Summary
在这里，我们提出了一个详细的方案，用于从水中分离和鉴定抗生素耐药细菌及其抗生素抗性基因（ARG）的分子特征。使用基于培养物和非基于培养物（宏基因组分析）技术提供了有关印度孟买淡水中存在的细菌多样性和不同ARG的总库的完整信息。
Abstract
抗生素耐药性（AR）通过与淡水水体相关的微生物群的发展和传播是一个主要的全球健康问题。在本研究中，使用传统的基于培养的技术和高通量非培养物的宏基因组方法收集和分析淡水样品的总细菌多样性和AR基因（ARG）。本文提出了一种系统方案，用于从淡水样品中计数总细菌和抗生素耐药菌，并测定可培养分离株中的表型和基因型耐药性。此外，我们报告了使用从淡水样品中提取的总宏基因组DNA的全宏基因组分析来鉴定整体细菌多样性，包括不可培养的细菌，以及鉴定水体中不同ARG（抗性组）的总库。按照这些详细的方案，我们观察到抗生素耐药细菌负荷在9.6×10 5-1.2×109 CFU/mL范围内。大多数分离株对多种测试的抗生素耐药，包括头孢噻肟、氨苄西林、左氧氟沙星、氯霉素、头孢曲松、庆大霉素、新霉素、甲氧苄啶和环丙沙星，多种抗生素耐药性（MAR）指数为≥0.2，表明分离株的耐药性水平很高。16S rRNA测序鉴定了潜在的人类病原体，如肺炎克雷伯菌，以及机会性细菌，如Comamonas spp.、Micrococcus spp.、Arthrobacter spp.和Aeromonas spp.。 分离株的分子表征表明存在各种ARG，例如blaTEM，blaCTX-M（β-内酰胺），aadA，aac（6'）-Ib（氨基糖苷类）和dfr1（甲氧苄啶），这也得到了全宏基因组DNA分析的证实。在宏基因组DNA中还检测到编码抗生素外排泵的其他ARGs-mtrA，macB，mdtA，acrD，β-内酰胺酶-SMB-1，VIM-20，ccrA，ampC，blaZ，氯霉素乙酰转移酶基因catB10和利福平耐药基因rphB-的高患病率。在本研究中讨论的方案的帮助下，我们确认了具有不同AR表型和基因型性状的水性MAR细菌的存在。因此，全宏基因组DNA分析可以用作传统基于培养的技术的补充技术，以确定水体的整体AR状态。
Introduction
抗菌素耐药性（AMR）已被确定为最紧迫的全球问题之一。抗微生物药物耐药性的快速演变及其在世界范围内的传播是人类健康和全球经济面临的最大威胁之一，就与之相关的健康成本而言1.抗生素的过度使用和滥用导致AR增加。COVID-19大流行突出了这一点，在此期间，在许多情况下，由于受影响患者的AMR，相关继发感染的治疗受到巨大损害2。除了人类直接使用/滥用抗生素外，在农业和畜牧业中过度使用和滥用抗生素以及不适当地排放到环境（包括水体）中也是一个主要问题3。细菌中新的耐药性状和多重耐药性的兴起迫切需要更好地了解导致AR发展及其传播的因素。多种抗生素耐药细菌，通常在质粒等移动遗传元件上携带多个AR基因（ARG），可以将这些耐药基因转移到非耐药微生物，包括潜在的人类病原体，从而导致超级细菌的出现，即使是最后的抗生素也无法治愈4。这些多重抗生素耐药细菌，如果存在于水生态系统中，可以通过食用受污染的水基食物（如鱼、螃蟹和软体动物）直接进入人体肠道。先前的研究表明，AR细菌在天然水系统中的传播也可以到达其他供水，包括饮用水，从而可以进入人类食物链5，6，7。
本研究的目的是使用基于培养物和非基于培养物（全宏基因组分析）技术的组合来提供全面的方案，以获得有关印度孟买水体中存在的细菌多样性和不同ARG的总库的完整信息。传统上，基于培养的技术已被用于研究水体中的细菌多样性。由于可培养微生物仅占任何生态位中总微生物群的一小部分，为了更好地了解细菌多样性的整体状况以及任何样品中普遍存在的各种耐药性状，必须同时使用各种基于培养和独立于培养的技术。一种强大而可靠的非培养技术是全宏基因组DNA分析。这种高通量方法已成功用于细菌多样性的各种研究或各种ARG的功能注释8，9。该技术使用宏基因组（样品中的总遗传物质）作为各种分析的起始材料，因此与培养无关。本研究中的方案可用于全宏基因组DNA分析，以获取有关水样中总细菌多样性和各种ARG（抗性组）的信息。
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Protocol
1. 样品采集和处理
- 样品采集
- 在无菌样品容器中收集适当体积的水样，确保填充不超过容器的 3/4。
- 收集后尽快将样品在无菌条件下运输到实验室，并立即进行处理。
- 来样加工
- 通过无菌平纹细布无菌过滤水样，以去除任何颗粒物质。
- 对过滤水进行适当的连续稀释以进行进一步分析。
2. 估计细菌总载量和抗生素耐药细菌计数
- 测定总细菌负荷
- 将 18.12 g R2A 琼脂、改性粉末悬浮在 1，000 mL 双蒸水中，并通过加热溶解混合物。将溶解的混合物在121°C，15psi高压灭菌20分钟。 通过将适量的高压灭菌混合物倒入无菌培养皿中来制备R2A琼脂，改性板（例如，将约20mL高压灭菌的无菌培养基加入90mm无菌培养皿中）。
- 将 100 μL 过滤水样品的适当稀释液均匀地铺在 R2A 琼脂上，一旦培养基凝固，就改性板。执行实验一式两份。
- 将上述所有板在35-37°C孵育48小时（根据用于分离的培养基改变温度和孵育时间）。
- 使用公式（1）以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）表示总细菌负荷：
（1）
- AR 细菌计数的测定
- 按照步骤 2.1.1-2.1.4 操作。然而，代替R2A琼脂，改良板，使用R2A琼脂，改性平板单独补充五种不同的抗生素，即头孢噻肟（3μg/ mL），环丙沙星（0.5μg/ mL），红霉素（20μg/ mL），卡那霉素（15μg/ mL）和万古霉素（3μg/ mL）。
- 将抗生素分别加入含有20mL无菌熔融R2A琼脂的管中，改性（用熔融R2A琼脂的温度，在≤40°C下改性）以达到步骤2.2.1中提到的最终抗生素浓度。
- 漩涡均匀混合，并在琼脂凝固之前倒入无菌培养皿上。执行实验一式两份。
- 将上述所有板在35-37°C孵育48小时（如果使用不同的培养基，温度和孵育时间可能会有所不同）。
- 为了质量控制和检查抗生素的功效，将100μL 大肠杆菌 ATCC 25922和 金黄色葡萄球菌 ATCC 29213菌株的细菌悬浮液散布到各自含有抗生素的R2A琼脂，修饰的平板上（确保用于接种的新鲜培养物的密度在600nm处为OD = 0.5）。
- 如步骤 2.1.4 中所述，以 CFU/mL 为单位确定抗生素耐药细菌计数。
- 分离物的甘油库存
- 选择形态不同的 AR 菌落。
- 将单个分离菌落悬浮在含有相应抗生素的 2 mL 无菌 Luria-Bertani 肉汤中（例如，如果从含有头孢噻肟的平板中选择菌落，则将步骤 2.3.1 中的菌落接种在含有相应浓度的头孢噻肟的无菌 Luria-Bertani 肉汤中）。
- 将接种的试管在37°C以80rpm孵育，直到OD600 达到0.5。
- 通过在无菌条件下将步骤 2.3.3 中的 750 μL 培养悬浮液混合到 250 μL 无菌 100% 甘油中来制备分离物的甘油储备液。
- 将甘油储备液储存在-80°C直至进一步分析。
注意：为了从甘油原液中恢复培养物，请在4°C下解冻甘油原液。 将该原液的循环接种到 2 mL 含有相应抗生素的无菌 Luria-Bertani 肉汤中并使其生长。
（1）3. 通过16S rRNA基因测序鉴定可培养细菌
- 从分离株制备用于PCR的DNA模板
注意：Carlson等人给出了用于PCR制备用于从细菌中分离粗DNA的DNA模板的协议10。- 使用无菌牙签，取在培养皿上生长的单个分离的纯分离菌落。将细菌菌落悬浮在无菌微量离心管中的 100 μL 无菌双蒸水中并煮沸 10 分钟。
- 将悬浮液以10，000 ×g 离心2分钟以沉淀碎片，并将上清液转移到新鲜的无菌微量离心管中用作粗DNA模板。
- 16S rRNA基因V3区域的靶向PCR扩增和测序
- 如 表1所示，在PCR管中制备40μL反应混合物进行PCR扩增。
注意：DNA制备应在冰块上进行，同时尽量减少污染的机会（处理试剂时戴手套，并用70%乙醇彻底清洁工作表面）。 - 将试管放入热模块中，然后在PCR热循环仪中运行适当的程序。有关标准化PCR循环条件和16S rRNA基因V3区域扩增的引物信息，请参见 表2 。
- 为了分离扩增子和可视化，进行琼脂糖凝胶电泳（AGE）。将 10 μL 扩增的 PCR 产物和 2 μL 6x 凝胶上样缓冲液（表 3）混合，并将该混合物上样到含有 5 μL 10 mg/mL 溴化乙锭 （EtBr） 的 1.5% 琼脂糖凝胶上的孔中（将 1.5 g 琼脂糖粉末溶解在 100 mL 的 1x TAE 缓冲液 [表 3]） 中，终浓度为 0.5 μg/mL EtBr。
注意：EtBr是一种强致癌物质。处理 EtBr 和含有 EtBr 的凝胶时，应始终佩戴手套。 - 添加DNA分子量标准以估计扩增子的大小。
- 在80-100 V的TAE罐缓冲液中进行凝胶电泳。
- 一旦示踪染料运行3/4的凝胶，停止电泳，并在紫外透射仪下观察扩增子条带。
- 使用 PCR 产物（扩增子）进行 16S rRNA 基因测序以鉴定分离株。
- 通过使用公式（2）对其进行分光光度分析来量化扩增子。
（二） - 要检查DNA的纯度，请计算A260 / A280的比率。
注意：理想情况下，此数字应高于 1.5，最好介于 1.8 和 2.0 之间。 - 要识别分离株，请使用适当的比对搜索工具比较与序列数据库获得的序列。
- 如 表1所示，在PCR管中制备40μL反应混合物进行PCR扩增。
（二）4. 使用抗生素敏感性测试检测分离株中的抗生素耐药性
注意：本协议描述了通过椎间盘扩散进行抗生素敏感性测试（AST）的方法。使用以下抗生素盘：头孢噻肟（5μg）、氨苄西林（10μg）、左氧氟沙星（5μg）、氯霉素（30μg）、替加环素（15μg）、头孢曲松（30μg）、亚胺培南（10μg）、庆大霉素（10μg）、新霉素（10μg）、甲氧苄啶（5μg）和环丙沙星（5μg）。
- 制备 AST 接种物
- 使用无菌环在2mL无菌非选择性培养基（例如Luria-Bertani肉汤（不含任何抗生素）中无菌接种单个分离的纯化的AR菌落，并在37°C以80rpm孵育过夜。
- 通过将 100-150 μL 过夜生长的培养物（大约，OD 600 = 1.8-2.0）重悬于 2 mL 新鲜的非选择性 Luria-Bertani 肉汤培养基中并孵育 2-4 小时（直到 OD600 达到 0.4-0.5）。
- 使用无菌0.85%盐水溶液稀释这种新鲜生长的培养悬浮液，使培养物的密度等于0.5麦克法兰标准品（大约OD600 = 0.1），大致相当于1-2×108 个细胞/ mL。
- 轻轻混合细菌悬浮液，使细胞分布均匀。
- 在稀释后15分钟内使用上述悬浮液。
- 琼脂平板的接种
- 通过将 38 g MHA 混合在 1，000 mL 双蒸水中，准备用于执行 AST 的 Mueller-Hinton 琼脂 （MHA） 板，并通过加热溶解混合物。将溶解的混合物在121°C，15psi下高压灭菌15分钟。
- 确保板中MHA的深度为4 mm（每块板25 mL培养基）。
- 同时，从冰箱中取出抗生素盘并加热至室温。
注意：抗生素盘片应通过最初在4°C下解冻，然后在室温下解冻来逐渐解冻，以减少盘上冷凝的任何潜在危险，这随后可能会影响抑制区（ZOI）。 - 在无菌条件下，将无菌棉签浸入步骤4.1中制备的接种物中，并去除多余的悬浮液以避免板过度接种。
- 将培养物均匀地铺在平板上，从MHA板的顶部开始，从边缘到边缘来回。擦拭时将板旋转 60°。
- 抗生素盘的应用
- 在火焰灭菌镊子的帮助下，无菌地将抗生素盘转移到接种的MHA平板上，然后轻轻按压盘以确保与琼脂完全水平接触。
注意：此过程必须在将培养物接种到平板上的15分钟内完成。 - 考虑到微生物、使用的抗生素和平板的大小，将适当数量的抗生素盘放在琼脂平板上，以避免抑制区域的重叠。
注意： 90 毫米圆板上可容纳四到五个圆盘。
- 在火焰灭菌镊子的帮助下，无菌地将抗生素盘转移到接种的MHA平板上，然后轻轻按压盘以确保与琼脂完全水平接触。
- 培养板的孵育
- 在施用抗生素盘后15分钟内，将板倒置并在37°C孵育过夜。
- 结果解读
- 以毫米 （mm） 为单位测量 ZOI 直径，并根据 EUCAST11 给出的断点值进行解释。请参阅下面给出的两个示例。
- 用于 肠杆菌 的环丙沙星抗生素盘（5μg）的区域直径断点（mm）为S ≥ 25和R < 22，这意味着如果ZOI≥25 mm，则认为它是敏感的（S），而如果ZOI<22 mm，则被认为是耐药的（R）。如果 ZOI 直径介于 22 和 25 之间，则分离物被认为是中间 （I）。
- 氯霉素抗生素盘（30 μg）用于葡萄球菌 属的区域直径 断点（mm）为S ≥ 18和R < 18，这意味着如果ZOI≥18 mm，则认为它是敏感的，而如果ZOI<18 mm，则被认为是耐药的。
- 通过查找分离株耐药的抗生素数量与分离株暴露的抗生素总数的比率来确定多种抗生素耐药性 （MAR） 指数。
注意：对于质量控制， 大肠杆菌 ATCC 25922和 S。 葡萄球菌 ATCC 29213 按照步骤 4 中的协议用作参考菌株。
- 以毫米 （mm） 为单位测量 ZOI 直径，并根据 EUCAST11 给出的断点值进行解释。请参阅下面给出的两个示例。
5. 基于PCR检测分离株中的抗生素耐药基因
- 使用标准 PCR 方案鉴定分离株中的 ARG。使用步骤3.1中给出的方案制备DNA模板。
注意：本研究中使用的PCR循环条件为94°C10分钟，然后35个94°C循环30秒，在适当温度下退火30秒（每个引物组的标准化），在72°C下延伸40秒，并在72°C下最终延伸5分钟。反应混合物描述见 表4。ARG、引物和退火温度的列表见 表5。 - 要分离、可视化和检查扩增子的纯度，请执行步骤3.2.3-3.2.10。
6. 全宏基因组DNA分析，用于鉴定总细菌多样性和检测宏基因组中的ARG
- 从水样中提取总DNA（宏基因组）
- 从过滤的水样中提取宏基因组DNA。
注意：在当前的研究中，按照制造商的方案，使用参考的DNA分离试剂盒从过滤后的水样中提取宏基因组DNA（总DNA）（参见 材料表）。 - 通过将 3 μL 提取的宏基因组 DNA 加载到 0.8% 琼脂糖凝胶上来检查 DNA 的质量，并在 80-110 V 下运行凝胶约 30 分钟。
- 检查是否存在单个完整条带。
- 使用荧光计检查DNA浓度。
- 从过滤的水样中提取宏基因组DNA。
- 使用全宏基因组DNA测序测定细菌多样性并检测ARG
- 文库制备和PCR扩增：
- 使用参考的DNA文库制备试剂盒制备配对末端测序文库（参见 材料表）。
- 通过取 200 ng 的 DNA 并将其机械剪切成更小的片段，准备 DNA 进行接头连接，然后进行连续的末端修复步骤，其中在 3' 端添加一个“A”。
- 根据用于测序的平台，将特异性接头连接到DNA片段的两端。
注意：这些适配器中存在将双条形码文库与流通池结合以进行测序至关重要的序列。这允许对接头连接的片段进行PCR扩增并结合标准测序引物。 - 要检查质量和数量，请按照制造商的说明使用高灵敏度DNA芯片分析扩增的文库。
- 集群生成和排序：
- 将扩增的文库加载到适当的测序平台上，用于簇生成和后续测序。
注意：文库分子与配对端流通池上的互补适配器寡核苷酸结合。在测序过程中，在反向链的再合成后选择性地裂解前链。然后从片段的另一端对复制的反向链进行测序。
- 将扩增的文库加载到适当的测序平台上，用于簇生成和后续测序。
- 生物信息学分析：
- 使用适当的平台从高质量数据生成脚手架。
- 对这些支架进行生物信息学分析，以进行ARG的分类和鉴定。
注意： 图1给出了用于鉴定总细菌多样性和检测宏基因组中ARG的整个宏基因组DNA分析的工作流程。 图 2 给出了手稿中描述的完整方法的流程图。
- 文库制备和PCR扩增：
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Representative Results
细菌总载量和抗生素耐药 （AR） 细菌计数
通过在改良培养基R2A琼脂上散布10-4至10-6倍稀释的水样品来计数总细菌负荷。为了计数AR细菌计数，将10-3至10-6倍稀释液散布在含有抗生素的培养基板上（图3）。总细菌计数和AR细菌计数计算为CFU/mL，所有电镀实验一式两份。按照上述方案，本研究表明细菌总数为3.0×109CFU / mL。发现AR细菌负荷很高，范围为9.6×10 5-1.2×109 CFU/mL（表6）。
通过16S rRNA基因测序鉴定可培养细菌
使用来自每种分离株的粗DNA作为模板进行16S rRNA基因特异性PCR。在测序的总共 15 株 AR 分离株中，有 10 株属于肠杆菌科，大多数是大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。 罕见的机会性细菌，如属于Comamonadaceae家族的Comamonas spp.，Micrococcus spp.和Arthrobacter spp。 还从水样中鉴定出属于微球菌科和气单胞菌科的气单胞菌属（表7）。
使用抗生素敏感性测试检测可培养细菌中的抗生素耐药性
通过使用圆盘扩散法进行AST，产生了上述鉴定的分离株的抗生素耐药性曲线（图4）。在测试的15株分离株中，有8株的MAR指数为≥0.2，表明具有高度的耐药性。此外，许多分离株显示出共同耐药性特征（对同一组抗生素的耐药性）。然而， 诸如Comamonas spp.和 Arthrobacter spp.的分离株对任何测试的抗生素都没有显示出耐药性（表8）。
可培养细菌中抗生素耐药基因的检测和鉴定
使用PCR共筛选了10个AR分离株是否存在ARG。可培养分离株中最常见的ARG是编码β-内酰胺酶的 blaTEM，其次是氨基糖苷类抗性基因 aadA。其他扩增的ARG分别为 blaCTX-M、 dfr1和 aac（6'）-Ib ，分别赋予β-内酰胺类、甲氧苄啶和氨基糖苷类抗生素抗性。ARG扩增的代表性结果如图 5所示。对于大多数已鉴定的分离株，通过基于PCR的基因型AR分析 在 分子水平上确认了表型抗性（AST）。
鉴定宏基因组DNA中的细菌多样性
为了检查所有可能的细菌（可培养和不可培养）的存在并确定它们的相对丰度，对总细菌多样性进行了宏基因组DNA分析。使用高通量二代测序（HT-NGS）方法，获得了~96.94%的总序列读数，从而实现了高覆盖率。进行分类注释，将读物分类为从门到属的不同分类群（图6和图7）。在宏基因组中总共可以鉴定出50个门，表明水样中的细菌多样性很高。变形杆菌是最主要的门，由α变形杆菌，β变形杆菌和Gammaproteo细菌类组成。在目水平上，伯克霍尔德菌是最普遍的目，属于β变形杆菌类。 假单胞菌、不动杆菌、足部杆菌、假杆菌、柠檬酸菌、黄杆菌和昏迷单胞菌是在水样中发现的一些丰富的属。
从宏基因组DNA中检测ARG
为了了解水样宏基因组中ARG的总库，进行了全宏基因组测序，然后使用适当的生物信息学工具鉴定ARG。宏基因组方法可确保检测样品中可培养和不可培养微生物中存在的ARG。赋予β-内酰胺抗性的各种基因（SMB-1，ampC1，VIM-20，ccrA，nmcR，ARL-1，blaZ）;氨基木糖苷（AAC（6'）-34）;喹诺酮类药物（qnrS6， qnrVC5）;抗生素外排泵-抗结瘤细胞分裂（RND）（evgA，mtrA，mdtA，acrD），ATP结合盒（ABC）（oleC，macB，patA，bcrA）和主要促进超家族（MFS）（abaQ）;甲氧苄啶抗性二氢叶酸还原酶（dfrD，dfrA20）;利福平磷酸转移酶（rphB）;和氯霉素乙酰转移酶（CAT）（catB10）在宏基因组中检测到。通过PCR在可培养分离株（blaTEM，blaCTX-M，aadA，aac（6'）-Ib，dfr1）中检测到的ARG也通过全宏基因组测序进行检测，从而确认了它们在水样中的存在。使用全宏基因组DNA分析在宏基因组中鉴定的ARG的代表性结果如表9所示。
图 1：全宏基因组 DNA 分析的工作流程。 介绍了用于鉴定总细菌多样性和检测宏基因组ARG的逐步工作流程。总体步骤涉及宏基因组DNA制备、扩增和鉴定。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：完整方法的流程图。 本研究中使用的方法的逐步工作流程。基于培养和非基于培养的技术的组合用于获得有关细菌多样性和水样中存在的ARG的身份的完整信息。 请点击此处查看此图的大图。
图3：含抗生素的R2A琼脂上分离菌落的代表性图像，改良平板。 将水样接种在含有头孢噻肟（3μg/ mL）的R2A琼脂上，改良板。将样品连续稀释并接种在重复A1，A2：10-4中;B1， B2： 10−5;C1， C2： 10−6.在适当的孵育期后，分离的菌落在B1，B2，C1和C2平板上可见。 请点击此处查看此图的大图。
图4：椎间盘扩散法的抗生素敏感性测试。 通过圆盘扩散法对 大肠杆菌 分离株的AST代表性图像。AST在A1，A2中重复进行：CTX，IPM，C，CIP;B1， B2： LE， TGC， AMP， GEN;C1， C2： TR， N， K， CTRZOI 的直径以毫米 （mm） 为单位进行测量。为了解释分离株是否对所使用的抗生素具有耐药性或敏感性，将ZOI与最新的EUCAST表进行了比较。缩写：AST = 抗生素敏感性测试;CTX = 头孢噻肟;IPM = 亚胺培南;C = 氯霉素;CIP = 环丙沙星;LE = 左氧氟沙星;TGC = 替加环素;AMP = 氨苄西林;GEN = 庆大霉素;TR = 甲氧苄啶;N = 新霉素;K = 卡那霉素;点击率=头孢曲松;ZOI = 抑制区;EUCAST = 欧洲抗生素敏感性测试委员会。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：来自可培养细菌的抗生素抗性基因的 PCR 扩增。 PCR后进行琼脂糖凝胶电泳，以可视化扩增的条带，以检查分离株中是否存在ARG。在凝胶上可以看到分离的PCR扩增子条带。将单个PCR扩增子的大小与适当的DNA标记物进行比较。泳道 L1：100 bp DNA 分子量标准;车道 1-5： 1： DFR1 （425 bp）;车道 2： blaTEM （310 bp）;车道 3： 布拉CTX-M （500 bp）;车道 4： aac（6'）-Ib （ 395 bp）;车道 5： aadA （624 bp）。缩写：ARGs=抗生素抗性基因。 请点击此处查看此图的大图。
图6：门和类水平的 分类学分类。 （A）显示水样中细菌宏基因组的门级分类丰度分布的条形图。通过宏基因组分析共鉴定出50个细菌门。图中显示了细菌的前 12 个优势门。（B）显示水样中细菌宏基因组的分类丰度分布的条形图。通过宏基因组分析共鉴定出50个细菌类别。显示了前 15 种主要细菌类别。 请点击此处查看此图的大图。
图7：目和属级的 分类学分类。 （A）显示水样中细菌宏基因组的目级分类丰度分布的条形图。通过宏基因组分析共鉴定出50个细菌目。图中显示了细菌的前 14 个优势目。（B）显示水样中细菌宏基因组的属级分类丰度分布的条形图。通过宏基因组分析共鉴定出50个细菌属。图中显示了细菌的前 15 个优势属。 请点击此处查看此图的大图。
| 聚合酶链反应试剂 | 体积（微升） |
| 2x Taq 预混液 | 20 |
| 前向底漆（10皮摩尔） | 1.5 |
| 反向底漆（10皮摩尔） | 1.5 |
| 粗DNA模板 | 1.5 |
| 无菌分子生物学水 | 15.5 |
| 总体积 | 40 |
表1：PCR预混液成分。 反应混合物组成各种PCR试剂。
| 方向 | 引物序列 5' – 3' | 聚合酶链反应条件 | 周期数 |
| 向前 | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94°C10分钟 | 1 |
| 在94°C下变性30秒 | 35 | ||
| 在50°C下退火30秒 | |||
| 在 72 °C 下延伸 40 秒 | |||
| 反向 | CTACCGGGGTATCTAATCC | 最终延伸在72°C下5分钟 | 1 |
表2：扩增16S rRNA基因的PCR循环条件。 图中显示了16S rRNA基因扩增所需的PCR循环条件。这些步骤包括初始变性步骤，然后是 35 个变性、退火和延伸循环，以及最后的延伸步骤。
| 6x 上样凝胶 | |
| 内容 | 数量 |
| 溴酚蓝 | 25毫克 |
| 85%甘油 | 7.06毫升 |
| 毫Q水 | 2.94毫升 |
| 总体积 | 10毫升 |
| 50x 乙酸三酯 （TAE） 储备缓冲液组合物 | |
| 内容 | 数量 |
| 三重底座 | 242 g 700 mL 双蒸水中 |
| 冰醋酸 | 57.1毫升 |
| 0.5 米 （EDTA） 酸碱度 8.0 | 100毫升 |
| 将pH调节至8.5，并用双蒸水将体积补足至1000 mL | |
| 对于 1x TAE：20 mL 50x TAE 缓冲液 + 980 mL 双蒸水 | |
表3：6x凝胶上样缓冲液和50x乙酸三酯-EDTA储备缓冲液的组成。 将6x凝胶上样缓冲液与琼脂糖凝胶电泳运行的样品混合。它含有溴酚蓝作为示踪染料。甘油增加了上样样品的密度，以便正确上样到孔中。还显示了制备50xTAE储备缓冲液所需的各种试剂的组成。TAE缓冲液是用于AGE的最常见缓冲液之一，它将pH值保持在8.5，并使扩增的DNA在AGE期间迁移。缩写：TAE = 乙酸三酯-EDTA;AGE = 琼脂糖凝胶电泳。
| 聚合酶链反应试剂 | 体积（微升） |
| 2x Taq 预混液 | 5 |
| 前向底漆（10皮摩尔） | 0.5 |
| 反向底漆（10皮摩尔） | 0.5 |
| 粗DNA模板 | 1.5 |
| 无菌分子生物学级水 | 2.5 |
| 总体积 | 10 |
表 4：用于鉴定 ARG 的 PCR 预混液组合物。 进行PCR实验所需的各种PCR试剂的反应混合物组成。
| 高级编号 | 靶基因 | 抗性 | 底漆 | 引物序列 （5'-3'） | 扩增子大小 （bp） | 退火温度（°C） | 引用 | ||||
| 1 | 东风一个 | 甲氧苄啶 | 向前 | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | Racewicz et al.， 19 | ||||
| 反向 | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | 布拉特姆 | β – 内酰胺类 | 向前 | GCACGAGTGGG 塔卡特加 |
310 | 60 | 格布雷耶斯，塔库尔20 | ||||
| 反向 | GGTCCTCCGAT 中国国际旅游局 |
||||||||||
| 3 | 布拉克特克斯-M | β – 内酰胺类 | 向前 | 中国广加加 ATGTCACTG |
500 | 52 | 李等 21 | ||||
| 反向 | 中广委 CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | AAC（6'）-Ib | 氨基糖苷类 | 向前 | 塔加格特格茨 塔阿特奇加特 |
395 | 50 | Akers 等人 22 | ||||
| 反向 | CCCGCTTTCT 中总局 |
||||||||||
| 5 | AAD一个 | 氨基糖苷类 | 向前 | 阿克塔格茨 特加特加阿卡 |
624 | 58 | 切西尔丘克 23 | ||||
| 反向 | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
表5：可培养细菌中ARG的PCR引物。 显示了本研究中使用的不同ARG及其各自的引物序列。扩增子的预期大小以碱基对给出。还提到了每个引物组的退火温度。
| 抗生素 | 抗生素浓度（微克/毫升） | 立方英尺/毫升 |
| - | - | 约3.0 x 109 |
| 中电讯 | 3 | 约4.5 x 107 |
| 原位清洗 | 0.5 | 3.2 x 108 |
| K | 15 | 约9.6 x 105 |
| E | 20 | 约1.6 x 108 |
| 弗吉尼亚州 | 3 | 约1.2 x 109 |
表6：细菌总数和抗生素耐药细菌计数。 使用五种抗生素从水样中初步分离抗生素耐药细菌。细菌总数（不含抗生素）和 AR 细菌计数以每毫升菌落形成单位 （CFU/mL） 表示。缩写：AR = 抗生素耐药性;CFU = 菌落形成单位;CTX = 头孢噻肟;CIP = 环丙沙星;K = 卡那霉素;E = 红霉素;VA = 万古霉素。
| 隔离代码 | 微生物 | 家庭 |
| 1 | 大肠杆菌 | 肠杆菌科 |
| 2 | 大肠杆菌 | 肠杆菌科 |
| 3 | 大肠杆菌 | 肠杆菌科 |
| 4 | 大肠杆菌 | 肠杆菌科 |
| 5 | 大肠杆菌 | 肠杆菌科 |
| 6 | 大肠杆菌 | 肠杆菌科 |
| 7 | 肺炎克雷伯菌 | 肠杆菌科 |
| 8 | 肺炎克雷伯菌 | 肠杆菌科 |
| 9 | 肺炎克雷伯菌 | 肠杆菌科 |
| 10 | 肺炎克雷伯菌 | 肠杆菌科 |
| 11 | 科马莫纳斯属 | 苜蓿科 |
| 12 | 科马莫纳斯属 | 苜蓿科 |
| 13 | 微球菌属 | 微球菌科 |
| 14 | 关节杆菌属 | 微球菌科 |
| 15 | 气单胞菌属 | 气单胞菌科 |
表7：通过16S rRNA基因测序鉴定抗生素耐药分离株。 使用16S rRNA基因特异性引物对每种分离株进行菌落PCR。然后使用适当的生物信息学工具对获得的扩增子进行测序和鉴定。
| 隔离编号 | 隔离 | 中电讯 | 放大 器 | 乐 | C | TGC | 点击率 | 病虫害综合治理 | 根 | N | TR | 原位清洗 | 三月 | 年农指数 | ||
| 1 | 大肠杆菌 | 13R | 0R | 0R | 28秒 | 23秒 | 11R | 39秒 | 20秒 | 18秒 | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | 大肠杆菌 | 31秒 | 0R | 12R | 29秒 | 23秒 | 32秒 | 37秒 | 19秒 | 16秒 | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | 大肠杆菌 | 14R | 0R | 14R | 14R | 21秒 | 10R | 34秒 | 17秒 | 11R | 24秒 | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | 大肠杆菌 | 28秒 | 13R | 18R | 26秒 | 21秒 | 28秒 | 32秒 | 16R | 11R | 24秒 | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | 大肠杆菌 | 11R | 0R | 12R | 26秒 | 21秒 | 10R | 31秒 | 17秒 | 16秒 | 22秒 | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | 大肠杆菌 | 27秒 | 0R | 12R | 12R | 22秒 | 30秒 | 32秒 | 19秒 | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | 肺炎克雷伯菌 | 28秒 | 0R | 17R | 27秒 | 22秒 | 30秒 | 32秒 | 18秒 | 22秒 | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | 肺炎克雷伯菌 | 29秒 | 11R | 26秒 | 24秒 | 22秒 | 30秒 | 28秒 | 17秒 | 16秒 | 24秒 | 23秒 | 1 | 0.1 | ||
| 9 | 肺炎克雷伯菌 | 29秒 | 13R | 25秒 | 24秒 | 22秒 | 28秒 | 29秒 | 18秒 | 17秒 | 24秒 | 25秒 | 1 | 0.1 | ||
| 10 | 肺炎克雷伯菌 | 33秒 | 14秒 | 26秒 | 28秒 | 22秒 | 31秒 | 32秒 | 19秒 | 20秒 | 24秒 | 29秒 | 0 | 0 | ||
| 11 | 科马莫纳斯属 | - | - | - | 23秒 | - | - | 37秒 | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | 科马莫纳斯属 | - | - | - | 27秒 | - | - | 42秒 | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | 微球菌属 | 25秒 | 17R | 24秒 | 32秒 | 22秒 | 34秒 | 28秒 | 20秒 | - | 21秒 | 26秒 | 1 | 0.1 | ||
| 14 | 关节杆菌属 | 45秒 | 57秒 | 28秒 | 26秒 | 34秒 | 27秒 | 39秒 | 26秒 | - | 28秒 | 28秒 | 0 | 0 | ||
| 15 | 气单胞菌属 | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
表8：AST分析的细菌分离株的抗生素耐药性表型。使用圆盘扩散法分析分离株中的表型抗性。这些数字以毫米 （mm） 表示 ZOI。对于MAR指数，这些数字表示分离株耐药的抗生素总数。缩写：AST = 抗生素敏感性测试;CTX = 头孢噻肟;AMP = 氨苄西林;LE = 左氧氟沙星;C = 氯霉素;TGC = 替加环素;点击率=头孢曲松;IPM = 亚胺培南;GEN = 庆大霉素;N = 新霉素;TR = 甲氧苄啶;CIP = 环丙沙星;R = 耐;S = 敏感;MAR = 多种抗生素耐药性;ZOI = 抑制区。
| 抗微生物药物耐药性基因家族 | 基因 |
| SMB β-内酰胺酶 | SMB-1 |
| ampC型β-内酰胺酶 | ampC1 |
| VIM β-内酰胺酶 | VIM-20 |
| CcrA β-内酰胺酶 | 中央注册委员会 |
| NmcA β-内酰胺酶 | 纳米克尔 |
| ARL β-内酰胺酶 | ARL-1 |
| blaZ β-内酰胺酶 | 布拉兹 |
| blaTEM β-内酰胺酶 | 布拉特姆* |
| blaCTX β-内酰胺酶 | 布拉科特克斯 |
| 加气混凝土（6'） | aac（6'）-Ib， AAC（6'）-34 |
| 蚂蚁（3''） | aadA |
| 喹诺酮类耐药蛋白 | qnrS6， qnrVC5 |
| 耐药结节细胞分裂 （RND） 抗生素外排泵 | evgA， mtrA， mdtA， acrD |
| ATP 结合盒 （ABC） 抗生素外排泵 | oleC， macB， patA， bcrA |
| 主要促进超家族 （MFS） 抗生素外排泵 | 阿巴Q |
| 甲氧苄啶耐药二氢叶酸还原酶DFR | dfr1， dfrD， dfrA20 |
| 利福平磷酸转移酶 | rphB |
| 十一碳烯基焦磷酸相关蛋白 | bcrC |
| 耐甲氧西林PBP2 | 机电 |
| 凡氏膜蛋白 | 范· |
| 四环素抗性核糖体保护蛋白 | 泰特 |
| 氯霉素乙酰转移酶 | 猫B10 |
| Erm 23S 核糖体 RNA 甲基转移酶 | 呃（37） |
| 糖肽抗性基因簇 | vanRB， vanRE， vanRD |
| MCR 磷酸乙醇胺转移酶 | MCR-9 |
| 磺胺类耐药性硫酸盐 | 苏尔3 |
| *在可培养微生物中也检测到带下划线的基因 | |
表9：使用全宏基因组DNA分析鉴定的ARG。 将水样的总宏基因组用于全宏基因组测序，并使用适当的ARG数据库对获得的序列进行注释。显示了在宏基因组DNA中鉴定的一些重要ARG的代表性结果。在可培养微生物中也检测到带下划线的基因。缩写：ARG =抗生素抗性基因。
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Discussion
样本收集和处理起着重要作用，可能会影响研究结果和解释。因此，为了排除样品的变化，重要的是在所研究的淡水体的多个位置进行采样。在处理此类样品时保持适当的无菌环境条件可以防止污染。此外，为了防止细菌组成的变化可能影响提取核酸的质量和数量，运输条件应保持在4°C，从样品收集点到后续处理的时间最短。一些研究强调，如果不仔细进行，样品收集和处理之间的过渡期可能会在分析的后期阶段给出不同的结果12，13。
使用一系列稀释液进行铺板可确保菌落既不会聚集在一起，也不会有太少的菌落而无法计数。为了考虑由于移液/处理错误而可能出现的CFU/mL变化，有必要一式两份进行实验。此外，每个实验都保持对照板，以确保使用的抗生素有效工作并消除假阳性结果。因此，对照板应该没有可见的菌落生长。这表明所用抗生素的功效。
在AST期间，接种物培养密度和琼脂平板的厚度会影响ZOI的直径，从而影响结果的解释。因此，在进行AST实验时，应注意保持这两个因素的统一。最关键的方面是接种物中存在的细菌细胞的数量。通常，使用1×108-2×108 CFU/mL的细胞作为接种物，等于0.5麦克法兰标准14。接种物的浓度必须保持恒定，以避免结果发生任何变化。任何高于或低于所需浓度的浓度必须在无菌盐水的帮助下稀释，并在15分钟内立即用于接种。在将接种物铺在琼脂平板上时，必须注意避免接种量过多。多余的接种物可以通过在将拭子接种到MHA平板之前按压细菌悬浮管侧面来去除。与标准AST程序的任何偏差都会显着影响从此类协议11，15获得的数据。先前的一项研究表明，MAR 指数值为 ≥0.2 表明分离株16 具有高抗性。由于对 AST 结果的解释是基于 ZOI，因此应避免接种不足或过度接种培养物。
对于PCR，预混液应在冰块上制备，以最大程度地减少成分降解和酶活性损失的机会。在设置反应时戴手套可最大限度地减少外部污染的机会17.AGE期间的电压不应过高，因为这可能导致加热效应和上样样品的降解。在最佳电压下执行 AGE 可确保条带分离良好且清晰，没有任何拖曳或污迹效应。
过去几十年进行的研究表明，使用16S rRNA基因扩增子测序来鉴定不同的微生物。对于16S rRNA基因测序，选择提取模板DNA的方法会导致偏差，进而影响下游分析。革兰氏阳性细菌具有厚厚的肽聚糖细胞壁，使其难以提取核酸。因此，提取方法的选择应使其能够有效地捕获所有类型的微生物DNA。传统的沸腾法提取粗模板DNA是一种提取细胞内容物的有效方法，从而减少了结果中的偏差。
为了了解水体的完整细菌群落，本研究使用了高通量二代测序（HT-NGS）技术。全宏基因组DNA分析允许研究给定样品的整个宏基因组。基于培养的技术主要给出细菌负荷的有氧计数，表明样品的微生物质量。然而，可培养微生物仅占微生物总数的1%。其余的微生物群落包括包括厌氧菌在内的多种物种，其特征很差，经常被忽视。这些微生物可能携带AR特征。此外，共生微生物是AR基因的库，可以通过各种遗传交换事件传播给病原体18。这些共生体中的许多是不可培养的，可以通过涉及HT-NGS的宏基因组学方法进行研究，为鉴定任何样品中的各种微生物群落提供更大的覆盖范围。使用宏基因组分析，获得了细菌分类群的详细图谱，这补充了可培养的数据。此外，这种互补方法可以提供所研究水体的整体AR状态的概念。
在本研究中，使用基于传统培养物和非基于培养物的宏基因组技术的组合，我们能够确定总细菌多样性、不同的抗生素耐药细菌和水性 ARG 的总库。本研究中描述的方法可以复制和定制，以鉴定任何其他水源（沿海水、天然水和人造饮用水）中的 AR 病原体。它还可用于跟踪水传播的院内病原体的传播，以及通过水槽、马桶、浴缸和加湿器等水源监测医院和诊所环境中的医院相关感染。这将有助于监测抗微生物药物耐药性和确定水基抗微生物药物耐药性热点。
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Disclosures
作者没有需要披露的利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了孟买大学科技部-大学研究和科学卓越促进（DST-PURSE）计划的财政资助的部分支持。Devika Ghadigaonkar在该计划下担任项目研究员。科学和技术部科学与工程研究委员会（DST-SERB）项目编号：CRG/2018/003624高级研究员Harshali Shinde提供的技术支持得到了认可。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
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