BEMÆRK: Figur 8 viser eksemplariske RIN-spektre.
  5. For at garantere spektral matchning mellem de to fotodiodearrays skal du placere en lille slids eller en iris mellem gitteret og PBS for rumligt at filtrere den dispergerede pumpe. Klip alle undtagen en spektralkomponent i pumpereplikaerne for at centrere de transmitterede stråler på den nth detektor af reference- og signalfotodiodearrays. Brug de nævnte styrespejle til at justere korrelationen mellem de forskellige detektionskanaler.
  6. På dette tidspunkt skal du starte SRS-mikroskopi. For at gøre dette skal du modulere Stokes, raster-scanne prøven og erhverve modulationsoverførslen på pumpespektret (ΔI) med dets tilsvarende DC-spektrum (I) for at få det normaliserede SRS-spektrum (ΔI / I) fra hver pixel. Fremstil tredimensionelle matricer, hvis rækker (x) og kolonner (y) indeholder prøvens scannede positioner. På hver vektor (z) ortogonal til x-y-planet skal du gemme et SRS-spektrum.
    BEMÆRK: Figur 12 viser strukturen af SRS-hyperspektrale data.
    1. Indstil effekten af Stokes-strålen til 65 mW og bredbåndspumpestrålen til 20 mW. Indstil en ideel integrationstid for eksperimenterne.
      BEMÆRK: Her var integrationstiden 44 μs; pixelopnøvningstiden var dog 1 ms på grund af den langsomme piezo-scanner.

4. Kemometri af hyperspektrale SRS-data

  1. Brug multivariat kurveopløsningsanalyse til at adskille de forskellige kemiske bestanddele i prøven. Download GUI fra linket i Tauler, de Juan og Jaumot33.
    BEMÆRK: Her blev Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) MATLAB-program udviklet af Tauler og kolleger brugt34,35. For anvendelser af MCR-ALS til SRS-data henvises til 36,37; For detaljerede diskussioner om algoritmen henvises til 38.
  2. I MATLAB skal du omforme SRS-hyperspektraldatakuben til en matrix D med dens rækker, der indeholder SRS-spektrene. Antag, at den udfoldede SRL hypercube D er en lineær kombination af koncentrationen C og spektralprofilerne S af prøvens kemiske bestanddele (dvs. D = CS T + E, hvor E er en matrix, der indeholder den eksperimentelle fejl, og hævet T angiver matrixtransponering).
  3. Få hovedkomponenterne i dataene til at adskille C og S. Da det på forhånd er kendt, at den prøve, der diskuteres i afsnit 1, indeholder fire arter, nemlig DMSO, olivenolie, PMMA og PS, skal du konfigurere programmet til at søge efter fire arter plus en anden for at tage højde for baggrundsstøjen. Hvis der er en anden prøve med et højere eller lavere antal arter, skal du konfigurere programmet i overensstemmelse hermed.
    BEMÆRK: Programmet foretager en entalsværdinedbrydning af spektraldataene ved at bruge dem som de første gæt på de rene spektre S.
    1. Alternativt kan du fodre programmet med en matrix, der indeholder de kendte spektrale spor (f.eks. stoffernes spontane Raman-spektre).
      BEMÆRK: Ved hjælp af de indledende estimater af de rene spektre beregner programmet C = DS (STS) -1 og ST = (CTC) -1CTD. De nye værdier for C og S er optimeret med en vekslende algoritme med mindst kvadrater.
  4. Da SRS er et ikke-negativt signal, skal du begrænse den vekslende algoritme med mindst kvadrater til kun at levere positive værdier.
    BEMÆRK: Den optimerede C og S gør det muligt at konstruere en ny matrix D *= CST, et datasæt, som programmet sammenligner med de originale data D. Programmet gentager automatisk disse trin, indtil forskellen mellem D * og D er mindre end en vilkårlig tærskelværdi, der kan defineres.
  5. Plot C og S for at erhverve kemiske billeder og de karakteristiske spektre af prøvens kemiske bestanddele.

Representative Results

Figur 3 viser eksemplariske resultater opnået ved hjælp af denne protokol med PS, PMMA og olivenolie. Denne rotation af LBO1 vil ændre brydningsindekset, der opleves af SHG-feltet, og direkte ændre dets fasehastighed. Når fasehastigheden af SHG-feltet svarer til den for den ikke-lineære polarisation induceret i LBO1, vil det ikke-lineært genererede felt og den ikke-lineære polarisering være i fase, hvilket fører til intens SHG-stråling. Med andre ord vil justering af LBO1's φ vinkel give brugeren mulighed for at opnå den ideelle fasematchningsbetingelse for SHG. Da der anvendes en type I-fasematchende krystal her, vil polariseringen af SHG-strålen være ortogonal i modsætning til den grundlæggende stråle (figur 5B).

Figur 8 viser RIN for de optiske kilder, der anvendes i denne protokol, og skudstøjgrænsen, som er en konsekvens af elektroners og fotoners kvantekarakter, der sætter en grundlæggende grænse for laserstøj. Den begrænsede RIN for skudstøj beregnes med Equation 5 som vist ved Eq (3).

Equation 6 (3)

Hvor h er Plancks konstant, og ν er den optiske frekvens. Således giver skudstøjen nyttige retningslinjer for elektronikdesignet.

Figur 11A og figur 11C viser eksemplariske data for afbalancerede og ubalancerede spektre. Naturligvis påvirker virkningerne af afbalanceret detektion de endelige resultater af eksperimenterne, nemlig de kemiske kort. Figur 11B og figur 11D viser sammensatte billeder under henholdsvis ubalancerede og afbalancerede forhold. En vellykket implementering af den beskrevne protokol vil hjælpe med at identificere og lokalisere de forskellige kemiske bestanddele i en heterogen prøve og udtrække deres karakteristiske SRS-spektre. At udsætte de hyperspektrale data i figur 12 for kemometrisk analyse giver figur 13. Figur 13A viser en sammensætning af koncentrationskortene over prøvens forskellige kemiske bestanddele, mens figur 13B viser deres karakteristiske SRS-spektre. Bemærk, at de data, der er vist i figur 13A , ikke kun giver brugeren mulighed for let at identificere de forskellige bestanddele i prøven, men også at udføre mere kvantitativ analyse. For eksempel kunne vi ved hjælp af koncentrationskortene beregne gennemsnittet af fraktioneret koncentration af hver kemisk art: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS og 22% olivenolie.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over bredbånds-SRS-mikroskopet, der anvendes i denne protokol. Forkortelser: PBSx = polariserende strålesplitter; SHG = andet harmonisk generationsmodul; OPO = optisk parametrisk oscillator; AOM = acousto optisk modulator; SPF = kortpasfilter; M-LIA: Multikanals lock-in forstærker; DM = dikroisk spejl. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Spektre for den justerbare bredbåndspumpe (blå) og smalbåndsbjælkerne (rød) Stokes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Brightfield-billede af den kemisk heterogene prøve. Bemærk, at konventionel mikroskopi ikke tillader, at de forskellige bestanddele skelnes. Skalabjælke = 100 μm. Forkortelser: PS = polystyren; PMMA = polymethylmethacrylat; DMSO = dimethylsulfoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Modulering af smalbåndet Stokes pulser. (A) Det gennemsigtige blå spor viser den 0. diffrakterede stråle, mens den sorte viser den tilsvarende 1. rækkefølge. (B) Optisk opsætning til optimering af moduleringseffektiviteten af den 1. ordens diffrakterede stråle og finjustering af Stokes-strålens spotstørrelse, inden man når frem til excitationsmålet. Forkortelser: AOM = acousto optisk modulator; fx = objektivets brændvidde X. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Ikke-lineære optiske processer, der kræves for at drive OPO. (A) Geometri af SHG-interaktionen. To grundlæggende fotoner ved ω1 bringer materialesystemet til et virtuelt niveau med høj energi, hvorfra materialesystemet springer ned til jordtilstanden og udsender en foton ved ωSHG. B) Skema for SHG-eksperimentet. C) En skematisk oversigt over SHG- og OPO-opsætningerne. D) DFG-interaktionens geometri. En ωSHG-foton er opdelt i signalet (ωSignal) og tomgangsfotoner (ωIdler). En forstærkning af signalstrålen opnås ved at fodre signalfotonerne tilbage og få dem til at resonere i hulrummet. E) Ordningen for DFG-eksperimentet. Forkortelser: SMx = sfærisk spejl (R = 75 mm); OPO = optisk parametrisk oscillator; SHG = andet harmonisk generationsmodul; DFG = generering af forskelsfrekvenser; LBO = lithiumtriborat; OC = oliekondensator; DM = dikroisk spejl; fx = objektivets brændvidde X. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Prismekompressorens geometri. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Sumfrekvensgenerering for at optimere spatiotemporal overlapning. (A) SFG mellem pumpen og Stokes og deres respektive SHG-impinginging på en skærm. Her fokuserede en linse pumpen og Stokes-strålerne på krystallen, mens et lavpasfilter fjernede dem. (B) SFG's intensitet mellem pumpe og Stokes som funktion af tidsforsinkelse. Indstil tidsnul for SRS-opsætningen til den position, der maksimerer SFG. Asymmetrien af krydskorrelationen i B skyldes den tidsmæssige profil forårsaget af etalon på Stokes-strålen. Forkortelser: SFG = sumfrekvensgenerering; SHG = andet harmonisk generationsmodul; SRS = stimuleret Raman spredning spektroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: RIN-spektre. Bandet fremhævet med grønt viser det bedste spektrale område til SRS-eksperimenterne. Modulering af Stokes-strålen ved enhver frekvens inden for dette bånd garanterer, at virkningerne af laserstøj på SRS-signalet vil være de lavest mulige. Forkortelser: RIN = relativ intensitetsstøj; SRS = stimuleret Raman spredning spektroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 9
Figur 9: Stråleprofiler. (A) Pumpe, (B) Stokes og (C) pumpe og Stokes. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 10
Figur 10: Antaget geometri for et dispersionsgitter og en fotodiode array-detektor.

Figure 11
Figur 11. Virkningerne af afbalanceret detektion. Virkninger på spektre (A, C) og kemiske billeder (B, D). Kompositterne vist i paneler (B) og (D) er de endelige resultater af eksperimenterne (dvs. efter kemometrisk analyse af hyperspektrale data. Se protokollens afsnit 4 for at få flere oplysninger). Skalastænger = 10 μm. Forkortelse: SRS = stimuleret Raman spredning spektroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 12
Figur 12: En repræsentativ SRS hypercube erhvervet med bredbånds-SRS-mikroskopi. X-y-planet gemmer koordinaterne for de scannede positioner, mens hver vektor langs z registrerer et SRS-spektrum. Forkortelse: SRS = stimuleret Raman spredning spektroskopi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 13
Figur 13: Kemometrisk analyse af hyperspektrale SRS-data. (A) Sammensat af koncentrationskortene over prøvens forskellige bestanddele. B) Karakteristiske spektre af de kemiske arter. I begge paneler gul: olivenolie, blå: DMSO, cyan: PS og orange: PMMA. Skalabjælke = 20 μm (A). Forkortelser: SRS = stimuleret Raman spredning spektroskopi; PS = polystyren; PMMA = polymethylmethacrylat. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Bredbånd SRS-mikroskopi er en kraftfuld billeddannelsesteknik, der tilbyder autentisk kemisk kontrast til at identificere og adskille de kemiske bestanddele i en heterogen prøve. Potentialet i dette analytiske værktøj kan være gavnligt for flere forskningsområder, lige fra materialevidenskab til histopatologi. Ulempen ved bredbånds-SRS-mikroskopi er, at det er teknisk krævende; eksperimentalisten kræver ikke kun knowhow om bredbåndslaserkilder, men skal også manipulere laserpulserne for effektivt at generere SRS, et signal, der igen skal måles med sofistikerede detektionsordninger. Dette papir præsenterer en protokol, der beskriver en arbejdsgang til fremstilling af kemiske kort over blandede kemiske forbindelser ved hjælp af et multiplex bredbåndSRS-mikroskop. Selvom det beskrevne arbejde kan være trivielt for nogle laserfysikere og ikke-lineære mikroskopister, er det måske ikke tilfældet for læsere, der er interesseret i fordelene ved bredbånds-SRS-mikroskopi, hvis videnskabelige viden ligger uden for disse domæner. Derfor havde vi til formål at detaljere hvert trin for at guide det brede publikum, der er interesseret i bredbånds-SRS-mikroskopi.

Den foreliggende protokol startede med at vise, hvordan man forbereder en simpel, men spektroskopisk rig prøve sammensat af flere stærke og velkendte Raman-spredere. Vi diskuterede, hvordan man får bredbåndspumpen og smalbånds Stokes-bjælkerne, der er nødvendige for at oprette et SRS-mikroskop. Figur 5C viser et skema over SHG- og OPO-opsætningerne. Bemærk, at linse f1 fokuserer den grundlæggende stråle på LBO1 for at generere SHG, mens et dikroisk spejl reflekterer SHG-strålingen og transmitterer den resterende grundlæggende stråle. En anden linse f2 samler SHG-strålen. Som f2 > f1 udvides SHG-strålen med en faktor svarende til f2/f1. En tredje linse f3 fokuserer den udvidede SHG-stråle på en anden type I LBO-krystal (LBO2), der er skåret ved θ = 90 ° og φ = 29,0 °. Ved at pumpe LBO2 med ovennævnte SGH (520 nm) vil stråling inden for området 680-910 nm komme fra LBO2 gennem forskelsfrekvensgenerering (DFG), der producerer to stråler: signalet ogtomgangen 27 (figur 5D,E). Sidstnævnte kasseres, mens førstnævnte forstærkes i OPO-hulrummet for at levere de pumpeimpulser, der anvendes i SRS-eksperimenterne. OPO'ens pumpe ved 520 nm, nemlig SHG-strålen, bør ikke forveksles med pumpen i SRS-eksperimenterne (dvs. OPO'ens signalstråle).

Kontrasten i SRS-mikroskopi stammer fra et ikke-lineært signal, der genereres ved mikroskopets brændpunkt, et signal, der kræver begrænsning af et stort antal fotoner i prøveplanet på et givet tidspunkt. Denne fotonindespærring opnås med et mikroskopmål med høj numerisk blænde (NA), en række linser, der også indstiller systemets rumlige opløsning: jo højere NA, jo højere er den rumlige opløsning. Imidlertid er høje NA-mål tæt pakket med glas, hvilket introducerer positiv GDD til pulserende stråling, en frekvenskvidder, der i sidste ende udvider pulsernes tidsmæssige profil39. Således kan GDD, der blev introduceret med mikroskopmålet, øge varigheden af bredbåndspumpeimpulserne, hvilket gør det endnu længere end Stokes tidsmæssige konvolut og reducerer den effektive, tilgængelige båndbredde af Raman-signalet. Desuden kan denne udvidelse også medføre en forvrængning af spektralprofilen for det målte SRS-spektrum.

I CARS opstår det spektroskopisk relevante signal ved bølgelængder, der adskiller sig fra excitationsfelterne. Et simpelt fotomultiplikatorrør eller CCD-kamera (charge-coupled device) kan bruges til at integrere CARS-signalet i tide og opsummere tusindvis af impulser for at udjævne laserstøjen. I stedet vises SRS-signalet som en svag moduleringsoverførsel indlejret i en stærk og svingende laserbaggrund. Fordi denne modulering er svag, kan laserstøjen let overvælde den, hvilket reducerer både billedhastigheden og følsomheden af SRS-mikroskopet. Før billeddannelse er det derfor bydende nødvendigt at måle den relative intensitetsstøj (RIN) for at afgøre, om laseren er egnet til højhastigheds-SRS-billeddannelse og vælge moduleringsfrekvensen med den laveste støj. RIN defineres som laserens støjeffektspektraltæthed [δP(f), med W2/Hz-enheder] normaliseret med den gennemsnitlige optiske effekt (Equation 2)40,41. Med andre ord beskriver RIN de normaliserede laserudsving ved forskellige frekvenser (Eq [4]).

Equation 7 (4)

RIN er således en parameter i SRS-systemet, der bestemmer det ideelle moduleringsfrekvensområde for eksperimenterne. For eksempel viser olivenbjælken i figur 8 det ideelle moduleringsfrekvensområde til SRS-billeddannelse. I tilfælde af smalbånds SRS skal brugeren måle RIN for både pumpe og Stokes for at vælge, hvilken stråle der skal moduleres for at opnå optimal ydeevne. Bemærk fra figur 8, for eksempel, at Stokes-strålen har en lidt højere RIN end pumpen, hvilket antyder, at SRG-målingerne ville vise sig mere støjende end deres SRL-kolleger. I tilfælde af bredbånds-SRS er den stråle, der skal moduleres, smalbåndsstrålen.

Gitterets vinkeldispersion D udtrykker diffraktionsvinklen som en funktion af bølgelængden og defineres som derivatet af gitterligningen. For Littrow-konfigurationen er vinkeldispersionen givet ved Eq (5).

Equation 8 (5)

For at få Eq (5) antog vi, α = β, løste Eq (2) for m / d og indsatte resultatet i dβ / dλ. Bemærk, at i Littrow-konfigurationen β = sin-1 (mλ/2d). Inden for den lille vinkeltilnærmelse er ændringen i position langs spektret fdβ ≈ dl (figur 10). Ved at indsætte dβ i Eq (5) kan vi således beregne den lineære dispersion, en mængde med enheder af nm mm-1 ved hjælp af Eq (6):

Equation 9 (6)

For et diffraktionsgitter, der fungerer i Littrow-konfigurationen med 1.851,85 riller/mm, d = 540 nm. Hvis vi bruger førsteordens diffraktion af lys ved ~ 789 nm, D = 0,0027 rad nm-1. Med en f = 750 mm linse får vi en lineær dispersion på ≈ 0,5 nm mm-1, hvilket oversættes til ≈ 7,8 cm-1 mm-1. Objektivets brændvidde bestemmer således "densiteten" af nm pr. mm ved detektorplanet: Jo længere brændvidden er, jo færre nm pr. mm opnås, hvilket øger rummet mellem bredbåndspumpens spektrallinjer. Omvendt vil der med kortere brændvidder være mere nm pr. mm på detektorplanet, hvilket reducerer den plads, der optages af den dispergerede pumpe.

Afbalanceret detektion forbedrer billedkvaliteten og følsomheden af støjende opsætninger. For eksempel er det ubalancerede signal-støj-forhold (SNR) ifølge RIN-spektrene vist i figur 8 og i betragtning af typisk SRS med en amplitude på 1 x 10-5 ≈60. Ved hjælp af afbalanceret detektion (dvs. tæt på skudstøj) er det muligt at opnå en SNR på ≈145. Figur 11 viser spektre og sammensatte billeder under afbalancerede og ubalancerede forhold. Naturligvis påvirker virkningerne af afbalanceret detektion de endelige resultater af eksperimenterne, nemlig de kemiske kort. Understøttet af disse resultater understreger vi, at afbalanceret detektion er en kraftfuld teknik til at imødegå de skadelige virkninger af laserudsving på billedkvaliteten. Det er værd at nævne, at afbalanceret detektion er bedst egnet til støjende lasere, såsom fiberoscillatorer. SRS-mikroskoper, der arbejder med støjsvage optiske lyskilder (f.eks. solid state-lasere), kræver muligvis ikke afbalanceret detektion.

Protokollen forklarer også en tilgang baseret på ikke-lineær optik for at finde den spatiotemporale overlapning mellem impulserne af disse bjælker. Vi beskrev fordelene ved at bruge 1st i stedet for 0th diffraktionsorden af en AOM som den modulerede Stokes-stråle. Endvidere blev de skadelige virkninger af spredning på SRS-produktionseffektiviteten beskrevet med forslag til måder at afbøde dem via en prismekompressor. Derudover forklarer protokollen, hvordan prismerne justeres, og fremhæver tre kritiske aspekter, der skal overvejes for optimal ydeevne. Vi diskuterer ikke kun rin's relevans for SRS-mikroskopi, men viser også, hvordan man måler den med en lock-in-forstærker og med RIN-spektret definerer den bedste moduleringsfrekvens. Med et konkret eksempel forklarer dette papir, hvordan gitterligningen hjælper med at designe detektionskæden. Endelig illustrerer protokollen med ægte SRS-data strukturen af SRS hypercube og hvordan man analyserer den med et konventionelt anvendt videnskabeligt programmeringssprog.

Denne protokol har tre mindre begrænsninger. For det første består den detektionsordning, der anvendes i dette bidrag, af en ikke-konventionel, multikanals lock-in-detektor, der er designet og bygget internt af Sciortino et al.26 Som tidligere påvist25 kan denne detektor erstattes af en hyldebalanceret fotodiode. Selvom denne ændring kun vedrører detektoren og efterlader protokollen næsten uændret, skal man med en enkelt fotodiode scanne hver spektralkomponent på detektoren i stedet for at måle dem alle på én gang. For det andet anvender denne protokol inline afbalanceret detektion, hvilket kræver indsættelse af flere optiske elementer i strålebanen. Disse optiske elementer øger systemets kompleksitet og fører til tab af optisk effekt og pulsudvidning.

Inline-balanceret detektion kræver også, at de to pumpereplikaer passerer gennem prøven, en situation, der måske ikke er ideel til lysfølsomme prøver, såsom levende celler, eller til stærkt torefringente, hvor de to pumpereplikaer kan opleve forskellige optiske egenskaber, hvilket annullerer den afbalancerede detektion. For det tredje er protokollen afhængig af en hjemmebygget OPO, en enhed, der muligvis ikke er let tilgængelig. Alternativer til bredbåndsspektrene leveret af OPO er imidlertid superkontinuert fra ikke-lineære optiske fibre eller bulkkrystaller. Sidstnævnte kunne kun anvendes med lasere med lav gentagelseshastighed (op til 5 MHz). Som med ethvert eksperimentelt design har den foreliggende protokol således nogle begrænsninger. De er dog minimale og kompromitterer ikke succesen med denne tilgang.

Selvom en referenceprøve er beskrevet her, kan denne protokol med succes adskille kemiske arter i celler og dyre- og plantevæv, såsom cellulose, lipidiske arter eller proteiner, finde praktiske anvendelser i forskellige biokemiske quests eller som et diagnostisk værktøj i histopatologi. Tilsvarende kan denne protokol være et værdifuldt redskab inden for materialevidenskab. For eksempel kan man efter denne protokol forhøre den molekylære sammensætning og koncentration af polymere arter42. Desuden er denne metode kompatibel med andre ikke-lineære mikroskopiteknikker, såsom bredbåndsmikroskopi baseret på pumpesonde43 og heterodyne CARS44, firebølgeblandingsprocesser, der, som med SRS, også kræver to excitationslysstråler og moduleringsoverførselsmålinger. Endelig kan nogle af oplysningerne i dette papir anvendes på ikke-lineære billeddannelsesteknikker, der ikke er afhængige af moduleringsoverførselsteknikker, men kræver justering af to eller flere pulserende laserstråler, såsom konventionelle CARS45 og SFG-mikroskopier46.

Sammenfattende beskriver denne protokol en kraftfuld metode baseret på bredbånds-SRS-mikroskopi til at udtrække kemiske kort og deres karakteristiske SRS-spektre fra kemisk heterogene blandinger, der leverer datasæt, der muliggør ligetil kvantitativ dataanalyse. Metodens alsidighed og enkelhed giver også den interesserede læser mulighed for at tilpasse den til forskellige ikke-lineære teknikker.

Disclosures

G. C. erklærer engagement i virksomheden, Cambridge Raman Imaging, der har til formål at kommercialisere bredbånds SRS-mikroskopiteknologien. De øvrige forfattere erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

D. P. anerkender finansiering fra EU-projektet CRIMSON under tilskudsaftale nr. 101016923 og Regione Lombardia-projektet NEWMED under tilskudsaftale nr. POR FESR 2014-2020. G.C. anerkender finansiering fra EU-projektet GRAPHENE Core3 under tilskudsaftale nummer 881603. G. C. anerkender også finansiering fra King Abdullah University of Science and Technology, Grant Award Number: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection objective Nikon CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon Oil immersion objective
Coverslips Thermo Fisher 043211-KJ Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line Physik Instrumente (PI) M-406.6PD Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO Merck D8418-500ML Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon SLS Optics Ltd Custom made Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective Nikon CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon Water immersion objective
Grating LightSmyth T-1850-800s Series High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser Coherent Custom made Fidelity, HP
λ/2 Thorlabs SAHWP05M-1700 Mounted superachromatic half-wave plate
PBS Thorlabs CM5-PBS203/M 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads Merck MFCD00198073 Micro particles based on polymethacrylate
Prisms Crisel 320-8218 LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads Merck 72986-10ML-F Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal Dr. Sztatecsny GmbH Custom made  thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 - 1,100 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
  2. Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
  3. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
  4. Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
  5. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  6. Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
  7. Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
  8. Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
  9. Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
  10. Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020 (2018).
  11. Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101 (2018).
  12. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  13. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  14. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  15. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363 (2009).
  17. Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305 (2020).
  18. Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent Raman scattering microscopy. , CRC press. Boca Raton. (2012).
  19. Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
  20. Blume, R. J. Boxcar'' integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
  21. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  22. Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378 (2019).
  23. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  24. De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
  25. Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
  26. Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
  27. Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545 (2017).
  28. Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer's guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001 (2010).
  29. Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150 (1984).
  30. Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475 (2017).
  31. Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , https://www.zhinst.com/europe/en/blogs/noise-spectral-density-measured-lock-amplifiers (2021).
  32. Palmer, C., Loewen, E. G. Diffraction grating handbook. , (2005).
  33. Tauler, R., de Juan, A., Jaumot, J. Multivariate curve resolution homepage. , Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021).
  34. Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
  35. de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
  36. Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
  37. Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
  38. Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , Elsevier. (2020).
  39. Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397 (1997).
  40. Paschotta, R. RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise.". , Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021).
  41. Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101 (2020).
  42. Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
  43. Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
  44. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241 (2006).
  45. Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363 (2002).
  46. Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).

Tags

Engineering Udgave 185 Raman spredning stimuleret Raman spredning ikke-lineær mikroskopi hyperspektral bredbånd vibrationsbilleddannelse
Multiplex kemisk billeddannelse baseret på bredbåndsstimuleret Raman Scattering Mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De la Cadena, A., Vernuccio, F.,… More

De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter