Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Multiplex kjemisk avbildning basert på bredbånd stimulert Raman spredning mikroskopi

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/63709
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1,2
1Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano, 2Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

Vi presenterer en protokoll for å skaffe kjemiske bilder med bredbånd stimulert Raman spredning (SRS) mikroskopi. Basert på et SRS-mikroskop som opererer med differensial multikanalslåsdeteksjon, beskriver protokollen prøveprepareringen, justeringen av SRS-apparatet og kjemometri for å disentangle forskjellige bestanddeler av kjemisk heterogene prøver.

Abstract

Stimulert Raman-spredning (SRS) mikroskopi er en ikke-lineær optisk teknikk for etikettfri kjemisk avbildning. Dette analytiske verktøyet leverer kjemiske kart i høy hastighet, og høy romlig oppløsning av tynne prøver ved å direkte forhøre deres molekylære vibrasjoner. I standardimplementeringen er SRS-mikroskopi smalbånd og danner bilder med bare en enkelt vibrasjonsfrekvens om gangen. Imidlertid hindrer denne tilnærmingen ikke bare den kjemiske spesifisiteten til SRS, men forsømmer også rikdommen av informasjon kodet innenfor vibrasjonsspektra.

Disse begrensningene kan overvinnes av bredbånds-SRS, en implementering som er i stand til å trekke ut et vibrasjonsspekter per piksel av bildet parallelt. Dette gir hyperspektrale data som, når de kombineres med kjemometrisk analyse, maksimerer mengden informasjon som hentes fra prøven. Dermed forbedrer bredbånd sRS systemets kjemiske spesifisitet, noe som tillater kvantitativ bestemmelse av konsentrasjonen av de forskjellige bestanddelene i en prøve. Her rapporterer vi en protokoll for kjemisk avbildning med bredbånds SRS-mikroskopi, basert på et hjemmebygd SRS-mikroskop som opererer med en tilpasset differensial multikanals-lock-in forsterkerdeteksjon. Den diskuterer prøvepreparering, justering av SRS-apparatet og kjemometrisk analyse. Ved å anskaffe vibrasjonsmessige Raman-spektra illustrerer protokollen hvordan man identifiserer forskjellige kjemiske arter i en blanding, og bestemmer deres relative konsentrasjoner.

Introduction

Raman mikroskopi er en kraftig bildeteknikk som leverer rike kjemiske kart ved å måle Raman spredning1, en uelastisk radiativ prosess som stammer fra molekyler som vibrerer som svar på hendelseslys 2,3. Hver piksel i et Raman-kart inneholder et spektrum som inneholder direkte informasjon om den kjemiske sammensetningen og strukturen til prøven, noe som resulterer i bilder med iboende vibrasjonskontrast. Til dags dato er Raman mikroskopi referansesynspunktet for mikrospektroskopistudier av molekylære vibrasjoner, da ingen annen bildeteknikk kan produsere bilder med både høy kjemisk spesifisitet og høy romlig oppløsning4. Til tross for sin enestående kjemiske spesifisitet, er generasjonseffektiviteten til Raman-spredning lav, og krever enten utvidede pikselboetider eller høyeffekts eksitasjon, noe som fører til lave oppkjøpsrater og inkompatibilitet med sensitive prøver.

Denne enkeltmangelen av Raman-mikroskopi førte til at forskere brukte sammenhengende Raman-spredning 5,6,7,8,9 som en kilde til kontrast for mikroskopi. Dette er en ikke-lineær optisk prosess som forbedrer vibrasjonsresponsen med flere (opptil syv) størrelsesordener, og dermed tillater høyhastighets kjemisk bildebehandling 10,11,12,13. Spesielt er de to mest brukte sammenhengende Raman-spredningsteknikkene sammenhengende anti-Stokes Raman-spredning (CARS)14 og stimulert Raman-spredning (SRS)15. I motsetning til CARS viser SRS en lineær avhengighet av konsentrasjonen av resonansmolekyler. Det er immun mot den ikke-resonante bakgrunnen, en ikke-lineær effekt som ikke er relatert til noen vibrasjonsovergang, men forvrengende for lorentziske former som er karakteristiske for Raman-spektraet til de molekylære vibrasjonene16,17. Dermed gir SRS-mikroskopi autentisk Raman-informasjon som tillater direkte kvantitativ bildeanalyse.

SRS er en tredjeordens, ikke-lineær, optisk prosess som gir direkte informasjon om de kjemiske bindingene til en prøve. Den stammer fra den romlige superposisjonen til to optiske felt generelt i den nær-infrarøde spektralregionen, nemlig pumpen og Stokes ved frekvens ωpu og ωS, henholdsvis 10,11,18. Denne superposisjonen genererer et slag ved pump-Stokes frekvensavskrekking Ω = ωpu-ω S. Når Ω samsvarer med en molekylær vibrasjon ΩR, resonerer molekylet, noe som forårsaker en sammenhengende energioverføring mellom lysfeltene og molekylet. Som et resultat når molekylet en vibrasjonsmessig spent tilstand. Denne prosessen kan overvåkes ved å måle enten utslettelse av pumpefotoner (et signal kjent som stimulert Raman-tap [SRL]) eller samtidig forsterkning av Stokes fotoner (en prosess kjent som stimulert Raman gain [SRG]). SRG og SRL er små signaler (ΔI) som sitter oppå en intens og varierende bakgrunn (I). Siden typiske verdier for SRS-signalet (ΔI/I) er i området 10-6-10-4, kan laserstøyen lett skjule den. For å redusere de skadelige effektene av laserstøyen på signal-til-støy-forholdet (SNR) og følgelig på bildehastigheten, SRS-deteksjon er avhengig av modulasjonsoverføringsteknikker (f.eks. låseforsterkere, resonanskretser eller bokseremner) ved høye modulasjonsfrekvenser (>1 MHz), der laserstøyen når minimumsverdiene 15,19,20.

Konvensjonell SRS-mikroskopi bruker smalbåndspumpe (≈10 cm−1) og Stokes-pulser for å produsere kjemiske bilder med en enkelt vibrasjonsfrekvens, slik at videohastighetsbilder med pikselboetider så lave som ≈ 100 ns21,22. Men fordi smalbånd sRS mikroskopi danner kjemiske kart ved sekvensielt skanning av prøven med bare noen få vibrasjonsfrekvenser, er informasjonen begrenset23. SRS-bilder med en eller to vibrasjonskontraster er kanskje ikke tilstrekkelig til å skille kjemiske arter med overlappende Raman-bånd, spesielt innen heterogene systemer. Derfor utnytter det paradigmatiske smalbåndet SRS-mikroskopet ikke det fulle potensialet til SRS, fordi det å undersøke en håndfull vibrasjonsfrekvenser hindrer dens kjemiske spesifisitet og forsømmer rikdommen av informasjon kodet innenfor vibrasjonsspektra. Videre resulterer sekvensiell skanning av prøven ved forskjellige frekvenser i utvidede pikselbotider som kan utløse fotodamage og forhindre streng romlig kjernegistrasjon mellom påfølgende bilder, noe som fører til bevegelsesartefakter.

I motsetning til den smale motstykket, henter bredbånds SRS-mikroskopi et vibrasjonsspekter per piksel ved hver prøveskanning 10,12,24. Dermed gir bredbåndSRS hyperspektral avbildning med streng romlig kjernegistrasjon av forskjellige vibrasjonskontraster, noe som tillater streng dataanalyse. Dette avslører ikke bare de kjemiske bestanddelene av prøven gjennom Raman spektra, men bidrar også til å bestemme deres relative konsentrasjoner. Avhengig av hvordan spektra er anskaffet, er bredbånd SRS mikroskopi klassifisert enten som hyperspektral SRS eller multiplex SRS. I hyperspektral SRS oppnås SRS-spekteret per skannede punkt i prøven sekvensielt (dvs. det hentes ved å feie frekvensen som detuning Ω), bygge et SRS-spektrum ved å stable sammen SRS-signalene ved påfølgende Raman-skift. Raman-spekteret måles samtidig i flere vibrasjonsmoduser i multipleks SRS. Dermed kombinerer multiplex SRS-tilnærmingen en modulert smalbåndpuls med en bredbåndspuls for å drive SRS-signalet ved forskjellige frekvenser, og bruker en flerkanalsdetektor med en følsomhet som kan sammenlignes med smalbånds SRS for å oppdage SRS-spektraet.

Dette dokumentet presenterer en protokoll for å produsere kjemiske kart over heterogene prøver ved hjelp av multiplex SRS mikroskopi. En ordning av SRS-mikroskopet som brukes i denne protokollen er avbildet i figur 1 og beskrevet i detalj andre steder 25,26,27. Kort sagt, en kommersiell modus-låst Yb fiber laser, produserer 140 fs pulser sentrert på 1040 nm, med 10 W gjennomsnittlig effekt og en 80 MHz repetisjonshastighet, driver bredbånd SRS mikroskop. En polariserende bjelkesplitter (PBS) skiller den grunnleggende strålen i to grener. For å produsere narrowband Stokes pulser, sendes en gren med 4 W av den grunnleggende strålen til et etalon som genererer en smalbåndsstråle (≈15 cm-1), som deretter moduleres ved 1,6 MHz med en akustisk optisk modulator (AOM). Den resterende brøkdelen med 6 W av den grunnleggende strålen er frekvensfortobblet med en 2,8 mm tykk litiumtriborat (LBO) krystall, kuttet for type-I fasematching (θ = 90°, φ = 13,8°). Den resulterende andre harmoniske generasjonen på 520 nm går til et X-foldet hulrom for å pumpe en optisk parametrisk oscillator (OPO), en enhet som bruker en 3,0 mm tykk LBO-krystall (type I fasematching, θ = 90°, φ = 9,8°) som aktivt medium for å levere en optisk bredbåndsstråling som kan justeres innenfor 680-910 nm spektralområdet (figur 2). Disse bredbåndspulsene fungerer som pumpen i SRS-eksperimentene og forplanter seg til en prismekompressor for å prekompensere dispersjonseffektene som er indusert av mikroskopmålet.

Etter kompresjonsfasen produserer en λ/2 bølgeplate, kombinert med en YVO4 birefringent plate, to ortogonalt polariserte kopier hvis elektroniske subtraksjon på deteksjonsplanet avbryter støyen fra bredbåndspumpen. Et dikroisk speil kombinerer pumpen og Stokes bjelker og sender dem til et oppreist mikroskop. Et vann-nedsenkingsmål med en numerisk blenderåpning (NA) på 1,27 fokuserer lyset på prøven, mens et oljeinnlevelsesmål med en NA på 1,4 samler det. Før deteksjonsfasen fjerner et kortpassfilter (SPF) de modulerte Stokes, mens et diffraksjonsgitter som opererer i Littrow-konfigurasjon sprer den overførte bredbåndspumpen. En annen PBS2 skiller pumpekopiene, og et objektiv fokuserer dem på to fotodiodematriser. Signalene fra disse fotodiodematrisene trekkes elektronisk fra og sendes til en hjemmebygd flerkanals innlåsingsforsterker (M-LIA). Det demodulerte signalet normaliseres deretter av likestrømsavlesningene (DC) til en av fotodiodematrisene, og produserer dermed SRL-spekteret.

Som et eksemplarisk eksperiment ser vi for oss blandinger av flere kjente Raman-spredere, hver med et unikt Raman-spektrum. Dermed starter protokollen med å beskrive hvordan referanseprøvene skal klargjøres. Når vi oppdager SRL, fortsetter vi å forklare hvordan du får tak i narrowband Stokes pulser og setter opp den optiske kilden som leverer bredbåndspumpepulsene (≈250 cm-1), nemlig den hjemmebygde OPO. Protokollen viser justering og optimalisering av de optiske bjelkene, som beskriver kritiske parametere som kraften og spektraet til narrowband Stokes og bredbåndspumpen. Protokollen beskriver i detalj den optiske banen til bredbåndspumpen fordi den krever spesielle optiske elementer. Den forklarer også hvordan du finner den romlige overlappingen mellom pumpe-Stokes pulser og viser en praktisk måte å bestemme den relative intensitetsstøyen (RIN), som igjen bidrar til å definere den beste modulasjonsfrekvensen for SRS-eksperimenter. Deretter forklarer vi arbeidsprinsippet og kalibreringen av deteksjonskjeden. Til slutt viser protokollen datainnsamlingsprosessen, kjemometrien og datasamlebåndet for bildebehandling.

Protocol

1. Prøvepreparering

MERK: Denne protokollen beskriver gjenfinning av konsentrasjonskartene og karakteristisk SRS-spektra av kjemisk heterogene blandinger.

  1. For å forberede prøven, trekk ut 2 μL fra en vandig suspensjon av polymetylmetakrylat (PMMA) mikrober (se materialtabellen) og hell 2 μL-fraksjonen på et mikroskop.
    1. Med en ren pipettespiss trekker du ut 2 μL fra en vandig suspensjon av polystyren (PS) mikrober og kombinerer den med PMMA-suspensjonen på dekslene. Bruk en pipettespiss til å blande suspensjonen forsiktig og la den tørke i 24 timer.
      MERK: Det er viktig å nøye matche konsentrasjonen av mikrobeadfjæringene for å unngå uforholdsmessige mengder mikrober på prøveoverflaten. Diameteren på PS- og PMMA-perlene er henholdsvis 10 og 6 μm. Disse dimensjonene gjør det mulig å demonstrere mikroskopets høye romlige oppløsning uten å gå på kompromiss med genereringseffektiviteten til SRS.
  2. På toppen av det flate, hvite laget av perler som vil vises når vannet tørker av, tilsett 20 μL dimetylsulfoksid (DMSO) og deretter 20 μL ren olivenolje.
  3. Påfør neglelakk på kantene på et annet mikroskopdekslerlip. Plasser dekslene på blandingen, med neglelakken vendt ned, og legg nok trykk til å forsegle den. La det tørke.
    MERK: Figur 3 viser eksemplariske resultater oppnådd med disse trinnene. Hvis den er ordentlig forseglet, skal denne prøven vare opptil tre måneder.

2. Optimalisering av pumpe- og Stokes-bjelker

  1. Slå på laseren, og la den nå termisk likevekt. Påfør en negativ gruppeforsinkelsesspredning (GDD) av GDD = -6000 fs2 på den grunnleggende strålen.
    MERK: Denne GDD-verdien er avgjørende for å kunne kjøre OPO og er optimal for dette oppsettet, men vil sannsynligvis variere i forskjellige systemer. Negativ GDD kan introduseres gjennom gitterpar, prismekompressorer eller pulsformere basert på romlige lysmodulatorer28.
  2. Del den grunnleggende laseren med en polariserende strålesplitter (PBS1) i to grener. For å få narrowband Stokes pulser, guide en gren med 4 W til etalon. Roter etalonen litt til en smal spektrallinje oppnås og midtstilles på toppen av pulsspekteret (se den røde kurven i figur 2).
    MERK: Denne etalonen har en effektiv finesse på 29 og en frispektral rekkevidde på 29,8 nm ved 1040 nm.
  3. For å oppnå modulerte Stokes-pulser, send den smale strålen til en acousto-optisk modulator.
    MERK: Som vist i figur 4A, opplever den første bestilte diffracted strålen 100% modulering, mens nullordren bare er 50%. Derfor er det å foretrekke å bruke den første ordren for å unngå å belyse prøven med en sterk umodulert stråle som kan indusere prøvefotodamage uten å generere noe SRS-signal.
    1. For å optimalisere modulasjonseffektiviteten må du endre avstanden mellom objektivene f1 og f2 (figur 4B). Mål den modulerte strålen med en fotodiode og registrer profilen med et oscilloskop.
    2. Endre avstanden mellom f1 og f2 til maksimal kontrast oppnås mellom amplituden og grunnlinjen til oscilloskopavlesningene.
      MERK: Dette paret med linser fungerer ikke som en collimator, men snarere skaper det et effektivt fokuspunkt ved krystallen til AOM.
    3. Plasser en tredje linse f3 for å finjustere midjen på Stokes-strålen, slik at interaksjonsvolumet ved mikroskopets fokusplan kan endres og dermed optimalisere SRS-signalet.
      MERK: Stokes-strålen ble modulert på 1,6 MHz i denne protokollen.
  4. Fokuser de resterende 6 W av den grunnleggende strålens optiske kraft på en litiumtriboratkrystall (LBO1, θ = 90°, φ = 13,8°) for å frekvensdobbel den grunnleggende strålen gjennom andre harmoniske generasjon (SHG) (figur 5A).
    1. For å maksimere SHG-effektiviteten, roter krystallen litt, variere φ vinkel (figur 5B). Optimaliser LBO1 for å få minst 2,5 W SHG.
  5. Juster den φ vinkelen på LBO2 for å maksimere genereringseffektiviteten til signalstrålen.
    MERK: Brennviddene på linsene f1, f2 og f3 ble nøye valgt for å matche SHG-strålen med OPO-hulrommet. Dermed vil brennvidden på disse linsene variere i forskjellige oppsett. På grunn av gjenværende dispersjon i OPO-hulrommet, induserer en liten endring i hulromslengden et skifte av spekteret av signalstrålen.
    1. Juster hulromslengden for å få et pumpespekter som sammen med det smale armbåndet Stokes på 1040 nm kan produsere en frekvensavskrekking innen 1373-5090 cm-1. Dette området dekker vibrasjonene i CH som strekker seg spektralområdet (2800-3050 cm-1). Se det blå spektraet i figur 2.
  6. For å kompensere for dispersjonseffektene som er indusert av eksitasjonsmikroskopmålet, send bredbåndspumpen til en prismekompressor. Gå inn i pumpen i prisme A gjennom toppen og før den dispergerte pumpen mot toppen av prisme B. Definer mengden negativ dispersjon som er nødvendig, og still deretter avstanden mellom prismenes apices L tilsvarende.
    MERK: Figur 6 viser arrangementet av prismene29. I dette tilfellet ble kompensasjonen satt for GDD ≈ -12 800 fs2; derfor L = 1,26 m.
    1. Bruk Brewster-cut prismer.
      1. Sørg for at polariseringen av pumpestrålen ligger innenfor de trekantede planene til prismene (topp / bunn upolerte ansikter).
      2. Påse at forekomstvinkelen θi pumpestrålen stemmer overens med Brewster-vinkelen.
      3. Pass på at utgangsflaten til prisme A er parallell med inngangssiden av prisme B.
    2. For å estimere GDD for bredbåndspulsen som skal kompenseres, måler du SRS-signalet med en enkelt bølgelengde λ1, og registrerer tidsforsinkelsen τ1 mellom pump-Stokes der maksimal SRS (λ1) oppnås. Gjenta denne prosedyren for en ny bølgelengde λ2, og registrer igjen tidsforsinkelsen τ2 der SRS(λ2) var maksimal.
      MERK: Fordi GDD er definert som derivat av gruppeforsinkelsen med hensyn til vinkelfrekvensen, tillater de nevnte målingene estimering av GDD for bredbåndsstrålen (Eq [1]).
      Equation 1(1)
  7. Bruk en λ/2 bølgeplate, sett polariseringen av pumpestrålen til 45°. Før den polariserte pumpen til en YVO4-plate med en lengde på 13,3 mm, og still inn den raske aksen til denne birefringente krystall vertikale.
    MERK: Når du reiser gjennom YVO4-platen , vil pumpepulsene deles inn i to ortogonalt polariserte kopier som forplanter seg kollinearisk, men holder en forsinkelse Δt ≈ 10 ps mellom dem. Denne forsinkelsen er en funksjon av tykkelsen og brytningsindeksene til den birefringente krystallen. Deretter vil pumpekopiene med samme polariseringstilstand av Stokes-pulsene bli kalt "signal" mens de med ortogonal tilstand som "referanse". Detaljene i denne teknikken, kalt innebygd balansert deteksjon, har blitt beskrevet tidligere30.
  8. Kombiner pumpen og Stokes bjelker med et dikroisk speil og juster dem forsiktig ved hjelp av et par fluorescerende pinholes, og sørg for at begge forplanter kollinearly. Demper bjelkene og bruker et objektiv til å fokusere dem på en rask (minst 100 MHz båndbredde) fotodiode.
    1. Blokker pumpen og mål enkle Stokes-pulser med et digitalt oscilloskop med høy båndbredde. Bruk utløsersignalet til laseren som klokkekilde for målingene av oscilloskopet. Bestem gjennomsnittsverdien som fotodiodespenningen når sitt maksimum.
    2. Blokker Stokes-strålen og gjenta denne prosedyren for pumpepulsene. Øk eller reduser pumpens optiske bane (Stokes) til pulsene kommer omtrent samtidig som Stokes (pumpen) pulserer.
      MERK: Dette bør garantere en presisjon på noen få millimeter maksimalt i samsvar med den optiske baneforskjellen mellom de to armene.
    3. Fjern fotodioden og plasser en ikke-lineær krystall med en passende kuttvinkel for sumfrekvensgenerering (SFG) mellom pumpe-Stokes fotoner.
      MERK: Den ikke-lineære krystallen som ble brukt her, ble kuttet for fasematching av type I, θ = 90°, φ = 9,8°. Den optiske aksen til den ikke-lineære krystallen skal være parallell med polariseringen av Stokes og signalpulser.
    4. Gjør pumpen/Stokes-bjelkene litt ikke-collinear og flytt forsinkelseslinjen til SFG, et signal som på grunn av fasematching er mellom SHG-ene til pumpen og Stokes-bjelkene. Hvis signalet ikke blir funnet, må du kontrollere den romlige overlappingen av de to bjelkene på krystallen.
      MERK: SFG er blåforskjøvet og skal være lett synlig for det blotte øye.
    5. Ved uventede problemer, plasser et low pass-filter for å fjerne pumpen og Stokes og deres respektive SHG-er og måle SFG med et spektrometer (figur 7A). Finn tidsforsinkelsen der SFG når maksimal intensitet, en verdi som bestemmer den ideelle romlige overlappingen som kreves for ikke-lineær signalgenerering, og fest forsinkelseslinjen der (figur 7B).
  9. Mål stråleprofilene med et kalibrert kamera. Alternativt kan du bruke et infrarødt kort og estimere diameteren med øye. Bruk to teleskoper, ett for pumpen og et annet for Stokes-strålen. Med disse teleskoper, prøv å matche strålediametrene til bakre blenderåpning av eksitasjonsmålet.
    MERK: Denne prosedyren garanterer den maksimale romlige oppløsningen til oppsettet.
    1. Når SRS-signalet er oppnådd, bruk teleskopet på pumpestrålen til å finjustere diameteren, variere Rayleigh-rekkevidden og følgelig interaksjonsvolumet i fokus for mikroskopet. Stopp når maksimal SRS er oppnådd.
  10. Bruk en fotodiode til å måle intensiteten til pumpestrålen (Stokes) og med fotodiodens ansvar beregne gjennomsnittlig effekt Equation 2 som hindrer det aktive området av detektoren.
    1. Hvis du bruker en fotodiode med høy båndbredde, kobler du til et elektronisk low-pass-filter for å få bare konstant- eller DC-komponenten. For å måle δP(f), koble utgangen av en fotodiode med høy båndbredde (koble fra low pass-filteret) til inngangen til en innlåsingsforsterker. Oppbevar innlåsingsutgangen Equation 3 på forskjellige demoduleringsfrekvenser, og bruk fotodiodens ansvar til å konvertere fra V til W.
      MERK: Kommersielle innlåsingsforsterkere har innebygde verktøy for å måle δP(f) (f.eks. Zürich-instrumenter innlemmet i LabOne a Frequency Sweeper31).
    2. Etter å ha målt RIN på bjelkene, slå av laseren og mål den elektroniske støyen (dvs. RIN beregnet uten lys på detektorer).
      MERK: Forutsatt at RIN er begrenset av lasersvingningene og ikke av skuddstøyen, vil denne mørke målingen bidra til å diagnostisere instrumenteringen som brukes til målingene; hvis den elektroniske støyen er så høy som RIN på laseren, kan dette ikke brukes til å måle RIN på laseren; ultralow-noise-forsterkere må kanskje brukes til å redusere den elektroniske støyen.
    3. Hvis RIN er begrenset av skuddstøyen og ikke av laservariasjonen, må du skinne mer optisk kraft på detektoren. Se figur 8.

3. Sette opp spektraldeteksjon for SRS-avbildning

  1. Før pumpen og Stokes bjelker til mikroskopet.
  2. Plasser prøven som er omtalt i avsnitt 1, og finn en region uten perler for å justere pumpestrålen. Bruk et kamera til å måle den reflekterte profilen til Stokes (pumpe)-strålen mens du blokkerer pumpen (Stokes). Juster plasseringen av laserpunktene med speilene rett før mikroskopet.
    MERK: For å få den høyeste SRS-generasjonen, bør de overlappe perfekt. Figur 9 viser (A) pumpen, (B) Stokes, og (C) begge bjelkene overlappet perfekt ved mikroskopets fokusplan.
  3. Gjør eksitasjons- og innsamlingsmålene konfilere.
    MERK: Bruk av uendelig korrigerte mål betyr at fokusering av pumpen på prøveplanet vil resultere i en kollatert stråle på baksiden av oppsamlingsmålet.
    1. Sett et kortslutningsfilter for å fjerne de modulerte Stokes og lede pumpestrålen til gitteret. Plasser et objektiv etter gitteret for å fokusere den dispergerte strålen på detektorene.
      MERK: Gitterligningen vil bidra til å bestemme den lineære dispersjonen (dvs. hvor mange nm per mm på detektorplanet med et objektiv med en gitt brennvidde f32). Gitterligningen relaterer sporet periodicity d av gitteret, forekomstens vinkel α, diffraksjonsvinkelen β, den diffracted bølgelengden λ og diffraksjonsrekkefølgen m (Eq [2]).
      Equation 4 (2)
  4. For balansert deteksjon, mål spekteret av referansen og signalreplikaene som forplanter seg langs pumpestrålen.
    MERK: Pumpestrålens romlige profil etter gitteret er en linje som består av de forskjellige spektralkomponentene til bredbåndspumpen langs lengden. Hver spektralkomponent i pumpeledningen vil bli fokusert i avstand f av en sfærisk linse (se trinn 3.1-3.2).
    1. For å unngå å klippe den dispergerte pumpen, plasser den sfæriske linsen så nær gitteret som mulig. Sett en PBS rett etter den sfæriske linsen for å skille pumpekopiene.
      MERK: Her ble det brukt en polariserende kubebjelkesplitter fordi denne typen polarisator ikke forvrenger polariseringen av pumpestrålen. Den skiller også effektivt de forskjellige pumpekopiene og kan være stor nok til å unngå å klippe bredbåndspumpen. PBS vil gjenspeile signalreplikaen (s-polarisert) og overføre referansereplikaen (p-polarisert).
    2. Med et par styrespeil leder du signalet og referansen til de respektive detektorene (figur 1).
      MERK: I den ideelle balanserte konfigurasjonen skal signal- og referansereplikaene ha samme optiske effekt.
    3. For å fjerne støyen i pumpestrålen, korreler kanalene til fotodiodematrisen som måler signalet med sine kolleger i referansedetektoren. Sørg derfor for at signalets og referansefotodiodematrisenes n tediode-fotodiodematriser måler den optiske effekten til den samme spektralkomponenten i signal- og referansereplikaene.
      MERK: Figur 8 viser eksemplarisk RIN-spektra.
  5. For å garantere spektral matching mellom de to fotodiodematrisene, plasser en liten spalte eller en iris mellom gitteret og PBS for å filtrere den dispergerte pumpen på en romlig måte. Klipp alle unntatt en spektralkomponent i pumpekopiene for å midtstille de overførte strålene på den nte detektoren til referanse- og signalfotodiodematrisene. Bruk de nevnte styrespeilene til å justere korrelasjonen mellom de forskjellige deteksjonskanalene.
  6. På dette tidspunktet starter du SRS-mikroskopi. For å gjøre dette, modulere Stokes, rastrere prøven og anskaffe modulasjonsoverføringen på pumpespekteret (ΔI) med det tilsvarende DC-spekteret (I) for å få det normaliserte SRS (ΔI / I) spekteret fra hver piksel. Lag tredimensjonale matriser der radene (x) og kolonnene (y) inneholder de skannede plasseringene til prøven. På hver vektor (z) ortogonal til x-y-planet lagrer du et SRS-spektrum.
    MERK: Figur 12 viser strukturen til SRS hyperspektraldata.
    1. Sett kraften til Stokes-strålen til 65 mW og bredbåndspumpestrålen til 20 mW. Angi en ideell integrasjonstid for eksperimentene.
      MERK: Her var integrasjonstiden 44 μs; Pikselboetiden var imidlertid 1 ms på grunn av den langsomme piezo-skanneren.

4. Kjemometri av hyperspektrale SRS-data

  1. Bruk multivariat kurveoppløsningsanalyse for å disentangle de forskjellige kjemiske bestanddelene i prøven. Last ned GUI fra lenken i Tauler, de Juan og Jaumot33.
    MERK: Her ble Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) MATLAB-programmet utviklet av Tauler og kolleger brukt34,35. For anvendelser av MCR-ALS til SRS-data, se 36,37; For detaljerte diskusjoner om algoritmen, se 38.
  2. I MATLAB endrer du formen på SRS hyperspektral datakube til en matrise D med radene som inneholder SRS-spektraet. Anta at den utfoldede SRL hypercube D er en lineær kombinasjon av konsentrasjonen C og spektralprofilene S av de kjemiske bestanddelene i prøven (dvs. D = CS T + E, hvor E er en matrise som inneholder den eksperimentelle feilen, og hevet skrift T indikerer matrisetransponering).
  3. Hent hovedkomponentene i dataene for å skille C og S. Som det er kjent a priori at prøven som er omtalt i avsnitt 1 inneholder fire arter, nemlig DMSO, olivenolje, PMMA og PS, konfigurerer programmet til å søke etter fire arter pluss en annen for å ta hensyn til bakgrunnsstøyen. Hvis det er en annen prøve med et høyere eller lavere antall arter, konfigurerer du programmet deretter.
    MERK: Programmet gjør en entall-verdi dekomponering av spektraldataene, ved hjelp av dem som de første gjetningene av den rene spektra S.
    1. Alternativt kan du mate programmet med en matrise som inneholder de kjente spektralsporene (f.eks. det spontane Raman-spektraet av stoffene).
      MERK: Ved hjelp av de første estimatene av det rene spektraet vil programmet beregne C = DS (STS)−1 og ST = (CTC)−1CTD. De nye verdiene for C og S er optimalisert med en vekslende minste kvadraters algoritme.
  4. Siden SRS er et ikke-negativt signal, begrenser du algoritmen for vekslende minste kvadrater for å levere bare positive verdier.
    MERK: Den optimaliserte C og S vil tillate bygging av en ny matrise D *= CST, et datasett som programmet vil sammenligne med de opprinnelige dataene D. Disse trinnene gjentas automatisk til differansen mellom D* og D er mindre enn en vilkårlig terskelverdi som kan defineres.
  5. Plot C og S for å skaffe kjemiske bilder og det karakteristiske spektraet til de kjemiske bestanddelene i prøven.

Representative Results

Figur 3 viser eksemplariske resultater oppnådd ved hjelp av denne protokollen med PS, PMMA og olivenolje. Denne rotasjonen av LBO1 vil endre brytningsindeksen som SHG-feltet har opplevd, og endrer fasehastigheten direkte. Når fasehastigheten til SHG-feltet samsvarer med fasehastigheten til den ikke-lineære polariseringen som er indusert i LBO1, vil det ikke-lineært genererte feltet og den ikke-lineære polariseringen være i fase, noe som fører til intens SHG-stråling. Med andre ord, justering av φ vinkelen på LBO1 vil tillate brukeren å oppnå den ideelle fasematchingsbetingelsen for SHG. Når en Type I fase matchende krystall brukes her, vil polariseringen av SHG-strålen være ortogonal til den grunnleggende strålen (figur 5B).

Figur 8 viser RIN for de optiske kildene som brukes i denne protokollen og skuddstøygrensen, som er en konsekvens av kvantenaturen til elektroner og fotoner som setter en grunnleggende grense for laserstøyen. Skuddstøybegrenset RIN beregnes med Equation 5 som vist av Eq (3).

Equation 6 (3)

Hvor h er Plancks konstant, og ν er den optiske frekvensen. Dermed gir skuddstøyen nyttige retningslinjer for elektronikkdesignet.

Figur 11A og figur 11C viser eksemplariske data om balansert og ubalansert spektra. Naturligvis påvirker effekten av balansert deteksjon de endelige resultatene av forsøkene, nemlig de kjemiske kartene. Figur 11B og figur 11D viser sammensatte bilder under de ubalanserte og balanserte forholdene. Vellykket implementering av den beskrevne protokollen vil bidra til å identifisere og lokalisere de forskjellige kjemiske bestanddelene i en heterogen prøve og trekke ut deres karakteristiske SRS-spektra. Hvis du utsetter hyperspektraldataene i figur 12 for kjemometrisk analyse, får figur 13. Figur 13A viser en sammensetning av konsentrasjonskartene for de ulike kjemiske bestanddelene i prøven, mens figur 13B viser deres karakteristiske SRS-spektra. Vær oppmerksom på at dataene som vises i figur 13A , ikke bare lar brukeren enkelt identifisere de forskjellige bestanddelene i utvalget, men også å utføre mer kvantitativ analyse. Ved å bruke konsentrasjonskartene kan vi for eksempel beregne gjennomsnittet av fraksjonskonsentrasjonen av hver kjemiske art: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS og 22% olivenolje.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk for SRS-mikroskopet for bredbånd som brukes i denne protokollen. Forkortelser: PBSx = polariserende bjelkerplitter; SHG = andre harmoniske generasjonsmodul; OPO = optisk parametrisk oscillator; AOM = acousto optisk modulator; SPF = kortpassfilter; M-LIA: Multikanals innlåsingsforsterker; DM = dikroisk speil. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Spektra av den justerbare bredbåndspumpen (blå) og smalbåndet (rød) Stokes bjelker. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Brightfield-bilde av den kjemisk heterogene prøven. Vær oppmerksom på at konvensjonell mikroskopi ikke tillater at de forskjellige bestanddelene skiller seg ut. Skalastang = 100 μm. Forkortelser: PS = polystyren; PMMA = polymetylmetakrylat; DMSO = dimetylsulfoksid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Modulering av smalbånd stokes pulser. (A) Det gjennomsiktige blå sporet viser den 0. (B) Optisk oppsett for optimalisering av modulasjonseffektiviteten til den 1st bestillings diffracted strålen og fintuning av Stokes-bjelkens spotstørrelse før du ankommer eksitasjonsmålet. Forkortelser: AOM = acousto optisk modulator; fx = brennvidde på linse X. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Ikke-lineære optiske prosesser som kreves for å drive OPO. (A) Geometrien til SHG-interaksjonen. To grunnleggende fotoner på ω1 bringer materialsystemet til et høyenergi virtuelt nivå, hvorfra materialsystemet hopper ned til bakken, og sender ut en foton ved ωSHG. (B) Ordningen med SHG-eksperimentet. (C) Et skjematisk skjema for SHG- og OPO-oppsettene. (D) Geometri av DFG-interaksjonen. En ωSHG foton er delt inn i signalet (ωSignal) og idler (ωIdler) fotoner. En gevinst av signalstrålen oppnås ved å mate tilbake signalfotonene og få dem til å resonere i hulrommet. (E) Ordningen med DFG-eksperimentet. Forkortelser: SMx = sfærisk speil (R = 75 mm); OPO = optisk parametrisk oscillator; SHG = andre harmoniske generasjonsmodul; DFG = generering av differansefrekvens; LBO = litiumtriborat; OC = oljekondensator; DM = dikroisk speil; fx = brennvidde på linse X. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Geometri av prismekompressoren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Sumfrekvensgenerering for å optimalisere romlig overlapping. (A) SFG mellom pumpen og Stokes og deres respektive SHG-impinging på en skjerm. Her fokuserte en linse pumpen og Stokes-strålene på krystallen, mens et lavpassfilter fjernet dem. (B) Intensiteten av SFG mellom pumpen og Stokes som en funksjon av tidsforsinkelse. Still inn tid null for SRS-oppsettet i den posisjonen som maksimerer SFG. Asymmetrien av krysskorrelasjonen i B skyldes den tidsmessige profilen forårsaket av etalonen på Stokes-strålen. Forkortelser: SFG = sumfrekvensgenerering; SHG = andre harmoniske generasjonsmodul; SRS = stimulert Raman spredning spektroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: RIN-spektra. Bandet uthevet i grønt viser den beste spektralregionen for SRS-eksperimentene. Modulering av Stokes-strålen uansett frekvens i dette båndet garanterer at effekten av laserstøyen på SRS-signalet vil være lavest mulig. Forkortelser: RIN = relativ intensitetsstøy; SRS = stimulert Raman spredning spektroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Bjelkeprofiler. (A) Pumpe, (B) Stokes og (C) pumpe og Stokes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Antatt geometri for dispersjonsgitter og fotodiodematrisedetektor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11. Effekten av balansert deteksjon. Effekter på spektra (A, C) og kjemiske bilder (B, D). Komposittene vist i paneler (B) og (D) er de endelige resultatene av forsøkene (dvs. etter kjemometrisk analyse av hyperspektraldata. Se protokoll avsnitt 4 for mer informasjon). Skalastenger = 10 μm. Forkortelse: SRS = stimulert Raman spredning spektroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 12
Figur 12: En representativ SRS hypercube ervervet med bredbånds SRS-mikroskopi. x-y-planet lagrer koordinatene til de skannede posisjonene, mens hver vektor langs z registrerer et SRS-spektrum. Forkortelse: SRS = stimulert Raman spredning spektroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 13
Figur 13: Kjemometrisk analyse av hyperspektrale SRS-data. (A) Sammensatt av konsentrasjonskartene til de ulike bestanddelene i prøven. (B) Karakteristisk spektra av den kjemiske arten. I begge panelene, gul: olivenolje, blå: DMSO, cyan: PS og oransje: PMMA. Skalastang = 20 μm (A). Forkortelser: SRS = stimulert Raman spredning spektroskopi; PS = polystyren; PMMA = polymetylmetakrylat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Bredbånds SRS-mikroskopi er en kraftig bildeteknikk som gir autentisk kjemisk kontrast for å identifisere og disentangle de kjemiske bestanddelene i en heterogen prøve. Potensialet i dette analytiske verktøyet kan være gunstig for flere forskningsfelt, alt fra materialvitenskap til histopatologi. Ulempen med bredbånds SRS-mikroskopi er det faktum at det er teknisk krevende; eksperimentalisten krever ikke bare kunnskap om bredbåndslaserkilder, men må også manipulere laserpulsene for å effektivt generere SRS, et signal som igjen må måles med sofistikerte deteksjonsordninger. Dette dokumentet presenterer en protokoll som beskriver en arbeidsflyt for å produsere kjemiske kart over blandede kjemiske forbindelser ved hjelp av et multipleks bredbånd SRS mikroskop. Selv om det beskrevne arbeidet kan være trivielt for noen laserfysikere og ikke-lineære mikroskopister, kan det ikke være tilfelle for lesere som er interessert i fordelene med bredbånds SRS-mikroskopi hvis vitenskapelige kunnskap ligger utenfor disse domenene. Derfor tok vi sikte på å detaljere hvert trinn for å veilede det brede publikum som er interessert i bredbånds SRS-mikroskopi.

Protokollen startet med å vise hvordan man lager en enkel, men spektroskopisk rik prøve sammensatt av flere sterke og kjente Raman-scattere. Vi diskuterte hvordan man får tak i bredbåndspumpen og smalbånd stokes bjelker som er nødvendige for å sette opp et SRS-mikroskop. Figur 5C viser et oppsett av SHG- og OPO-oppsettene. Merk at linse f1 fokuserer den grunnleggende strålen på LBO1 for å generere SHG, mens et dikroisk speil reflekterer SHG-strålingen og overfører den gjenværende grunnleggende strålen. En annen linse f2 samler SHG-strålen. Som f2 > f1 utvides SHG-strålen med en faktor som er lik f2/f1. En tredje linse f3 fokuserer den utvidede SHG-strålen på en annen Type I LBO-krystall (LBO2) kuttet ved θ = 90° og φ = 29,0°. Ved å pumpe LBO2 med nevnte SGH (520 nm), vil stråling innenfor området 680-910 nm komme fra LBO2 til og med generering av forskjellsfrekvens (DFG), som produserer to bjelker: signalet og idler27 (figur 5D,E). Sistnevnte kastes mens førstnevnte forsterkes i OPO-hulrommet for å levere pumpepulsene som brukes i SRS-eksperimentene. Pumpen til OPO ved 520 nm, nemlig SHG-strålen, bør ikke forveksles med pumpen til SRS-eksperimentene (dvs. signalstrålen til OPO).

Kontrasten i SRS-mikroskopet stammer fra et ikke-lineært signal generert på mikroskopets fokuspunkt, et signal som krever å begrense et stort antall fotoner i prøveplanet på et gitt tidspunkt. Denne foton innesperring oppnås med en høy numerisk blenderåpning (NA) mikroskop mål, en rekke linser som også setter romlig oppløsning av systemet: jo høyere NA, jo høyere romlig oppløsning. Imidlertid er høye NA-mål tett pakket med glass, noe som introduserer positiv GDD til pulserende stråling, en frekvens chirp som til slutt utvider temporalprofilen til pulsene39. Dermed kan GDD introdusert av mikroskopmålet øke varigheten av bredbåndspumpepulsene, noe som gjør den enda lengre enn Stokes temporale konvolutt og reduserer den effektive, tilgjengelige båndbredden til Raman-signalet. Videre kan denne utvidelsen også innføre en forvrengning av spektralprofilen til det målte SRS-spekteret.

I CARS oppstår det spektroskopisk relevante signalet ved bølgelengder som avviker fra eksitasjonsfeltene. Et enkelt fotomultiplierrør eller ccd-kamera (charge-coupled) kan brukes til å integrere CARS-signalet i tide, og oppsummere tusenvis av pulser for å beregne gjennomsnittet av laserstøyen. I stedet vises SRS-signalet som en svak modulasjonsoverføring innebygd i en sterk og varierende laserbakgrunn. Fordi denne moduleringen er svak, kan laserstøyen lett overvelde den, noe som reduserer både bildehastigheten og følsomheten til SRS-mikroskopet. Derfor, før bildebehandling, er det viktig å måle den relative intensitetsstøyen (RIN) for å avgjøre om laseren er egnet for høyhastighets SRS-bildebehandling og å velge modulasjonsfrekvensen med lavest støy. RIN er definert som støyeffektspektral tetthet [δP(f), med W2/Hz-enheter] av laseren normalisert med gjennomsnittlig optisk effekt (Equation 2)40,41. RIN beskriver med andre ord de normaliserte lasersvingningene ved ulike frekvenser (Eq [4]).

Equation 7 (4)

Dermed er RIN en parameter for SRS-systemet som bestemmer det ideelle modulasjonsfrekvensområdet for forsøkene. Olivenlinjen i figur 8 viser for eksempel det ideelle modulasjonsfrekvensområdet for SRS-avbildning. Ved smalbåndsS bør brukeren måle RIN for både pump og Stokes for å velge hvilken stråle som må moduleres for å oppnå optimal ytelse. Legg for eksempel merke til at Stokes-strålen har en litt høyere RIN enn pumpen, noe som antyder at SRG-målingene ville bli mer støyende enn deres SRL-kolleger. Når det gjelder bredbåndsSRS, er bjelken som skal moduleres smalbåndstrålen.

Ristens vinkeldispersjon D uttrykker diffraksjonsvinkelen som en funksjon av bølgelengde, og er definert som derivat av gitterligningen. For Littrow-konfigurasjonen er vinkeldispersjonen gitt av Eq (5).

Equation 8 (5)

For å få Eq (5) antok vi α = β, løst Eq (2) for m/d og satte inn resultatet i dβ/ dλ. Merk at i Littrow-konfigurasjonen β = sin-1 (mλ/2d). Innenfor den lille vinkelens tilnærming er endringen i posisjon langs spekteret fdβ ≈ dl (figur 10). Ved å sette inn dβ i Eq (5) kan vi derfor beregne den lineære dispersjonen, en mengde med enheter på nm mm-1 ved hjelp av Eq (6):

Equation 9 (6)

For et diffraksjonsgitter som opererer i littrow-konfigurasjonen med 1851,85 spor/mm, d = 540 nm. Hvis vi bruker førsteordens diffraksjon av lys ved ~789 nm, D = 0,0027 rad nm-1. Med en f = 750 mm linse får vi en lineær spredning på ≈ 0,5 nm mm-1, og oversettes til ≈ 7,8 cm-1 mm-1. Dermed bestemmer objektivets brennvidde "tetthet" av nm per mm ved detektorplanet: Jo lengre brennvidden er, jo færre nm per mm oppnås, noe som øker plassen mellom spektrallinjene til bredbåndspumpen. Omvendt, med kortere brennvidder, vil det være mer nm per mm på detektorplanet, noe som reduserer plassen okkupert av den dispergerte pumpen.

Balansert deteksjon forbedrer bildekvaliteten og følsomheten til støyende oppsett. For eksempel, i henhold til RIN-spektraet vist i figur 8 og vurderer typisk SRS med en amplitude på 1 x 10-5, er det ubalanserte signal-til-støy-forholdet (SNR) ≈60. Ved hjelp av balansert deteksjon (dvs. nær skuddstøyen) er det mulig å oppnå en SNR på ≈145. Figur 11 viser spektra- og sammensatte bilder under balanserte og ubalanserte forhold. Naturligvis påvirker effekten av balansert deteksjon de endelige resultatene av forsøkene, nemlig de kjemiske kartene. Støttet av disse resultatene understreker vi at balansert deteksjon er en kraftig teknikk for å motvirke de skadelige effektene av lasersvingninger på bildekvaliteten. Det er verdt å nevne at balansert deteksjon er best egnet for støyende lasere, for eksempel fiberoscillatorer. SRS-mikroskoper som opererer med stille optiske lyskilder (f.eks. solid state-lasere), krever kanskje ikke balansert deteksjon.

Protokollen forklarer også en tilnærming basert på ikke-lineær optikk for å finne den romlige overlappingen mellom pulsene til disse bjelkene. Vi beskrev fordelene ved å bruke 1m i stedet forden 0. Videre ble de skadelige effektene av dispersjon på SRS-generasjonseffektiviteten beskrevet med forslag til måter å redusere dem via en prismekompressor. I tillegg forklarer protokollen hvordan du justerer prismene og fremhever tre kritiske aspekter å vurdere for optimal ytelse. Vi diskuterer ikke bare relevansen av RIN for SRS-mikroskopi, men viser også hvordan du måler den med en innlåsingsforsterker og, med RIN-spekteret, definerer den beste modulasjonsfrekvensen. Med et konkret eksempel forklarer dette papiret hvordan gitterligningen hjelper til med å designe deteksjonskjeden. Til slutt illustrerer protokollen, med ekte SRS-data, strukturen til SRS hypercube og hvordan man analyserer den med et konvensjonelt brukt vitenskapelig programmeringsspråk.

Denne protokollen har tre mindre begrensninger. For det første består deteksjonsordningen som brukes i dette bidraget av en ikke-konvensjonell, flerkanals låsedetektor designet og bygget internt av Sciortino et al.26 Som vist tidligere25, kan denne detektoren erstattes av en hyllebalansert fotodiode. Selv om denne modifikasjonen bare gjelder detektoren og forlater protokollen nesten uendret, med en enkelt fotodiode, må man skanne hver spektralkomponent på detektoren i stedet for å måle dem alle samtidig. For det andre bruker denne protokollen innebygd balansert deteksjon, noe som krever å sette inn flere optiske elementer i strålebanen. Disse optiske elementene øker systemets kompleksitet og fører til tap av optisk kraft og puls utvides.

Innebygd balansert deteksjon krever også at de to pumpekopiene passerer gjennom prøven, en situasjon som kanskje ikke er ideell for lysfølsomme prøver, for eksempel levende celler, eller for sterkt birefringente der de to pumpekopiene kan oppleve forskjellige optiske egenskaper, og dermed avbryte den balanserte deteksjonen. For det tredje er protokollen avhengig av en hjemmebygd OPO, en enhet som kanskje ikke er lett tilgjengelig. Imidlertid er alternativer til bredbåndsspektra levert av OPO superkontinenten fra ikke-lineære optiske fibre eller bulkkrystaller. Sistnevnte kunne bare brukes med lasere med lav repetisjonshastighet (opptil 5 MHz). Dermed, som med alle eksperimentelle design, har protokollen for hånden noen begrensninger. Imidlertid er de minimale og kompromitterer ikke suksessen til denne tilnærmingen.

Selv om en referanseprøve er beskrevet her, kan denne protokollen vellykket disentangle kjemiske arter i celler og dyre- og plantevev, for eksempel cellulose, lipidiske arter eller proteiner, finne praktiske anvendelser i forskjellige biokjemiske oppdrag eller som et diagnostisk verktøy i histopatologi. På samme måte kan denne protokollen være et verdifullt verktøy i materialvitenskap. For eksempel, etter denne protokollen, kan man forhøre molekylær sammensetning og konsentrasjon av polymere arter42. Videre er denne metodikken kompatibel med andre ikke-lineære mikroskopiteknikker, for eksempel bredbåndsmikroskopi basert på pumpesonde43 og heterodyne CARS44, firebølge blandeprosesser som, som med SRS, også krever to eksitasjonslysbjelker og modulasjonsoverføringsmålinger. Til slutt kan noe av informasjonen i dette papiret brukes på ikke-lineære bildeteknikker som ikke er avhengige av modulasjonsoverføringsteknikker, men krever justering av to eller flere pulserende laserstråler, for eksempel konvensjonelle CARS45- og SFG-mikroskoper46.

Oppsummert beskriver denne protokollen en kraftig metodikk basert på bredbånds SRS-mikroskopi for å trekke ut kjemiske kart og deres karakteristiske SRS-spektra fra kjemisk heterogene blandinger, og levere datasett som tillater enkel kvantitativ dataanalyse. Allsidigheten og enkelheten i metoden gir også den interesserte leseren muligheten til å tilpasse den til forskjellige ikke-lineære teknikker.

Disclosures

G. C. erklærer involvering med selskapet, Cambridge Raman Imaging, som har som mål å kommersialisere bredbåndet SRS mikroskopi teknologi. De andre forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

D. P. anerkjenner finansiering fra EU-prosjektet CRIMSON under Grant Agreement No. 101016923 og Regione Lombardia-prosjektet NEWMED under Grant Agreement No. POR FESR 2014-2020. G. C. erkjenner finansiering fra EU-prosjektet GRAPHENE Core3 under tilskuddsavtalenummer 881603. G. C. anerkjenner også finansiering fra King Abdullah University of Science and Technology, Grant Award Number: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection objective Nikon CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon Oil immersion objective
Coverslips Thermo Fisher 043211-KJ Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line Physik Instrumente (PI) M-406.6PD Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO Merck D8418-500ML Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon SLS Optics Ltd Custom made Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective Nikon CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon Water immersion objective
Grating LightSmyth T-1850-800s Series High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser Coherent Custom made Fidelity, HP
λ/2 Thorlabs SAHWP05M-1700 Mounted superachromatic half-wave plate
PBS Thorlabs CM5-PBS203/M 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads Merck MFCD00198073 Micro particles based on polymethacrylate
Prisms Crisel 320-8218 LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads Merck 72986-10ML-F Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal Dr. Sztatecsny GmbH Custom made  thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 - 1,100 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
  2. Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
  3. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
  4. Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
  5. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  6. Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
  7. Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
  8. Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
  9. Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
  10. Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020 (2018).
  11. Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101 (2018).
  12. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  13. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  14. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  15. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363 (2009).
  17. Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305 (2020).
  18. Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent Raman scattering microscopy. , CRC press. Boca Raton. (2012).
  19. Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
  20. Blume, R. J. Boxcar'' integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
  21. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  22. Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378 (2019).
  23. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  24. De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
  25. Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
  26. Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
  27. Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545 (2017).
  28. Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer's guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001 (2010).
  29. Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150 (1984).
  30. Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475 (2017).
  31. Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , https://www.zhinst.com/europe/en/blogs/noise-spectral-density-measured-lock-amplifiers (2021).
  32. Palmer, C., Loewen, E. G. Diffraction grating handbook. , (2005).
  33. Tauler, R., de Juan, A., Jaumot, J. Multivariate curve resolution homepage. , Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021).
  34. Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
  35. de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
  36. Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
  37. Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
  38. Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , Elsevier. (2020).
  39. Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397 (1997).
  40. Paschotta, R. RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise.". , Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021).
  41. Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101 (2020).
  42. Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
  43. Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
  44. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241 (2006).
  45. Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363 (2002).
  46. Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).

Tags

Engineering Utgave 185 Raman spredning stimulert Raman spredning ikke-lineær mikroskopi hyperspektral bredbånd vibrasjonsavbildning
Multiplex kjemisk avbildning basert på bredbånd stimulert Raman spredning mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De la Cadena, A., Vernuccio, F.,… More

De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter