Summary
细胞壁生物力学的研究对于了解植物生长和形态发生至关重要。提出以下协议以使用原子力显微镜研究年轻植物器官内部组织中的薄原代细胞壁。
Abstract
初级细胞壁的机械性能决定了植物细胞生长的方向和速度，因此决定了植物的未来大小和形状。已经开发了许多复杂的技术来测量这些特性;然而，原子力显微镜（AFM）仍然是在细胞水平上研究细胞壁弹性的最方便的方法。该技术最重要的局限性之一是只能研究浅表或分离的活细胞。在这里，介绍了使用原子力显微镜来研究属于植物体内部组织的原代细胞壁的机械性能。该协议描述了根中细胞壁的表观杨氏模量的测量，但该方法也可以应用于其他植物器官。测量是在液体细胞中植物材料的振动切片机衍生部分进行的，这允许（i）避免使用浆解溶液或用蜡或树脂浸渍样品，（ii）使实验快速，以及（iii）防止样品脱水。可以研究抗斜细胞壁和斜周细胞壁，具体取决于标本的切片方式。不同组织的机械性能差异可以在一个切片中研究。该协议描述了研究计划的原理，试样制备和测量的问题，以及选择力 - 变形曲线以避免形貌对获得的弹性模量值的影响的方法。该方法不受样本量的限制，但对细胞大小敏感（即，难以检查具有大腔的细胞）。
Introduction
植物细胞壁的机械性能决定了细胞的形状及其生长能力。例如，花粉管的生长尖端比同一管1的非生长部分软。 在拟南芥 分生组织上形成原基之前，未来原基2，3位点的细胞壁硬度局部降低。 拟南芥 下胚轴的细胞壁平行于主生长轴并且生长更快，比垂直于该轴的细胞壁更软，生长速度更慢4，5.在玉米根系中，细胞从分裂到伸长的转变伴随着根系所有组织中弹性模量的降低。模量在伸长区保持较低，在伸长后期区6中增加。
尽管有各种方法，但每年获得的关于细胞壁生物学的大量生化和遗传信息很少与细胞壁的机械性能进行比较。例如，细胞壁相关基因上的突变体通常具有改变的生长和发育4，7，8，但很少用生物力学来描述。造成这种情况的原因之一是难以在细胞和亚细胞水平上进行测量。原子力显微镜（AFM）是目前进行此类分析的主要方法9。
近年来，已经开展了许多基于AFM的植物细胞壁生物力学研究。已经研究了拟南芥2，3，4，5，10，11和洋葱12的外部组织以及培养细胞13，14，15的细胞壁的机械性能。然而，植物的浅表细胞可能具有与内部组织不同的细胞壁6。此外，植物细胞被膨胀加压，使它们更硬。为了摆脱膨胀压力的影响，研究人员必须使用浆解溶液2，3，4，5，10，11或将获得的值分解为膨胀和细胞壁贡献12。第一种方法导致样品脱水并改变细胞壁16的厚度和性质，而第二种方法需要额外的测量和复杂的数学运算，并且仅适用于形状相对简单的细胞12。内部组织的细胞壁特性可以在冷冻切片17或浸渍有树脂8的植物材料切片上进行评估。然而，这两种方法都涉及样品的脱水和/或浸渍，这不可避免地会导致性质的变化。分离或培养细胞的特性很难与整个植物的生理学联系起来。植物细胞的培养和分离都会影响其细胞壁的机械性能。
这里介绍的方法补充了上述方法。使用它，可以检查任何组织的原代细胞壁和植物发育的任何阶段。切片和AFM观察在液体中进行，避免样品脱水。随着细胞被切割，膨胀问题得到了解决。该协议描述了玉米和黑麦根的工作，但可以检查任何其他样品是否适合振动切片。
这里描述的AFM研究是使用力 - 体积技术进行的。不同的仪器对此方法使用不同的名称。但是，基本原则是相同的;通过悬臂（或样品）的正弦或三角运动获得样品的力-体积图，以在每个分析点处达到一定的加载力，同时记录悬臂偏转18。结果结合了表面的地形图像和力-距离曲线阵列。每条曲线用于计算特定点的变形、刚度、杨氏模量、粘附和能量耗散。在接触模式19下扫描后，可以通过逐点力谱获得类似的数据，尽管它更耗时。
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Protocol
1. AFM测量的样品制备
- 植物材料：用0.35%NaOCl溶液将玉米（Zea mays L.）和黑麦（Secale cereale L.）的种子灭菌10分钟，用蒸馏水洗涤3x，然后在27°C的黑暗中水培生长4天和2天。初级根用于实验。
- 制备用于振动切片的溶液和样品
- 通过使用微波炉将 3% （w/w） 低熔点琼脂糖溶解在水中来制备用于根包埋的琼脂糖溶液。
注意：所有实验均在水中进行。如果研究需要缓冲液或任何其他类型的培养基，最好使用相同的培养基进行琼脂糖制备、切片期间和AFM的液体池中，以避免损坏样品。 - 在培养皿底部倒入4毫米融化的3%琼脂糖层（直径= 35毫米），并使其稍微冷却以防止对样品的热损伤。
- 将三或四小块（约5毫米长）研究的植物器官水平放在琼脂糖上。
注意：样品应半浸入，但不要浸没在琼脂糖层中。如果样品未浸入，则在振动切片过程中可能会从琼脂糖中脱落。如果样品沉到底部，它将太靠近截面的边缘，并且不方便进行进一步的步骤。 - 当第一层琼脂糖（30-60秒）顶部出现一层薄的半固体薄膜时，小心地将第二层倒在上面。
注意：琼脂糖的底层不应完全凝固。否则，在进一步的工作中，两层可能会彼此分离。 - 琼脂糖完全凝固后，切出含有标本的块。将块塑造成六边形截断的金字塔，以确保其在进一步切片过程中的稳定性（图1A）。
注意：样品可以在此模块内垂直或水平定向，具体取决于所需截面的类型。制备块时，在标本周围留下2-3毫米的琼脂糖。在这种情况下，样品部分将被3%琼脂糖层保留，这将有助于其进一步固定（图1B）。
- 通过使用微波炉将 3% （w/w） 低熔点琼脂糖溶解在水中来制备用于根包埋的琼脂糖溶液。
- 用振动切片机切片样品
- 用氰基丙烯酸酯粘合剂将块粘在振动切片机阶段。将载物台放在振动切片机中，使其中一个金字塔角朝向振动切片机的刀片。将水倒入振动切片机浴中。
- 设置切片参数（切片厚度、刀片速度和振动频率），然后切割样品。
注意： 使用介于 200 和 400 μm 之间的截面厚度。太薄的部分可能会在机械性能评估中引入错误，而太厚的部分容易破损。黑麦和玉米根系的叶片速度为1.3 mm·s-1 ，振荡频率为90 Hz。 - 使用细刷将水浴中的部分移动到载玻片上，并在该部分上滴一滴水以防止其变干。在光学显微镜下检查切片的质量。
注意： 斜截面不能用于测量弹性模量。细胞壁必须垂直于截面平面，否则它们可能会在AFM尖端下弯曲或弯曲。
- 固定用于AFM测量的部分（图1B）
- 使用移液管在培养皿盖的底部倒入一层熔融的 1% （w/w） 琼脂糖 （~1 mL）。
注意：确保培养皿盖的侧面不会阻止尖端接近样品。琼脂糖层应为1毫米厚，并应覆盖盖子的整个底部。 - 1%琼脂糖凝固后，通过将滤纸带到其边缘来去除切片中多余的水。
注意：请勿用纸张接触植物部分，以免损坏和样品完全干燥。 - 使用刷子小心地将切片从载玻片转移到培养皿盖的中心。使用 20 μL 移液器，小心地在切片周围添加 1% 琼脂糖（图 1B）。
注意：1%琼脂糖不应沾在标本上。它应该只覆盖保留植物标本的3%琼脂糖层的边缘。1%琼脂糖应该在这个3%琼脂糖层的边缘形成小节。大旋钮可能会阻止悬臂接近样品。 - 将用于AFM的水或其他溶液倒入带有固定部分的培养皿盖中。
- 使用移液管在培养皿盖的底部倒入一层熔融的 1% （w/w） 琼脂糖 （~1 mL）。
2. 原子力显微镜的制备和校准
注意：AFM的力 - 体积方法生成在研究区域的每个点获得的空间分辨力 - 距离曲线数组。在接触模式下获取力-体积模式的所有参数（悬臂刚度、IOS 等）。其他制造商的仪器的类似程序已在前面描述过10，20。
- 选择合适的悬臂类型。
注意：悬臂刚度必须与试样刚度21 相当。比试样硬得多的悬臂不会偏转太多，而太软的悬臂不会使试样变形。典型的共振频率应足以摆动液体中的悬臂（即至少几十kHz）。与细胞壁的大小相比，接触面积应该很小，因为在杨氏模量计算中研究的样品被假设为无限的半空间。黑麦和玉米根系采用以下悬臂：典型共振频率为60 kHz、平均弹簧常数为1.5 N·m-1、顶点半径为10 nm的尖悬臂，或典型共振频率为75 kHz、平均弹簧常数为2.8 N·m-1的球形悬臂， 顶点半径为 150 nm。 - 打开 AFM 设备和相关软件（材料表）。将悬臂安装在液体池的尖端支架上。将一滴液体放在尖端，以避免在将尖端浸入液体时在尖端形成气泡。
注意：如果形成气泡，可以用精确擦拭去除液体，然后放置新的液滴。 - 将吸头支架安装在扫描头上。
- 将硬样品（新鲜载玻片）放入培养皿盖中。将液体倒入其中，确保它覆盖载玻片。将扫描头放在载物台上并抬起标本，使液体覆盖悬臂。
- 选择下拉菜单中的 “头” 选项卡。 确保选择了液体池的扫描头。
- 单击瞄准按钮以打开激光瞄准窗口。单击相机按钮以打开光学显微镜窗口。将激光定位在悬臂的尖端，使用AFM头上的螺钉和光学显微镜窗口进行定向。
- 从程序主窗口的下拉菜单中选择 半接触 模式。
- 打开 共振 选项卡，然后在 探头 菜单中选择要使用的悬臂类型。单击 自动 按钮以确定谐振频率。
注意：如果未列出正在使用的悬臂，请打开“ 工具>探头护照”。创建一个新文件，输入悬臂参数，然后保存。然后在 探针 下拉菜单中选择它。 - 选择 接触 模式 从程序主窗口的下拉菜单中。
- 单击 N_Force Cal 按钮打开悬臂校准窗口。选择正在使用的悬臂，然后单击“ 扫描 ”按钮，然后单击 “Spect Meas ”按钮，使用热调谐程序确定悬臂弹簧常数。关闭窗口。
- 将 设定值 设置为 1 nA。打开 “方法 ”选项卡，然后单击 “着陆 ”按钮以接近示例。
- 打开 扫描 选项卡。将扫描 速率 设置为 0.5 Hz。单击 “区域 ”按钮并将扫描 尺寸 设置为 10 μm x 10 μm，将扫描 点 设置为 256 x 256。单击 “运行 ”按钮并扫描大约 20 条线，以检查玻璃上是否有污染。单击“ 停止” 按钮结束扫描而不会丢失数据。
- 打开 曲线 选项卡。将退刀和接近参数分别设置为 500 nm 和 -100 nm。
- 在下拉菜单中选择上次扫描 选择帧 以观察表面。
- 在玻璃上找到一个干净的区域，并指出应该采取力-变形曲线的点，然后单击 “运行 ”按钮以获取曲线。在扫描的不同位置记录三到五条力曲线。
- 单击 “数据 ”按钮打开分析窗口，然后选择具有力-变形曲线的帧。
- 单击 “成对标记 ”按钮并指示回缩曲线的线性部分，以计算DFL信号与位移的比值，即逆光学灵敏度（IOS，nA nm-1）或偏转灵敏度。
- 对所有记录的曲线重复步骤2.17，并记下DFL信号与位移比的所有计算值。它们应该是相同的。
- 关闭分析窗口，单击“ 方法 ”选项卡，然后单击“ 删除 ”按钮以将探针从样品中收回。
3. 数据采集
- 使用光学显微镜将样品引导到AFM悬臂下。单击“接近”选项卡，然后单击“着陆”按钮，以接触模式接近样品，设定值为 1 nA。
- 单击“ 扫描 ”选项卡，然后单击 “区域 ”按钮。选择要扫描 的区域尺寸 为 70 μm x 70 μm。
- 单击“ 移动探头 ”按钮，通过将扫描仪移到扫描区域上来检查整个扫描区域。根据扫描仪突出的程度，找到最高点。
- 打开 “方法 ”选项卡，然后单击“ 删除 ”按钮以从示例中收回。使用最高点作为目标，单击 着陆 按钮再次接近样本。然后，通过单击“ 移动探针 ”按钮并将扫描仪移到表面上再次检查表面。该区域中的任何点都不应要求扫描仪完全凸起。
注意：理想情况下，扫描仪z范围应超过样品的高度差。但是，如果扫描区域上的某些点低于扫描仪的容量，则可以接受。同时，这样的点应该不多。扫描仪无法到达的大面积区域可能会导致扫描流产。 - 将扫描 速率 设置为 0.5 Hz。将扫描 尺寸 设置为 70 μm x 70 μm，将扫描 点 设置为 64 x 64。单击 “运行” 按钮并扫描以检查样品表面及其可能被琼脂糖污染。
注意：如果样品具有大管腔的细胞，则可以减小扫描区域的大小，或者应移动扫描区域以使扫描上有更多的细胞壁。 - 单击主窗口顶部的 “打开 ”按钮以关闭反馈循环。
- 在程序主窗口的下拉菜单中选择 HDPlus 模式（力度-音量方法）。将出现一个附加窗口（高清窗口）。
- 在主程序窗口中将 设定点 设置为 0.1 nA。
- 在HD窗口的 “主要 ”选项卡中，设置适合所研究样品的扫描参数（正弦悬臂运动的幅度和频率）。
注意：每种类型的样品和悬臂都需要选择扫描参数。一些初步实验是必要的。对于玉米或黑麦根，使用尖锐和球形悬臂，振幅为400 nm，频率为300 Hz。 - 打开HD窗口中的 噪声 选项卡，然后输入悬臂的共振频率。
- 打开高清窗口的 “数量 ”选项卡，然后输入 IOS，悬臂 刚度以及尖端半径和角度。根据尖端几何形状选择将用于计算的接触模型。
注意：DMT模型考虑了探针和样品之间存在的粘附力，最常用于机械生物学21。 - 打开高清窗口的 “扫描 ”选项卡，然后选择要记录的信号。选择记录信号的方向。勾选 力体积 框以获取所有 力 曲线的记录。
注意： 记录向前和向后方向的弹性模量信号。它将提供更多的计算点。 - 单击主程序窗口顶部的“ 关闭 ”按钮以打开反馈循环。
- 单击高清主窗口中的 PhaseCorr 按钮以校正光学系统的灵敏度。
- 高清主窗口的 vs 时间选项卡实时显示 DFL 信号与时间的功能;选择此函数中将用于基线水平确定的部分，并拟合接触模型以进行进一步计算。
- 在程序的主窗口中将扫描 点 值设置为 256 x 256。将扫描 速率 设置为 0.2 Hz，然后单击 “运行” 按钮扫描样品。
- 扫描停止后，单击主窗口顶部的 “打开 ”按钮以关闭反馈循环。
- 在下拉菜单中选择 接触 模式，打开 “方法 ”选项卡，然后单击“ 删除 ”按钮以从样品中收回。
- 单击 “数据 ”按钮打开分析软件并保存输出。
- 在一天的测量结束时，从头部取下悬臂尖端支架，并用超纯水小心地冲洗几次。每次，用精确擦拭去除水。
4. 数据评估和后处理
注意： 不要依赖自动计算的弹性模量值。由于表面的高度差异很大，因此应排出许多伪影曲线。
- 在分析软件中打开保存的文件。
- 选择 “HDForceVolume” 帧。
- 按住 Ctrl 键并选择在相同扫描方向上获得的一个可视帧。单击“ 加载外部映射 ”按钮以查看细胞壁的位置。
注意：任何信号图都可以用作视觉框架，但使用 DFL 信号图（不同的仪器可能将其称为偏转信号或错误信号）可能是最简单的方法。 - 在“主”选项卡中检查 InvOptSens （IOS） 和悬臂刚度值。
- 打开 附加 选项卡并检查吸头参数和触点模型。
- 单击视觉框架上细胞壁上的各个点，并仅选择模型很好地描述的曲线。有关详细信息，请参阅代表性结果。
- 记下获得的值。
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Representative Results
典型的弹性模量和DFL图，以及通过所述方法在黑麦和玉米根上获得的力曲线，如图 2所示。图 2A 显示了在黑麦主根的横向截面上获得的弹性模量和DFL图。模量图中的白色区域（图2A，左）对应于由于扫描仪在z方向上达到极限而导致的杨氏模量的错误高估。此图像不方便用作进一步选择令人满意的力曲线的外部地图。右侧所示的DFL信号图（偏转/误差图）（图2A）更适合此目的。
玉米根系横向和纵向截面的模量图如图 2B，C所示。在试图到达样品底部时完全展开的扫描仪可能会导致错误的测量，甚至中断扫描（ 图2C的顶部）。有时，在接触模式下进行良好的扫描后，仪器会突然完全收缩扫描仪，当切换到力-体积模式时，会发出警报，表明它已达到最大 z 方向限制。这意味着样品没有正确固定并漂浮起来。应准备新的样品。
琼脂糖污染也可能是制备新样品的原因（图2D，E）。琼脂糖的存在可以在接触模式下获得第一次扫描时检查（步骤3.5）。理想情况下，细胞壁和一些细胞底部在此类扫描中应该是可见的（图2D）;然而，在不准确固定的情况下，表面可能会被琼脂糖覆盖（图2E），这掩盖了样品形貌。
图2F 显示了在同一细胞壁的不同点记录的四种不同的力曲线。在第 1 点记录的曲线显示没有基线。这意味着悬臂尖端与细胞壁没有分离。根据该曲线计算出的模量被高估了。在第 3 点记录的曲线显示了接近部分的肩膀。该伪影可能表明细胞壁弯曲。在第 1 点和第 3 点记录的两条曲线都应排出。点 2 和点 4 显示了模量值相似的令人满意的力曲线。以下标准可用于区分适当的曲线：（i） 基线水平在曲线接近和缩回部分都应明显;（ii） 不应有不规则的情况，例如肩部或故障（分别表现为斜坡中间的恒定力值和力值突然减小）;（iii） 所选模型应与曲线拟合良好。对于所有选定的曲线，施加的最大力值应相似。明显高于或低于预期值的最大施加力也可以用作曲线排出的标准。使用神经网络丢弃质量差的曲线19 可以加快结果的处理速度。
图 1：样品制备中的关键步骤 。 （A）嵌入琼脂糖块并安装在振动切片机台上的根碎片。（B）样品切片放置在1%琼脂糖层的顶部，并用额外的琼脂糖固定在培养皿盖中。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：初级根上的典型 AFM 图像和测量值。 （A）黑麦根横向截面的弹性模量和DFL图。在玉米根系的纵向和横向截面上获得的弹性模量的完整记录（B）和断续（C）图。玉米根部干净 （D） 和琼脂糖覆盖 （E） 部分的 3D 视图。（F）玉米根横截面的DFL图。细胞壁上的点1-4显示了记录图像右侧的力曲线的位置。红线表示接近，蓝线表示缩回，黑线表示接触力学模型拟合。记录在点 1 和点 3 的曲线有伪影，不能用于计算。用锋利的尖端检查黑麦根，用球形尖端检查玉米根。缩写：根=根茎，Exo=外皮，OC=外皮层，IC=内皮层，末端=内皮层，Per =周周期，VP=血管实质。比例尺 = 10 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
原代细胞壁的机械性能决定了植物细胞生长的方向和速率，从而决定了植物的未来大小和形状。这里介绍的基于AFM的方法补充了用于研究植物细胞壁特性的现有技术。它允许研究属于植物内部组织的细胞壁的弹性。利用该方法绘制了玉米根系不同组织中细胞壁的力学性能图谱，并基于这些特性构建了数学模型6。模拟根部通过线性尺寸的变化响应模拟膨胀的压力应用。这些变化与浆解培养基6中新鲜切除的根所表现出的变化范围和方向相反。
样品制备对于该方案至关重要。在整个制备过程中应避免样品干燥。正确放置要切片的植物材料是一个重要问题;细胞壁必须严格垂直于未来的扫描平面。否则，由于细胞壁被弯曲或弯曲，将获得不令人满意的力-变形曲线。琼脂糖包埋部分应用额外的琼脂糖紧密固定（图2B）。后者不应进入样品，否则将测量琼脂糖特性。该协议最重要的部分是过滤产生的力曲线。即使研究模型对象，例如AFM校准网格，也可能导致很大比例的错误力 - 变形曲线22。直接使用计算出的模量值而不分析潜在的力-变形曲线可能会导致错误的结论（图2F）。
该技术不受细胞定位或植物器官大小的限制。但是，太小的物体很难切割、定向和固定。具有大腔的细胞很难使用，因为扫描中断的可能性很高（图2C）。
尽管使用用振动切片机制备的非固定植物切片具有所有好处，但至少有两个关键问题：切割植物材料后发生应激反应的可能性，以及材料从切割的细胞壁部分溶解的可能性。两者都可能导致细胞壁组成和性质的变化。在拟南芥顶端10上测试切口上即时应激反应的存在。没有报告对观察到的特性有显著影响。进行实验以测试切割细胞壁在水中孵育期间的性质变化19。在同一壁玉米根上测量的杨氏表观模量值至少半小时没有稳定的趋势19。但是，最好保持尽可能短的实验时间，并在样品在水中孵育期间检查每个样品的此类变化。
AFM是研究植物细胞壁的强大技术。然而，很明显，弹性模量、刚度和附着力的计算是基于植物细胞壁无法满足的几个假设。AFM使用的所有接触力学模型都将所研究的样品视为各向同性材料的无限半空间，这对于植物细胞壁来说并非如此。同时，假设压头的几何形状和特性在悬臂使用寿命内是精确测量和恒定的，这也可能是错误的。此外，植物细胞壁表现出复杂的机械行为，涉及弹性、粘弹性和塑料成分，通常只能在单个实验中测量其中之一。然而，使用基于AFM的方法获得的数据与植物细胞生长和各种器官和物种的机械性能可靠地相关3，4，5，6。所有这些都意味着可以提高技术本身和对使用它获得的数据的理解。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢Dmitry Suslov博士（圣彼得堡国立大学，圣彼得堡，俄罗斯）和Mira Ponomareva教授（鞑靼农业科学研究所，FRC KazSC RAS，喀山，俄罗斯）分别提供玉米和黑麦种子。所提出的方法是在授予LK的俄罗斯科学基金会项目No. 18-14-00168的框架内开发的。部分工作（获得所呈现的结果）由AP在RAS喀山科学中心政府任务的财政支持下完成。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
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