Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Multiplex kemisk avbildning baserad på bredbandsstimulerad Raman-spridningsmikroskopi

Published: July 25, 2022 doi: 10.3791/63709
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,2, 1,2
1Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano, 2Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att erhålla kemiska bilder med bredbandsstimulerad Ramanspridningsmikroskopi (SRS). Baserat på ett SRS-mikroskop som arbetar med differentiell flerkanalig inlåsningsdetektering beskriver protokollet provberedningen, justeringen av SRS-apparaten och kemometri för att skilja olika beståndsdelar i kemiskt heterogena prover.

Abstract

Stimulerad Ramanspridning (SRS) mikroskopi är en olinjär optisk teknik för etikettfri kemisk avbildning. Detta analysverktyg levererar kemiska kartor med hög hastighet och hög rumslig upplösning av tunna prover genom att direkt förhöra deras molekylära vibrationer. I sin standardimplementering är SRS-mikroskopi smalband och bildar bilder med endast en enda vibrationsfrekvens åt gången. Detta tillvägagångssätt hindrar dock inte bara den kemiska specificiteten hos SRS utan försummar också den mängd information som kodas inom vibrationsspektra.

Dessa begränsningar kan övervinnas genom bredbands-SRS, en implementering som kan extrahera ett vibrationsspektrum per pixel i bilden parallellt. Detta levererar hyperspektrala data som, i kombination med kemometrisk analys, maximerar mängden information som hämtas från provet. Således förbättrar bredband SRS systemets kemiska specificitet, vilket möjliggör kvantitativ bestämning av koncentrationen av de olika beståndsdelarna i ett prov. Här rapporterar vi ett protokoll för kemisk avbildning med bredbands-SRS-mikroskopi, baserat på ett hembyggt SRS-mikroskop som arbetar med en anpassad differentiell flerkanalslåsningsförstärkare. Den diskuterar provberedning, inriktning av SRS-apparaten och kemometrisk analys. Genom att förvärva vibrationsspektra Raman-spektra illustrerar protokollet hur man identifierar olika kemiska arter i en blandning och bestämmer deras relativa koncentrationer.

Introduction

Ramanmikroskopi är en kraftfull avbildningsteknik som levererar rika kemiska kartor genom att mäta Raman-spridning1, en oelastisk strålningsprocess som härstammar från molekyler som vibrerar som svar på infallande ljus 2,3. Varje pixel i en Raman-karta innehåller ett spektrum som bär direkt information om provets kemiska sammansättning och struktur, vilket resulterar i bilder med inneboende vibrationskontrast. Hittills är Raman-mikroskopi referenspunkten för mikrospektroskopistudier av molekylära vibrationer eftersom ingen annan bildteknik kan producera bilder med både hög kemisk specificitet och hög rumslig upplösning4. Trots sin enastående kemiska specificitet är genereringseffektiviteten för Raman-spridning låg, vilket kräver antingen förlängda pixelboendetider eller högeffekts excitation, vilket leder till låga förvärvshastigheter och inkompatibilitet med känsliga prover.

Denna enda brist på Raman-mikroskopi fick forskare att tillämpa koherent Raman-spridning 5,6,7,8,9 som en kontrastkälla för mikroskopi. Detta är en olinjär optisk process som förbättrar vibrationsresponsen med flera (upp till sju) storleksordningar, vilket möjliggör höghastighetskemisk avbildning 10,11,12,13. I synnerhet är de två mest använda koherenta Raman-spridningsteknikerna koherenta anti-Stokes Raman-spridning (CARS)14 och stimulerad Raman-spridning (SRS)15. Till skillnad från CARS visar SRS ett linjärt beroende av koncentrationen av resonansmolekyler. Det är immunt mot den icke-resonanta bakgrunden, en olinjär effekt som inte är relaterad till någon vibrationsövergång men förvrängande till de Lorentziska formerna som är karakteristiska för Raman-spektra för de molekylära vibrationerna16,17. Således ger SRS-mikroskopi autentisk Raman-information som möjliggör direkt kvantitativ bildanalys.

SRS är en tredje ordningens, olinjära, optiska process som ger direkt information om de kemiska bindningarna i ett prov. Det härstammar från den spatiotemporala superpositionen av två optiska fält i allmänhet i det nära infraröda spektralområdet, nämligen pumpen och Stokes vid frekvensen ωpu respektive ωS, 10,11,18. Denna superposition genererar ett slag vid pump-Stokes-frekvensen som avstämde Ω = ωpu-ω S. När Ω matchar en molekylär vibration ΩR, resonerar molekylen och orsakar en sammanhängande energiöverföring mellan ljusfälten och molekylen. Som ett resultat når molekylen ett vibrationsupphetsat tillstånd. Denna process kan övervakas genom att mäta antingen förintelsen av pumpfotoner (en signal som kallas stimulerad Raman-förlust [SRL]) eller den samtidiga förstärkningen av Stokes-fotoner (en process som kallas stimulerad Raman-förstärkning [SRG]). SRG och SRL är små signaler (ΔI) som sitter ovanpå en intensiv och fluktuerande bakgrund (I). Eftersom typiska värden för SRS-signalen (ΔI / I) ligger i intervallet 10-6-10-4 kan laserbruset lätt dölja det. För att mildra de skadliga effekterna av laserbruset på signal-brusförhållandet (SNR) och följaktligen på bildhastigheten förlitar sig SRS-detektering på moduleringsöverföringstekniker (t.ex. inlåsningsförstärkare, resonanskretsar eller lådbilsmedelvärden) vid höga moduleringsfrekvenser (>1 MHz), där laserbruset når sina minimivärden 15,19,20.

Konventionell SRS-mikroskopi använder smalbandspump (≈10 cm−1) och Stokes-pulser för att producera kemiska bilder med en enda vibrationsfrekvens, vilket möjliggör videohastighetsavbildning med pixelboendetider så låga som ≈100 ns21,22. Men eftersom smalbands-SRS-mikroskopi bildar kemiska kartor genom att sekventiellt skanna provet vid endast några vibrationsfrekvenser, är dess information begränsad23. SRS-bilder med en eller två vibrationskontraster kanske inte räcker för att skilja kemiska arter med överlappande Raman-band, särskilt inom heterogena system. Därför utnyttjar det paradigmatiska smalbands-SRS-mikroskopet inte SRS fulla potential, eftersom undersökning av en handfull vibrationsfrekvenser hindrar dess kemiska specificitet och försummar den mängd information som kodas inom vibrationsspektra. Dessutom resulterar sekventiell skanning av provet vid olika frekvenser i förlängda pixelboendetider som kan utlösa fotoskador och förhindra rigorös rumslig coregistration mellan på varandra följande bilder, vilket leder till rörliga artefakter.

I motsats till dess smalbandsmotsvarighet hämtar bredbands-SRS-mikroskopi ett vibrationsspektrum per pixel vid varje provskanning 10,12,24. Således tillhandahåller bredband SRS hyperspektral avbildning med strikt rumslig coregistration av olika vibrationskontraster, vilket möjliggör noggrann dataanalys. Detta avslöjar inte bara provets kemiska beståndsdelar genom Raman-spektra, utan hjälper också till att bestämma deras relativa koncentrationer. Beroende på hur spektra förvärvas klassificeras bredbands-SRS-mikroskopi antingen som hyperspektral SRS eller multiplex SRS. I hyperspektral SRS förvärvas SRS-spektrumet per skannad punkt i provet sekventiellt (dvs. det hämtas genom att svepa frekvensen som avkodar Ω), bygga ett SRS-spektrum genom att stapla ihop SRS-signalerna vid på varandra följande Raman-skift. Raman-spektrumet mäts samtidigt i flera vibrationslägen i multiplex SRS. Således kombinerar multiplex SRS-metoden en modulerad smalbandspuls med en bredbandspuls för att driva SRS-signalen vid olika frekvenser och använder en flerkanalsdetektor med en känslighet som är jämförbar med smalbands-SRS för att detektera SRS-spektra.

Detta dokument presenterar ett protokoll för att producera kemiska kartor över heterogena prover med hjälp av multiplex SRS-mikroskopi. Ett schema för SRS-mikroskopet som används i detta protokoll visas i figur 1 och beskrivs i detalj någon annanstans 25,26,27. Kortfattat driver en kommersiell lägeslåst Yb-fiberlaser, som producerar 140 fs pulser centrerade vid 1040 nm, med 10 W genomsnittlig effekt och en repetitionshastighet på 80 MHz, bredbands-SRS-mikroskopet. En polariserande stråldelare (PBS) separerar grundstrålen i två grenar. För att producera smalbands Stokes-pulser skickas en gren med 4 W av grundstrålen till en etalon som genererar en smalbandsstråle (≈15 cm-1), som sedan moduleras vid 1,6 MHz med en akustisk optisk modulator (AOM). Den återstående fraktionen med 6 W av grundstrålen frekvensdubblas med en 2,8 mm tjock litiumtriboratkristall (LBO), skuren för typ I-fasmatchning (θ = 90 °, φ = 13,8 °). Den resulterande andra harmoniska generationen vid 520 nm färdas till ett X-vikt hålrum för att pumpa en optisk parametrisk oscillator (OPO), en anordning som använder en 3,0 mm tjock LBO-kristall (typ I-fasmatchning, θ = 90 °, φ = 9,8 °) som aktivt medium för att leverera en bredbandsoptisk strålning som kan avstämbars inom spektralområdet 680-910 nm (figur 2). Dessa bredbandspulser fungerar som pumpen i SRS-experimenten och sprider sig till en prismakompressor för att förkompensera dispersionseffekterna som induceras av mikroskopmålet.

Efter kompressionssteget producerar en λ/2-vågplatta, i kombination med en YVO 4-birefringentplatta, två ortogonalt polariserade repliker vars elektroniska subtraktion vid detekteringsplanet avbryter bruset från bredbandspumpen. En dikroisk spegel kombinerar pumpen och Stokes strålar och skickar dem till ett upprätt mikroskop. Ett vattendjupningsmål med en numerisk bländare (NA) på 1,27 fokuserar ljuset på provet, medan ett oljedykningsmål med ett NA på 1,4 samlar upp det. Före detekteringssteget tar ett kortpassfilter (SPF) bort de modulerade Stokes, medan ett diffraktionsgitter som arbetar i Littrow-konfiguration sprider den överförda bredbandspumpen. En andra PBS2 separerar pumpreplikerna, och en lins fokuserar dem på två fotodiodmatriser. Signalerna från dessa fotodiodmatriser subtraheras elektroniskt och skickas till en hembyggd flerkanalig inlåsningsförstärkare (M-LIA). Den demodulerade signalen normaliseras sedan av likströmsavläsningarna (DC) för en av fotodiodmatriserna, vilket ger SRL-spektrumet.

Som ett föredömligt experiment avbildar vi blandningar av flera välkända Raman-spridare, var och en med ett unikt Raman-spektrum. Således börjar protokollet med att beskriva hur man förbereder referensproverna. När vi upptäcker SRL fortsätter vi att förklara hur man får smalband Stokes-pulser och ställer in den optiska källan som levererar bredbandspumpen (≈250 cm-1), nämligen den hembyggda OPO. Protokollet visar inriktningen och optimeringen av de optiska strålarna och beskriver kritiska parametrar som effekten och spektra för smalbands-Stokes och bredbandspumpen. Protokollet beskriver i detalj bredbandspumpens optiska väg eftersom den kräver speciella optiska element. Den förklarar också hur man hittar den spatiotemporala överlappningen mellan pump-Stokes-pulser och visar ett praktiskt sätt att bestämma det relativa intensitetsbruset (RIN), vilket i sin tur hjälper till att definiera den bästa moduleringsfrekvensen för SRS-experiment. Sedan förklarar vi arbetsprincipen och kalibreringen av detekteringskedjan. Slutligen visar protokollet datainsamlingsprocessen, kemometri och bildbehandlingspipeline.

Protocol

1. Beredning av prover

OBS: Detta protokoll beskriver hämtningen av koncentrationskartor och karakteristiska SRS-spektra för kemiskt heterogena blandningar.

  1. För att bereda provet, extrahera 2 μl från en vattenhaltig suspension av polymetylmetakrylat (PMMA) mikrokulor (se materialtabellen) och häll 2 μL-fraktionen på ett mikroskopöverdrag.
    1. Med en ren pipettspets extraherar du 2 μL från en vattenhaltig suspension av polystyren (PS) mikrober och kombinerar den med PMMA-suspensionen på täckglaset. Blanda försiktigt suspensionen med en pipettspets och låt den torka i 24 timmar.
      OBS: Det är viktigt att noggrant matcha koncentrationen av mikrobeasuspensionerna för att undvika oproportionerliga mängder av mikropärlorna på provytan. Diametern på PS- och PMMA-pärlorna är 10 respektive 6 μm. Dessa dimensioner gör det möjligt att demonstrera mikroskopets höga rumsliga upplösning utan att kompromissa med SRS genereringseffektivitet.
  2. Ovanpå det platta, vita lagret av pärlor som kommer att dyka upp när vattnet torkar bort, tillsätt 20 μL dimetylsulfoxid (DMSO) och sedan 20 μL ren olivolja.
  3. Applicera nagellack på kanterna på ett andra mikroskopöverdrag. Placera täckglaset på blandningen, med nagellacket nedåt, tryck tillräckligt för att täta det. Låt det torka.
    OBS: Figur 3 visar exemplifierande resultat som erhållits med dessa steg. Om det är ordentligt förseglat bör detta prov vara upp till tre månader.

2. Optimera pump- och Stokes-balkar

  1. Slå på lasern och låt den nå termisk jämvikt. Applicera en negativ gruppfördröjningsdispersion (GDD) av GDD = -6 000 fs2 på grundstrålen.
    OBS: Detta GDD-värde är avgörande för att framgångsrikt köra OPO och är optimalt för denna inställning men kommer sannolikt att variera i olika system. Negativ GDD kan introduceras genom gallerpar, prismakompressorer eller pulsformare baserade på rumsliga ljusmodulatorer28.
  2. Dela upp grundlasern med en polariserande strålspett (PBS1) i två grenar. För att få smalband Stokes pulser, styr en gren med 4 W till en etalon. Rotera etalonet något tills en smal spektrallinje erhålls och centreras vid toppen av pulsspektrumet (se den röda kurvan i figur 2).
    OBS: Denna etalon har en effektiv finess på 29 och ett fritt spektralområde på 29,8 nm vid 1 040 nm.
  3. För att erhålla modulerade Stokes-pulser, skicka smalbandsstrålen till en acousto-optisk modulator.
    OBS: Som visas i figur 4A upplever den första ordningens diffraktionerade stråle 100% modulering, medan nollordningen endast är 50%. Därför är det att föredra att använda den första ordningen för att undvika att belysa provet med en stark omodulerad stråle som kan inducera provfotoskador utan att generera någon SRS-signal.
    1. För att optimera moduleringseffektiviteten, ändra avståndet mellan linserna f1 och f2 (figur 4B). Mät den modulerade strålen med en fotodiod och spela in dess profil med ett oscilloskop.
    2. Ändra avståndet mellan f1 och f2 tills maximal kontrast uppnås mellan amplituden och baslinjen för oscilloskopavläsningarna.
      OBS: Detta par linser fungerar inte som en kollimator, utan skapar snarare en effektiv fokalpunkt vid AOM: s kristall.
    3. Placera en tredje lins f3 för att finjustera midjan på Stokes-strålen, så att interaktionsvolymen vid mikroskopets fokalplan kan ändras och följaktligen optimera SRS-signalen.
      OBS: Stokes-strålen modulerades vid 1,6 MHz i detta protokoll.
  4. Fokusera de återstående 6 W av den grundläggande strålens optiska effekt på en litiumtriboratkristall (LBO) (LBO1, θ = 90 °, φ = 13,8 °) för att frekvensdubbla den grundläggande strålen genom andra harmoniska generationen (SHG) (figur 5A).
    1. För att maximera SHG-effektiviteten, rotera kristallen något och variera φ vinkel (figur 5B). Optimera LBO1 för att få minst 2,5 W SHG.
  5. Justera den φ vinkeln på LBO2 för att maximera signalstrålens genereringseffektivitet.
    OBS: Brännvidderna för linserna f1, f2 och f3 valdes noggrant för att mode-matcha SHG-strålen med OPO-hålrummet. Således kommer brännvidderna för dessa linser att variera i olika inställningar. På grund av den återstående dispersionen i OPO-hålrummet inducerar en liten förändring i hålrumslängden en förskjutning av signalstrålens spektrum.
    1. Justera hålrumslängden för att få ett pumpspektrum som tillsammans med smalbands-Stokes vid 1 040 nm kan producera en frekvensavlystning inom 1 373-5 090 cm-1. Detta intervall täcker vibrationerna i CH-sträckningsspektralområdet (2 800-3 050 cm-1). Se de blå spektra i figur 2.
  6. För att kompensera för dispersionseffekterna som induceras av excitationsmikroskopmålet, skicka bredbandspumpen till en prismakompressor. För in pumpen i prisma A genom dess topp och styr den dispergerade pumpen mot toppen av prisma B. Definiera mängden negativ dispersion som krävs och ställ sedan in avståndet mellan prismornas apices L i enlighet därmed.
    OBS: Figur 6 visar arrangemanget av prismorna29. I detta fall fastställdes ersättningen för GDD ≈ -12 800 fs2; alltså L = 1,26 m.
    1. Använd Brewster-skurna prismor.
      1. Se till att polarisationen av pumpstrålen ligger inom prismornas triangulära plan (opolerade ytor upptill/nedtill).
      2. Se till att infallsvinkeln θin på pumpstrålen matchar Brewster-vinkeln.
      3. Se till att utgångsytan på prisma A är parallell med ingångsytan på prisma B.
    2. För att uppskatta GDD för bredbandspulsen som ska kompenseras, mät SRS-signalen vid en enda våglängd λ1 och registrera tidsfördröjningen τ1 mellan pump-Stokes vid vilken den maximala SRS (λ1) erhålls. Upprepa denna procedur för en andra våglängd λ2, registrera igen tidsfördröjningen τ2 vid vilken SRS(λ2) var maximal.
      OBS: Eftersom GDD definieras som derivatan av gruppfördröjningen med avseende på vinkelfrekvensen, tillåter de ovannämnda mätningarna uppskattningen av GDD för bredbandsstrålen (Eq [1]).
      Equation 1(1)
  7. Använd en λ/2 vågplatta och ställ in polarisationen på pumpstrålen till 45°. Styr den polariserade pumpen till en YVO4-platta med en längd av 13,3 mm och ställ in den snabba axeln för denna birefringenta kristallvertikal.
    OBS: När du reser genom YVO4-plattan kommer pumppulserna att delas upp i två ortogonalt polariserade replikor som förökar sig kolil nästan men håller en fördröjning ≈ 10 ps mellan dem. Denna fördröjning är en funktion av tjockleken och brytningsindexen för den birefringenta kristallen. Därefter kommer pumpreplikerna med samma polarisationstillstånd för Stokes-pulserna att kallas "signal" medan de med ett ortogonalt tillstånd som "referens". Detaljerna i denna teknik, kallad inline balanserad detektering, har beskrivits tidigare30.
  8. Kombinera pumpen och Stokes-strålarna med en dikroisk spegel och rikta dem försiktigt med ett par fluorescerande pinhål, så att båda sprider sig kolil nästan. Dämpa strålarna och använd en lins för att fokusera dem på en snabb (minst 100 MHz bandbredd) fotodiod.
    1. Blockera pumpen och mät enstaka Stokes-pulser med ett digitalt oscilloskop med hög bandbredd. Använd laserns utlösningssignal som klockkälla för mätningarna av oscilloskopet. Bestäm medelvärdet vid vilket fotodiodspänningen når sitt maximala.
    2. Blockera Stokes-strålen och upprepa denna procedur för pumppulserna. Öka eller minska den optiska vägen för pumpstrålen (Stokes) tills dess pulser anländer ungefär samtidigt som Stokes (pump) pulser.
      OBS: Detta bör garantera en precision på några millimeter maximalt i matchningen av den optiska vägskillnaden mellan de två armarna.
    3. Ta bort fotodioden och placera en olinjär kristall med en lämplig skärvinkel för summafrekvensgenerering (SFG) mellan pump-Stokes-fotoner.
      OBS: Den olinjära kristallen som används här skars för fasmatchning av typ I, θ = 90 °, φ = 9,8 °. Den olinjära kristallens optiska axel bör vara parallell med polarisationen av Stokes och signalpulser.
    4. Gör pumpens/Stokes-strålarna något icke kolllinjära och flytta fördröjningsledningen till SFG, en signal som på grund av fasmatchning ligger mellan pumpens SHG och Stokes-strålarna. Om signalen inte hittas, verifiera den rumsliga överlappningen av de två strålarna på kristallen.
      OBS: SFG är blåförskjuten och ska vara lätt synlig för blotta ögat.
    5. Vid oväntade svårigheter, placera ett lågpassfilter för att ta bort pumpen och Stokes och deras respektive SHG och mät SFG med en spektrometer (figur 7A). Hitta den tidsfördröjning vid vilken SFG når sin maximala intensitet, ett värde som bestämmer den ideala spatiotemporala överlappningen som krävs för olinjär signalgenerering, och fixa fördröjningslinjen där (figur 7B).
  9. Mät strålprofilerna med en kalibrerad kamera. Alternativt kan du använda ett infrarött kort och uppskatta diametrarna med ögat. Använd två teleskop, ett för pumpen och ett annat för Stokes-strålen. Med dessa teleskop, försök att matcha stråldiametrarna till excitationsmålets bakre öppning.
    OBS: Denna procedur garanterar den maximala rumsliga upplösningen för installationen.
    1. När SRS-signalen har erhållits, använd teleskopet på pumpstrålen för att justera dess diameter, variera dess Rayleigh-intervall och följaktligen interaktionsvolymen vid mikroskopets fokus. Stanna när maximal SRS uppnås.
  10. Använd en fotodiod för att mäta pumpstrålens intensitet (Stokes) och, med fotodiodens responsivitet, beräkna medeleffekten Equation 2 som påverkar detektorns aktiva område.
    1. Om du använder en fotodiod med hög bandbredd, anslut ett elektroniskt lågpassfilter för att bara få konstant- eller DC-komponenten. För att mäta δP(f), anslut utgången från en fotodiod med hög bandbredd (koppla bort lågpassfiltret) till ingången till en inlåsningsförstärkare. Lagra inlåsningsutgången Equation 3 vid olika demoduleringsfrekvenser och använd fotodiodens responsivitet för att konvertera från V till W.
      OBS: Kommersiella inlåsningsförstärkare har inbyggda verktyg för att mäta δP (f) (t.ex. Zürich Instruments införlivade i LabOne en frekvenssopmaskin31).
    2. Efter mätning av strålarnas RIN, stäng av lasern och mät det elektroniska bruset (dvs. RIN beräknat utan lampa på detektorer).
      OBS: Förutsatt att RIN begränsas av laserfluktuationerna och inte av skottbruset, kommer denna mörka mätning att hjälpa till att diagnostisera instrumenteringen som används för mätningarna; Om det elektroniska bruset är lika högt som laserns referensnummer kan detta inte användas för att mäta laserns referensnummer. ultralow-noise-amplifiers kan behöva användas för att minska det elektroniska bruset.
    3. Om RIN begränsas av skottbruset och inte av laserfluktuationerna, lyser mer optisk kraft på detektorn. Se figur 8.

3. Ställa in spektraldetektering för SRS-avbildning

  1. Styr pumpen och Stokes strålar till mikroskopet.
  2. Placera provet som diskuteras i avsnitt 1 och hitta ett område utan pärlor för att hjälpa till att justera pumpstrålen. Använd en kamera och mät den reflekterade profilen för Stokes (pump) -strålen medan du blockerar pumpen (Stokes). Justera positionerna för laserfläckarna med speglarna precis före mikroskopet.
    OBS: För att få den högsta SRS-generationen bör de överlappa varandra perfekt. Figur 9 visar (A) pumpen, (B) Stokes och (C) båda strålarna överlappade perfekt vid mikroskopets fokalplan.
  3. Gör excitations- och insamlingsmålen konfokala.
    OBS: Användningen av oändlighetskorrigerade mål innebär att fokusering av pumpen på provplanet kommer att resultera i en kollimerad stråle vid den bakre öppningen av uppsamlingsmålet.
    1. Sätt ett kortpassfilter för att ta bort de modulerade Stokes och styr pumpstrålen till gallret. Placera en lins efter gallret för att fokusera den spridda strålen på detektorerna.
      OBS: Gitterekvationen hjälper till att bestämma den linjära dispersionen (dvs. hur många nm per mm vid detektorplanet med en lins med en given brännvidd f32). Gitterekvationen relaterar spår periodiciteten d för gallret, infallsvinkeln α, diffraktionsvinkeln β, den diffraktionerade våglängden λ och diffraktionsordningen m (Eq [2]).
      Equation 4 (2)
  4. För balanserad detektering, mät referensens spektrum och signalreplikerna som sprider sig längs pumpstrålen.
    ANMÄRKNING: Pumpbalkens rumsliga profil efter gallret är en linje som består av bredbandspumpens olika spektrala komponenter längs dess längd. Varje spektral komponent i pumpledningen kommer att fokuseras på avstånd f av en sfärisk lins (se steg 3.1-3.2).
    1. För att undvika att klippa den dispergerade pumpen, placera den sfäriska linsen så nära gallret som möjligt. Sätt en PBS direkt efter den sfäriska linsen för att separera pumpreplikerna.
      OBS: Här användes en polariserande kubstråledelare eftersom denna typ av polarisator inte förvränger polarisationen av pumpstrålen. Det separerar också effektivt de olika pumpreplikerna och kan vara tillräckligt stort för att undvika att klippa bredbandspumpen. PBS kommer att återspegla signalrepliken (s-polariserad) och överföra referensrepliken (p-polariserad).
    2. Styr signalen med ett par styrspeglar och hänvisningen till deras respektive detektorer (figur 1).
      OBS: I den ideala balanserade konfigurationen bör signal- och referensreplikerna ha samma optiska effekt.
    3. För att avlägsna bruset i pumpstrålen, korrelera kanalerna i fotodioduppsättningen som mäter signalen med deras motsvarigheter i referensdetektorn. Se därför till att den n: e fotodioden för signal- och referensfotodiodmatriserna mäter den optiska effekten hos samma spektralkomponent i signalen och referensrepliker.
      OBS: Figur 8 visar exemplariska RIN-spektra.
  5. För att garantera spektralmatchningen mellan de två fotodiodmatriserna, placera en liten slits eller en iris mellan gallret och PBS för att rumsligt filtrera den dispergerade pumpen. Klipp alla utom en spektralkomponent i pumpreplikerna för att centrera de överförda strålarna på den n: e detektorn för referens- och signalfotodiodmatriserna. Använd de nämnda styrspeglarna för att justera korrelationen mellan de olika detekteringskanalerna.
  6. Starta nu SRS-mikroskopi. För att göra detta, modulera Stokes, raster-skanna provet och förvärva moduleringsöverföringen på pumpspektrumet (ΔI) med motsvarande DC-spektrum (I) för att få det normaliserade SRS -spektrumet (ΔI / I) från varje pixel. Skapa tredimensionella matriser vars rader (x) och kolumner (y) innehåller provets skannade positioner. På varje vektor (z) ortogonal till x-y-planet lagrar du ett SRS-spektrum.
    OBS: Figur 12 visar strukturen för SRS hyperspektrala data.
    1. Ställ in effekten för Stokes-strålen på 65 mW och bredbandspumpbalkens effekt på 20 mW. Ange en idealisk integrationstid för experimenten.
      OBS: Här var integrationstiden 44 μs; pixelns uppehållstid var dock 1 ms på grund av den långsamma piezoskannern.

4. Kemometri för hyperspektrala SRS-data

  1. Använd multivariat kurvupplösningsanalys för att skilja de olika kemiska beståndsdelarna i provet. Ladda ner GUI från länken i Tauler, de Juan och Jaumot33.
    OBS: Här användes Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) MATLAB-program utvecklat av Tauler och kollegor34,35. För tillämpningar av MCR-ALS på SRS-data, se 36,37; för detaljerade diskussioner om algoritmen, se 38.
  2. I MATLAB omformar du SRS hyperspektrala datakub till en matris D med dess rader som innehåller SRS-spektra. Antag att den utfällda SRL-hyperkuben D är en linjär kombination av koncentrationen C och spektralprofilerna S för provets kemiska beståndsdelar (dvs D = CS T + E, där E är en matris som innehåller experimentfelet och den upphöjda T indikerar matristransponering).
  3. Hämta huvudkomponenterna i data för att separera C och S. Eftersom det är känt a priori att provet som diskuteras i avsnitt 1 innehåller fyra arter, nämligen DMSO, olivolja, PMMA och PS, konfigurerar programmet för att söka efter fyra arter plus en annan för att ta hänsyn till bakgrundsbruset. Om det finns ett annat prov med ett högre eller lägre antal arter, konfigurera programmet i enlighet därmed.
    OBS: Programmet gör en singulärvärdesnedbrytning av spektraldata och använder dem som de första gissningarna för det rena spektra S.
    1. Alternativt kan du mata programmet med en matris som innehåller de kända spektralspåren (t.ex. ämnenas spontana Raman-spektra).
      OBS: Med hjälp av de första uppskattningarna av de rena spektra kommer programmet att beräkna C = DS (STS) −1 och ST = (CTC) −1CTD. De nya värdena för C och S optimeras med en alternerande minstakvadratalgoritm.
  4. Eftersom SRS är en icke-negativ signal, begränsa den alternerande minsta kvadratalgoritmen för att bara leverera positiva värden.
    OBS: Den optimerade C och S gör det möjligt att konstruera en ny matris D *= CST, en datauppsättning som programmet kommer att jämföra med de ursprungliga data D. Programmet itererar automatiskt dessa steg tills skillnaden mellan D* och D är mindre än ett godtyckligt tröskelvärde som kan definieras.
  5. PlotT C och S för att erhålla kemiska bilder och de karakteristiska spektra för provets kemiska beståndsdelar.

Representative Results

Figur 3 visar exemplifierande resultat som erhållits med detta protokoll med PS, PMMA och olivolja. Denna rotation av LBO1 kommer att ändra brytningsindexet som upplevs av SHG-fältet och direkt modifiera dess fashastighet. När SHG-fältets fashastighet matchar den för den olinjära polarisationen som induceras i LBO1, kommer det icke-nästan genererade fältet och den olinjära polarisationen att vara i fas, vilket leder till intensiv SHG-strålning. Med andra ord, justering av φ vinkeln på LBO1 gör det möjligt för användaren att uppnå det perfekta fasmatchningsförhållandet för SHG. Eftersom en typ I-fasmatchande kristall används här kommer polarisationen av SHG-strålen att vara ortogonal mot den för den grundläggande strålen (figur 5B).

Figur 8 visar RIN för de optiska källorna som används i detta protokoll och skottbrusgränsen, vilket är en följd av kvantnaturen hos elektroner och fotoner som sätter en grundläggande gräns för laserbruset. Det begränsade RIN-RIN för skottbrus beräknas med Equation 5 vilket visas av Eq (3).

Equation 6 (3)

Där h är Plancks konstant och ν är den optiska frekvensen. Således ger skottbruset användbara riktlinjer för elektronikdesignen.

Figur 11A och figur 11C visar exemplariska data om balanserade och obalanserade spektra. Naturligtvis påverkar effekterna av balanserad detektion de slutliga resultaten av experimenten, nämligen de kemiska kartorna. Figur 11B och figur 11D visar sammansatta bilder under obalanserade respektive balanserade förhållanden. Att framgångsrikt implementera det beskrivna protokollet hjälper till att identifiera och lokalisera de olika kemiska beståndsdelarna i ett heterogent prov och extrahera deras karakteristiska SRS-spektra. Att utsätta hyperspektrala data i figur 12 för kemometrisk analys ger figur 13. Figur 13A visar en sammansättning av koncentrationskartorna för de olika kemiska beståndsdelarna i provet, medan figur 13B visar deras karakteristiska SRS-spektra. Observera att de data som visas i figur 13A inte bara gör det möjligt för användaren att enkelt identifiera de olika beståndsdelarna i provet utan också att utföra mer kvantitativ analys. Genom att till exempel använda koncentrationskartorna kan vi beräkna medelvärdet av den fraktionerade koncentrationen för varje kemisk art: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS och 22% olivolja.

Figure 1
Figur 1: Schematisk över bredbands-SRS-mikroskopet som används i detta protokoll. Förkortningar: PBSx = polariserande strålar; SHG = andra harmoniska generationens modul; OPO = optisk parametrisk oscillator; AOM = akustotisk modulator; SPF = kortpassfilter; M-LIA: Flerkanalig inlåsningsförstärkare; DM = dikroisk spegel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Bild 2: Spektra för den avstämbara bredbandspumpen (blå) och smalbandsbalkarna (röd) Stokes. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Brightfield-bild av det kemiskt heterogena provet. Observera att konventionell mikroskopi inte tillåter att de olika beståndsdelarna särskiljs. Skalstreck = 100 μm. Förkortningar: PS = polystyren; PMMA = polymetylmetakrylat; DMSO = dimetylsulfoxid. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Modulering av smalbandet Stokes pulser. (A) Det genomskinliga blå spåret visar den 0: e diffraktionerade strålen, medan den svarta visar motsvarande 1st ordning. (B) Optisk inställning för optimering av moduleringseffektiviteten hos den 1: a ordningens diffraktionerade stråle och finjustering av Stokes-strålens punktstorlek innan den når excitationsmålet. Förkortningar: AOM = acousto optisk modulator; fx = brännvidd på objektiv X. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Icke-linjära optiska processer som krävs för att driva OPO. Två grundläggande fotoner vid ω1 tar materialsystemet till en virtuell nivå med hög energi, varifrån materialsystemet hoppar ner till marktillståndet och avger en foton vid ωSHG. (B) SHG-experimentets schema. (C) En schematisk bild av SHG- och OPO-inställningarna. (D) Geometri för DFG-interaktionen. En ωSHG-foton delas upp i signalen (ωSignal) och idler (ωIdler) fotonerna. En förstärkning av signalstrålen uppnås genom att mata tillbaka signalfotonerna och få dem att resonera i hålrummet. (E) System för DFG-experimentet. Förkortningar: SMx = sfärisk spegel (R = 75 mm); OPO = optisk parametrisk oscillator; SHG = andra harmoniska generationens modul; DFG = generering av differensfrekvens; LBO = litiumtriborat; OC = oljekondensor; DM = dikroisk spegel; fx = brännvidd på objektiv X. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Prismakompressorns geometri.

Figure 7
Figur 7: Summafrekvensgenerering för att optimera spatiotemporal överlappning. Här fokuserade en lins pumpen och Stokes strålar på kristallen, medan ett lågpassfilter tog bort dem. (B) SFG:s intensitet mellan pump och Stokes som en funktion av tidsfördröjningen. Ställ in tidsnollan för SRS-inställningen på den position som maximerar SFG. Asymmetrin hos korskorrelationen i B beror på den tidsmässiga profilen orsakad av etalon på Stokes-strålen. Förkortningar: SFG = summafrekvensgenerering; SHG = andra harmoniska generationens modul; SRS = stimulerad Ramanspridningsspektroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: RIN-spektra. Bandet markerat med grönt visar den bästa spektralregionen för SRS-experimenten. Modulering av Stokes-strålen vid vilken frekvens som helst inom detta band garanterar att effekterna av laserbruset på SRS-signalen blir lägsta möjliga. Förkortningar: RIN = relativt intensitetsbrus; SRS = stimulerad Ramanspridningsspektroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Balkprofiler . (A) Pump, (B) Stokes och (C) pump och Stokes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: Antagen geometri för ett dispersionsgaller och en fotodiodmatrisdetektor.

Figure 11
Figur 11. Effekterna av balanserad detektering. Effekter på spektra (A, C) och kemiska bilder (B, D). Kompositerna som visas i panelerna (B) och (D) är de slutliga resultaten av experimenten (dvs. efter kemometrisk analys av hyperspektrala data. Se protokollavsnitt 4 för mer information). Skalstänger = 10 μm. Förkortning: SRS = stimulerad Raman spridningsspektroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 12
Figur 12: En representativ SRS-hyperkub förvärvad med bredbands-SRS-mikroskopi. X-y-planet lagrar koordinaterna för de skannade positionerna, medan varje vektor längs z registrerar ett SRS-spektrum. Förkortning: SRS = stimulerad Raman spridningsspektroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 13
Figur 13: Kemometrisk analys av hyperspektrala SRS-data. (B) Karakteristiska spektra för den kemiska arten. I båda panelerna, gul: olivolja, blå: DMSO, cyan: PS och orange: PMMA. Skalstreck = 20 μm (A). Förkortningar: SRS = stimulerad Raman spridningsspektroskopi; PS = polystyren; PMMA = polymetylmetakrylat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Bredbands-SRS-mikroskopi är en kraftfull bildteknik som erbjuder autentisk kemisk kontrast för att identifiera och avlägsna de kemiska beståndsdelarna i ett heterogent prov. Potentialen i detta analytiska verktyg kan vara till nytta för flera forskningsområden, allt från materialvetenskap till histopatologi. Nackdelen med bredbands-SRS-mikroskopi är det faktum att det är tekniskt krävande; experimentalisten kräver inte bara kunskap om bredbandslaserkällor utan behöver också manipulera laserpulserna för att effektivt generera SRS, en signal som i sin tur måste mätas med sofistikerade detektionsscheman. Detta dokument presenterar ett protokoll som beskriver ett arbetsflöde för att producera kemiska kartor över blandade kemiska föreningar med hjälp av ett multiplex bredbands-SRS-mikroskop. Även om det beskrivna arbetet kan vara trivialt för vissa laserfysiker och olinjära mikroskopister, kanske det inte är fallet för läsare som är intresserade av fördelarna med bredbands-SRS-mikroskopi vars vetenskapliga kunskaper ligger utanför dessa domäner. Därför syftade vi till att detaljera varje steg för att vägleda den breda publiken som är intresserad av bredbands-SRS-mikroskopi.

Det aktuella protokollet började med att visa hur man förbereder ett enkelt men spektroskopiskt rikt prov bestående av flera starka och välkända Raman-spridare. Vi diskuterade hur man får tag på de bredbandspumps- och smalbandsbalkar som krävs för att sätta upp ett SRS-mikroskop. Figur 5C visar ett schema över SHG- och OPO-inställningarna. Observera att lins f1 fokuserar den grundläggande strålen på LBO1 för att generera SHG, medan en dikroisk spegel reflekterar SHG-strålningen och överför den återstående grundläggande strålen. En andra lins f2 kolliderar SHG-strålen. Som f2 > f1 expanderas SHG-strålen med en faktor lika med f2/f1. En tredje lins f3 fokuserar den expanderade SHG-strålen på en andra typ I LBO-kristall (LBO2) skuren vid θ = 90 ° och φ = 29,0 °. Genom att pumpa LBO2 med ovannämnda SGH (520 nm) kommer strålning inom intervallet 680-910 nm att dyka upp från LBO2 genom skillnadsfrekvensgenerering (DFG), vilket ger två strålar: signalen och tomgång27 (figur 5D, E). Den senare kasseras medan den förra förstärks i OPO-hålrummet för att leverera pumppulserna som används i SRS-experimenten. Pumpen av OPO vid 520 nm, nämligen SHG-strålen, bör inte förväxlas med pumpen i SRS-experimenten (dvs. OPO: s signalstråle).

Kontrasten i SRS-mikroskopi härstammar från en olinjär signal som genereras vid mikroskopets brännpunkt, en signal som kräver att ett stort antal fotoner begränsas i provplanet vid en given tidpunkt. Denna fotonbegränsning uppnås med ett mikroskopmål med hög numerisk bländare (NA), en rad linser som också ställer in systemets rumsliga upplösning: ju högre NA, desto högre rumslig upplösning. Höga NA-mål är dock tätt packade med glas, vilket introducerar positiv GDD till pulserad strålning, ett frekvenskvitter som i slutändan breddar pulsernas tidsprofil39. Således kan GDD som införs av mikroskopmålet öka varaktigheten för bredbandspumppulserna, vilket gör den ännu längre än Stokes temporala kuvert och minskar den effektiva, tillgängliga bandbredden för Raman-signalen. Dessutom kan denna breddning också medföra en snedvridning av spektralprofilen för det uppmätta SRS-spektrumet.

I CARS framträder den spektroskopiskt relevanta signalen vid våglängder som skiljer sig från excitationsfältens. En enkel fotomultiplikatorrör eller CCD-kamera (charge-coupled device) kan användas för att integrera CARS-signalen i tid och summera tusentals pulser för att beräkna laserbruset i genomsnitt. Istället visas SRS-signalen som en svag moduleringsöverföring inbäddad i en stark och fluktuerande laserbakgrund. Eftersom denna modulering är svag kan laserbruset lätt överväldiga det, vilket minskar både bildhastigheten och känsligheten hos SRS-mikroskopet. Därför är det före avbildning absolut nödvändigt att mäta det relativa intensitetsbruset (RIN) för att avgöra om lasern är lämplig för höghastighets SRS-avbildning och för att välja moduleringsfrekvensen med det lägsta bruset. Referensnumret definieras som bruseffektspektraldensiteten [δP(f), med W2/Hz-enheter] för lasern normaliserad med den genomsnittliga optiska effekten (Equation 2)40,41. Med andra ord beskriver RIN de normaliserade laserfluktuationerna vid olika frekvenser (Eq [4]).

Equation 7 (4)

Således är RIN en parameter för SRS-systemet som bestämmer det ideala moduleringsfrekvensområdet för experimenten. Till exempel visar olivfältet i figur 8 det ideala moduleringsfrekvensområdet för SRS-avbildning. När det gäller smalbands-SRS bör användaren mäta RIN för både pump och Stokes för att välja vilken stråle som behöver moduleras för att uppnå optimal prestanda. Observera till exempel från figur 8 att Stokes-strålen har ett något högre RIN än pumpen, vilket innebär att SRG-mätningarna skulle bli bullrigare än deras SRL-motsvarigheter. När det gäller bredbands-SRS är den stråle som ska moduleras smalbandsstrålen.

Gitterets vinkeldispersion D uttrycker diffraktionsvinkeln som en funktion av våglängden och definieras som derivatan av gitterekvationen. För Littrow-konfigurationen ges vinkeldispersionen av Eq (5).

Equation 8 (5)

För att få Eq (5) antog vi α = β, löste Eq (2) för m/d och satte in resultatet i dβ/ dλ. Observera att i Littrow-konfigurationen β = sin-1(mλ/2d). Inom approximationen med liten vinkel är förändringen i position längs spektrumet fdβ ≈ dl (figur 10). Genom att infoga dβ i Eq (5) kan vi alltså beräkna den linjära dispersionen, en kvantitet med enheter av nm mm-1 med användning av Eq (6):

Equation 9 (6)

För ett diffraktionsgitter som arbetar i Littrow-konfigurationen med 1 851,85 spår/mm, d = 540 nm. Om vi använder första ordningens diffraktion av ljus vid ~ 789 nm, D = 0,0027 rad nm-1. Med en f = 750 mm lins får vi en linjär dispersion av ≈ 0,5 nm mm-1, vilket översätts till ≈ 7,8 cm-1 mm-1. Således bestämmer linsens brännvidd "densiteten" för nm per mm vid detektorplanet: Ju längre brännvidd, desto färre nm per mm erhålls, vilket ökar utrymmet mellan bredbandspumpens spektrallinjer. Omvänt, med kortare brännvidd, kommer det att finnas mer nm per mm vid detektorplanet, vilket minskar utrymmet som upptas av den dispergerade pumpen.

Balanserad detektering förbättrar bildkvaliteten och känsligheten hos bullriga inställningar. Till exempel, enligt RIN-spektra som visas i figur 8 och med tanke på typisk SRS med en amplitud på 1 x 10-5, är det obalanserade signal-brusförhållandet (SNR) ≈60. Med hjälp av balanserad detektering (dvs. nära skottbruset) är det möjligt att uppnå en SNR på ≈145. Figur 11 visar spektra och sammansatta bilder under balanserade och obalanserade förhållanden. Naturligtvis påverkar effekterna av balanserad detektion de slutliga resultaten av experimenten, nämligen de kemiska kartorna. Med stöd av dessa resultat betonar vi att balanserad detektering är en kraftfull teknik för att motverka de skadliga effekterna av laserfluktuationer på bildkvaliteten. Det är värt att nämna att balanserad detektering passar bäst för bullriga lasrar, såsom fiberoscillatorer. SRS-mikroskop som arbetar med tysta optiska ljuskällor (t.ex. solid state-lasrar) kanske inte kräver balanserad detektering.

Protokollet förklarar också ett tillvägagångssätt baserat på olinjär optik för att hitta den spatiotemporala överlappningen mellan pulserna hos dessa strålar. Vi beskrev fördelarna med att använda 1st istället för 0: e diffraktionsordningen för en AOM som den modulerade Stokes-strålen. Vidare beskrevs de skadliga effekterna av dispersion på SRS-generationens effektivitet med förslag på sätt att mildra dem via en prismakompressor. Dessutom förklarar protokollet hur man justerar prismorna och belyser tre kritiska aspekter att tänka på för optimal prestanda. Vi diskuterar inte bara relevansen av RIN för SRS-mikroskopi utan visar också hur man mäter det med en inlåsningsförstärkare och med RIN-spektrumet definierar den bästa moduleringsfrekvensen. Med ett konkret exempel förklarar detta dokument hur gitterekvationen hjälper till att utforma detekteringskedjan. Slutligen illustrerar protokollet, med verkliga SRS-data, strukturen hos SRS-hyperkuben och hur man analyserar den med ett konventionellt använt vetenskapligt programmeringsspråk.

Detta protokoll har tre mindre begränsningar. För det första består det detektionsschema som används i detta bidrag av en icke-konventionell, flerkanalig inlåsningsdetektor designad och byggd internt av Sciortino et al.26 Som visats tidigare25 kan denna detektor ersättas med en balanserad fotodiod från hyllan. Även om denna modifiering endast gäller detektorn och lämnar protokollet praktiskt taget oförändrat, med en enda fotodiod, måste man skanna varje spektralkomponent på detektorn istället för att mäta dem alla på en gång. För det andra använder detta protokoll inline balanserad detektering, vilket kräver att flera optiska element sätts in i strålbanan. Dessa optiska element ökar systemets komplexitet och leder till förluster av optisk kraft och pulsbreddning.

Inline balanserad detektering kräver också att de två pumpreplikerna passerar genom provet, en situation som kanske inte är idealisk för ljuskänsliga prover, såsom levande celler, eller för starkt birefringenta där de två pumpreplikerna kan uppleva olika optiska egenskaper, vilket avbryter den balanserade detekteringen. För det tredje förlitar sig protokollet på en hembyggd OPO, en enhet som kanske inte är lätt tillgänglig. Alternativ till bredbandsspektra som levereras av OPO är dock superkontinua från olinjära optiska fibrer eller bulkkristaller. Den senare kunde endast användas med laser med låg repetitionshastighet (upp till 5 MHz). Således, som med alla experimentella mönster, har det aktuella protokollet vissa begränsningar. De är dock minimala och äventyrar inte framgången med detta tillvägagångssätt.

Även om ett referensprov beskrivs här, kan detta protokoll framgångsrikt skilja kemiska arter i celler och djur- och växtvävnader, såsom cellulosa, lipidarter eller proteiner, hitta praktiska tillämpningar i olika biokemiska uppdrag eller som ett diagnostiskt verktyg i histopatologi. På samma sätt kan detta protokoll vara ett värdefullt verktyg inom materialvetenskap. Till exempel, efter detta protokoll, kan man förhöra den molekylära sammansättningen och koncentrationen av polymera arter42. Dessutom är denna metod kompatibel med andra olinjära mikroskopitekniker, såsom bredbandsmikroskopi baserad på pump-sond43 och heterodyn CARS44, fyrvågsblandningsprocesser som, liksom med SRS, också kräver två excitationsljusstrålar och moduleringsöverföringsmätningar. Slutligen kan en del av informationen i detta dokument tillämpas på icke-linjära avbildningstekniker som inte förlitar sig på moduleringsöverföringstekniker, men kräver justering av två eller flera pulserade laserstrålar, såsom konventionella CARS45- och SFG-mikroskop46.

Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en kraftfull metod baserad på bredbands-SRS-mikroskopi för att extrahera kemiska kartor och deras karakteristiska SRS-spektra från kemiskt heterogena blandningar, vilket ger dataset som möjliggör enkel kvantitativ dataanalys. Metodens mångsidighet och enkelhet ger också den intresserade läsaren möjlighet att anpassa den till olika olinjära tekniker.

Disclosures

G. C. förklarar engagemang i företaget, Cambridge Raman Imaging, som syftar till att kommersialisera bredband SRS-mikroskopitekniken. De andra författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

D. P. erkänner finansiering från Europeiska unionens projekt CRIMSON enligt bidragsavtal nr 101016923 och Regione Lombardia-projektet NEWMED enligt bidragsavtal nr. POR FESR 2014-2020. G. C. erkänner finansiering från Europeiska unionens projekt Graphene Core3 enligt bidragsavtal nummer 881603. G. C. erkänner också finansiering från King Abdullah University of Science and Technology, Grant Award Number: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collection objective Nikon CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon Oil immersion objective
Coverslips Thermo Fisher 043211-KJ Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line Physik Instrumente (PI) M-406.6PD Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO Merck D8418-500ML Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon SLS Optics Ltd Custom made Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective Nikon CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon Water immersion objective
Grating LightSmyth T-1850-800s Series High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser Coherent Custom made Fidelity, HP
λ/2 Thorlabs SAHWP05M-1700 Mounted superachromatic half-wave plate
PBS Thorlabs CM5-PBS203/M 16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads Merck MFCD00198073 Micro particles based on polymethacrylate
Prisms Crisel 320-8218 LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads Merck 72986-10ML-F Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal Dr. Sztatecsny GmbH Custom made  thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 - 1,100 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stewart, S., Priore, R. J., Nelson, M. P., Treado, P. J. Raman Imaging. Annual Review of Analytical Chemistry. 5 (1), 337-360 (2012).
  2. Smekal, A. Zur quantentheorie der dispersion. Die Naturwissenschaften. 11 (43), 873-875 (1923).
  3. Raman, C. V., Krishnan, K. S. A new type of secondary radiation. Nature. 121 (3048), 501-502 (1928).
  4. Vanna, R., et al. Vibrational imaging for label-free cancer diagnosis and classification. La Rivista del Nuovo Cimento. 45, 107-187 (2021).
  5. Eckhardt, G., et al. Stimulated Raman scattering from organic liquids. Physical Review Letters. 9 (11), 455-457 (1962).
  6. Hellwarth, R. W. Theory of stimulated Raman scattering. Physical Review. 130 (5), 1850-1852 (1963).
  7. Maker, P. D., Terhune, R. W. Study of optical effects due to an induced polarization third order in the electric field strength. Physical Review. 137 (3), 801-818 (1965).
  8. Bloembergen, N. The stimulated Raman effect. American Journal of Physics. 35 (11), 989-1023 (1967).
  9. Levenson, M. D., Flytzanis, C., Bloembergen, N. Interference of resonant and nonresonant three-wave mixing in diamond. Physical Review B. 6 (10), 3962-3965 (1972).
  10. Polli, D., Kumar, V., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G. Broadband coherent Raman scattering microscopy. Laser & Photonics Reviews. 12 (9), 1800020 (2018).
  11. Rigneault, H., Berto, P. Tutorial: Coherent Raman light matter interaction processes. APL Photonics. 3 (9), 091101 (2018).
  12. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  13. Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), (2015).
  14. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-stokes raman scattering. Physical Review Letters. 82 (20), 4142-4145 (1999).
  15. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  16. Liu, Y., Lee, Y. J., Cicerone, M. T. Broadband CARS spectral phase retrieval using a time-domain Kramers-Kronig transform. Optics Letters. 34 (9), 1363 (2009).
  17. Valensise, C. M., et al. Removing non-resonant background from CARS spectra via deep learning. APL Photonics. 5 (6), 061305 (2020).
  18. Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent Raman scattering microscopy. , CRC press. Boca Raton. (2012).
  19. Slipchenko, M. N., Oglesbee, R. A., Zhang, D., Wu, W., Cheng, J. X. Heterodyne detected nonlinear optical imaging in a lock-in free manner. Journal of Biophotonics. 5 (10), 801-807 (2012).
  20. Blume, R. J. Boxcar'' integrator with long holding times. Review of Scientific Instruments. 32 (9), 1016-1018 (1961).
  21. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  22. Sarri, B., et al. Stimulated Raman histology: one to one comparison with standard hematoxylin and eosin staining. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5378 (2019).
  23. Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (37), 11624-11629 (2015).
  24. De la Cadena, A., et al. Broadband stimulated Raman imaging based on multi-channel lock-in detection for spectral histopathology. APL Photonics. 7 (7), (2022).
  25. Dela Cadena, A., Valensise, C. M., Marangoni, M., Cerullo, G., Polli, D. Broadband stimulated Raman scattering microscopy with wavelength-scanning detection. Journal of Raman Spectroscopy. 51 (10), 1951-1959 (2020).
  26. Sciortino, G., et al. Four-channel differential lock-in amplifiers with autobalancing network for stimulated Raman spectroscopy. IEEE Journal of Solid-State Circuits. 56 (6), 1859-1870 (2021).
  27. Coluccelli, N., et al. Tunable 30 fs light pulses at 1 W power level from a Yb-pumped optical parametric oscillator. Optics Letters. 42 (21), 4545 (2017).
  28. Monmayrant, A., Weber, S., Chatel, B. A newcomer's guide to ultrashort pulse shaping and characterization. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 43 (10), 103001 (2010).
  29. Fork, R. L., Martinez, O. E., Gordon, J. P. Negative dispersion using pairs of prisms. Optics Letters. 9 (5), 150 (1984).
  30. Crisafi, F., et al. In-line balanced detection stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 10475 (2017).
  31. Alem, M. Noise spectral density measured with lock-in amplifiers. Zurich Instruments Company Blog. , https://www.zhinst.com/europe/en/blogs/noise-spectral-density-measured-lock-amplifiers (2021).
  32. Palmer, C., Loewen, E. G. Diffraction grating handbook. , (2005).
  33. Tauler, R., de Juan, A., Jaumot, J. Multivariate curve resolution homepage. , Available from: https://mcrals.wordpress.com/download/mcr-als-2-0-toolbox/ (2021).
  34. Tauler, R. Multivariate curve resolution applied to second order data. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).
  35. de Juan, A., Jaumot, J., Tauler, R. Multivariate Curve Resolution (MCR). Solving the mixture analysis problem. Analytical Methods. 6 (14), 4964-4976 (2014).
  36. Zhang, D., et al. Quantitative vibrational imaging by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy and multivariate curve resolution analysis. Analytical Chemistry. 85 (1), 98-106 (2013).
  37. Chitra Ragupathy, I., Schweikhard, V., Zumbusch, A. Multivariate analysis of hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy images. Journal of Raman Spectroscopy. 52 (9), 1630-1642 (2021).
  38. Brown, S. D., Tauler, R., Walczak, B. Comprehensive Chemometrics: Chemical and Biochemical Data Analysis. , Elsevier. (2020).
  39. Guild, J. B., Xu, C., Webb, W. W. Measurement of group delay dispersion of high numerical aperture objective lenses using two-photon excited fluorescence. Applied Optics. 36 (1), 397 (1997).
  40. Paschotta, R. RP Photonics Encyclopedia. Article on "Relative Intensity Noise.". , Available from: https://www.rp-photonics.com/relative_intensity_noise.html (2021).
  41. Audier, X., Heuke, S., Volz, P., Rimke, I., Rigneault, H. Noise in stimulated Raman scattering measurement: From basics to practice. APL Photonics. 5 (1), 011101 (2020).
  42. Xu, S., Camp, C. H., Lee, Y. J. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy for polymers. Journal of Polymer Science. , (2021).
  43. Davydova, D., de al Cadena, A., Akimov, D., Dietzek, B. Transient absorption microscopy: advances in chemical imaging of photoinduced dynamics. Laser & Photonics Reviews. 10 (1), 62-81 (2016).
  44. Potma, E. O., Evans, C. L., Xie, X. S. Heterodyne coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) imaging. Optics Letters. 31 (2), 241 (2006).
  45. Cheng, J. X., Volkmer, A., Xie, X. S. Theoretical and experimental characterization of coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Journal of the Optical Society of America B. 19 (6), 1363 (2002).
  46. Raghunathan, V., Han, Y., Korth, O., Ge, N. H., Potma, E. O. Rapid vibrational imaging with sum frequency generation microscopy. Optics Letters. 36 (19), 3891 (2011).

Tags

Teknik utgåva 185 Ramanspridning stimulerad Ramanspridning olinjär mikroskopi hyperspektral bredband vibrationsavbildning
Multiplex kemisk avbildning baserad på bredbandsstimulerad Raman-spridningsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De la Cadena, A., Vernuccio, F.,… More

De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter