Summary
Studier av celleveggbiomekanikk er avgjørende for å forstå plantevekst og morfogenese. Følgende protokoll foreslås å undersøke tynne primære cellevegger i det indre vevet av unge planteorganer ved hjelp av atomkraftmikroskopi.
Abstract
De mekaniske egenskapene til de primære celleveggene bestemmer retningen og hastigheten på plantecelleveksten og dermed plantens fremtidige størrelse og form. Mange sofistikerte teknikker er utviklet for å måle disse egenskapene; Atomkraftmikroskopi (AFM) er imidlertid fortsatt den mest praktiske for å studere celleveggelastisitet på mobilnivå. En av de viktigste begrensningene ved denne teknikken har vært at bare overfladiske eller isolerte levende celler kan studeres. Her presenteres bruken av atomkraftmikroskopi for å undersøke de mekaniske egenskapene til primære cellevegger som tilhører det indre vevet i en plantekropp. Denne protokollen beskriver målinger av den tilsynelatende Youngs modul av cellevegger i røtter, men metoden kan også brukes på andre planteorganer. Målingene utføres på vibratomavledede seksjoner av plantemateriale i en flytende celle, noe som gjør det mulig (i) å unngå bruk av plasmolyserende løsninger eller prøveimpregnering med voks eller harpiks, (ii) gjøre forsøkene raske og (iii) forhindre dehydrering av prøven. Både antiklinale og periklinale cellevegger kan studeres, avhengig av hvordan prøven ble seksjonert. Forskjeller i de mekaniske egenskapene til forskjellige vev kan undersøkes i en enkelt seksjon. Protokollen beskriver prinsippene for studieplanlegging, problemer med prøvepreparering og målinger, samt metoden for å velge kraftdeformasjonskurver for å unngå påvirkning av topografi på de oppnådde verdiene av elastisk modul. Metoden er ikke begrenset av prøvestørrelse, men er følsom for cellestørrelse (dvs. celler med stort lumen er vanskelig å undersøke).
Introduction
De mekaniske egenskapene til plantecelleveggen bestemmer cellens form og dens evne til å vokse. For eksempel er den voksende spissen av pollenrøret mykere enn de ikke-voksende delene av samme rør1. Primordia-dannelsen på Arabidopsis meristem innledes av en lokal reduksjon i celleveggstivhet på stedet for det fremtidige primordium 2,3. Celleveggene til Arabidopsis hypocotyl, som er parallelle med hovedvekstaksen og vokser raskere, er mykere enn de som er vinkelrett på denne aksen og vokser langsommere 4,5. I maisroten ble overgangen av celler fra divisjon til forlengelse ledsaget av en reduksjon i elastisk moduli i alle vev av roten. Moduli forble lav i forlengelsessonen og økte i sen forlengelsessone6.
Til tross for tilgjengeligheten av ulike metoder, blir de store utvalgene av biokjemisk og genetisk informasjon om celleveggbiologi oppnådd årlig sjelden sammenlignet med de mekaniske egenskapene til cellevegger. For eksempel har mutanter på celleveggrelaterte gener ofte endret vekst og utvikling 4,7,8, men er sjelden beskrevet i form av biomekanikk. En av grunnene til dette er vanskeligheten med å gjennomføre målinger på cellulært og subcellulært nivå. Atomkraftmikroskopi (AFM) er i dag den primære tilnærmingen for slike analyser9.
I de senere år har det blitt utført en rekke AFM-baserte studier på plantecelleveggbiomekanikk. De mekaniske egenskapene til cellevegger i det ytre vevet av Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 og løk 12, samt av dyrkede celler13,14,15, har blitt undersøkt. Imidlertid kan overfladiske celler av en plante ha cellevegger hvis mekaniske egenskaper er forskjellige fra de indre vevene6. I tillegg er planteceller trykksatt av turgor, noe som gjør dem stivere. For å bli kvitt påvirkning av turgortrykk, må forskere bruke plasmolyserende løsninger 2,3,4,5,10,11 eller dekomponere verdiene oppnådd i turgor og celleveggbidrag 12. Den første tilnærmingen fører til prøvedehydrering og endrer tykkelsen og egenskapene til celleveggen16, mens den andre tilnærmingen krever ytterligere målinger og komplisert matematikk, og gjelder bare for celler med relativt enkel form12. Celleveggegenskapene til indre vev kan evalueres på kryoseksjoner17 eller seksjoner av plantemateriale impregnert med harpiks8. Imidlertid innebærer begge metodene dehydrering og / eller impregnering av prøver, noe som uunngåelig fører til endringer i egenskaper. Egenskapene til isolerte eller dyrkede celler er vanskelige å forholde seg til fysiologien til hele planten. Både dyrking og isolering av planteceller kan påvirke de mekaniske egenskapene til celleveggene.
Metoden som presenteres her utfyller de nevnte tilnærmingene. Ved å bruke den kan de primære celleveggene i noe vev og på et hvilket som helst stadium av planteutvikling undersøkes. Seksjonerings- og AFM-observasjoner ble utført i væske som unngår dehydrering av prøver. Problemet med turgor ble løst da cellene ble kuttet. Protokollen beskriver arbeid med mais og rugrøtter, men enhver annen prøve kan undersøkes om den er egnet for vibratomseksjonering.
AFM-studiene beskrevet her ble utført ved bruk av kraftvolumteknikken. Ulike instrumenter bruker forskjellige navn for denne metoden. Det grunnleggende prinsippet er imidlertid det samme; Et kraftvolumkart over prøven oppnås ved en sinusformet eller trekantet bevegelse av utkrageren (eller prøven) for å oppnå en viss belastningskraft ved hvert analysert punkt, mens du registrerer utkragingsavbøyningen18. Resultatet kombinerer et topografisk bilde av overflaten og rekken av kraftavstandskurver. Hver kurve brukes til å beregne deformasjon, stivhet, Youngs modul, vedheft og energispredning på et bestemt punkt. Lignende data kan fås ved punkt-for-punkt kraftspektroskopi etter skanning i kontaktmodus19, selv om det er mer tidkrevende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvepreparering for AFM-målinger
- Plantemateriale: Sterilisfrø av mais (Zea mays L.) og rug (Secale cereale L.) med en 0,35% NaOCl-løsning i 10 minutter, vask 3x med destillert vann, og vokse deretter hydroponisk i mørket ved 27 ° C i henholdsvis 4 dager og 2 dager. Primære røtter ble brukt til forsøket.
- Fremstilling av løsninger og prøve for vibratomseksjonering
- Forbered agaroseløsning for rotinnstøping ved å oppløse 3% (w / w) lavsmeltepunkt agarose i vann ved hjelp av en mikrobølgeovn.
MERK: Alle eksperimenter ble utført i vann. Hvis buffer eller annen type medium er nødvendig for studien, er det bedre å bruke samme medium for agarosepreparat, under seksjonering og i væskecellen i AFM for å unngå å skade prøven. - Hell et 4 mm lag smeltet 3% agarose på bunnen av petriskålen (diameter = 35 mm), og la den avkjøles litt for å forhindre termisk skade på prøven.
- Plasser tre eller fire små stykker (ca. 5 mm lange) av det studerte planteorganet horisontalt på agarose.
MERK: Prøvene skal være halvt nedsenket, men ikke nedsenket i agaroselaget. Hvis prøven ikke er nedsenket, kan den bryte ut av agarosen under vibratomseksjonering. Hvis prøven synker til bunnen, vil den være for nær kanten av seksjonen og bli upraktisk for videre trinn. - Når en tynn, halvfast film vises på toppen av det første laget av agarose (30-60 s), hell forsiktig et andre lag på toppen.
MERK: Det nederste laget av agarose bør ikke stivne helt. Ellers kan de to lagene skille seg fra hverandre under videre arbeid. - Etter at agarosen er fullstendig størknet, kutt ut blokken som inneholder prøven. Form blokken til en sekskantet avkortet pyramide for å sikre stabiliteten under videre seksjonering (figur 1A).
MERK: Prøven kan orienteres vertikalt eller horisontalt i denne blokken, avhengig av hvilken type seksjon som kreves. Når du forbereder blokken, la 2-3 mm agarose ligge rundt prøven. I dette tilfellet vil prøveseksjonen beholdes av laget på 3% agarose, noe som vil lette den videre immobiliseringen (figur 1B).
- Forbered agaroseløsning for rotinnstøping ved å oppløse 3% (w / w) lavsmeltepunkt agarose i vann ved hjelp av en mikrobølgeovn.
- Seksjonere prøven med vibratomen
- Lim blokken til vibratometrinnet med cyanoakrylatlim. Plasser scenen i vibratomen slik at et av pyramidehjørnene vender mot vibratomets blad. Hell vann i vibratomebadet.
- Still inn seksjoneringsparametrene (seksjonstykkelse, bladhastighet og vibrasjonsfrekvens), og kutt prøven.
MERK: Bruk seksjonstykkelsene mellom 200 og 400 μm. En seksjon som er for tynn kan introdusere feil i evalueringen av mekaniske egenskaper, mens en seksjon som er for tykk er utsatt for brudd. En bladhastighet på 1,3 mm · s-1 og en oscillasjonsfrekvens på 90 Hz ble brukt til rug og maisrøtter. - Bruk en fin børste, flytt seksjonen fra vannbadet til en glasssklie, og legg en dråpe vann på seksjonen for å forhindre at den tørker ut. Kontroller kvaliteten på seksjonen under et lysmikroskop.
MERK: Skrå seksjoner kan ikke brukes til å måle elastisitetsmodulen. Cellevegger må være vinkelrett på seksjonsplanet, ellers kan de bøye eller spenne seg under AFM-spissen.
- Immobilisering av seksjonen for AFM-målinger (figur 1B)
- Hell et lag med smeltet 1% (w / w) agarose (~ 1 ml) på bunnen av petriskålhetten ved hjelp av en pipette.
MERK: Pass på at sidene av petriskålhetten ikke hindrer spissen i å nærme seg prøven. Agaroselaget skal være 1 mm tykt og skal dekke hele bunnen av hetten. - Etter at 1% agarose har størknet, fjern overflødig vann fra seksjonen ved å bringe filterpapir til kanten.
MERK: Ikke berør planteseksjonen med papiret for å unngå skade og fullstendig tørking av prøven. - Overfør delen forsiktig fra lysbildet til midten av petriskålhetten ved hjelp av en børste. Bruk en 20 μL pipette, tilsett forsiktig 1% agarose rundt seksjonen (figur 1B).
MERK: 1% agarose bør ikke komme på selve prøven. Det skal bare dekke kantene på 3% agaroselaget som beholder planteprøven. 1% agarose skal danne små knolls på kantene av dette 3% agaroselaget. Store knauser kan hindre utkrageren i å nærme seg prøven. - Hell vannet eller annen løsning som skal brukes til AFM i petriskålhetten med den immobiliserte delen.
- Hell et lag med smeltet 1% (w / w) agarose (~ 1 ml) på bunnen av petriskålhetten ved hjelp av en pipette.
2. AFM forberedelse og kalibrering
MERK: Kraftvolummetoden til AFM genererer et romlig løst utvalg av kraftavstandskurver oppnådd på hvert punkt i det studerte området. Oppnå alle parametere for kraftvolummodus (cantilever stivhet, IOS, etc.) i kontaktmodus. Lignende prosedyrer for instrumenter fra andre produsenter er beskrevet tidligere10,20.
- Velg riktig type utkrager.
MERK: Utkragestivheten må være sammenlignbar med prøvestivheten21. En cantilever som er mye stivere enn prøven, vil ikke avlede mye, mens en utkrager som er for myk, ikke vil deformere prøven nok. En typisk resonansfrekvens bør være tilstrekkelig til å svinge utkrageren i væsken (dvs. være minst noen titalls kHz). Kontaktområdet skal være lite i forhold til størrelsen på celleveggen siden prøven som studeres i Youngs modulberegninger antas å være et uendelig halvrom. Følgende utkragere ble brukt til rug- og maisrøtter: skarpe utkragere med en typisk resonansfrekvens på 60 kHz, en gjennomsnittlig fjærkonstant på 1,5 N·m-1 og en apexradius på 10 nm, eller sfæriske utkragere med en typisk resonansfrekvens på 75 kHz, en gjennomsnittlig fjærkonstant på 2,8 N·m-1, og en toppradius på 150 nm. - Slå på AFM-enheten og tilhørende programvare (materialtabell). Monter utkrageren på spissholderen for væskecellen. Plasser en dråpe væske på spissen for å unngå at det dannes luftbobler på spissen mens du senker den ned i væsken.
MERK: Ved bobledannelse kan væsken fjernes med en presisjonsserviett, og deretter kan en ny dråpe plasseres. - Monter spissholderen på skannehodet.
- Plasser en hard prøve (fersk glasssklie) i en petriskålhette. Hell væsken i den, og sørg for at den dekker lysbildet. Plasser skannehodet på scenen og løft prøven slik at væsken dekker utkrageren.
- Velg Hoder-fanen i rullegardinmenyen Verktøy . Forsikre deg om at skannehodet for væskecellen er valgt.
- Klikk på sikteknappen for å åpne lasersiktevinduet . Klikk på Kamera-knappen for å åpne vinduet Optisk mikroskop . Plasser laseren på tuppen av utkrageren, ved hjelp av skruene på AFM-hodet og vinduet for optisk mikroskop for orientering.
- Velg Semicontact modus fra rullegardinmenyen i hovedvinduet til programmet.
- Åpne Resonans-fanen og velg hvilken type utkragende som brukes i Probes-menyen . Klikk på Auto-knappen for å bestemme resonansfrekvensen.
MERK: Hvis utkrageren som brukes ikke er oppført, åpner du Tools > Probe Passport. Opprett en ny fil, skriv inn cantilever-parametrene, og lagre den. Velg den deretter i rullegardinmenyen Prober . - Velg kontaktmodus fra rullegardinmenyen i hovedvinduet til programmet.
- Klikk på N_Force Cal-knappen for å åpne cantilever kalibreringsvinduet. Velg utkrageren som brukes, og klikk på Sweep-knappen , og deretter Spect Meas-knappen for å bestemme utkragefjærkonstanten ved hjelp av termisk innstillingsprosedyre. Lukk vinduet.
- Sett SetPoint til 1 nA. Åpne kategorien Tilnærming og klikk på Landing-knappen for å nærme deg prøven.
- Åpne kategorien Skanning . Sett skannehastigheten til 0.5 Hz. Klikk på Område-knappen og sett skannestørrelsen til 10 μm x 10 μm og skanningen peker på 256 x 256. Klikk på Kjør-knappen og skann omtrent 20 linjer for å sjekke at det ikke er forurensning på glasset. Klikk på Stopp-knappen for å avslutte skanningen uten å miste data.
- Åpne Kurver-fanen . Sett parametere for tilbaketrekking og tilnærming til henholdsvis 500 nm og -100 nm.
- Velg den siste skanningen i rullegardinmenyen Velg ramme for å observere overflaten.
- Finn et rent område på glasset og angi punktet der kraftdeformasjonskurven skal tas, og klikk på Kjør-knappen for å få kurven. Ta opp tre til fem kraftkurver på forskjellige steder på skanningen.
- Klikk på Data-knappen for å åpne analysevinduet og velg rammen med kraftdeformasjonskurven.
- Klikk på Parmarkører-knappen og angi den lineære delen av tilbaketrekningskurven for å beregne forholdet mellom DFL-signalet og forskyvningen, som er den inverse optiske følsomheten (IOS, nA nm-1) eller avbøyningsfølsomheten.
- Gjenta trinn 2.17 for alle registrerte kurver og skriv ned alle beregnede verdier av DFL-signal-til-forskyvningsforholdet. De skal være de samme.
- Lukk analysevinduet, klikk kategorien Tilnærming , og deretter Fjern-knappen for å trekke sonden tilbake fra prøven.
3. Datainnsamling
- Veiled prøven under AFM-utkrageren ved hjelp av det optiske mikroskopet. Klikk kategorien Tilnærming , og deretter Landing-knappen for å nærme seg prøven i kontaktmodus med et settpunkt på 1 nA.
- Klikk på kategorien Skanning , og deretter Område-knappen . Velg arealstørrelsen på 70 μm x 70 μm for å skanne.
- Klikk på Move Probe-knappen og sjekk hele skanneområdet ved å flytte skanneren over den. Basert på graden av skannerfremspring, finn det høyeste punktet.
- Åpne Tilnærming-fanen , og klikk deretter på Fjern-knappen for å trekke seg fra prøven. Bruk det høyeste punktet som mål, og klikk på Landing-knappen for å nærme deg prøven igjen. Kontroller deretter overflaten igjen ved å klikke på Flytt sonde-knappen og flytte skanneren over den. Ingen av punktene i området skal kreve at skanneren er helt hevet.
MERK: Ideelt sett bør skannerens z-område overstige høydeforskjellen på prøven. Det er imidlertid akseptabelt hvis noen punkter på skanneområdet er under skannerens kapasitet. Samtidig bør det ikke være mange slike punkter. Store områder som ikke kan nås med skanneren kan føre til skanning abort. - Sett skannehastigheten til 0.5 Hz. Sett skannestørrelsen til 70 μm x 70 μm og skannepunktet til 64 x 64. Klikk på Kjør-knappen og skann for å sjekke overflaten av prøven og dens mulige forurensning med agarose.
MERK: Hvis prøven har celler med et stort lumen, kan størrelsen på skanneområdet reduseres, eller det bør flyttes slik at det er flere cellevegger på skanningen. - Klikk på På-knappen øverst i hovedvinduet for å slå av tilbakemeldingssløyfen.
- Velg HDPlus-modus (force-volume method) i rullegardinmenyen i hovedvinduet til programmet. Et ekstra vindu (HD-vindu) vises.
- Sett SetPoint til 0,1 nA i hovedprogramvinduet.
- I hovedfanen i HD-vinduet angir du skanningsparametrene (amplitude og frekvens av sinusformet cantilever bevegelse) som passer til den studerte prøven.
MERK: Hver type prøve og utkrager krever valg av skanneparametere. Noen foreløpige eksperimenter er nødvendige. For mais- eller rugrøtter ble skarpe og sfæriske cantilevers brukt ved en amplitude på 400 nm og en frekvens på 300 Hz. - Åpne Støy-fanen i HD-vinduet og skriv inn resonansfrekvensen til utkrageren.
- Åpne Quant-fanen i HD-vinduet og skriv inn IOS, cantilever Stiffness og spissradius og vinkel. Velg kontaktmodellen som skal brukes til beregninger avhengig av spissgeometri.
MERK: DMT-modellen tar hensyn til adhesjonskraften som eksisterer mellom sonden og prøven, og brukes mest i mekanobiologi21. - Åpne skannefanen i HD-vinduet og velg signalene som skal spilles inn. Velg retningen signalet spilles inn i. Merk av for Kraftvolum for å få en oversikt over alle kraftkurver.
MERK: Ta opp elastisitetsmodulsignalet i både fremover og bakover. Det vil gi flere poeng å beregne. - Klikk på Av-knappen øverst i hovedprogramvinduet for å slå på tilbakemeldingssløyfen.
- Klikk på PhaseCorr-knappen i HD-hovedvinduet for å korrigere følsomheten til det optiske systemet.
- Vs-tidsfanen i HD-hovedvinduet presenterer funksjonen til DFL-signalet vs. tid i sanntid; Velg delene av denne funksjonen som skal brukes til bestemmelse av grunnlinjenivå og for å tilpasse kontaktmodellen for videre beregninger.
- Sett skannepunktverdien til 256 x 256 i hovedvinduet til programmet. Sett skannehastigheten til 0.2 Hz og klikk på Kjør-knappen for å skanne prøven.
- Etter at skanningen stopper, klikker du på På-knappen øverst i hovedvinduet for å slå av tilbakemeldingssløyfen.
- Velg Kontaktmodus i rullegardinmenyen, åpne Tilnærming-fanen , og klikk på Fjern-knappen for å trekke seg fra prøven.
- Klikk på Data-knappen for å åpne analyseprogramvaren og lagre utdataene.
- På slutten av måledagen, fjern utkragespissen fra hodet og skyll den forsiktig med ultrarent vann flere ganger. Fjern vannet hver gang med en presisjonsserviett.
4. Dataevaluering og etterbehandling
MERK: Ikke stol på elastiske modulverdier beregnet automatisk. Siden overflaten varierer sterkt i høyden, bør mange artefaktkurver utvises.
- Åpne den lagrede filen i analyseprogramvaren.
- Velg HDForceVolume-rammen .
- Hold nede Ctrl-tasten og velg en visuell ramme oppnådd i samme skanneretning. Klikk på Last inn eksternt kart-knappen for å se hvor celleveggene er plassert.
MERK: Ethvert signalkart kan brukes som en visuell ramme, men bruk av DFL-signalkartet (forskjellige instrumenter kan referere til det som et avbøyningssignal eller feilsignal) kan være den enkleste måten. - Merk av for InvOptSens (IOS) og cantilever Stiffness i kategorien Hoved .
- Åpne kategorien Tillegg og sjekk tipsparametrene og kontaktmodellen.
- Klikk på forskjellige punkter på celleveggene på den visuelle rammen og velg bare de kurvene som er godt beskrevet av modellen. Se Representative resultater for mer informasjon.
- Skriv ned de oppnådde verdiene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiske elastiske modul- og DFL-kart, samt kraftkurver oppnådd på rug- og maisrøtter ved den beskrevne metoden, er presentert i figur 2. Figur 2A viser elastiske modul- og DFL-kart oppnådd på den tverrgående delen av rugens primære rot. De hvite områdene i modulkartet (figur 2A, til venstre) tilsvarer en feilaktig overestimering av Youngs modul på grunn av at skanneren når grensen i z-retningen. Dette bildet er ikke praktisk å bruke som et eksternt kart for et videre utvalg av tilfredsstillende kraftkurver. DFL-signalkartet (avbøynings-/feilkart) som presenteres til høyre (figur 2A) er bedre egnet til dette formålet.
Modulkartene over tverrgående og langsgående deler av maisroten er vist i figur 2B,C. Skanneren som har blitt fullstendig utvidet mens du prøver å nå bunnen av prøven, kan resultere i feilaktige målinger og til og med avbrutte skanninger (øverste del av figur 2C). Noen ganger, etter å ha fått en god skanning i kontaktmodus, trekker instrumentet plutselig skanneren helt sammen, og alarmerer at den har nådd maksimal z-retningsgrense når den bytter til kraftvolummodus. Det betyr at prøven ikke ble immobilisert riktig og fløt opp. En ny prøve skal utarbeides.
Agaroseforurensningen kan også være en grunn til å lage en ny prøve (figur 2D, E). Tilstedeværelsen av agarose kan kontrolleres mens du utfører den første skanningen i kontaktmodus (trinn 3.5). Ideelt sett bør celleveggene og noen cellebunner være synlige på slike skanninger (figur 2D); Ved unøyaktig immobilisering kan overflaten imidlertid dekkes med agarose (figur 2E), som maskerer prøvetopografien.
Figur 2F viser fire forskjellige kraftkurver registrert på forskjellige punkter i samme cellevegg. Kurven som registreres ved punkt 1, viser ingen grunnlinje. Det betyr at det ikke var noen separasjon av utkragespissen fra celleveggen. Modulen beregnet fra denne kurven ble overvurdert. Kurven registrert på punkt 3 viser en skulder på den nærliggende delen. Denne gjenstanden kan indikere at celleveggen ble bøyd. Begge kurvene registrert på punkt 1 og 3 skal utvises. Punkt 2 og 4 viser tilfredsstillende kraftkurver med tilsvarende verdier av moduli. Følgende kriterier kan brukes til å skille riktige kurver: (i) grunnlinjenivået skal være tydelig på både nærliggende og tilbaketrekkende deler av kurven; (ii) det skal ikke være uregelmessigheter som skuldre eller feil (vises henholdsvis som konstante kraftverdier og en plutselig reduksjon av kraftverdier midt i skråningen); (iii) den valgte modellen skal passe kurven godt. For alle valgte kurver skal verdiene for maksimal påført kraft være like. En maksimal påført kraft som er betydelig høyere eller lavere enn forventet verdi, kan også brukes som kriterium for kurveutvisning. Bruk av nevrale nettverk for å kaste bort kurver av dårlig kvalitet19 kan øke hastigheten på behandlingen av resultater.
Figur 1: Kritiske trinn i prøvepreparering . (A) Rotfragment innebygd i en blokk med agarose og montert på vibratometrinnet. (B) Prøveseksjon plassert på toppen av et lag med 1% agarose og immobilisert med ekstra agarose i en petriskålhette. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Typiske AFM-bilder og målinger på primærrøtter . (A) Elastisitetsmodul og DFL-kart over en tverrgående del av rugroten. Fullt registrert (B) og avbrutt (C) kart over elastisitetsmodul oppnådd på langsgående og tverrgående seksjoner av maisrot. 3D-visning av rene (D) og agarosedekkede (E) deler av maisrøtter. (F) Et DFL-kart over en tverrgående del av maisrot. Punkt 1-4 på celleveggen viser posisjonene der kraftkurvene som ble presentert på høyre side av bildet ble registrert. Den røde linjen er for å nærme seg, den blå linjen er for tilbaketrekning, og den svarte linjen viser kontaktmekanikkens modelltilpasning. Kurvene som registreres på punkt 1 og 3 har artefakter og kan ikke brukes til beregninger. Rugrøtter ble undersøkt med skarpe spisser, og maisrøtter ble undersøkt med sfæriske spisser. Forkortelser: Rhiz = rhizodermis, Exo = exodermis, OC = ytre cortex, IC = indre cortex, End = endodermis, Per = pericycle, og VP = vaskulær parenchyma. Skala barer = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De mekaniske egenskapene til de primære celleveggene bestemmer retningen og hastigheten på plantecelleveksten, og dermed plantens fremtidige størrelse og form. Den AFM-baserte metoden som presenteres her utfyller eksisterende teknikker som brukes til å studere egenskapene til plantecellevegger. Det gjør at elastisiteten til cellevegger, som tilhører plantens indre vev, kan undersøkes. Ved hjelp av den presenterte metoden ble de mekaniske egenskapene til cellevegger i forskjellige vev av den voksende maisroten kartlagt, og en matematisk modell ble konstruert basert på disse egenskapene6. Den simulerte roten reagerte på anvendelsen av trykkimiterende turgor ved endringer i lineær størrelse. Disse endringene var i samme område og i motsatt retning som de som ble vist av en nyskåret rot i plasmolyserende medium6.
Prøveprepareringen er avgjørende for denne protokollen. Tørking av prøven bør unngås under hele preparatet. Riktig plassering av plantematerialet som skal seksjoneres er et viktig spørsmål; Celleveggene må være orientert strengt vinkelrett på det fremtidige skanneplanet. Ellers vil utilfredsstillende kraftdeformasjonskurver oppnås fordi celleveggen er bøyd eller spent. Den agarose-innebygde delen skal festes tett med ekstra agarose (figur 2B). Sistnevnte bør ikke komme inn på prøven, ellers vil agaroseegenskapene bli målt. Den viktigste delen av denne protokollen er å filtrere de resulterende kraftkurvene. Selv studier av modellobjekter, for eksempel AFM-kalibreringsgitter, kan resultere i en betydelig andel av feilaktige kraftdeformasjonskurver22. Direkte bruk av de beregnede modulverdiene uten å analysere de underliggende kraftdeformasjonskurvene kan føre til feil konklusjoner (figur 2F).
Teknikken er ikke begrenset av lokalisering av cellen eller størrelsen på planteorganer. Objekter som er for små er imidlertid vanskelige å kutte, orientere og immobilisere. Celler med stort lumen er vanskelige å jobbe med siden det er stor sannsynlighet for skanneavbrudd (figur 2C).
Med alle fordelene ved å bruke ikke-faste planteseksjoner utarbeidet med en vibratome, er det minst to avgjørende problemer: muligheten for å utvikle en stressreaksjon etter kutting av plantemateriale, og muligheten for delvis oppløseliggjøring av materiale fra kuttcelleveggene. Begge kan føre til endringer i sammensetningen og egenskapene til cellevegger. Tilstedeværelsen av umiddelbar stressrespons på kuttet ble testet på Arabidopsis apices10. Ingen signifikant effekt på de observerte egenskapene ble rapportert. Eksperimenter ble utført for å teste endringer i egenskapene til kuttede cellevegger under inkubasjon i vann19. Det var ingen stabil trend i tilsynelatende Youngs modulverdier målt på samme vegg av maisrot i minst en halv times periode19. Det er imidlertid bedre å opprettholde forsøkstiden så kort som mulig og sjekke hvert eksemplar for slike endringer under inkubasjon av prøven i vann.
AFM er en kraftig teknikk for å studere plantecellevegger. Det er imidlertid åpenbart at beregninger av elastisitetsmodul, stivhet og vedheft er basert på flere forutsetninger som ikke oppfylles av plantecellevegger. Alle modeller av kontaktmekanikk som brukes av AFM, anser det undersøkte eksemplaret som et uendelig halvrom av isotropisk materiale, noe som ikke gjelder for plantecellevegger. Samtidig antas det at geometrien og egenskapene til indenter er nøyaktig målt og konstant over utkragets levetid, noe som også kan være feil. I tillegg utviser plantecellevegger kompleks mekanisk oppførsel som involverer elastiske, viskoelastiske og plastkomponenter, og vanligvis kan bare en av disse måles i et enkelt eksperiment. Likevel korrelerer dataene oppnådd ved hjelp av AFM-baserte metoder pålitelig med plantecelleveksten og mekanisk ytelse i forskjellige organer og arter 3,4,5,6. Alt dette betyr at både selve teknikken og forståelsen av dataene som er oppnådd med den, kan forbedres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi ønsker å anerkjenne Dr. Dmitry Suslov (St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russland) og Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russland) for å gi mais og rugfrø, henholdsvis. Den presenterte metoden ble utviklet innenfor rammen av den russiske vitenskapsstiftelsens prosjekt nr. 18-14-00168 tildelt LK. Den delen av arbeidet (innhenting av resultatene som ble presentert) ble utført av AP med økonomisk støtte fra regjeringsoppdraget til FRC Kazan Scientific Center of RAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al.
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
