Summary
Исследования биомеханики клеточных стенок необходимы для понимания роста и морфогенеза растений. Следующий протокол предлагается исследовать тонкие первичные клеточные стенки во внутренних тканях молодых органов растений с помощью атомно-силовой микроскопии.
Abstract
Механические свойства первичных клеточных стенок определяют направление и скорость роста растительных клеток и, следовательно, будущие размеры и форму растения. Для измерения этих свойств было разработано много сложных методов; однако атомно-силовая микроскопия (АСМ) остается наиболее удобной для изучения упругости клеточной стенки на клеточном уровне. Одним из наиболее важных ограничений этого метода было то, что только поверхностные или изолированные живые клетки могут быть изучены. Здесь представлено использование атомно-силовой микроскопии для исследования механических свойств первичных клеточных стенок, принадлежащих внутренним тканям растительного тела. Этот протокол описывает измерения кажущегося модуля Юнга клеточных стенок в корнях, но метод также может быть применен к другим органам растений. Измерения проводятся на вибратомных участках растительного материала в жидкой клетке, что позволяет (i) избежать использования плазмолизирующих растворов или пропитки образца воском или смолой, (ii) сделать эксперименты быстрыми и (iii) предотвратить обезвоживание образца. Как антиклинальные, так и периклинальные клеточные стенки могут быть изучены, в зависимости от того, как образец был разделен. Различия в механических свойствах разных тканей могут быть исследованы в одном срезе. В протоколе описаны принципы планирования исследования, вопросы подготовки образцов и измерений, а также метод выбора силовых деформационных кривых во избежание влияния топографии на полученные значения модуля упругости. Метод не ограничен размером выборки, но чувствителен к размеру клеток (т.е. клетки с большим просветом трудно исследовать).
Introduction
Механические свойства клеточной стенки растения определяют форму клетки и ее способность расти. Например, растущий кончик пыльцевой трубки мягче, чем нерастающие части той же трубки1. Образованию примордий на меристеме Arabidopsis предшествует локальное снижение жесткости клеточной стенки на месте будущего примордия 2,3. Клеточные стенки Arabidopsis hypocotyl, которые параллельны основной оси роста и растут быстрее, мягче, чем те, которые перпендикулярны этой оси и растут медленнее 4,5. У корня кукурузы переход клеток от деления к удлинению сопровождался снижением модулей упругости во всех тканях корня. Модули оставались низкими в зоне удлинения и увеличивались в зоне позднего удлинения6.
Несмотря на наличие различных методов, большие массивы биохимической и генетической информации по биологии клеточных стенок, получаемые ежегодно, редко сравниваются с механическими свойствами клеточных стенок. Например, мутанты на генах, связанных с клеточной стенкой, часто имеют измененный рост и развитие 4,7,8, но редко описываются в терминах биомеханики. Одной из причин этого является сложность проведения измерений на клеточном и субклеточном уровнях. Атомно-силовая микроскопия (AFM) в настоящее время является основным подходом для таких анализов9.
В последние годы были проведены многочисленные исследования биомеханики клеточной стенки растений на основе AFM. Исследованы механические свойства клеточных стенок наружных тканей Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 и лука12, а также культивируемых клеток 13,14,15. Однако поверхностные клетки растения могут иметь клеточные стенки, механические свойства которых отличаются от механических свойств внутренних тканей6. Кроме того, растительные клетки находятся под давлением тургора, что делает их более жесткими. Чтобы избавиться от влияния тургорного давления, исследователям приходится использовать плазмолизирующие растворы 2,3,4,5,10,11 или разлагать полученные значения на тургор и вклады клеточной стенки12. Первый подход приводит к обезвоживанию образца и изменяет толщину и свойства клеточной стенки16, в то время как второй подход требует дополнительных измерений и сложной математики и применяется только к клеткам относительно простой формы12. Свойства клеточных стенок внутренних тканей могут быть оценены на криосекции17 или участках растительного материала, пропитанных смолой8. Однако оба метода предполагают обезвоживание и/или пропитку образцов, что неизбежно приводит к изменению свойств. Свойства изолированных или культивируемых клеток трудно соотнести с физиологией всего растения. Как культивирование, так и изоляция растительных клеток могут влиять на механические свойства их клеточных стенок.
Представленный здесь метод дополняет вышеупомянутые подходы. С его помощью можно исследовать первичные клеточные стенки любой ткани и на любой стадии развития растений. Секционирование и наблюдения AFM проводились в жидкости, что позволяет избежать обезвоживания образца. Проблема тургора была решена по мере разрезания клеток. Протокол описывает работу с корнями кукурузы и ржи, но любой другой образец может быть исследован, если он подходит для вибратомного сечения.
Описанные здесь исследования AFM были выполнены с использованием метода силы-объема. Различные инструменты используют разные названия для этого метода. Однако основной принцип тот же; карта силы-объема образца получается синусоидальным или треугольным движением консольного аппарата (или образца) для достижения определенной силы нагрузки в каждой анализируемой точке при регистрации консольного отклонения18. Результат объединяет топографическое изображение поверхности и массив кривых силы-расстояния. Каждая кривая используется для расчета деформации, жесткости, модуля Юнга, адгезии и рассеивания энергии в определенной точке. Аналогичные данные могут быть получены путем точечной силовой спектроскопии после сканирования в контактном режиме19, хотя это более трудоемко.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Пробоподготовка к измерениям AFM
- Растительный материал: Стерилизовать семена кукурузы (Zea mays L.) и ржи (Secale cereale L.) 0,35% раствором NaOCl в течение 10 мин, промыть 3 раза дистиллированной водой, а затем выращивать гидропонно в темноте при 27 °C в течение 4 дней и 2 дней соответственно. Для эксперимента использовались первичные корни.
- Подготовка растворов и образцов для вибратомного сечения
- Готовят раствор агарозы для встраивания корней, растворяя 3% (мас./мас.) агарозу с низкой температурой плавления в воде с помощью микроволновой печи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводились в воде. Если для исследования требуется буферная или любая другая среда, лучше использовать ту же среду для приготовления агарозы, во время секционирования и в жидкой клетке АСМ, чтобы избежать повреждения образца. - Налейте 4-миллиметровый слой расплавленной 3% агарозы на дно чашки Петри (диаметр = 35 мм) и дайте ему слегка остыть, чтобы предотвратить термическое повреждение образца.
- Поместите три или четыре небольших кусочка (длиной около 5 мм) исследуемого растительного органа горизонтально на агарозу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть наполовину погружены, но не погружены в слой агарозы. Если образец не погружен, он может вырваться из агарозы во время вибратомного сечения. Если образец опустится на дно, он окажется слишком близко к краю секции и станет неудобным для дальнейших шагов. - Когда сверху на первом слое агарозы появится тонкая, полутвердая пленка (30-60 с), аккуратно залейте сверху второй слой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нижний слой агарозы не должен полностью затвердевать. В противном случае два слоя могут отделяться друг от друга во время дальнейшей работы. - После того, как агароза полностью затвердеет, вырежьте блок, содержащий образец. Придайте блоку форму шестиугольной усеченной пирамиды, чтобы обеспечить его стабильность при дальнейшем сечении (рисунок 1А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Образец может быть ориентирован вертикально или горизонтально внутри этого блока в зависимости от типа требуемого участка. При приготовлении блока оставьте 2-3 мм агарозы вокруг экземпляра. В этом случае сечение образца будет удерживаться слоем 3% агарозы, что облегчит его дальнейшую иммобилизацию (рисунок 1В).
- Готовят раствор агарозы для встраивания корней, растворяя 3% (мас./мас.) агарозу с низкой температурой плавления в воде с помощью микроволновой печи.
- Секционирование образца вибратомом
- Приклейте блок к стадии вибратома цианоакрилатным клеем. Поместите сцену в вибратом так, чтобы один из углов пирамиды был обращен к лезвию вибратома. Налейте воду в вибратомную ванну.
- Установите параметры сечения (толщина сечения, скорость лезвия и частота вибрации) и вырежьте образец.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте толщину сечения от 200 до 400 мкм. Слишком тонкий участок может внести ошибки в оценку механических свойств, в то время как слишком толстый участок склонен к поломке. Для корней ржи и кукурузы использовались скорость лопасти 1,3 мм·с-1 и частота колебаний 90 Гц. - Используя тонкую щетку, переместите секцию с водяной бани на стеклянную горку и поместите каплю воды на секцию, чтобы предотвратить ее высыхание. Проверьте качество секции под световым микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Косые сечения не могут быть использованы для измерения модуля упругости. Клеточные стенки должны быть перпендикулярны плоскости сечения, иначе они могут изгибаться или прогибаться под наконечником AFM.
- Иммобилизация секции для измерений АСМ (рисунок 1В)
- Вылейте слой расплавленной 1% (мас./мас.) агарозы (~1 мл) на дно крышки чашки Петри с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что боковые стороны крышки чашки Петри не препятствуют приближению наконечника к образцу. Слой агарозы должен быть толщиной 1 мм и должен покрывать все дно шляпки. - После того, как 1% агарозы затвердеет, удалите лишнюю воду из секции, поднеся фильтровальную бумагу к ее краю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к секции растения бумагой, чтобы избежать повреждения и полного высыхания образца. - Аккуратно перенесите срез от слайда к центру крышки чашки Петри с помощью кисти. Используя пипетку объемом 20 мкл, осторожно добавьте 1% агарозы вокруг сечения (рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: 1% агарозы не должен попадать на сам образец. Он должен покрывать только края 3% агарозного слоя, который удерживает образец растения. 1% агароза должна образовывать небольшие узелки по краям этого 3% агарозного слоя. Большие узелки могут препятствовать приближению консольного аппарата к образцу. - Налейте воду или другой раствор, который будет использоваться для AFM, в крышку чашки Петри с обездвиженной секцией.
- Вылейте слой расплавленной 1% (мас./мас.) агарозы (~1 мл) на дно крышки чашки Петри с помощью пипетки.
2. Подготовка и калибровка АСМ
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод «сила-объем» AFM генерирует пространственно разрешенный массив кривых силы-расстояния, полученных в каждой точке исследуемой области. Получить все параметры для режима сила-объем (консольная жесткость, IOS и т.д.) в контактном режиме. Аналогичные процедуры для приборов других производителей были описаны ранее10,20.
- Выберите подходящий тип консольного устройства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Консольная жесткость должна быть сопоставима с жесткостью образца21. Консоль, которая намного жестче, чем образец, не будет сильно отклоняться, в то время как консоль, которая слишком мягкая, не будет достаточно деформировать образец. Типичная резонансная частота должна быть достаточной для раскачивания консольного аппарата в жидкости (т.е. быть не менее нескольких десятков кГц). Площадь контакта должна быть небольшой по сравнению с размером клеточной стенки, поскольку исследуемый образец в расчетах модуля Юнга предполагается бесконечным полупространством. Для корней ржи и кукурузы использовались следующие кантилеверы: острые кантилеверы с типичной резонансной частотой 60 кГц, средней постоянной пружины 1,5 Н·м-1 и радиусом вершины 10 нм или сферические консольные с типичной резонансной частотой 75 кГц, средней постоянной пружины 2,8 Н·м-1, и радиус вершины 150 нм. - Включите устройство AFM и связанное с ним программное обеспечение (Таблица материалов). Установите консоль на держатель наконечника для жидкой ячейки. Поместите каплю жидкости на наконечник, чтобы избежать образования пузырьков воздуха на наконечнике при погружении его в жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае образования пузырьков жидкость может быть удалена с помощью прецизионной протирки, а затем может быть помещена новая капля. - Установите держатель наконечника на сканирующую головку.
- Поместите твердый образец (свежий стеклянный слайд) в крышку чашки Петри. Налейте в него жидкость, убедившись, что она покрывает горку. Поместите сканирующую головку на сцену и поднимите образец так, чтобы жидкость покрыла консоль.
- Выберите вкладку «Головы» в раскрывающемся меню «Сервис ». Убедитесь, что выбрана сканирующая головка для жидкой ячейки.
- Нажмите на кнопку Прицеливание , чтобы открыть окно Лазерное прицеливание . Нажмите кнопку Камера , чтобы открыть окно Оптический микроскоп . Расположите лазер на кончике консольного аппарата, используя винты на головке AFM и окне оптического микроскопа для ориентации.
- Выберите полуконтактный режим из выпадающего меню в главном окне программы.
- Откройте вкладку Резонанс и выберите тип консольного аппарата, который будет использоваться в меню Зонды . Нажмите на кнопку Авто , чтобы определить резонансную частоту.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используемого консольного устройства нет в списке, откройте Инструменты > Паспорт зонда. Создайте новый файл, введите параметры консольного устройства и сохраните его. Затем выберите его в раскрывающемся меню Зонды . - Выберите режим Контакт из выпадающего меню в главном окне программы.
- Нажмите кнопку N_Force Cal , чтобы открыть окно консольной калибровки. Выберите используемый консоль и нажмите кнопку Sweep , а затем кнопку Spect Meas , чтобы определить константу консольной пружины с помощью процедуры тепловой настройки. Закройте окно.
- Установите для параметра SetPoint значение 1 нА. Откройте вкладку Подход и нажмите кнопку Посадка , чтобы приблизиться к образцу.
- Откройте вкладку Сканирование . Установите скорость сканирования на 0,5 Гц. Нажмите кнопку «Область» и установите размер сканирования 10 мкм x 10 мкм, а точку сканирования — 256 x 256. Нажмите кнопку «Выполнить» и отсканируйте около 20 строк, чтобы убедиться, что на стекле нет загрязнения. Нажмите кнопку Стоп , чтобы завершить сканирование без потери данных.
- Откройте вкладку Кривые . Задайте параметры для втягивания и приближения к 500 нм и -100 нм соответственно.
- Выберите последнее сканирование в раскрывающемся меню Выбрать кадр , чтобы наблюдать за поверхностью.
- Найдите чистую область на стекле и укажите точку, где должна быть взята кривая деформации силы, и нажмите кнопку «Выполнить », чтобы получить кривую. Запишите от трех до пяти кривых силы в разных местах сканирования.
- Нажмите на кнопку Данные , чтобы открыть окно анализа и выбрать кадр с кривой деформации силы.
- Нажмите на кнопку Pair Markers и укажите линейную часть кривой втягивания, чтобы рассчитать отношение сигнала DFL к смещению, которое является обратной оптической чувствительностью (IOS, nA нм-1) или чувствительностью отклонения.
- Повторите шаг 2.17 для всех записанных кривых и запишите все рассчитанные значения отношения сигнала DFL к смещению. Они должны быть одинаковыми.
- Закройте окно анализа, перейдите на вкладку Подход , а затем нажмите кнопку Удалить , чтобы отозвать зонд из образца.
3. Сбор данных
- Направьте образец под консоль AFM с помощью оптического микроскопа. Перейдите на вкладку Подход , а затем кнопку Посадка , чтобы приблизиться к образцу в режиме контакта с параметром SetPoint 1 нА.
- Перейдите на вкладку Сканирование , а затем на кнопку Область . Выберите размер области 70 мкм x 70 мкм для сканирования.
- Нажмите кнопку «Переместить зонд» и проверьте всю область сканирования, переместив сканер над ней. Исходя из степени протрузии сканера, найдите самую высокую точку.
- Откройте вкладку Подход , затем нажмите кнопку Удалить , чтобы отозвать образец. Используя самую высокую точку в качестве цели, нажмите на кнопку Посадка , чтобы снова приблизиться к образцу. Затем снова проверьте поверхность, нажав кнопку Move Probe и переместив сканер по ней. Ни одна из точек в этой области не должна требовать полного поднятия сканера.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале z-диапазон сканера должен превышать перепад высот образца. Тем не менее, это приемлемо, если некоторые точки в области сканирования находятся ниже емкости сканера. При этом таких точек быть не должно. Большие площади, которые не могут быть достигнуты сканером, могут привести к сканирующему аборту. - Установите скорость сканирования на 0,5 Гц. Установите размер сканирования 70 мкм x 70 мкм, а точку сканирования — 64 x 64. Нажмите на кнопку «Выполнить» и просканируйте, чтобы проверить поверхность образца и его возможное загрязнение агарозой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если образец имеет клетки с большим просветом, размер области сканирования может быть уменьшен или его следует переместить так, чтобы на сканировании было больше клеточных стенок. - Нажмите кнопку Вкл . в верхней части главного окна, чтобы отключить петлю обратной связи.
- Выберите режим HDPlus (метод сила-громкость) в выпадающем меню в главном окне программы. Появится дополнительное окно (HD окно).
- Установите для параметра SetPoint значение 0,1 нА в главном окне программы.
- На вкладке Main окна HD задайте параметры сканирования (амплитуда и частота синусоидального консольного движения), соответствующие исследуемому образцу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый тип образца и консольный требует выбора параметров сканирования. Необходимы некоторые предварительные эксперименты. Для корней кукурузы или ржи использовались острые и сферические консольные с амплитудой 400 нм и частотой 300 Гц. - Откройте вкладку «Шумы » в окне HD и введите резонансную частоту консольного устройства.
- Откройте вкладку «Квант » окна HD и введите IOS, консольную жесткость, радиус и угол наклона наконечника. Выберите модель контакта, которая будет использоваться для расчетов в зависимости от геометрии наконечника.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модель DMT учитывает силу адгезии, существующую между зондом и образцом, и чаще всего используется в механобиологии21. - Откройте вкладку Сканирование окна HD и выберите сигналы для записи. Выберите направление, в котором записывается сигнал. Установите флажок Громкость Силы , чтобы получить запись всех кривых силы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запись сигнала модуля упругости как в прямом, так и в обратном направлениях. Это даст больше баллов для расчета. - Нажмите кнопку Выкл. в верхней части главного окна программы, чтобы включить цикл обратной связи.
- Нажмите на кнопку PhaseCorr в главном окне HD, чтобы исправить чувствительность оптической системы.
- Вкладка vs Time главного окна HD представляет функцию сигнала DFL против времени в режиме реального времени; выбрать части этой функции, которые будут использоваться для определения базового уровня и соответствия контактной модели для дальнейших расчетов.
- Установите значение Scan Point равным 256 x 256 в главном окне программы. Установите скорость сканирования на 0,2 Гц и нажмите кнопку Выполнить , чтобы отсканировать образец.
- После остановки сканирования нажмите кнопку «Вкл.» в верхней части главного окна, чтобы отключить петлю обратной связи.
- Выберите Режим контакта в раскрывающемся меню, откройте вкладку Подход и нажмите кнопку Удалить , чтобы отозвать образец.
- Нажмите кнопку Данные , чтобы открыть программное обеспечение для анализа и сохранить выходные данные.
- В конце измерительного дня снимите с головы держатель консольного наконечника и несколько раз тщательно промойте его сверхчистой водой. Каждый раз удаляйте воду с помощью точной протирки.
4. Оценка и постобработка данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Не полагайтесь на значения модуля упругости, рассчитанные автоматически. Поскольку поверхность сильно варьируется по высоте, многие кривые артефактов должны быть удалены.
- Откройте сохраненный файл в аналитическом программном обеспечении.
- Выберите кадр HDForceVolume .
- Удерживая нажатой клавишу Ctrl, выберите один визуальный кадр, полученный в том же направлении сканирования. Нажмите кнопку Загрузить внешнюю карту , чтобы увидеть, где расположены клеточные стенки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любая карта сигналов может быть использована в качестве визуальной рамки, но использование карты сигналов DFL (различные инструменты могут называть ее сигналом отклонения или сигналом ошибки) может быть самым простым способом. - Проверьте значения InvOptSens (IOS) и консольной жесткости на вкладке Главная .
- Откройте вкладку Дополнительно и проверьте параметры наконечника и контактную модель.
- Нажимайте на различные точки на клеточных стенках на визуальном фрейме и выбирайте только те кривые, которые хорошо описаны моделью. Подробности см. в разделе Репрезентативные результаты.
- Запишите полученные значения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичные карты модулей упругости и DFL, а также кривые силы, полученные на корнях ржи и кукурузы описанным способом, представлены на фиг.2. На рисунке 2А показаны карты модулей упругости и DFL, полученные на поперечном сечении первичного корня ржи. Белые области на карте модулей (рисунок 2A, слева) соответствуют ошибочному завышению модуля Юнга из-за того, что сканер достигает своего предела в z-направлении. Это изображение неудобно использовать в качестве внешней карты для дальнейшего выбора удовлетворительных кривых силы. Карта сигналов DFL (карта отклонений/ошибок), представленная справа (рисунок 2A), лучше подходит для этой цели.
Карты модулей поперечных и продольных участков корня кукурузы показаны на рисунке 2B,C. Сканер, который был полностью расширен при попытке достичь нижней части образца, может привести к ошибочным измерениям и даже прерванному сканированию (верхняя часть рисунка 2C). Иногда, получив хорошее сканирование в контактном режиме, прибор внезапно полностью сжимает сканер, тревожа, что он достиг максимального предела z-направления при переключении в режим силы-громкости. Это означает, что образец не был обездвижен должным образом и всплыл вверх. Должен быть подготовлен новый образец.
Загрязнение агарозой также может быть причиной для подготовки нового образца (рисунок 2D, E). Наличие агарозы может быть проверено при получении первого сканирования в режиме контакта (шаг 3.5). В идеале клеточные стенки и некоторые клеточные дна должны быть видны на таких сканированиях (рисунок 2D); однако в случае неточной иммобилизации поверхность может быть покрыта агарозой (рис. 2Е), которая маскирует топографию образца.
На рисунке 2F показаны четыре различные кривые силы, записанные в разных точках одной и той же клеточной стенки. Кривая, записанная в точке 1, не показывает базовой линии. Это означает, что не было отделения кончика консольной части от клеточной стенки. Модуль, рассчитанный по этой кривой, был завышен. Кривая, записанная в точке 3, показывает плечо на приближающейся части. Этот артефакт может указывать на то, что клеточная стенка была изогнута. Обе кривые, записанные в точках 1 и 3, должны быть исключены. Точки 2 и 4 показывают удовлетворительные силовые кривые с аналогичными значениями модулей. Для различения надлежащих кривых можно использовать следующие критерии: i) базовый уровень должен быть очевиден как на приближающейся, так и на убирающейся частях кривой; ii) не должно быть таких неровностей, как плечи или неисправности (проявляется в виде постоянных значений силы и внезапного уменьшения значений силы в середине наклона, соответственно); iii) выбранная модель должна хорошо соответствовать кривой. Для всех выбранных кривых максимальные значения приложенной силы должны быть одинаковыми. Максимальная приложенная сила, которая значительно выше или ниже ожидаемого значения, также может быть использована в качестве критерия для отклонения кривой. Использование нейронных сетей для отбрасывания некачественных кривых19 может ускорить обработку результатов.
Рисунок 1: Критические этапы пробоподготовки. (A) Фрагмент корня встроен в блок агарозы и установлен на стадии вибратома. (B) Участок образца помещается поверх слоя 1% агарозы и иммобилизуется с дополнительной агарозой в крышке чашки Петри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Типичные изображения и измерения AFM на первичных корнях. (A) Карты модуля упругости и DFL поперечного сечения корня ржи. Полностью записанные (В) и прерванные (В) карты модуля упругости, полученные на продольных и поперечных участках корня кукурузы. 3D-вид чистых (D) и покрытых агарозой (E) участков корней кукурузы. (F) Карта DFL поперечного среза корня кукурузы. Точки 1-4 на клеточной стенке показывают положения, в которых были записаны силовые кривые, представленные в правой части изображения. Красная линия предназначена для приближения, синяя линия для втягивания, а черная линия показывает соответствие модели контактной механики. Кривые, записанные в точках 1 и 3, имеют артефакты и не могут быть использованы для расчетов. Корни ржи исследовали острыми кончиками, а корни кукурузы исследовали сферическими кончиками. Сокращения: Rhiz = rhizodermis, Exo = exodermis, OC = внешняя кора, IC = внутренняя кора, End = endodermis, Per = перицикл, и VP = сосудистая паренхима. Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Механические свойства первичных клеточных стенок определяют направление и скорость роста растительных клеток, а значит, будущие размеры и форму растения. Метод на основе AFM, представленный здесь, дополняет существующие методы, которые используются для изучения свойств клеточных стенок растений. Это позволяет исследовать эластичность клеточных стенок, которые принадлежат внутренним тканям растения. С помощью представленного метода были нанесены на карту механические свойства клеточных стенок в разных тканях растущего корня кукурузы, и на основе этих свойствпостроена математическая модель 6. Моделируемый корень реагировал на применение давления, имитирующего тургор, изменением линейного размера. Эти изменения происходили в том же диапазоне и в противоположном направлении, что и изменения, проявляемые свежеиссеченным корнем в плазмолизирующей среде6.
Подготовка образцов имеет решающее значение для этого протокола. Следует избегать высыхания образца в течение всей подготовки. Важным вопросом является правильное размещение растительного материала, подлежащего разделению; клеточные стенки должны быть ориентированы строго перпендикулярно будущей плоскости сканирования. В противном случае будут получены неудовлетворительные кривые деформации силы, потому что клеточная стенка была изогнута или согнута. Сечение, встроенное в агарозу, должно быть плотно закреплено дополнительной агарозой (рисунок 2B). Последний не должен попадать на образец, иначе будут измерены свойства агарозы. Наиболее важной частью этого протокола является фильтрация результирующих кривых силы. Даже изучение объектов модели, таких как калибровочные сетки AFM, может привести к значительной доле ошибочных кривых деформации силы22. Прямое использование рассчитанных значений модуля без анализа лежащих в основе кривых деформации силы может привести к неправильным выводам (рисунок 2F).
Методика не ограничивается локализацией клетки или размерами органов растений. Однако объекты, которые слишком малы, трудно разрезать, сориентировать и обездвижить. С клетками с большим просветом трудно работать, так как высока вероятность прерывания сканирования (рисунок 2С).
При всех преимуществах использования нефиксированных секций растений, приготовленных с помощью вибратома, есть, по крайней мере, два важных вопроса: возможность развития стрессовой реакции после резки растительного материала и возможность частичной солюбилизации материала из разрезанных клеточных стенок. И то, и другое может привести к изменению состава и свойств клеточных стенок. Наличие немедленной реакции на стресс на разрезе было протестировано на Arabidopsis apices10. О существенном влиянии на наблюдаемые свойства не сообщалось. Проводились эксперименты по проверке изменений свойств разрезанных клеточных стенок во время их инкубации в воде19. Не было устойчивой тенденции в очевидных значениях модуля Юнга, измеренных на той же стенке корня кукурузы в течение по крайней мере получасового периода19. Однако лучше поддерживать время экспериментов как можно короче и проверять каждый образец на предмет таких изменений во время инкубации образца в воде.
AFM является мощным методом изучения клеточных стенок растений. Однако очевидно, что расчеты модуля упругости, жесткости и адгезии основаны на нескольких предположениях, которые не выполняются клеточными стенками растений. Все модели контактной механики, используемые AFM, рассматривают исследуемый образец как бесконечное полупространство изотропного материала, что не относится к клеточным стенкам растений. Одновременно предполагается, что геометрия и свойства индентора точно измерены и постоянны на протяжении всего срока службы консольного аппарата, что также может быть ошибочным. Кроме того, клеточные стенки растений демонстрируют сложное механическое поведение, включающее упругие, вязкоупругие и пластиковые компоненты, и обычно только один из них может быть измерен в одном эксперименте. Тем не менее, данные, полученные с помощью методов на основе AFM, надежно коррелируют с ростом растительных клеток и механическими характеристиками в различных органах и видах 3,4,5,6. Все это означает, что можно улучшить как саму методику, так и понимание полученных с ее помощью данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дмитрия Суслова (Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия) и профессора Миру Пономареву (Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, ФИЦ КАЗНЦ РАН, Казань, Россия) за предоставление семян кукурузы и ржи соответственно. Представленный метод разработан в рамках проекта Российского научного фонда No 18-14-00168, присужденного ЛК. Часть работ (получение представленных результатов) была выполнена АП при финансовой поддержке государственного задания для ФИЦ «Казанский научный центр РАН».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
- Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties. Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).
- Braybrook, S. A., Peaucelle, A. Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin. Plos One. 8 (3), 57813 (2013).
- Milani, P., et al. In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy. Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).
- Daher, F. B., et al. Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry. Elife. 7, 38161 (2018).
- Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl. Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).
- Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize. Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).
- Chiniquy, D., et al. Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis. Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).
- Majda, M., et al. Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells. Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).
- Bidhendi, A. J., Geitmann, A. Methods to quantify primary plant cell wall mechanics. Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).
- Peaucelle, A. AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions. Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).
- Peaucelle, A., et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis. Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).
- Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope. Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).
- Radotic, K., et al. Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth. Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).
- Yakubov, G. E., et al. Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls. Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).
- Zdunek, A., Kurenda, A. Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope. Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).
- Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L). Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).
- Torode, T. A., et al. Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics. Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).
- Garcia, R. Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications. Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).
- Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots. Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).
- Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues. Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).
- Krieg, M., et al.
- Braunsmann, C., Schaffer, T. E. Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy. Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).
