Summary
Dit protocol beschrijft rectale organoïde morfologie analyse (ROMA), een nieuwe diagnostische test voor cystic fibrosis (CF). Morfologische kenmerken, namelijk de rondheid (circulariteitsindex, CI) en de aanwezigheid van een lumen (intensiteitsverhouding, IR), zijn een maat voor de CFTR-functie. Analyse van 189 proefpersonen toonde perfecte discriminatie tussen CF en niet-CF.
Abstract
De diagnose van cystische fibrose (CF) is niet altijd eenvoudig, vooral wanneer de zweetchlorideconcentratie gemiddeld is en/of minder dan twee ziekteveroorzakende CFTR-mutaties kunnen worden geïdentificeerd. Fysiologische CFTR-assays (nasale potentiaalverschil, intestinale stroommeting) zijn opgenomen in het diagnostische algoritme, maar zijn niet altijd direct beschikbaar of haalbaar (bijvoorbeeld bij zuigelingen). Rectale organoïden zijn 3D-structuren die groeien uit stamcellen geïsoleerd uit crypten van een rectale biopsie wanneer ze onder specifieke omstandigheden worden gekweekt. Organoïden van niet-CF-proefpersonen hebben een ronde vorm en een met vloeistof gevuld lumen, omdat CFTR-gemedieerd chloridetransport water in het lumen drijft. Organoïden met een defecte CFTR-functie zwellen niet op, behouden een onregelmatige vorm en hebben geen zichtbaar lumen. Verschillen in morfologie tussen CF- en niet-CF-organoïden worden gekwantificeerd in de 'Rectal Organoid Morphology Analysis' (ROMA) als een nieuwe CFTR fysiologische assay. Voor de ROMA-test worden organoïden verguld in platen met 96 putten, gekleurd met calceïne en afgebeeld in een confocale microscoop. Morfologische verschillen worden gekwantificeerd met behulp van twee indexen: de circulariteitsindex (CI) kwantificeert de rondheid van organoïden en de intensiteitsverhouding (IR) is een maat voor de aanwezigheid van een centraal lumen. Niet-CF-organoïden hebben een hoge CI en lage IR in vergelijking met CF-organoïden. ROMA-indexen onderscheidden perfect 167 proefpersonen met CF van 22 proefpersonen zonder CF, waardoor ROMA een aantrekkelijke fysiologische CFTR-test was om te helpen bij CF-diagnose. Rectale biopsieën kunnen routinematig worden uitgevoerd op alle leeftijden in de meeste ziekenhuizen en weefsel kan worden verzonden naar een centraal laboratorium voor organoïde cultuur en ROMA. In de toekomst kan ROMA ook worden toegepast om de werkzaamheid van CFTR-modulatoren in vitro te testen. Het doel van dit rapport is om de methoden die voor ROMA worden gebruikt volledig uit te leggen, om replicatie in andere laboratoria mogelijk te maken.
Introduction
Cystic fibrosis (CF) is een autosomaal recessieve ziekte veroorzaakt door mutaties in het CF transmembraan geleidingsregulator (CFTR) gen. Het CFTR-eiwit is een chloride- en bicarbonaatkanaal, dat zorgt voor hydratatie van verschillende epithelia1. CF is een ziekte met een hoge belasting, die het leven verkort, multisysteem, die zich voornamelijk manifesteert als een luchtwegaandoening, maar ook het maagdarmkanaal, de alvleesklier, de lever en het voortplantingskanaalaantast 2.
Ziekteverwekkende CFTR-mutaties leiden tot een afname van de hoeveelheid of functie van CFTR, wat op zijn beurt slijmuitdroging veroorzaakt. Meer dan 2.000 varianten in het CFTR-gen zijn beschreven3, waarvan er slechts 466 grondig zijn gekarakteriseerd4.
Een diagnose van CF kan worden gesteld wanneer de zweetchlorideconcentratie (SCC) boven de drempel van 60 mmol/l ligt of wanneer twee ziekteverwekkende CFTR-mutaties (volgens de CFTR2-database) worden geïdentificeerd 4,5. Bij proefpersonen met slechts gemiddeld verhoogde (30-60 mmol/L) SCC, die voorkomt in ongeveer 4%-5% van de zweettests6, en CFTR-mutaties met variërende of onbekende klinische gevolgen, kan de diagnose niet worden bevestigd of uitgesloten, zelfs niet wanneer ze CF-compatibele symptomen of een positieve neonatale screeningstest hebben. Voor deze gevallen zijn tweedelijns fysiologische CFTR-assays (nasale potentiaalverschil (NPD) en intestinale stroommetingen (ICM)) opgenomen in het diagnostische algoritme. Deze tests zijn niet direct beschikbaar in de meeste centra en ook niet haalbaar op alle leeftijden, vooral bij baby's5.
Rectale organoïden zijn 3D-structuren gekweekt uit Lgr5 (+) volwassen darmstamcellen uit darmcrypten verkregen door rectale biopsie7. Organoïden worden steeds vaker gebruikt in biomedisch onderzoek, zoals het testen van modulatorbehandeling in CF8. Een levensvatbare biopsie kan worden verkregen door zuig- of tangbiopsie, een procedure die slechts minimaal ongemak veroorzaakt en zelfs bij zuigelingen veilig is, met lage complicatiepercentages9. De crypten geïsoleerd uit de rectale biopsieën zijn verrijkt in stamcellen en onder specifieke kweekomstandigheden organiseren deze zichzelf in rectale organoïden. De morfologie van deze organoïden wordt bepaald door de expressie en functie van CFTR, gelegen aan het apicale membraan van epitheelcellen. Functionele CFTR zorgt ervoor dat chloride en water het organoïde lumen kunnen binnendringen, waardoor zwelling van niet-CF-organoïden wordt veroorzaakt. CF-organoïden zwellen niet op en hebben geen zichtbaar lumen10,11.
Rectale organoïde morfologie analyse (ROMA) maakt de discriminatie tussen CF en niet-CF organoïden mogelijk op basis van deze verschillen in organoïde morfologie. Niet-CF-organoïden zijn ronder en hebben een zichtbaar lumen, terwijl het tegenovergestelde geldt voor CF-organoïden. Voor deze test worden patiëntspecifieke organoïden geplateerd in 32 putten van een 96-well plaat. Na 1 dag groeien worden de organoïden gekleurd met calceïnegroen en afgebeeld in een confocale microscoop. De niet-CF-organoïden vertonen een meer cirkelvormige vorm en een minder fluorescerend centraal deel, omdat het lumen vloeistof bevat en calceïne alleen cellen bevlekt. Deze verschillen in morfologie worden gekwantificeerd met behulp van twee ROMA-indexen: de circulariteitsindex (CI) kwantificeert de rondheid van organoïden, terwijl de intensiteitsverhouding (IR) een maat is voor de aan- of afwezigheid van een centraal lumen. In dit rapport beschrijven we in detail het protocol om deze discriminerende indexen te verkrijgen, om replicatie van de techniek mogelijk te maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor alle ingrepen met menselijk weefsel werd goedkeuring verkregen door de Ethische Commissie Onderzoek UZ/KU Leuven (EC-onderzoek). Al het onderzoek werd uitgevoerd met geïnformeerde toestemming en/of instemming van ouders, vertegenwoordigers en/of patiënten.
OPMERKING: Alle procedures met rectale biopsieën en organoïden moeten in een laminaire stroom worden uitgevoerd om de onderzoeker te beschermen tegen biologisch gevaar en om het risico op besmetting van de culturen te minimaliseren. Zoals voor elke laboratoriumprocedure, moeten onderzoekers te allen tijde laboratoriumjassen, handschoenen en veiligheidsbrillen dragen om monsters te manipuleren.
1. Rectale biopsie, isolatie van volwassen stamcellen uit crypten en organoïde cultuur
- Volg voor dit eerste deel van het protocol, inclusief mediaproductie en -gebruik, organoïde cultuur, splitsen, uitbreiden en bevriezen voor biobanking, de twee eerder gepubliceerde protocollen 8,12.
- Kortom, de volgende stappen moeten worden genomen:
- Neem drie tot vier rectale biopten met een tang of zuigapparaat en verzamel in een steriele container (bijv. 1,5 ml microcentrifugebuis) met het Ad-DF +++ medium zoals beschreven in het hierboven genoemde protocol.
- Transport biopten naar een centraal laboratorium op ijs of bij 4 °C. Transport naar andere centra is mogelijk en de kwaliteit wordt niet significant beïnvloed, zelfs niet wanneer het transport tot 48 uur duurt. Als het transport naar verwachting meer dan 6 uur zal duren, gebruik dan een conische buis van 15 ml met 6 ml Ad-DF +++ medium in plaats van een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Was de biopsieën in koude PBS totdat het supernatant helder is om het puin en niet-epitheelweefsel zoals vetweefsel te verwijderen.
- Incubeer de biopten met EDTA (eindconcentratie 10 mM) om de crypten los te maken. Plaats de crypten in een keldermembraanmatrix. Voeg breedspectrumantibiotica (gentamicine 50 μg / ml en vancomycine 50 μg / ml) toe aan het medium in de eerste week van het kweken om bacteriële besmetting te voorkomen.
- Wanneer de crypten zijn gesloten en verspreid zijn, voer dan mechanische splitsing uit, meestal na 7 dagen.
- Splits de resulterende organoïden ongeveer elke 7 dagen. Op deze manier breidt u de cultuur uit, bevriest u back-upmonsters in een biobank of gebruikt u de organoïden voor testen.
2. Organoïde beplating voor ROMA (dag 1)
- De organoïden mechanisch splitsen voor beplating
- Verzamel organoïden uit drie goed gekweekte putten uit een 24-wellsplaat door twee keer te wassen met koud Ad-DF +++ medium, verzamel ze in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en beoordeel ze onder de microscoop12.
- Zorg ervoor dat organoïden levensvatbaar en van hoge kwaliteit zijn, wat meestal kan worden bereikt na 5-7 dagen groei nadat ze eerder zijn gesplitst (figuur 1).
- De organoïden mechanisch splitsen volgens het eerder genoemde protocol 8,12. Herhaal dit totdat de meerderheid van de organoïden, zoals beoordeeld met behulp van de brightfield microscoop, klein genoeg zijn in vergelijking met de eerste waarneming.
- Verzamel de kleinere organoïden, meestal overeenkomend met de verzameling van ongeveer de bovenste 4/5 van de organoïde-mediumoplossing in een nieuwe microcentrifugebuis, omdat grote organoïden door de zwaartekracht naar de bodem van de buis zinken en kleine organoïden in het bovenste deel van de middelgrote kolom blijven hangen.
- Centrifugeer het monster van kleinere organoïden op 0,3 x 1000 g gedurende 2 minuten en gooi het medium weg.
- Verdun de pellet van kleinere organoïden in 130 μL van 40%-50% keldermembraanmatrix (verdund met Ad-DF+++ medium12).
- Resuspendeer goed met behulp van een 200 μL micropipette.
- Plaat de organoïden in een 96-well plaat
- Met behulp van een pipet van 20 μL, plaat organoïden in 32 putten van een voorverwarmde 96-well plaat. Zorg ervoor dat elke put één druppel van 4 μL bevat van de organoïde-matrixoplossing die in de vorige stap is geproduceerd.
- De organoïden in de oplossing hebben de neiging om een pellet te vormen aan de onderkant van de buis als gevolg van zwaartekrachtafhankelijke neerwaartse verplaatsing. Om dit te voorkomen en uniforme beplating te garanderen, resuspenseert u de organoïde-matrixoplossing regelmatig met behulp van een micropipette van 200 μL (bijvoorbeeld elke keer na het plateren van vier tot acht putten).
- Plaats elke druppel in het midden van de put om te voorkomen dat de druppel naar de randen van de put loopt, wat de beeldkwaliteit later zou verminderen.
- Streef naar ongeveer 30 organoïden per put (minimaal 15, maximaal 90) zonder overlappende organoïden.
- Houd er rekening mee dat deze organoïden 's nachts moeten worden geïncubeerd en gedurende deze tijd enigszins zullen groeien en mogelijk overlappen als de platingdichtheid te hoog is.
- Controleer de platingdichtheid met behulp van een brightfield-microscoop met een 5x vergrotingsobjectief na het beplateren van de eerste een of twee putten.
- Als de beplatingsdichtheid te hoog is, verdunt u de organoïde matrixoplossing stapsgewijs met de toevoeging van de keldermembraanmatrix totdat de gewenste beplatingsdichtheid is bereikt (figuur 2).
- Tik na het plateren voorzichtig op de plaat op een plat oppervlak om ervoor te zorgen dat de meeste organoïden zich in hetzelfde brandpuntsvlak bevinden.
- Incubeer de plaat
- Incubeer de 96-well plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 8-10 minuten om gelatatie van de keldermembraanmatrix mogelijk te maken.
- Voeg 50 μL humaan colon organoïde medium +/+12 toe aan elke put en incubeer een nacht gedurende 16-24 uur.
- Voeg geen forskoline of CFTR modulatoren toe, zodat de organoïden groeien onder basale omstandigheden.
3. Organoïde beeldvorming met behulp van confocale microscopie (dag 2)
- Kleur de organoïden met calceïnegroen
- Bereid een 1 mM stamoplossing van calceïnegroen door 50 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen aan één injectieflacon met 50 μg calceïnegroen.
- Bereid een werkoplossing van calceïnegroen door 1,2 μL van de stamoplossing toe te voegen aan 200 μL Ad-DF+++ (concentratie 6 μM).
- Voeg 5 μL van dit calceïnemengsel toe aan elk putje van de 96-wellsplaat waarin organoïden werden geplateerd (uiteindelijke calceïneconcentratie 0,6 μM). Raak de matrixdruppel in de put niet aan en ontwricht deze niet bij het uitvoeren van deze stap.
- Draai en kantel de plaat een paar keer met het deksel erop om een homogene verdeling van het calceïnegroen in de hele put te garanderen.
- Incubeer de plaat opnieuw gedurende 15-30 minuten bij 37 °C en 5% CO2 om kleuring van alle organoïden in de putten te garanderen.
- Breng de plaat over naar de confocale microscoop
- Breng de plaat over naar de confocale microscoop met een geautomatiseerd podium en geïntegreerde incubator. Zorg ervoor dat de plaat goed is bevestigd in de plaathouder.
- Incubatie bij 37 °C en 5% CO2 is optioneel maar niet noodzakelijk, gezien de korte duur (ongeveer 10 min) van het beeldvormingsproces.
- Focus op de organoïden (figuur 3)
- Bepaal met behulp van de confocale microscoop handmatig de optimale x/y-positie en focus (z-positie) van de organoïden in elke put en sla deze posities op in de beeldvormingssoftware.
- De beste focus impliceert een zo scherp mogelijke afbakening van de organoïden en visualisatie van een zo groot mogelijk deel van de organoïde druppel. Als de verdeling van de vlek niet voldoende is, herhaalt u stap 3.1.4 en 3.1.5 (incubeer bijvoorbeeld gedurende 5-10 minuten extra).
- Gebruik live-cell imaging-instellingen met emissie bij 488 nm en excitatie bij 515 nm (specifiek voor visualisatie van calceïnefluorescentie) en een 5x LD-vergrotingsdoelstelling.
- Verkrijg organoïde foto's van de 32 putten met de confocale microscoop (figuur 3 en figuur 4).
- Maak afbeeldingen op een unidirectionele manier met een resolutie van 1024 pixels x 1024 pixels (pixelgrootte 2,5 μm x 2,5 μm) en diepte van 16 bits.
- Kies de laserintensiteit en master gain voor een optimale visualisatie van morfologische verschillen tussen CF- en niet-CF-organoïden (bijv. Discriminatie tussen een niet-gekleurd met water gevuld centraal lumen (indien aanwezig) en een gekleurde celrand).
OPMERKING: Organoïden worden niet correct afgebakend wanneer de master gain en dus het fluorescentiesignaal te laag zijn; het te hoog instellen van de master gain zal resulteren in beelden met organoïden met een homogene zeer hoge signaalintensiteit, waardoor beeldvorming van meer subtiele morfologische verschillen wordt voorkomen (figuur 2). - Sla één afbeelding per put op voor alle 32 putten in het microscoopformaat en exporteer ze als TIFF-bestanden.
4. Beeldanalyse (figuur 5)
- Laad de TIFF-bestanden in de beeldanalysesoftware.
- Voer de eerste kwaliteitscontrole uit op basis van door de operator bepaalde exclusiecriteria (figuur 2): veel gedifferentieerde of dode structuren of puin, ontoereikende platingdichtheid, te veel (bijv. overlappende) of te weinig organoïden en onvoldoende fluorescentieverdeling (organoïden niet duidelijk afgebakend, achtergrondsignaal te hoog).
OPMERKING: Deze stap kan ook worden uitgevoerd voordat u afbeeldingen exporteert als TIFF-bestanden in stap 3.4. - Afbeeldingen voorbereiden voor analyse
- Kalibreer beelden, zodat 1 pixel overeenkomt met 2,5 μm x 2,5 μm.
- Eén netwerkgegevens (. ND) bestand van alle 32 foto's voor elke organoïde cultuur, waardoor gelijktijdige analyse van alle 32 foto's per onderwerp mogelijk is.
- Baken de organoïden af
- Structuren afbakenen met behulp van een lagere intensiteitsdrempel van 4.500 en een bovengrens van 65.535 (Gladde en schone functies uit; Fill Holes functie aan; Aparte functie bij x3).
OPMERKING: Dit bakent fluorescerende structuren af, met vulgaten inclusief het lumen in de afgebakende structuur indien aanwezig.
- Structuren afbakenen met behulp van een lagere intensiteitsdrempel van 4.500 en een bovengrens van 65.535 (Gladde en schone functies uit; Fill Holes functie aan; Aparte functie bij x3).
- Tel de organoïden
- Selecteer alle structuren ≥ 40 μm.
- Klik op de knop ND-meting bijwerken (elke keer dat een meting nodig is); de getelde organoïden worden genummerd.
OPMERKING: Dit is gelijk aan het totale aantal organoïden in de 32 putten, terwijl klein puin, zoals dode cellen, is uitgesloten.
- Meet intensiteit en circulariteit voor de berekening van de indexen
- Selecteer alle structuren ≥60 μm en tel.
OPMERKING: Dit telt de organoïden die groot genoeg zijn om morfologie te vertonen die typisch is voor CF of niet-CF. Organoïden >40 μm en <60 μm zijn klein en dicht, zowel bij niet-CF als bij CF. - Verwijder alle structuren die de randen van de afbeelding raken. Doe dit om organoïden te verwijderen die niet volledig zichtbaar zijn, omdat hun morfologie niet nauwkeurig kan worden gekwantificeerd.
- Erodeer 1 pixel (= 2,5 μm) van de rand van elke ≥60 μm structuur. Dit verwijdert de halo van diffuse calceïnefluorescentie rond de organoïden.
- Meet de gemiddelde intensiteit van elke structuur. Op deze manier wordt de gemiddelde fluorescentie van de organoïden gemeten.
- Selecteer alle structuren ≥ 60 μm opnieuw en verwijder alle structuren die de randen raken.
- Erodeer 10 pixels (= 25 μm) van de rand van elke ≥60 μm structuur.
OPMERKING: In niet-CF-organoïden erodeert dit de celrand en laat alleen het lumen achter. Bij CF-organoïden erodeert dit het buitenste deel van de organoïde, dat ongeveer dezelfde fluorescentie heeft als het binnenste deel dat overblijft. - Meet de gemiddelde intensiteit van elke geërodeerde structuur. Op deze manier wordt de gemiddelde fluorescentie van het centrale deel van de organoïden gemeten.
- Meet de circulariteit van elke structuur. Dit komt overeen met de gemiddelde circulariteit van de organoïden.
- Selecteer alle structuren ≥60 μm en tel.
- Voer de tweede kwaliteitscontrole uit: uitsluitingscriteria bepaald door de software. Sluit de reeks afbeeldingen uit wanneer minder dan 50% van de organoïden (gedefinieerd als structuren ≥40 μm) ≥ 60 μm zijn, omdat voldoende organoïden groot genoeg moeten zijn om morfologie te vertonen die typisch is voor CF of niet-CF. Sluit ook uit wanneer <500 of >3.000 organoïden (gedefinieerd als structuren ≥40 μm) aanwezig zijn in de 32 putten.
5. Meet de indices in de beeldverwerkingssoftware (figuur 6)
- Meet de circulariteitsindex (CI).
OPMERKING: Dit komt overeen met de gemiddelde circulariteit gemeten in stap 4.6, de gemiddelde circulariteit van alle organoïden in alle 32 putten. CI kwantificeert de rondheid van de organoïden, gedefinieerd als
, die lager is in CF dan in niet-CF-organoïden - Meet de intensiteitsverhouding (IR)
- Bereken de IR door het gemiddelde van de intensiteitsmeting na erodatie van 25 μm van de rand van elke ≥60 μm-structuur te delen door het gemiddelde van de intensiteitsmeting na erodatie van 2,5 μm van de rand van elke ≥60 μm structuur.
OPMERKING: IR meet de aan- of afwezigheid van een centraal lumen. IR is gelijk aan
, en is hoger in CF dan in niet-CF organoïden.
- Bereken de IR door het gemiddelde van de intensiteitsmeting na erodatie van 25 μm van de rand van elke ≥60 μm-structuur te delen door het gemiddelde van de intensiteitsmeting na erodatie van 2,5 μm van de rand van elke ≥60 μm structuur.
- Vereenvoudig het analyseproces
- Bereid een standaardwerkblad voor met behulp van spreadsheetsoftware om deze indexen automatisch te berekenen bij het kopiëren van de gegevens (figuur 7).
- De IR berekenen:
- Voer de intensiteitsmeting uit na het eroderen van 2,5 μm vanaf de rand van elke ≥60 μm structuur. Gebruik het gemiddelde voor de berekening (noemer).
- Voer de intensiteitsmeting uit na het eroderen van 25 μm vanaf de rand van elke ≥60 μm structuur. Gebruik het gemiddelde voor de berekening (teller).
- Om het CI te berekenen, neemt u de circulariteit van alle organoïden in alle putten. Het gemiddelde komt overeen met het CI.
OPMERKING: Wanneer analyse van grote batches afbeeldingen vereist is, kan het beeldanalyseproces zoals beschreven in sectie 4 semi-geautomatiseerd zijn, beginnend met de gekalibreerde ND-bestanden en het uitvoeren van een macro met alle stappen gecombineerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Organoïden van 212 proefpersonen werden verzameld tijdens routinematige klinische bezoeken. Er traden geen bijwerkingen op tijdens of na de rectale biopsieprocedure. Organoïden werden in beeld gebracht door één onderzoeker die blind was voor subjectkenmerken zoals genotype en klinische informatie. Vanwege beelden van lage kwaliteit werden 23 onderwerpen uitgesloten. Voorbeelden van succesvolle en mislukte organoïde culturen en beeldverwerving zijn te zien in figuur 2.
Organoïden van 167 proefpersonen met CF en twee ziekteverwekkende CFTR-mutaties (zoals gedefinieerd door de CFTR2-database4) en 22 niet-CF-proefpersonen werden geanalyseerd. De gemiddelde hoeveelheid organoïden per cultuur was 1.519 (ongeveer 40-50 organoïden per put). De gemiddelde hoeveelheid organoïden per cultuur die voor analyse werd opgenomen, was 77% (het aantal structuren ≥60 μm gedeeld door het aantal structuren ≥40 μm, overeenkomend met de fractie organoïden die groot genoeg zijn om typische CF- of niet-CF-morfologie weer te geven).
De IR en CI maakten onderscheid (p < 0,001) tussen organoïden van proefpersonen met en zonder CF (tabel 1). Met lineaire discriminante analyse werd perfecte discriminatie (AUC = 1) verkregen tussen CF en niet-CF, niet alleen bij gebruik van gegevens van alle 32 putten (figuur 8), maar ook wanneer acht putten willekeurig werden gekozen voor elke cultuur (figuur 9).
Figuur 10 toont histogrammen die de verdeling van waarden voor circulariteit, de intensiteit van het centrale deel van de organoïde en de intensiteit van de hele organoïde tonen voor vier illustratieve culturen (twee CF, twee niet-CF).
Figuur 1: Afbeeldingen van goed gekweekte en levensvatbare organoïden. (A) Organoïden van een persoon zonder CF en (B) organoïden van een persoon met CF. Beide culturen werden gedurende 7 dagen na de vorige splitsing gekweekt. Beelden werden gemaakt met behulp van een brightfield microscoop met een 5x objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustratie van organoïde beeldvorming in de confocale microscoop. (A) Goede kwaliteit CF organoïden; B) niet-CF-organoïden van goede kwaliteit; C) dichtheid van de beplating te laag: niet genoeg organoïden voor representatieve beeldvorming; D) dichtheid van de beplating te hoog: overlapping van organoïden voorkomt adequate calceïnekleuring en beoordeling van morfologie; (E) de intensiteit te laag als gevolg van een probleem met calceïnekleuring of de master gain-instelling die te laag is; (F) intensiteit te hoog omdat de master gain-instelling te hoog is: kleine lumens kunnen worden gemaskeerd door het overbelichte fluorescentiesignaal; (G) dode en gebarsten organoïden, waarbij afzonderlijke cellen te zien zijn en morfologie niet meer kan worden beoordeeld; (H) gedifferentieerde organoïden waarbij de stamcelstatus verloren gaat, die zich voordoen als dikke structuren, vaak met hoge fluorescentiesignalen in het midden van de organoïde structuren, die geen typische CF- of niet-CF-morfologie weerspiegelen; I) het achtergrondsignaal te hoog, hetzij omdat calceïnekleuring te lang geleden is uitgevoerd met diffusie naar de achtergrond, hetzij omdat de master gain-instelling te hoog is; (J) onvoldoende mechanische splitsing van organoïden, waardoor ze te groot blijven voor de test, niet goed kleuren en de CF- of niet-CF-morfologie niet adequaat weerspiegelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Focussen op organoïden en het verkrijgen van foto's. (A) Kies het tabblad Acquisitie . Klik op de live knop hieronder voor real-time beeldvorming. (B) Gebruik live cell imaging instellingen met emissie bij 488 nm. (C) Afbeelding met een resolutie van 1024 pixels x 1024 pixels en een diepte van 16 bits per pixel. Kies de unidirectionele beeldvormingsparameter. (D) Pas de masterversterking aan voor de optimale intensiteit van fluorescentie om de beeldvorming van organoïde kenmerken zoals vorm en aan- of afwezigheid van een lumen te optimaliseren. (E) Sla afzonderlijke posities (x, y en z) op voor elk van de 32 putten per organoïde cultuur. (F) Klik op de knop Experiment starten om het vooraf gedefinieerde protocol uit te voeren en afbeeldingen te verkrijgen volgens de gekozen parameters. (G) Afbeeldingen kunnen worden opgeslagen na voltooiing, of een autosave kan worden ingesteld met de knop Automatisch opslaan . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Afbeeldingen exporteren voor analyse. (A) Kies het tabblad Verwerking en klik op de knop Batch om afbeeldingen van meerdere organoïde culturen in één procedure te exporteren. (B) Klik op de knop Toevoegen en selecteer de opgeslagen afbeeldingen die nodig zijn voor analyse. (C) Selecteer afbeeldingsexport als methode. (D) Exporteer afbeeldingen als TIFF-bestanden, converteer niet naar 8 bits en comprimeer of wijzig het formaat niet. Exporteer originele gegevens zonder in te branden afbeeldingen. Selecteer de 32 putten van de 96-well plaat met de scèneparameter. Niet opnieuw betegelen. (E) Klik op de knop Toepassen om uit te pakken met behulp van de gekozen parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Analyse van organoïde afbeeldingen in de beeldvormingssoftware. (A) Klik met de rechtermuisknop op de grijze balk boven het resultatengedeelte (rood sterretje) om parameters voor objectmeting in te stellen. Voeg circulariteit en gemiddelde intensiteit toe. (B) Klik op Bestand > Importeren / exporteren > Maak ND-bestand van bestandsreeks om de TIFF-bestanden voor één cultuur in één ND-bestand te combineren. (C) Selecteer het gewenste bestand en bevestig; 32 foto's worden gecombineerd (rood sterretje). (D) Klik op Herkalibratie > Document opnieuw kalibreren. (E) Klik op Pixelgrootte in het pop-upvenster. (F) Invoer 2,5 μm als de grootte van 1 pixel. (G) Het beeld wordt nu opnieuw gekalibreerd naar micrometers in plaats van pixels (rood sterretje). (H) Klik op Binair > drempel definiëren. (I) Grootteselectie kan worden uitgevoerd in het pop-upvenster. De minimale grootte is 40 μm voor organoïdentellingen en 60 μm voor organoïde morfologieanalyse. Schakel altijd de functie Glad en schoon uit, schakel de functie Gaten vullen in en voer Separate x3 in. Toepassen op alle frames. (J) De software toont de afbakening van de gedefinieerde structuren. Klik op de knop ND-meting bijwerken om de gekozen parameters uit stap A als uitvoer te analyseren en op te halen. (K) Klik op de pijl naar beneden naast de exportknop en selecteer gegevens naar het klembord. (L) Klik op de knop Exporteren om de gegevensuitvoer naar het klembord te kopiëren. Gegevens kunnen nu in een spreadsheet worden geplakt. (M) Klik op de knop Gegevens opnieuw instellen om het gedeelte resultaten leeg te maken voordat een nieuwe meting wordt uitgevoerd. (N) Wanneer erosie moet worden uitgevoerd voor intensiteitsmeting voor de berekening van de intensiteitsverhouding, klikt u op Binaire > Eroderen. De functie Objecten verwijderen die randen aanraken, is te vinden in hetzelfde vervolgkeuzemenu. (O) Selecteer de matrix in de figuur voor erosie en kies het gewenste aantal (1 pixel of 2,5 μm voor verwijdering van de halo-omringende organoïden, 10 pixels of 25 μm voor verwijdering van de cellulaire rand rond een lumen indien aanwezig). Zie het aanvullende bestand voor schermvullende panelen van deze afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Afbeeldingen van rectale organoïden van mensen zonder (bovenste panelen) en met CF (onderste panelen). Illustratie van de methoden om de twee indexen te berekenen, IR (intensiteitsverhouding; centraal paneel) en CI (circulariteitsindex; rechterpaneel), die worden gebruikt om morfologische verschillen tussen rectale organoïden van proefpersonen met en zonder CF te kwantificeren. IR meet de aan- of afwezigheid van een centraal lumen, berekend in drie stappen: (I) bereken de globale fluorescentie-intensiteit van de organoïden: eroderen 1 pixel (2,5 μm) om de omringende 'halo' rond elke structuur te verwijderen en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de resterende gehele organoïde te meten; (II) bereken de centrale fluorescentie-intensiteit van de organoïden: eroderen 10 pixels (25 μm) rond elke structuur om de cellulaire rand van de organoïden te verwijderen en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de resterende structuur te meten; (III) IR is gelijk aan 
, en is hoger in CF dan in niet-CF organoïden. CI kwantificeert de rondheid van de organoïden, gedefinieerd als 
, die lager is in CF dan in niet-CF-organoïden. CF: cystische fibrose; IR: intensiteitsverhouding; CI: circulariteitsindex. Deze figuur is met toestemming van Cuyx et al.13 herdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Voorbeeld van een spreadsheet voor de berekening van CI en IR. De output (circulariteit en gemiddelde intensiteit, zoals gedefinieerd in figuur 5) wordt voor beide erosiestappen in de spreadsheet gekopieerd. De imaging software voegt automatisch de gemiddelde waarden voor elke parameter toe. Deze middelen kunnen worden gekopieerd naar een cel naar keuze in de spreadsheet en vervolgens worden gebruikt voor de berekening van CI en IR. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Intensiteitsverhouding (IR) en circulariteitsindex (CI) waarden van elke proefpersoon op basis van ziektestatus, pancreasstatus en zweetchlorideconcentratie. De lijn vertegenwoordigt de optimale discriminatielijn verkregen door lineaire discriminante analyse. CF: cystische fibrose; PS: pancreas voldoende; PI: pancreas onvoldoende; SCC: zweetchlorideconcentratie. Deze figuur is met toestemming van Cuyx et al.13 herdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Berekening van ROMA-indexen. De berekening van ROMA-indexen met behulp van acht willekeurige putten per onderwerp en met behulp van dezelfde statistische methodologie was vergelijkbaar met de resultaten met behulp van 32 putten. Opnieuw werd perfecte discriminatie verkregen. CI: circulariteitsindex; IR: intensiteitsverhouding. Deze figuur is met toestemming van Cuyx et al.13 herdrukt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Histogrammen die de verdeling illustreren van waarden gemeten in elke afzonderlijke organoïde in een bepaalde cultuur. De circulariteitsparameter, de intensiteitsparameter voor het centrale deel van de organoïde en de intensiteitsparameter voor de hele organoïde worden weergegeven (kolommen). Resultaten in twee CF- en twee niet-CF-culturen worden getoond (rijen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand: Presentatie in volledige resolutie van figuur 5. Klik hier om te downloaden.
| CF | Niet-CF | p-waarde | |
| n | 167 | 22* | |
| IR | 1.11 (0.93–1.34) | 0.76 (0.61–0.88) | <0.001 |
| CI | 0.59 (0.49–0.70) | 0.79 (0.73–0.84) | <0.001 |
| Leeftijd (jaren) | 18 (0–60) | 44 (0–77) | <0.001 |
| Geslacht | 85 mannen (51%) 82 vrouwen (49%) |
11 mannen (50%) 11 vrouwen (50%) |
>0.999 |
| VCA (mmol/l) (n = 164) | 97.61 (36–160) | ||
| SCC laag (<87 mmol/L) of hoog (≥87 mmol/L) | 41 laag (25%) 123 hoog (75%) |
||
| Pancreasstatus (n = 165) | 28 pk (17%) 137 PI (83%) |
Tabel 1: Baselinekenmerken van de proefpersonen en indexen berekend met behulp van rectale organoïde morfologieanalyse (ROMA). n of gemiddelde en bereik. CF: cystische fibrose; IR: intensiteitsverhouding; CI: circulariteitsindex; SCC: zweetchlorideconcentratie; PI: pancreas onvoldoende; PS: pancreas voldoende. * zeven dragers, drie niet-dragers, twee autosomaal dominante polycystische nierziekte, zes colitis ulcerosa, één poliepscreening, drie gezonde controles opgenomen in een studie over inflammatoire darmaandoeningen. Deze tabel is met toestemming van Cuyx et al.13 herdrukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We bieden een gedetailleerd protocol voor rectale organoïde morfologie-analyse (ROMA). De twee indexen berekend met ROMA, IR en CI, onderscheidden organoïden van proefpersonen met CF van die zonder CF met perfecte nauwkeurigheid. ROMA zou dus kunnen functioneren als een nieuwe fysiologische CFTR-test die complementair is aan SCC en andere momenteel beschikbare tests 13,14,15.
Het protocol is afhankelijk van het gebruik van intestinale organoïden, die een ronde vorm en een centraal lumen hebben wanneer CFTR functioneel is, zoals beschreven vóór10,11. Organoïden worden in toenemende mate gebruikt bij de beoordeling van nieuwe CF-behandelingen (bijv. in de FIS-test8). Het ROMA-protocol kan worden geïntegreerd met het FIS-testprotocol, omdat voor de FIS-test 32 putten 's nachts worden geïncubeerd zonder correctoren. Deze putten kunnen in beeld worden gebracht na de toevoeging van calceïnegroen, maar vóór de toevoeging van forskoline en / of potentiators. Op deze manier kan één 96-well plaat worden gebruikt voor zowel diagnostisch als gepersonaliseerd therapeutisch onderzoek voor elke specifieke patiënt. Naast de diagnose kan ROMA ook informatie verschaffen in de karakterisering van varianten van onbekende betekenis.
De grootste praktische hindernis van dit protocol zou waarschijnlijk het opstarten van intestinale organoïde culturen zijn. In de meeste algemene ziekenhuizen kunnen rectale zuigbiopten echter worden verkregen volgens een gestandaardiseerd protocol en met lage complicatiepercentages, zelfs bij zuigelingen9. Het genereren van organoïden uit biopsieën vereist alleen de aanwezigheid van darmcrypten, terwijl voor ICM biopsieën van volledige dikte van hogere kwaliteit nodig zijn12,15. Biopsieën kunnen worden getransporteerd naar een centraal laboratorium voor het genereren van een organoïde cultuur, en vervolgens ROMA met behulp van het gestandaardiseerde en semi-geautomatiseerde protocol dat hierin wordt beschreven 9,12. Aangezien reductie van 32 putten naar acht putten voor ROMA geen verschil liet zien in de classificatie van gevallen als CF of niet-CF, zou het beplateren van acht putten voor analyse voldoende zijn, waardoor de kosten zouden dalen.
Voor verdere validatie zal ROMA moeten worden uitgevoerd op proefpersonen met dubbelzinnige diagnoses. Organoïden kunnen worden opgeslagen in een biobank voor later onderzoek naar gepersonaliseerde geneeskunde voor mensen met de diagnose CF16. ROMA zou ook een rol kunnen spelen in een gepersonaliseerde geneeskundebenadering. IR zou bijvoorbeeld het uiterlijk van een centraal lumen kunnen detecteren na het incuberen van organoïden van proefpersonen met een resterende CFTR-functie, maar vóór stimulatie met een potentiator en forskoline.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Deze studie werd gefinancierd door de Belgische CF-patiëntenvereniging "Mucovereniging/Association Muco", de Onderzoeksbeurs van de Belgische Vereniging voor Kindergeneeskunde BVK-SBP 2019, en een subsidie van het UZ Leuven Fonds voor Translationeel Biomedisch Onderzoek. De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We bedanken de patiënten en ouders die hebben deelgenomen aan dit onderzoek. We bedanken Abida Bibi voor al het kweekwerk met de organoïden. We danken Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz en Bernard Wenderickx voor logistieke ondersteuning. We danken ook de Mucovereniging/Vereniging Muco, en in het bijzonder Stefan Joris en Dr. Jan Vanleeuwe, voor hun steun en financiering. We bedanken alle medewerkers van het Belgian Organoid Project: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Luik, België), Linda Boulanger (Universitaire Ziekenhuizen Leuven, België), Georges Casimir (HUDERF, Brussel, België), Benedicte De Meyere (Universitair Ziekenhuis Gent, België), Elke De Wachter (Universitair Ziekenhuis Brussel, België), Danny De Looze (Universitair Ziekenhuis Gent, België), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Brussel, België), Laurence Hanssens (HUDERF, Brussel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Brussel, België), Monique Lequesne (Universitair Ziekenhuis Antwerpen, België), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Ziekenhuis Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Ziekenhuis Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitair Ziekenhuis Gent, België), Eva Van Braeckel (Universitair Ziekenhuis Gent, België), Kim Van Hoorenbeeck (Universitair Ziekenhuis Antwerpen, België), Eef Vanderhelst (Universitair Ziekenhuis Brussel, België), Stijn Verhulst (Universitair Ziekenhuis Antwerpen, België), Stefanie Vincken (Universitair Ziekenhuis Brussel, België).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
References
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- Cystic Fibrosis Mutation Database. , Available from: http://www.genet.sickkids.on.ca/ (2022).
- CFTR2. , Available from: https://www.cftr2.org/ (2022).
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung's disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
