Summary
कोशिका भित्ति बायोमैकेनिक्स का अध्ययन पौधे के विकास और मोर्फोजेनेसिस को समझने के लिए आवश्यक है। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके युवा पौधों के अंगों के आंतरिक ऊतकों में पतली प्राथमिक कोशिका दीवारों की जांच करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रस्तावित है।
Abstract
प्राथमिक सेल की दीवारों के यांत्रिक गुण पौधे की कोशिका वृद्धि की दिशा और दर निर्धारित करते हैं और इसलिए, पौधे के भविष्य के आकार और आकार को निर्धारित करते हैं। इन गुणों को मापने के लिए कई परिष्कृत तकनीकों को विकसित किया गया है; हालांकि, सेलुलर स्तर पर सेल दीवार लोच का अध्ययन करने के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) सबसे सुविधाजनक बनी हुई है। इस तकनीक की सबसे महत्वपूर्ण सीमाओं में से एक यह रही है कि केवल सतही या पृथक जीवित कोशिकाओं का अध्ययन किया जा सकता है। यहां, एक पौधे के शरीर के आंतरिक ऊतकों से संबंधित प्राथमिक सेल दीवारों के यांत्रिक गुणों की जांच करने के लिए परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्रस्तुत किया गया है। यह प्रोटोकॉल जड़ों में कोशिका भित्ति के स्पष्ट यंग के मापांक के माप का वर्णन करता है, लेकिन विधि को अन्य पौधों के अंगों पर भी लागू किया जा सकता है। माप एक तरल कोशिका में पौधे सामग्री के विब्राटोम-व्युत्पन्न वर्गों पर किए जाते हैं, जो (i) प्लास्मोलाइजिंग समाधान के उपयोग से बचने या मोम या राल के साथ नमूना प्रत्यारोपण से बचने की अनुमति देता है, (ii) प्रयोगों को तेज करना, और (iii) नमूने के निर्जलीकरण को रोकना। एंटीक्लिनल और पेरिक्लिनल सेल की दीवारों दोनों का अध्ययन किया जा सकता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि नमूना कैसे विभाजित किया गया था। विभिन्न ऊतकों के यांत्रिक गुणों में अंतर की जांच एक ही खंड में की जा सकती है। प्रोटोकॉल अध्ययन योजना के सिद्धांतों, नमूना तैयारी और माप के साथ मुद्दों के साथ-साथ लोचदार मापांक के प्राप्त मूल्यों पर स्थलाकृति के प्रभाव से बचने के लिए बल-विरूपण वक्रों का चयन करने की विधि का वर्णन करता है। विधि नमूना आकार तक सीमित नहीं है, लेकिन सेल आकार के प्रति संवेदनशील है (यानी, एक बड़े लुमेन वाली कोशिकाओं की जांच करना मुश्किल है)।
Introduction
प्लांट सेल की दीवार के यांत्रिक गुण सेल के आकार और इसके बढ़ने की क्षमता निर्धारित करते हैं। उदाहरण के लिए, पराग ट्यूब की बढ़ती नोक एक ही ट्यूब1 के गैर-बढ़ते भागों की तुलना में नरम है। एराबिडोप्सिस मेरिस्टेम पर प्रिमोर्डिया गठन भविष्य के प्रिमोर्डियम 2,3 की साइट पर कोशिका भित्ति कठोरता में स्थानीय कमी से पहले होता है। एराबिडोप्सिस हाइपोकोटिल की कोशिका भित्ति, जो मुख्य विकास अक्ष के समानांतर हैं और तेजी से बढ़ती हैं, उन लोगों की तुलना में नरम होती हैं जो इस अक्ष के लंबवत होती हैं और धीमीगति से बढ़ती हैं। मक्का की जड़ में, विभाजन से बढ़ाव तक कोशिकाओं का संक्रमण जड़ के सभी ऊतकों में लोचदार मोडुलिन में कमी के साथ था। मोडुलिन बढ़ाव क्षेत्र में कम रहा और देर से बढ़ाव क्षेत्र6 में बढ़ गया।
विभिन्न तरीकों की उपलब्धता के बावजूद, सालाना प्राप्त सेल दीवार जीव विज्ञान पर जैव रासायनिक और आनुवंशिक जानकारी के बड़े सरणी की तुलना शायद ही कभी सेल की दीवारों के यांत्रिक गुणों से की जाती है। उदाहरण के लिए, सेल की दीवार से संबंधित जीन पर उत्परिवर्ती ने अक्सर विकास और विकास 4,7,8 को बदल दिया है, लेकिन बायोमैकेनिक्स के संदर्भ में शायद ही कभी वर्णित किया जाता है। इसका एक कारण सेलुलर और उपकोशिकीय स्तरों पर माप करने में कठिनाई है। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) वर्तमान में इस तरह के विश्लेषणके लिए प्राथमिक दृष्टिकोण है।
हाल के वर्षों में, प्लांट सेल वॉल बायोमैकेनिक्स पर कई एएफएम-आधारित अध्ययन किए गए हैं। एराबिडोप्सिस 2,3,4,5,10,11 और प्याज 12 के बाहरी ऊतकों की कोशिका भित्ति के यांत्रिक गुणों के साथ-साथ सुसंस्कृत कोशिकाओं13,14,15 की जांच की गई है। हालांकि, एक पौधे की सतही कोशिकाओं में कोशिका भित्ति हो सकती है जिनके यांत्रिक गुण आंतरिक ऊतकों से भिन्न होतेहैं। इसके अलावा, पौधों की कोशिकाओं को टर्गोर द्वारा दबाव डाला जाता है जो उन्हें कठोर बनाता है। टर्गोर दबाव के प्रभाव से छुटकारा पाने के लिए, शोधकर्ताओं को प्लास्मोलाइजिंग समाधान 2,3,4,5,10,11 का उपयोग करना होगा या टर्गोर और सेल दीवार योगदान 12 में प्राप्त मूल्यों को विघटित करना होगा। पहला दृष्टिकोण नमूना निर्जलीकरण की ओर जाता है और सेल की दीवार16 की मोटाई और गुणों को बदलता है, जबकि दूसरे दृष्टिकोण के लिए अतिरिक्त माप और जटिल गणित की आवश्यकता होती है, और केवल अपेक्षाकृत सरल आकार12 की कोशिकाओं पर लागू होता है। आंतरिक ऊतकों के सेल दीवार गुणों का मूल्यांकन क्रायोसेक्शन17 या राल 8 के साथ प्रभावित पौधे सामग्री के वर्गों पर किया जा सकताहै। हालांकि, दोनों तरीकों में निर्जलीकरण और / या नमूनों का प्रत्यारोपण शामिल है, जो अनिवार्य रूप से गुणों में परिवर्तन की ओर जाता है। पृथक या सुसंस्कृत कोशिकाओं के गुणों को पूरे पौधे के शरीर विज्ञान से संबंधित करना मुश्किल है। पौधों की कोशिकाओं की खेती और अलगाव दोनों उनके सेल की दीवारों के यांत्रिक गुणों को प्रभावित कर सकते हैं।
यहां प्रस्तुत विधि उपर्युक्त दृष्टिकोणों का पूरक है। इसका उपयोग करके, किसी भी ऊतक की प्राथमिक कोशिका भित्ति और पौधे के विकास के किसी भी चरण की जांच की जा सकती है। सेक्शनिंग और एएफएम अवलोकन तरल में किए गए थे जो नमूना निर्जलीकरण से बचाता है। टर्गोर की समस्या हल हो गई क्योंकि कोशिकाओं को काट दिया जाता है। प्रोटोकॉल मक्का और राई की जड़ों के साथ काम का वर्णन करता है, लेकिन किसी भी अन्य नमूने की जांच की जा सकती है कि क्या यह विब्राटोम सेक्शनिंग के लिए उपयुक्त है।
यहां वर्णित एएफएम अध्ययन बल-मात्रा तकनीक का उपयोग करके किए गए थे। विभिन्न उपकरण इस विधि के लिए विभिन्न नामों का उपयोग करते हैं। हालांकि, मूल सिद्धांत समान है; नमूने का एक बल-आयतन मानचित्र कैंटिलीवर (या नमूना) की साइनसॉइडल या त्रिकोणीय गति द्वारा प्राप्त किया जाता है ताकि प्रत्येक विश्लेषण बिंदु पर एक निश्चित लोडिंग बल प्राप्त किया जा सके, जबकि कैंटिलीवर विक्षेपण18 को रिकॉर्ड किया जा सके। परिणाम सतह की स्थलाकृतिक छवि और बल-दूरी वक्रों की सरणी को जोड़ता है। प्रत्येक वक्र का उपयोग एक विशिष्ट बिंदु पर विरूपण, कठोरता, यंग के मापांक, आसंजन और ऊर्जा अपव्यय की गणना करने के लिए किया जाता है। संपर्क मोड19 में स्कैनिंग के बाद बिंदु-दर-बिंदु बल-स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा इसी तरह के डेटा प्राप्त किए जा सकते हैं, हालांकि यह अधिक समय लेने वाला है।
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Protocol
1. एएफएम माप के लिए नमूना तैयारी
- पौधे की सामग्री: मक्का (ज़िया मेस एल) और राई (सेकेल अनाज एल) के बीजों को 10 मिनट के लिए 0.35% एनएओसीएल समाधान के साथ निष्फल करें, आसुत पानी के साथ 3 एक्स धोएं, और फिर क्रमशः 4 दिनों और 2 दिनों के लिए 27 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में हाइड्रोपोनिक रूप से उगाएं। प्रयोग के लिए प्राथमिक जड़ों का उपयोग किया गया था।
- वाइब्रेटोम सेक्शनिंग के लिए समाधान और नमूना तैयार करना
- माइक्रोवेव ओवन का उपयोग करके पानी में 3% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) कम पिघलने-बिंदु अगारोस को भंग करके जड़ एम्बेडिंग के लिए अगारोस समाधान तैयार करें।
नोट: सभी प्रयोग पानी में किए गए थे। यदि अध्ययन के लिए बफर या किसी अन्य प्रकार के माध्यम की आवश्यकता होती है, तो नमूने को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए एगारोस तैयारी के लिए, सेक्शनिंग के दौरान और एएफएम के तरल सेल में एक ही माध्यम का उपयोग करना बेहतर होता है। - पेट्री डिश (व्यास = 35 मिमी) के तल पर पिघली हुई 3% अगारोस की 4 मिमी परत डालें, और नमूने को थर्मल क्षति को रोकने के लिए इसे थोड़ा ठंडा होने दें।
- अध्ययन किए गए पौधे के अंग के तीन या चार छोटे टुकड़े (लगभग 5 मिमी लंबे) अगारोस पर क्षैतिज रूप से रखें।
नोट: नमूने आधे डूबे हुए होने चाहिए लेकिन अगारोस परत में डूबे नहीं होने चाहिए। यदि नमूना डूबा हुआ नहीं है, तो यह विब्राटोम सेक्शनिंग के दौरान अगारोस से बाहर निकल सकता है। यदि नमूना नीचे की ओर डूब जाता है, तो यह अनुभाग के किनारे के बहुत करीब होगा और आगे के चरणों के लिए असुविधाजनक हो जाएगा। - जब अगारोस (30-60 एस) की पहली परत के शीर्ष पर एक पतली, अर्ध-ठोस फिल्म दिखाई देती है, तो सावधानीपूर्वक शीर्ष पर एक दूसरी परत डालें।
नोट: अगारोस की निचली परत पूरी तरह से ठोस नहीं होनी चाहिए। अन्यथा, आगे के काम के दौरान दो परतें एक दूसरे से अलग हो सकती हैं। - अगारोस के पूरी तरह से जम जाने के बाद, नमूना युक्त ब्लॉक को काट दें। ब्लॉक को हेक्सागोनल कटे हुए पिरामिड में आकार दें ताकि आगे के सेक्शनिंग के दौरान इसकी स्थिरता सुनिश्चित की जा सके (चित्रा 1 ए)।
नोट: नमूना आवश्यक अनुभाग के प्रकार के आधार पर इस ब्लॉक के भीतर लंबवत या क्षैतिज रूप से उन्मुख किया जा सकता है। ब्लॉक तैयार करते समय, नमूने के चारों ओर 2-3 मिमी अगारोस छोड़ दें। इस मामले में, नमूना अनुभाग को 3% अगारोस की परत द्वारा बनाए रखा जाएगा, जो इसके आगे स्थिरीकरण की सुविधा प्रदान करेगा (चित्रा 1 बी)।
- माइक्रोवेव ओवन का उपयोग करके पानी में 3% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) कम पिघलने-बिंदु अगारोस को भंग करके जड़ एम्बेडिंग के लिए अगारोस समाधान तैयार करें।
- विब्राटोम के साथ नमूने को विभाजित करना
- साइनोएक्रिलेट चिपकने वाले के साथ ब्लॉक को वाइब्रेटम चरण में गोंद करें। मंच को वाइब्रेटोम में रखें ताकि पिरामिड कोनों में से एक वाइब्रेटोम के ब्लेड का सामना करे। विब्राटोम स्नान में पानी डालें।
- सेक्शनिंग पैरामीटर (अनुभाग मोटाई, ब्लेड की गति और कंपन आवृत्ति) सेट करें, और नमूना काट लें।
नोट: 200 और 400 μm के बीच अनुभाग मोटाई का उपयोग करें। एक खंड जो बहुत पतला है, यांत्रिक गुणों के मूल्यांकन में त्रुटियों का परिचय दे सकता है, जबकि एक खंड जो बहुत मोटा है, टूटने का खतरा है। राई और मक्का की जड़ों के लिए 1.3 मिमी -1 की ब्लेड गति और 90 हर्ट्ज की दोलन आवृत्ति का उपयोग किया गया था। - एक महीन ब्रश का उपयोग करके, पानी के स्नान से अनुभाग को कांच की स्लाइड पर ले जाएं, और इसे सूखने से रोकने के लिए अनुभाग पर पानी की एक बूंद रखें। प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत अनुभाग की गुणवत्ता की जांच करें।
नोट: लोच के मापांक को मापने के लिए तिरछे खंडों का उपयोग नहीं किया जा सकता है। सेल की दीवारों को अनुभाग विमान के लंबवत होना चाहिए, अन्यथा वे एएफएम टिप के नीचे झुक या झुक सकते हैं।
- एएफएम माप के लिए अनुभाग को स्थिर करना (चित्रा 1 बी)
- पिपेट का उपयोग करके पेट्री डिश कैप के निचले भाग पर पिघला हुआ 1% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) अगारोस (~ 1 एमएल) की एक परत डालें।
नोट: सुनिश्चित करें कि पेट्री डिश कैप के किनारे टिप को नमूने तक पहुंचने से नहीं रोकते हैं। अगारोस परत 1 मिमी मोटी होनी चाहिए और टोपी के पूरे तल को कवर करना चाहिए। - 1% अगारोस के जम जाने के बाद, फिल्टर पेपर को इसके किनारे पर लाकर अनुभाग से अतिरिक्त पानी निकालें।
नोट: क्षति से बचने और नमूने के पूर्ण सूखने के लिए पेपर के साथ पौधे अनुभाग को न छुएं। - ब्रश का उपयोग करके अनुभाग को स्लाइड से पेट्री डिश कैप के केंद्र में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। 20 μL पिपेट का उपयोग करके, अनुभाग के चारों ओर सावधानीपूर्वक 1% अगारोज़ जोड़ें (चित्रा 1 बी)।
नोट: 1% अगारोस को नमूने पर ही नहीं मिलना चाहिए। यह केवल 3% अगारोस परत के किनारों को कवर करना चाहिए जो पौधे के नमूने को बरकरार रखता है। 1% अगारोस को इस 3% अगारोस परत के किनारों पर छोटे नॉल बनाने चाहिए। बड़े नॉल कैंटिलीवर को नमूने तक पहुंचने से रोक सकते हैं। - एएफएम के लिए उपयोग किए जाने वाले पानी या अन्य समाधान को स्थिर खंड के साथ पेट्री डिश कैप में डालें।
- पिपेट का उपयोग करके पेट्री डिश कैप के निचले भाग पर पिघला हुआ 1% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) अगारोस (~ 1 एमएल) की एक परत डालें।
2. एएफएम तैयारी और अंशांकन
नोट: एएफएम की बल-मात्रा विधि अध्ययन किए गए क्षेत्र के प्रत्येक बिंदु पर प्राप्त बल-दूरी वक्रों की एक स्थानिक रूप से हल की गई सरणी उत्पन्न करती है। संपर्क मोड में बल-वॉल्यूम मोड (कैंटिलीवर कठोरता, आईओएस, आदि) के लिए सभी पैरामीटर प्राप्त करें। अन्य निर्माताओं के उपकरणों के लिए इसी तरह की प्रक्रियाओं को पहले10,20 वर्णित किया गया है।
- उपयुक्त प्रकार के कैंटिलीवर का चयन करें।
नोट: कैंटिलीवर कठोरता नमूना कठोरता21 के बराबर होनी चाहिए। एक कैंटिलीवर जो नमूने की तुलना में बहुत कठोर है, वह बहुत अधिक विक्षेपित नहीं करेगा, जबकि एक कैंटिलीवर जो बहुत नरम है, नमूने को पर्याप्त रूप से विकृत नहीं करेगा। तरल में कैंटिलीवर को स्विंग करने के लिए एक विशिष्ट अनुनाद आवृत्ति पर्याप्त होनी चाहिए (यानी, कम से कम कुछ दसियों kHz होना चाहिए)। संपर्क क्षेत्र सेल की दीवार के आकार की तुलना में छोटा होना चाहिए क्योंकि यंग के मापांक गणना में अध्ययन के तहत नमूना एक अनंत आधा स्थान माना जाता है। राई और मक्का की जड़ों के लिए निम्नलिखित कैंटिलीवर का उपयोग किया गया था: 60 kHz की विशिष्ट अनुनाद आवृत्ति के साथ तेज कैंटिलीवर, 1.5 N.m-1 का औसत वसंत स्थिरांक, और 10 nm की शीर्ष त्रिज्या, या 75 kHz की विशिष्ट अनुनाद आवृत्ति के साथ गोलाकार कैंटिलीवर, 2.8 N.m-1 का औसत वसंत स्थिरांक, और 150 एनएम की शीर्ष त्रिज्या। - AFM डिवाइस और संबंधित सॉफ़्टवेयर (सामग्री तालिका) पर स्विच करें। तरल सेल के लिए टिप होल्डर पर कैंटिलीवर माउंट करें। तरल में डुबोते समय नोक पर बनने वाले हवा के बुलबुले से बचने के लिए नोक पर तरल की एक बूंद रखें।
नोट: बुलबुला गठन के मामले में, तरल को एक सटीक पोंछे के साथ हटाया जा सकता है, और फिर एक नई बूंद रखी जा सकती है। - स्कैनिंग सिर पर टिप होल्डर को माउंट करें।
- पेट्री डिश कैप में एक कठोर नमूना (ताजा ग्लास स्लाइड) रखें। इसमें तरल डालें, सुनिश्चित करें कि यह स्लाइड को कवर करता है। स्कैनिंग सिर को मंच पर रखें और नमूना को ऊपर उठाएं ताकि तरल कैंटिलीवर को कवर करे।
- ड्रॉप-डाउन उपकरण मेनू में हेड्स टैब चुनें। सुनिश्चित करें कि तरल सेल के लिए स्कैनिंग हेड का चयन किया गया है।
- लेजर एमिंग विंडो खोलने के लिए एमिटिंग बटन पर क्लिक करें। ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप विंडो खोलने के लिए कैमरा बटन पर क्लिक करें। अभिविन्यास के लिए एएफएम सिर और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप विंडो पर स्क्रू का उपयोग करके कैंटिलीवर के सिरे पर लेजर रखें।
- प्रोग्राम की मुख्य विंडो में ड्रॉप-डाउन मेनू से सेमीकॉन्टैक्ट मोड चुनें।
- अनुनाद टैब खोलें और प्रोब्स मेनू में उपयोग किए जा रहे कैंटिलीवर का प्रकार चुनें। अनुनाद आवृत्ति निर्धारित करने के लिए ऑटो बटन पर क्लिक करें।
नोट: यदि उपयोग किया जा रहा कैंटिलीवर सूचीबद्ध नहीं है, तो उपकरण > प्रोब पासपोर्ट खोलें। एक नई फ़ाइल बनाएँ, कैंटिलीवर पैरामीटर दर्ज करें, और इसे सहेजें। फिर इसे प्रोब्स ड्रॉप-डाउन मेनू में चुनें। - प्रोग्राम की मुख्य विंडो में ड्रॉप-डाउन मेनू से संपर्क मोड चुनें।
- कैंटिलीवर अंशांकन विंडो खोलने के लिए N_Force कैल बटन पर क्लिक करें। उपयोग किए जा रहे कैंटिलीवर चुनें और स्वीप बटन पर क्लिक करें, और फिर थर्मल-ट्यून प्रक्रिया का उपयोग करके कैंटिलीवर स्प्रिंग स्थिरांक निर्धारित करने के लिए स्पेक्ट मीस बटन। विंडो बंद करें।
- SetPoint को 1 nA पर सेट करें। दृष्टिकोण टैब खोलें और नमूना तक पहुंचने के लिए लैंडिंग बटन पर क्लिक करें।
- स्कैनिंग टैब खोलें। स्कैन दर को 0.5 हर्ट्ज पर सेट करें। क्षेत्र बटन पर क्लिक करें और स्कैन आकार को 10 μm x 10 μm और स्कैन बिंदु को 256 x 256 पर सेट करें। रन बटन पर क्लिक करें और यह जांचने के लिए लगभग 20 लाइनों को स्कैन करें कि कांच पर कोई संदूषण नहीं है। डेटा खोए बिना स्कैन समाप्त करने के लिए स्टॉप बटन पर क्लिक करें।
- कर्व्स टैब खोलें। क्रमशः 500 एनएम और -100 एनएम तक वापस लेने और पहुंचने के लिए पैरामीटर सेट करें।
- सतह का निरीक्षण करने के लिए ड्रॉप-डाउन मेनू में अंतिम स्कैन चुनें फ्रेम का चयन करें ।
- ग्लास पर एक साफ क्षेत्र ढूंढें और उस बिंदु को इंगित करें जहां बल-विरूपण वक्र लिया जाना चाहिए, और वक्र प्राप्त करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें। स्कैन पर विभिन्न स्थानों पर तीन से पांच बल वक्र रिकॉर्ड करें।
- विश्लेषण विंडो खोलने के लिए डेटा बटन पर क्लिक करें और बल-विरूपण वक्र के साथ फ्रेम का चयन करें।
- पेयर मार्कर बटन पर क्लिक करें और विस्थापन के लिए डीएफएल सिग्नल के अनुपात की गणना करने के लिए वापसी वक्र के रैखिक भाग को इंगित करें, जो उलटा ऑप्टिकल संवेदनशीलता (आईओएस, एनए एनएम -1) या विक्षेपण संवेदनशीलता है।
- सभी रिकॉर्ड किए गए वक्रों के लिए चरण 2.17 दोहराएं और विस्थापन अनुपात के लिए डीएफएल सिग्नल के सभी गणना किए गए मूल्यों को लिखें। वे एक ही होने चाहिए।
- विश्लेषण विंडो बंद करें, दृष्टिकोण टैब पर क्लिक करें, और फिर नमूने से जांच को वापस लेने के लिए हटाएं बटन।
3. डेटा अधिग्रहण
- ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एएफएम कैंटिलीवर के तहत नमूने का मार्गदर्शन करें। 1 nA के SetPoint के साथ संपर्क मोड में नमूने तक पहुँचने के लिए दृष्टिकोण टैब पर क्लिक करें, और फिर लैंडिंग बटन।
- स्कैनिंग टैब पर क्लिक करें, और उसके बाद क्षेत्र बटन। स्कैन करने के लिए 70 μm x 70 μm के क्षेत्र आकार का चयन करें।
- मूव प्रोब बटन पर क्लिक करें और स्कैनर को उस पर ले जाकर पूरे स्कैन क्षेत्र की जांच करें। स्कैनर प्रोट्रूशियंस की डिग्री के आधार पर, उच्चतम बिंदु खोजें।
- दृष्टिकोण टैब खोलें, फिर नमूने से वापस लेने के लिए निकालें बटन पर क्लिक करें। लक्ष्य के रूप में उच्चतम बिंदु का उपयोग करते हुए, नमूना से फिर से संपर्क करने के लिए लैंडिंग बटन पर क्लिक करें। फिर, मूव प्रोब बटन पर क्लिक करके और स्कैनर को उसके ऊपर ले जाकर सतह को फिर से जांचें। क्षेत्र के किसी भी बिंदु को स्कैनर को पूरी तरह से उठाने की आवश्यकता नहीं होनी चाहिए।
नोट: आदर्श रूप से, स्कैनर जेड-रेंज नमूने की ऊंचाई के अंतर से अधिक होना चाहिए। हालांकि, यह स्वीकार्य है यदि स्कैन क्षेत्र पर कुछ बिंदु स्कैनर की क्षमता से नीचे हैं। साथ ही, ऐसे कई बिंदु नहीं होने चाहिए। बड़े क्षेत्र जो स्कैनर द्वारा नहीं पहुंच सकते हैं, स्कैनिंग गर्भपात का कारण बन सकते हैं। - स्कैन दर को 0.5 हर्ट्ज पर सेट करें। स्कैन आकार को 70 μm x 70 μm पर सेट करें और स्कैन बिंदु को 64 x 64 पर सेट करें। रन बटन पर क्लिक करें और नमूने की सतह और अगारोस के साथ इसके संभावित संदूषण की जांच करने के लिए स्कैन करें।
नोट: यदि नमूने में एक बड़े लुमेन के साथ कोशिकाएं हैं, तो स्कैन क्षेत्र का आकार कम किया जा सकता है, या इसे स्थानांतरित किया जाना चाहिए ताकि स्कैन पर अधिक सेल दीवारें हों। - फीडबैक लूप को बंद करने के लिए मुख्य विंडो के शीर्ष पर ऑन बटन पर क्लिक करें।
- प्रोग्राम की मुख्य विंडो में ड्रॉप-डाउन मेनू में एचडीप्लस मोड (फोर्स-वॉल्यूम विधि) चुनें। एक अतिरिक्त विंडो (HD विंडो) दिखाई देगी।
- मुख्य प्रोग्राम विंडो में SetPoint को 0.1 nA पर सेट करें।
- एचडी विंडो के मुख्य टैब में, अध्ययन किए गए नमूने के लिए उपयुक्त स्कैनिंग पैरामीटर (आयाम और साइनसॉइडल कैंटिलीवर आंदोलन की आवृत्ति) सेट करें।
नोट: प्रत्येक प्रकार के नमूने और कैंटिलीवर को स्कैनिंग मापदंडों के चयन की आवश्यकता होती है। कुछ प्रारंभिक प्रयोग आवश्यक हैं। मक्का या राई की जड़ों के लिए, 400 एनएम के आयाम और 300 हर्ट्ज की आवृत्ति पर तेज और गोलाकार कैंटिलीवर का उपयोग किया गया था। - एचडी विंडो में शोर टैब खोलें और कैंटिलीवर की अनुनाद आवृत्ति दर्ज करें।
- एचडी विंडो के क्वांट टैब खोलें और आईओएस, कैंटिलीवर कठोरता, और टिप त्रिज्या और कोण दर्ज करें। संपर्क के मॉडल का चयन करें जिसका उपयोग टिप ज्यामिति के आधार पर गणना के लिए किया जाएगा।
नोट: डीएमटी मॉडल जांच और नमूने के बीच मौजूद आसंजन बल को ध्यान में रखता है, और आमतौर पर मेकेनोबायोलॉजी21 में उपयोग किया जाता है। - एचडी विंडो के स्कैन टैब खोलें और रिकॉर्ड किए जाने वाले संकेतों का चयन करें। उस दिशा का चयन करें जिसमें सिग्नल रिकॉर्ड किया गया है। सभी बल वक्रों का रिकॉर्ड प्राप्त करने के लिए बल वॉल्यूम बॉक्स पर टिक करें।
नोट: आगे और पीछे दोनों दिशाओं में लोच मापांक संकेत रिकॉर्ड करें। यह गणना करने के लिए अधिक अंक प्रदान करेगा। - फीडबैक लूप पर स्विच करने के लिए मुख्य प्रोग्राम विंडो के शीर्ष पर ऑफ बटन पर क्लिक करें।
- ऑप्टिकल सिस्टम की संवेदनशीलता को सही करने के लिए मुख्य एचडी विंडो में फेजकोर बटन पर क्लिक करें।
- मुख्य एचडी विंडो का बनाम समय टैब वास्तविक समय में डीएफएल सिग्नल बनाम समय के कार्य को प्रस्तुत करता है; इस फ़ंक्शन के उन हिस्सों का चयन करें जिनका उपयोग बेसलाइन स्तर निर्धारण के लिए और आगे की गणना के लिए संपर्क मॉडल को फिट करने के लिए किया जाएगा।
- प्रोग्राम की मुख्य विंडो में स्कैन पॉइंट मान को 256 x 256 पर सेट करें। स्कैन दर को 0.2 हर्ट्ज पर सेट करें और नमूना स्कैन करने के लिए रन बटन पर क्लिक करें।
- स्कैनिंग बंद होने के बाद, फीडबैक लूप को बंद करने के लिए मुख्य विंडो के शीर्ष पर ऑन बटन पर क्लिक करें।
- ड्रॉप-डाउन मेनू में संपर्क मोड चुनें, दृष्टिकोण टैब खोलें, और नमूने से वापस लेने के लिए निकालें बटन पर क्लिक करें।
- विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलने और आउटपुट को सहेजने के लिए डेटा बटन पर क्लिक करें।
- माप दिवस के अंत में, कैंटिलीवर टिप धारक को सिर से हटा दें और सावधानी से इसे कई बार अल्ट्राप्योर पानी से धो लें। हर बार, एक सटीक पोंछे के साथ पानी को हटा दें।
4. डेटा मूल्यांकन और पोस्ट-प्रोसेसिंग
नोट: स्वचालित रूप से गणना किए गए लोचदार मापांक मानों पर भरोसा न करें। चूंकि सतह ऊंचाई में बहुत भिन्न होती है, इसलिए कई आर्टिफैक्ट वक्रों को निष्कासित किया जाना चाहिए।
- विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में सहेजी गई फ़ाइल खोलें।
- HDForceVolume फ़्रेम का चयन करें।
- Ctrl कुंजी दबाए रखें और स्कैनिंग की समान दिशा में प्राप्त एक दृश्य फ्रेम का चयन करें। लोड बाहरी मानचित्र बटन पर क्लिक करें यह देखने के लिए कि सेल की दीवारें कहां स्थित हैं।
नोट: किसी भी सिग्नल मैप का उपयोग दृश्य फ्रेम के रूप में किया जा सकता है, लेकिन डीएफएल सिग्नल मैप का उपयोग करना (विभिन्न उपकरण इसे विक्षेपण संकेत या त्रुटि संकेत के रूप में संदर्भित कर सकते हैं) सबसे आसान तरीका हो सकता है। - मुख्य टैब में InvOptSens (IOS) और कैंटिलीवर कठोरता मानों की जाँच करें।
- अतिरिक्त टैब खोलें और टिप पैरामीटर और संपर्क मॉडल की जांच करें।
- दृश्य फ्रेम पर सेल की दीवारों पर विभिन्न बिंदुओं पर क्लिक करें और केवल उन वक्रों का चयन करें जो मॉडल द्वारा अच्छी तरह से वर्णित हैं। विवरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें।
- प्राप्त मानों को लिखें।
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Representative Results
विशिष्ट लोचदार मापांक और डीएफएल मानचित्र, साथ ही वर्णित विधि द्वारा राई और मक्का की जड़ों पर प्राप्त बल वक्र, चित्र 2 में प्रस्तुत किए गए हैं। चित्र 2ए राई प्राथमिक जड़ के अनुप्रस्थ खंड पर प्राप्त लोचदार मापांक और डीएफएल मानचित्र दिखाता है। मापांक मानचित्र (चित्रा 2 ए, बाएं) में सफेद क्षेत्र जेड-दिशा में स्कैनर की सीमा तक पहुंचने के कारण यंग के मापांक की गलत अतिवृद्धि के अनुरूप हैं। यह छवि संतोषजनक बल वक्रों के आगे चयन के लिए बाहरी मानचित्र के रूप में उपयोग करने के लिए सुविधाजनक नहीं है। डीएफएल सिग्नल मैप (विक्षेपण / त्रुटि मानचित्र) जो दाईं ओर प्रस्तुत किया गया है (चित्रा 2 ए) इस उद्देश्य के लिए बेहतर अनुकूल है।
मक्का की जड़ के अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य वर्गों के मापांक मानचित्र चित्र 2 बी, सी में दिखाए गए हैं। नमूने के निचले भाग तक पहुंचने की कोशिश करते समय स्कैनर को पूरी तरह से विस्तारित किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप गलत माप और यहां तक कि बाधित स्कैन ( चित्रा 2 सी का शीर्ष भाग) हो सकता है। कभी-कभी, संपर्क मोड में एक अच्छा स्कैन प्राप्त करने के बाद, उपकरण अचानक स्कैनर को पूरी तरह से अनुबंधित करता है, खतरनाक है कि जब यह बल-वॉल्यूम मोड पर स्विच करता है तो यह अधिकतम जेड-दिशा सीमा तक पहुंच गया है। इसका मतलब है कि नमूना ठीक से स्थिर नहीं था और ऊपर तैर गया था। एक नया नमूना तैयार किया जाना चाहिए।
अगारोस संदूषण भी एक नया नमूना तैयार करने का एक कारण हो सकता है (चित्रा 2 डी, ई)। संपर्क मोड (चरण 3.5) में पहला स्कैन प्राप्त करते समय एगारोस उपस्थिति की जांच की जा सकती है। आदर्श रूप से, सेल की दीवारों और कुछ सेल बॉटम को ऐसे स्कैन पर दिखाई देना चाहिए (चित्रा 2 डी); हालांकि, गलत स्थिरीकरण के मामले में, सतह को अगारोस (चित्रा 2 ई) के साथ कवर किया जा सकता है, जो नमूना स्थलाकृति को मुखौटा करता है।
चित्र 2एफ एक ही सेल दीवार के विभिन्न बिंदुओं पर दर्ज चार अलग-अलग बल वक्रों को दर्शाता है। बिंदु 1 पर दर्ज वक्र कोई आधार रेखा नहीं दिखाता है। इसका मतलब है कि सेल की दीवार से कैंटिलीवर टिप का कोई अलगाव नहीं था। इस वक्र से गणना किए गए मापांक को कम करके आंका गया था। बिंदु 3 पर दर्ज वक्र आने वाले हिस्से पर एक कंधे को दर्शाता है। यह कलाकृति इंगित कर सकती है कि सेल की दीवार मुड़ी हुई थी। बिंदु 1 और 3 पर दर्ज दोनों वक्रों को निष्कासित किया जाना चाहिए। बिंदु 2 और 4 मोडुलिन के समान मूल्यों के साथ संतोषजनक बल वक्र दिखाते हैं। उचित वक्रों को अलग करने के लिए निम्नलिखित मानदंडों का उपयोग किया जा सकता है: (i) वक्र के आने और पीछे हटने वाले दोनों हिस्सों पर बेसलाइन स्तर स्पष्ट होना चाहिए; (ii) कंधे या विफलताओं जैसी कोई अनियमितता नहीं होनी चाहिए (क्रमशः निरंतर बल मूल्यों और ढलान के बीच में बल मूल्यों में अचानक कमी के रूप में दिखाई देती है); (iii) चयनित मॉडल को वक्र को अच्छी तरह से फिट करना चाहिए। सभी चयनित वक्रों के लिए, अधिकतम लागू बल मान समान होना चाहिए। एक अधिकतम लागू बल जो अपेक्षित मूल्य से काफी अधिक या कम है, का उपयोग वक्र निष्कासन के लिए एक मानदंड के रूप में भी किया जा सकता है। खराब गुणवत्ता वालेकर्व्स 19 को त्यागने के लिए तंत्रिका नेटवर्क का उपयोग करने से परिणामों के प्रसंस्करण में तेजी आ सकती है।
चित्र 1: नमूना तैयार करने में महत्वपूर्ण कदम। (A) जड़ का टुकड़ा अगारोस के एक ब्लॉक में एम्बेडेड है और विब्राटोम चरण पर लगाया गया है। (बी) नमूना अनुभाग 1% अगारोस की एक परत के शीर्ष पर रखा गया और पेट्री डिश कैप में अतिरिक्त अगारोस के साथ स्थिर किया गया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: प्राथमिक जड़ों पर विशिष्ट एएफएम छवियां और माप। (ए) राई की जड़ के अनुप्रस्थ खंड के लोच मापांक और डीएफएल मानचित्र। मक्का की जड़ के अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ खंडों पर प्राप्त लोच मापांक के पूरी तरह से रिकॉर्ड किए गए (बी) और बाधित (सी) नक्शे। मक्का की जड़ों के स्वच्छ (डी) और अगारोस-कवर (ई) खंडों का 3 डी दृश्य। (च) मक्का की जड़ के अनुप्रस्थ खंड का एक डीएफएल मानचित्र। सेल की दीवार पर बिंदु 1-4 उन स्थितियों को दिखाते हैं जहां छवि के दाईं ओर प्रस्तुत बल वक्र रिकॉर्ड किए गए थे। लाल रेखा आने के लिए है, नीली रेखा वापसी के लिए है, और काली रेखा संपर्क यांत्रिकी मॉडल फिट दिखाती है। बिंदु 1 और 3 पर दर्ज किए गए वक्रों में कलाकृतियां हैं और गणना के लिए उपयोग नहीं की जा सकती हैं। राई की जड़ों की जांच तेज युक्तियों के साथ की गई थी, और मक्का की जड़ों की गोलाकार युक्तियों के साथ जांच की गई थी। संक्षिप्तरूप: राइज = राइजोडर्मिस, एक्सो = एक्सोडर्मिस, ओसी = बाहरी कॉर्टेक्स, आईसी = आंतरिक कॉर्टेक्स, एंड = एंडोडर्मिस, पेर = पेरिसाइकिल, और वीपी = संवहनी पैरेन्काइमा। स्केल पट्टियाँ = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
प्राथमिक सेल की दीवारों के यांत्रिक गुण पौधे की कोशिका वृद्धि की दिशा और दर निर्धारित करते हैं, और इसलिए पौधे का भविष्य का आकार और आकार। यहां प्रस्तुत एएफएम-आधारित विधि मौजूदा तकनीकों का पूरक है जिसका उपयोग पौधे की कोशिका दीवारों के गुणों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। यह कोशिका भित्ति की लोच की अनुमति देता है, जो पौधे के आंतरिक ऊतकों से संबंधित है, की जांच की जा सकती है। प्रस्तुत विधि का उपयोग करते हुए, बढ़ते मक्का की जड़ के विभिन्न ऊतकों में सेल की दीवारों के यांत्रिक गुणों को मैप किया गया था, और इन गुणोंके आधार पर एक गणितीय मॉडल का निर्माण किया गया था। सिम्युलेटेड रूट ने रैखिक आकार में परिवर्तन द्वारा टर्गोर की नकल करने वाले दबाव के आवेदन का जवाब दिया। ये परिवर्तन उसी सीमा में और विपरीत दिशा में थे जैसा कि प्लास्मोलाइजिंग माध्यम6 में एक ताजा उत्पादित जड़ द्वारा प्रदर्शित किया गया था।
नमूना तैयारी इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है। पूरी तैयारी के दौरान नमूने के सुखाने से बचा जाना चाहिए। विभाजित की जाने वाली संयंत्र सामग्री का सही प्लेसमेंट एक महत्वपूर्ण मुद्दा है; सेल की दीवारों को भविष्य के स्कैनिंग विमान के लंबवत सख्ती से उन्मुख किया जाना चाहिए। अन्यथा, असंतोषजनक बल-विरूपण वक्र प्राप्त किए जाएंगे क्योंकि सेल की दीवार मुड़ गई है या झुक गई है। Agarose-एम्बेडेड अनुभाग को अतिरिक्त Agarose (चित्रा 2B) के साथ कसकर तय किया जाना चाहिए। उत्तरार्द्ध को नमूने पर नहीं जाना चाहिए, अन्यथा, अगारोस गुणों को मापा जाएगा। इस प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा परिणामी बल वक्रों को फ़िल्टर करना है। यहां तक कि मॉडल ऑब्जेक्ट्स का अध्ययन, जैसे कि एएफएम अंशांकन ग्रिड, के परिणामस्वरूप गलत बल-विरूपणवक्रों का एक महत्वपूर्ण अनुपात हो सकता है। अंतर्निहित बल-विरूपण वक्रों का विश्लेषण किए बिना गणना किए गए मापांक मानों का प्रत्यक्ष उपयोग गलत निष्कर्ष निकाल सकता है (चित्रा 2 एफ)।
तकनीक कोशिका के स्थानीयकरण या पौधे के अंगों के आकार तक सीमित नहीं है। हालांकि, जो वस्तुएं बहुत छोटी हैं, उन्हें काटना, उन्मुख करना और गतिहीन करना मुश्किल है। एक बड़े लुमेन वाली कोशिकाओं के साथ काम करना मुश्किल होता है क्योंकि स्कैन रुकावट की उच्च संभावना होती है (चित्रा 2 सी)।
एक वाइब्रेटोम के साथ तैयार गैर-निश्चित पौधे वर्गों का उपयोग करने के सभी लाभों के साथ, कम से कम दो महत्वपूर्ण मुद्दे हैं: पौधे की सामग्री को काटने के बाद तनाव प्रतिक्रिया विकसित करने की संभावना, और कट सेल की दीवारों से सामग्री के आंशिक घुलनशीलता की संभावना। दोनों सेल की दीवारों की संरचना और गुणों में परिवर्तन कर सकते हैं। कट पर तत्काल तनाव प्रतिक्रिया की उपस्थिति का परीक्षण एराबिडोप्सिस एपिसेस10 पर किया गया था। देखे गए गुणों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं बताया गया था। पानी में उनके इनक्यूबेशन के दौरान कट सेल की दीवारों के गुणों में परिवर्तन का परीक्षण करनेके लिए प्रयोग किए गए थे। कम से कम आधे घंटेकी अवधि के लिए मक्का की जड़ की एक ही दीवार पर मापा गया यंग के मापांक मूल्यों में कोई स्थिर प्रवृत्ति नहीं थी। हालांकि, प्रयोगों के समय को यथासंभव कम बनाए रखना और पानी में नमूने के इनक्यूबेशन के दौरान इस तरह के परिवर्तनों के लिए प्रत्येक नमूने की जांच करना बेहतर है।
एएफएम पौधे की कोशिका दीवारों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। हालांकि, यह स्पष्ट है कि लोच मापांक, कठोरता और आसंजन की गणना कई मान्यताओं पर आधारित है जो पौधे की कोशिका दीवारों द्वारा पूरी नहीं होती हैं। एएफएम द्वारा उपयोग किए जाने वाले संपर्क यांत्रिकी के सभी मॉडल जांच किए गए नमूने को आइसोट्रोपिक सामग्री के अनंत आधे स्थान के रूप में मानते हैं, जो पौधे की कोशिका दीवारों के लिए सच नहीं है। इसके साथ ही, यह माना जाता है कि इंडेंटर की ज्यामिति और गुणों को कैंटिलीवर जीवनकाल में सटीक रूप से मापा और स्थिर किया जाता है, जो गलत भी हो सकता है। इसके अलावा, प्लांट सेल की दीवारें लोचदार, विस्कोस्टिक और प्लास्टिक घटकों से जुड़े जटिल यांत्रिक व्यवहार का प्रदर्शन करती हैं, और आमतौर पर इनमें से केवल एक को एक ही प्रयोग में मापा जा सकता है। फिर भी, एएफएम-आधारित विधियों का उपयोग करके प्राप्त डेटा विश्वसनीय रूप से विभिन्न अंगों और प्रजातियों 3,4,5,6 में पौधे कोशिका वृद्धि और यांत्रिक प्रदर्शन के साथ सहसंबंधित है। इसका मतलब है कि तकनीक और इसके साथ प्राप्त डेटा की समझ दोनों में सुधार किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
हम क्रमशः मक्का और राई के बीज प्रदान करने के लिए डॉ दिमित्री सुस्लोव (सेंट पीटर्सबर्ग स्टेट यूनिवर्सिटी, सेंट पीटर्सबर्ग, रूस) और प्रोफेसर मीरा पोनोमेरेवा (तातार साइंटिफिक रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ एग्रीकल्चर, एफआरसी काज़एससी आरएएस, कज़ान, रूस) को धन्यवाद देना चाहते हैं। प्रस्तुत विधि को एलके को दिए गए रूसी विज्ञान फाउंडेशन परियोजना संख्या 18-14-00168 के ढांचे के भीतर विकसित किया गया था। काम का हिस्सा (प्रस्तुत परिणामों को प्राप्त करना) एपी द्वारा आरएएस के एफआरसी कज़ान वैज्ञानिक केंद्र के लिए सरकारी असाइनमेंट के वित्तीय समर्थन के साथ किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose, low melting point | Helicon | B-5000-0.1 | for sample fixation |
| Brush | - | - | for section moving |
| Cantilevers | NanoTools, Germany | NT_B150_v0020-5 | Model: Biosphere B150-FM |
| Cantilevers | NT-MDT, Russia | FMG01/50 | Model: FMG01 |
| Cyanoacrylate adhesive | - | - | for vibratomy |
| Glass slides | Heinz Herenz | 1042000 | for vibratomy and AFM calibration |
| ImageAnalysis P9 Software | NT-MDT, Russia | - | for data analysis |
| Leica DM1000 epifluorescence microscope | Leica Biosystems, Germany | 11591301 | for section check |
| NaOCl | - | - | for seed sterilization |
| Nova PX 3.4.1 Software | NT-MDT, Russia | - | for experiments conducting |
| NTEGRA Prima microscope with HD controller | NT-MDT, Russia | - | for AFM and data acquisition |
| Petri dish 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 153066 | for sample fixation |
| Tip pipette 1000 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642092 | - |
| Tip pipette 2-20 µL | Thermo Fisher Scientific | 4642062 | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
| Vibratome Leica VT 1000S | Leica Biosystems, Germany | 1404723512 | for sample sectioning |
References
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