Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Identifizierung von antibiotikaresistenten Bakterien aus Wasser und die molekulare Charakterisierung ihrer Antibiotikaresistenzgene (ARGs) vor. Die Verwendung von kulturbasierten und nicht-kulturbasierten (metagenomischen Analysen) Techniken liefert vollständige Informationen über die gesamte bakterielle Vielfalt und den Gesamtpool verschiedener ARGs, die in Süßgewässern aus Mumbai, Indien, vorhanden sind.
Abstract
Die Entwicklung und Ausbreitung von Antibiotikaresistenzen (AR) durch Mikrobiota in Verbindung mit Süßwasserkörpern ist ein großes globales Gesundheitsproblem. In der vorliegenden Studie wurden Süßwasserproben gesammelt und in Bezug auf die gesamte bakterielle Diversität und AR-Gene (ARGs) analysiert, wobei sowohl konventionelle kulturbasierte Techniken als auch ein kulturunabhängiger metagenomischer Ansatz mit hohem Durchsatz verwendet wurden. Dieser Artikel stellt ein systematisches Protokoll für die Zählung der gesamten und antibiotikaresistenten kultivierbaren Bakterien aus Süßwasserproben und die Bestimmung der phänotypischen und genotypischen Resistenz in den kultivierbaren Isolaten vor. Darüber hinaus berichten wir über die Verwendung der gesamten metagenomischen Analyse der gesamten metagenomischen DNA, die aus der Süßwasserprobe extrahiert wurde, zur Identifizierung der gesamten bakteriellen Vielfalt, einschließlich nicht kultivierbarer Bakterien, und zur Identifizierung des gesamten Pools verschiedener ARGs (Resistome) im Gewässer. Nach diesen detaillierten Protokollen beobachteten wir eine hohe Antibiotika-resistente Bakterienlast im Bereich von 9,6 × 10 5-1,2 × 109 KBE/ml. Die meisten Isolate waren resistent gegen die mehrfach getesteten Antibiotika, darunter Cefotaxim, Ampicillin, Levofloxacin, Chloramphenicol, Ceftriaxon, Gentamicin, Neomycin, Trimethoprim und Ciprofloxacin, mit multiplen Antibiotikaresistenzindizes (MAR) von ≥0,2, was auf eine hohe Resistenz der Isolate hinweist. Die 16S-rRNA-Sequenzierung identifizierte potenzielle humanpathogene wie Klebsiella pneumoniae und opportunistische Bakterien wie Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. und Aeromonas spp. Die molekulare Charakterisierung der Isolate zeigte das Vorhandensein verschiedener ARGs, wie blaTEM, blaCTX-M (β-Lactame), aadA, aac (6')-Ib (Aminoglykoside) und dfr1 (Trimethoprims), was auch durch die gesamte metagenomische DNA-Analyse bestätigt wurde. Eine hohe Prävalenz anderer ARGs, die für antibiotische Ausflusspumpen kodieren - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-Lactamasen-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen catB10 und das Rifampicin-Resistenzgen rphB- wurde ebenfalls in der metagenomischen DNA nachgewiesen. Mit Hilfe der in dieser Studie diskutierten Protokolle bestätigten wir das Vorhandensein von wasserbürtigen MAR-Bakterien mit verschiedenen phänotypischen und genotypischen Merkmalen von AR. Daher kann die gesamte metagenomische DNA-Analyse als komplementäre Technik zu herkömmlichen kulturbasierten Techniken verwendet werden, um den gesamten AR-Status eines Gewässers zu bestimmen.
Introduction
Antimikrobielle Resistenzen (AMR) wurden als eines der drängendsten globalen Probleme identifiziert. Die rasche Entwicklung antimikrobieller Resistenzen und ihre weltweite Ausbreitung sind eine der größten Bedrohungen für die menschliche Gesundheit und die Weltwirtschaft in Bezug auf die damit verbundenen Gesundheitskosten1. Der übermäßige Gebrauch und Missbrauch von Antibiotika haben zu einer Zunahme von AR geführt. Dies wurde durch die COVID-19-Pandemie unterstrichen, bei der die Behandlung von assoziierten Sekundärinfektionen in vielen Fällen aufgrund von AMR bei den betroffenen Patienten stark beeinträchtigt war2. Neben der direkten Verwendung/dem Missbrauch von Antibiotika durch den Menschen sind der übermäßige Einsatz und Missbrauch von Antibiotika in der Landwirtschaft und Tierhaltung und ihre unsachgemäße Einleitung in die Umwelt, einschließlich der Gewässer, eingroßes Problem 3. Das Aufkommen neuer Resistenzmerkmale und Multiresistenzen bei Bakterien unterstreicht dringend die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses der Faktoren, die zur Entwicklung von AR und ihrer Verbreitung führen. Mehrere antibiotikaresistente Bakterien, die oft mehrere AR-Gene (ARGs) auf mobilen genetischen Elementen wie Plasmiden tragen, können diese Resistenzgene auf nicht-resistente Mikroorganismen, einschließlich potenzieller humaner Krankheitserreger, übertragen, was zur Entstehung von Superbugs führt, die selbst mit Antibiotika als letztes Mittel nicht behandelbar sind4. Diese multiplen antibiotikaresistenten Bakterien können, wenn sie in Wasserökosystemen vorkommen, direkt über den Verzehr von kontaminierten wasserbasierten Lebensmitteln wie Fischen, Krabben und Weichtieren in den menschlichen Darm gelangen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Ausbreitung von AR-Bakterien in natürlich vorkommenden Wassersystemen auch andere Wasservorräte, einschließlich Trinkwasser, erreichen und so in die menschliche Nahrungskette gelangen kann 5,6,7.
Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, ein umfassendes Protokoll zu erstellen, das eine Kombination aus kulturbasierten und nicht-kulturbasierten (gesamte metagenomische Analyse) Techniken verwendet, um vollständige Informationen über die gesamte bakterielle Vielfalt und den Gesamtpool verschiedener ARGs in einem Gewässer in Mumbai, Indien, zu erhalten. Herkömmlicherweise wurden kulturbasierte Techniken verwendet, um die bakterielle Vielfalt in Gewässern zu untersuchen. Da kultivierbare Mikroorganismen nur einen kleinen Prozentsatz der gesamten Mikrobiota in jeder Nische ausmachen, müssen verschiedene kulturbasierte und kulturunabhängige Techniken gleichzeitig eingesetzt werden, um den Gesamtstatus der bakteriellen Vielfalt und die verschiedenen Resistenzmerkmale in jeder Probe besser zu verstehen. Eine solche robuste und zuverlässige kulturunabhängige Technik ist die gesamte metagenomische DNA-Analyse. Diese Hochdurchsatzmethode wurde erfolgreich in verschiedenen Studien zur bakteriellen Diversität oder den funktionellen Annotationen verschiedener ARGs 8,9 eingesetzt. Diese Technik nutzt das Metagenom (das gesamte Erbgut einer Probe) als Ausgangsmaterial für verschiedene Analysen und ist somit kulturunabhängig. Die Protokolle in der vorliegenden Studie können für die gesamte metagenomische DNA-Analyse verwendet werden, um Informationen über die gesamte bakterielle Diversität und verschiedene ARGs (Resistome) in Wasserproben zu erhalten.
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Protocol
1. Probenentnahme und -verarbeitung
- Musterkollektion
- Sammeln Sie das entsprechende Volumen der Wasserprobe in sterilen Probenbehältern und stellen Sie sicher, dass nicht mehr als 3/4 des Behälters gefüllt ist.
- Transportieren Sie die Proben so schnell wie möglich nach der Entnahme unter aseptischen Bedingungen ins Labor und verarbeiten Sie sie sofort.
- Probenbearbeitung
- Filtern Sie die Wasserprobe aseptisch durch ein steriles Musselintuch, um Partikel zu entfernen.
- Führen Sie geeignete serielle Verdünnungen des gefilterten Wassers zur weiteren Analyse durch.
2. Abschätzung der Gesamtkeimbelastung und der Keimzahl der Antibiotikaresistenzen
- Bestimmung der Gesamtkeimbelastung
- 18,12 g R2A-Agar, modifiziertes Pulver, in 1.000 ml doppelt destilliertem Wasser suspendieren und die Mischung durch Erhitzen auflösen. Das gelöste Gemisch wird bei 121 °C, 15 psi für 20 Minuten autoklaviert. Bereiten Sie R2A-Agar, modifizierte Platten vor, indem Sie die entsprechende Menge des autoklavierten Gemisches in sterile Petriplatten gießen (z. B. etwa 20 ml autoklaviertes steriles Medium zu einer 90 mm sterilen Petriplatte).
- Verteilen Sie gleichmäßig 100 μL der entsprechenden Verdünnungen der gefilterten Wasserprobe auf die R2A-Agar-modifizierte Platte, sobald das Medium erstarrt ist. Führen Sie das Experiment doppelt durch.
- Alle oben genannten Platten werden 48 Stunden lang bei 35-37 °C inkubiert (je nach verwendetem Medium variieren Temperatur und Inkubationszeit).
- Drücken Sie die Gesamtbakterienbelastung in koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) unter Verwendung von Gleichung (1) aus:
(1)
- Bestimmung der AR-Keimzahl
- Befolgen Sie die Schritte 2.1.1-2.1.4. Anstelle von R2A-Agar verwenden modifizierte Platten jedoch R2A-Agar, modifizierte Platten, die einzeln mit fünf verschiedenen Antibiotika ergänzt werden, nämlich Cefotaxim (3 μg / ml), Ciprofloxacin (0,5 μg / ml), Erythromycin (20 μg / ml), Kanamycin (15 μg / ml) und Vancomycin (3 μg / ml).
- Die Antibiotika werden separat in Röhrchen gegeben, die 20 ml steriles geschmolzenes R2A-Agar, modifiziert (mit der Temperatur des geschmolzenen R2A-Agars, modifiziert bei ≤40 °C), enthalten, um die endgültige Antibiotikakonzentration gemäß Schritt 2.2.1 zu erreichen.
- Zum gleichmäßigen Mischen schwenken und auf sterile Petriplatten gießen, bevor der Agar erstarrt. Führen Sie das Experiment doppelt durch.
- Inkubieren Sie alle oben genannten Platten bei 35-37 °C für 48 h (bei Verwendung eines anderen Mediums können Temperatur und Inkubationszeit variieren).
- Zur Qualitätskontrolle und Überprüfung der Wirksamkeit der Antibiotika verteilen Sie 100 μL Bakteriensuspensionen der Stämme Escherichia coli ATCC 25922 und Staphylococcus aureus ATCC 29213 auf ihre jeweiligen antibiotikahaltigen R2A-Agar, modifizierte Platten (stellen Sie sicher, dass die Dichte der für die Impfung verwendeten Frischkultur OD = 0,5 bei 600 nm beträgt).
- Die Anzahl der antibiotikaresistenten Keime in KBE/ml wird bestimmt, wie in Schritt 2.1.4 beschrieben.
- Glycerinvorräte der Isolate
- Wählen Sie morphologisch unterschiedliche AR-Kolonien aus.
- Eine einzelne isolierte Kolonie wird in 2 ml steriler Luria-Bertani-Bouillon suspendiert, die das entsprechende Antibiotikum enthält (z. B. wenn eine Kolonie aus einer Platte ausgewählt wurde, die Cefotaxim enthält, wird die Kolonie aus Schritt 2.3.1 in steriler Luria-Bertani-Bouillon, die Cefotaxim in ihrer jeweiligen Konzentration enthält, beimpft).
- Die beimpften Röhrchen werden bei 37 °C bei 80 U/min inkubiert, bis der OD600 0,5 erreicht.
- Glycerinvorräte der Isolate werden hergestellt, indem 750 μL der Kultursuspension aus Schritt 2.3.3 unter aseptischen Bedingungen in 250 μL steriles 100%iges Glycerin gemischt werden.
- Lagern Sie die Glycerinvorräte bis zur weiteren Analyse bei −80 °C.
HINWEIS: Zur Wiederbelebung der Kulturen aus den Glycerinvorräten die Glycerinvorräte bei 4 °C auftauen. Eine Schleife voll dieser Brühe in 2 ml sterile Luria-Bertani-Bouillon mit dem jeweiligen Antibiotikum einimpfen und wachsen lassen.
(1)3. Identifizierung kultivierbarer Bakterien durch 16S-rRNA-Gensequenzierung
- Herstellung eines DNA-Templates aus den Isolaten für die PCR
ANMERKUNG: Das beschriebene Protokoll für die Herstellung einer DNA-Vorlage für die PCR zur Isolierung von Roh-DNA aus den Bakterien wird von Carlson et al.10 gegeben.- Nehmen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine einzelne, isolierte, reine Kolonie des Isolats, das auf einer Petriplatte wächst. Die Bakterienkolonie in 100 μL sterilem, doppelt destilliertem Wasser in einem sterilen Mikrozentrifugenröhrchen suspendieren und 10 min kochen lassen.
- Zentrifugieren Sie die Suspension bei 10.000 × g für 2 Minuten, um die Trümmer zu pelletieren, und überführen Sie den Überstand in ein frisches steriles Mikrozentrifugenröhrchen, das als rohe DNA-Vorlage verwendet wird.
- Gezielte PCR-Amplifikation der V3-Region des 16S-rRNA-Gens und Sequenzierung
- 40 μL des Reaktionsgemisches werden in einem PCR-Röhrchen für die PCR-Amplifikation hergestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben.
HINWEIS: Die DNA-Präparation sollte auf einem Eisblock durchgeführt werden, wobei die Gefahr einer Kontamination minimiert werden sollte (tragen Sie Handschuhe bei der Handhabung der Reagenzien und reinigen Sie die Arbeitsfläche gründlich mit 70% Ethanol). - Legen Sie das Röhrchen in den Thermoblock und führen Sie das entsprechende Programm im PCR-Thermocycler aus. Siehe Tabelle 2 für die standardisierten PCR-Zyklusbedingungen und die Primer-Informationen für die Amplifikation der V3-Regionen der 16S-rRNA-Gene.
- Zur Auflösung der Amplikone und Visualisierung wird eine Agarose-Gelelektrophorese (AGE) durchgeführt. Mischen Sie 10 μL des amplifizierten PCR-Produkts und 2 μL 6x Gelbeladungspuffer (Tabelle 3) und laden Sie dieses Gemisch in Vertiefungen auf 1,5%igem Agarosegel (lösen Sie 1,5 g Agarosepulver in 100 mL 1x TAE-Puffer [Tabelle 3]), das 5 μL 10 mg/ml Ethidiumbromid (EtBr) enthält, bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml EtBr in 100 ml des Agarosegels.
VORSICHT: EtBr ist ein starkes Karzinogen. Beim Umgang mit EtBr und Gelen, die EtBr enthalten, sollten immer Handschuhe getragen werden. - Fügen Sie eine DNA-Leiter hinzu, um die Größe der Amplikonen abzuschätzen.
- Elektrophorese des Gels in einem TAE-Tankpuffer bei 80-100 V durchführen.
- Sobald der Tracking-Farbstoff 3/4 des Gels verläuft, stoppen Sie die Elektrophorese und visualisieren Sie die Amplikonbänder unter einem UV-Transilluminator.
- Verwenden Sie das PCR-Produkt (Amplicon) für die 16S-rRNA-Gensequenzierung, um das Isolat zu identifizieren.
- Quantifizieren Sie das Amplikon, indem Sie es einer spektralphotometrischen Analyse mit Gleichung (2) unterziehen.
(2) - Um die Reinheit der DNA zu überprüfen, berechnen Sie das Verhältnis von A260 zu A280.
HINWEIS: Idealerweise sollte diese Zahl über 1,5 und vorzugsweise zwischen 1,8 und 2,0 liegen. - Um die Isolate zu identifizieren, vergleichen Sie die erhaltenen Sequenzen mit Sequenzdatenbanken mithilfe eines geeigneten Alignment-Suchwerkzeugs.
- 40 μL des Reaktionsgemisches werden in einem PCR-Röhrchen für die PCR-Amplifikation hergestellt, wie in Tabelle 1 beschrieben.
(2)4. Nachweis von Antibiotikaresistenzen in den Isolaten mittels Antibiotika-Empfindlichkeitstests
HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Methode für die Antibiotika-Empfindlichkeitsprüfung (AST) durch Bandscheibendiffusion. Folgende antibiotische Bandscheiben wurden verwendet: Cefotaxim (5 μg), Ampicillin (10 μg), Levofloxacin (5 μg), Chloramphenicol (30 μg), Tigecyclin (15 μg), Ceftriaxon (30 μg), Imipenem (10 μg), Gentamicin (10 μg), Neomycin (10 μg), Trimethoprim (5 μg) und Ciprofloxacin (5 μg).
- Vorbereitung des Inokulums für die AST
- Eine einzelne, isolierte, gereinigte AR-Kolonie wird unter Verwendung einer sterilen Schleife in 2 ml eines sterilen, nicht selektiven Mediums, wie z. B. Luria-Bertani-Bouillon (ohne Antibiotikum), aseptisch beimpft und über Nacht bei 37 °C bei 80 U/min inkubiert.
- Resuspendieren, indem 100-150 μL der über Nacht gewachsenen Kultur (ca. OD 600 = 1,8-2,0) in 2 ml frischem, nicht selektivem Luria-Bertani-Brühmedium entnommen und 2-4 h inkubiert werden (bis der OD600 0,4-0,5 erreicht).
- Diese frisch gezüchtete Kultursuspension wird mit steriler 0,85%iger Kochsalzlösung so verdünnt, dass die Dichte der Kultur dem McFarland-Standard von 0,5 entspricht (ungefähr OD600 = 0,1), was ungefähr 1-2 × 108 Zellen/ml entspricht.
- Mischen Sie die Bakteriensuspension vorsichtig für eine gleichmäßige Zellverteilung.
- Verwenden Sie die obige Suspension innerhalb von 15 Minuten nach der Verdünnung.
- Beimpfung der Agarplatten
- Bereiten Sie Müller-Hinton-Agarplatten (MHA) für die Durchführung der AST vor, indem Sie 38 g MHA in 1.000 ml doppelt destilliertem Wasser mischen und die Mischung durch Erhitzen auflösen. Das gelöste Gemisch wird bei 121 °C, 15 psi für 15 min autoklaviert.
- Stellen Sie sicher, dass die MHA-Tiefe in den Platten 4 mm beträgt (25 ml Medium pro Platte).
- Nehmen Sie gleichzeitig die antibiotischen Scheiben aus dem Gefrierschrank und erwärmen Sie sie auf Raumtemperatur.
HINWEIS: Die antibiotischen Scheiben sollten allmählich aufgetaut werden, indem die Scheiben zunächst bei 4 °C und später bei Raumtemperatur aufgetaut werden, um eine mögliche Kondensationsgefahr auf den Scheiben zu verringern, die sich anschließend auf die Hemmzone (ZOI) auswirken kann. - Unter aseptischen Bedingungen wird ein steriles Wattestäbchen in das in Schritt 4.1 vorbereitete Inokulum getaucht und überschüssige Suspension entfernt, um eine Überbeimpfung der Platten zu vermeiden.
- Verteilen Sie die Kultur gleichmäßig auf den Tellern, beginnend mit der Oberseite der MHA-Platte und von Rand zu Rand hin und her. Drehen Sie die Platte beim Abtupfen um 60°.
- Anwendung der antibiotischen Scheiben
- Übertragen Sie die antibiotischen Scheiben mit Hilfe einer flammsterilisierten Pinzette aseptisch auf die inokulierten MHA-Platten und drücken Sie die Scheiben vorsichtig an, um einen vollständigen Kontakt mit dem Agar zu gewährleisten.
HINWEIS: Dieser Vorgang muss innerhalb von 15 Minuten nach der Beimpfung der Kultur auf den Platten durchgeführt werden. - Legen Sie die entsprechende Anzahl von Antibiotikascheiben auf die Agarplatte unter Berücksichtigung des Organismus, des verwendeten Antibiotikums und der Größe der Platte, um eine Überlappung der Hemmzonen zu vermeiden.
HINWEIS: Vier bis fünf Scheiben können auf einer 90 mm Rundplatte untergebracht werden.
- Übertragen Sie die antibiotischen Scheiben mit Hilfe einer flammsterilisierten Pinzette aseptisch auf die inokulierten MHA-Platten und drücken Sie die Scheiben vorsichtig an, um einen vollständigen Kontakt mit dem Agar zu gewährleisten.
- Inkubation der Platten
- Innerhalb von 15 min nach dem Auftragen der antibiotischen Scheiben die Platten umdrehen und über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Interpretation der Ergebnisse
- Messen Sie den ZOI-Durchmesser in Millimetern (mm) und interpretieren Sie gemäß den Haltepunktwerten von EUCAST11. Sehen Sie sich die beiden unten aufgeführten Beispiele an.
- Der Bruchpunkt des Zonendurchmessers (mm) für eine Ciprofloxacin-Antibiotikascheibe (5 μg) für Enterobacterales beträgt S ≥ 25 und R < 22, was bedeutet, dass sie als empfindlich (S) gilt, wenn ZOI 25 mm ≥, während sie resistent ist (R), wenn ZOI 22 mm <. Liegt der ZOI-Durchmesser zwischen 22 und 25, gilt das Isolat als intermediär (I).
- Der Bruchpunkt des Zonendurchmessers (mm) für eine Chloramphenicol-Antibiotikascheibe (30 μg) für Staphylococcus spp. ist S ≥ 18 und R < 18, was bedeutet, dass er als empfindlich gilt, wenn ZOI 18 mm ≥, während er resistent ist, wenn ZOI 18 mm <.
- Bestimmen Sie den Index der multiplen Antibiotikaresistenz (MAR), indem Sie das Verhältnis der Anzahl der Antibiotika, gegen die das Isolat resistent ist, zur Gesamtzahl der Antibiotika, denen das Isolat ausgesetzt ist, ermitteln.
HINWEIS: Für die Qualitätskontrolle E. coli ATCC 25922 und S. aureus ATCC 29213 werden als Referenzstämme gemäß dem Protokoll in Schritt 4 verwendet.
- Messen Sie den ZOI-Durchmesser in Millimetern (mm) und interpretieren Sie gemäß den Haltepunktwerten von EUCAST11. Sehen Sie sich die beiden unten aufgeführten Beispiele an.
5. PCR-basierter Nachweis von Antibiotikaresistenzgenen in den Isolaten
- Verwenden Sie ein Standard-PCR-Protokoll für die Identifizierung von ARGs in den Isolaten. Bereiten Sie die DNA-Vorlage unter Verwendung des in Schritt 3.1 angegebenen Protokolls vor.
ANMERKUNG: Die in dieser Studie verwendeten PCR-Zyklusbedingungen betrugen 94 °C für 10 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, Glühen für 30 s bei der entsprechenden Temperatur (wie für jeden Primer-Satz standardisiert), Dehnung bei 72 °C für 40 s und eine abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten. Das Reaktionsgemisch ist in Tabelle 4 beschrieben. Die Liste der ARGs, Primer und Glühtemperaturen ist in Tabelle 5 aufgeführt. - Führen Sie die Schritte 3.2.3 bis 3.2.10 aus, um die Reinheit der Amplikonen aufzulösen, zu visualisieren und zu überprüfen.
6. Metagenomische DNA-Analyse zur Identifizierung der gesamten bakteriellen Diversität und zum Nachweis von ARGs im Metagenom
- Extraktion der gesamten DNA (Metagenom) aus der Wasserprobe
- Extrahieren Sie die metagenomische DNA aus den gefilterten Wasserproben.
HINWEIS: In der aktuellen Studie wurde die metagenomische DNA (Gesamt-DNA) aus den gefilterten Wasserproben unter Verwendung des referenzierten DNA-Isolationskits gemäß dem Protokoll des Herstellers extrahiert (siehe Materialtabelle). - Überprüfen Sie die Qualität der DNA, indem Sie 3 μL der extrahierten metagenomischen DNA auf ein 0,8%iges Agarose-Gel laden und das Gel bei 80-110 V für ca. 30 Minuten laufen lassen.
- Prüfen Sie, ob ein einzelnes intaktes Band vorhanden ist.
- Überprüfen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer.
- Extrahieren Sie die metagenomische DNA aus den gefilterten Wasserproben.
- Bestimmung der bakteriellen Diversität und Detektion von ARGs mittels metagenomischer DNA-Sequenzierung
- Bibliotheksvorbereitung und PCR-Amplifikation:
- Bereiten Sie eine Paired-End-Sequenzierungsbibliothek mit dem referenzierten DNA-Bibliotheksvorbereitungskit vor (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie die DNA für die Adapterligatur vor, indem Sie 200 ng DNA nehmen und mechanisch in kleinere Fragmente scheren, gefolgt von einem kontinuierlichen Schritt der Endreparatur, bei dem ein "A" an die 3'-Enden angehängt wird.
- Abhängig von der Plattform, die für die Sequenzierung verwendet wird, ligieren Sie spezifische Adapter an beiden Enden der DNA-Fragmente.
HINWEIS: Sequenzen, die für die Bindung von Dual-Barcode-Bibliotheken an eine Flusszelle für die Sequenzierung entscheidend sind, sind in diesen Adaptern vorhanden. Dies ermöglicht die PCR-Amplifikation der adapterligierten Fragmente und die Bindung der Standard-Sequenzierungsprimer. - Um die Qualität und Quantität zu überprüfen, analysieren Sie die amplifizierte Bibliothek mit einem hochempfindlichen DNA-Chip gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Cluster-Generierung und -Sequenzierung:
- Laden Sie die erweiterte Bibliothek auf die entsprechende Sequenzierungsplattform für die Clustergenerierung und die anschließende Sequenzierung.
HINWEIS: Die Bibliotheksmoleküle binden an die komplementären Adapter-Oligos auf der Paired-End-Durchflusszelle. Bei der Sequenzierung werden die Vorwärtsstränge nach der Resynthese des Reversestrangs selektiv gespalten. Dieser kopierte umgekehrte Strang wird dann vom gegenüberliegenden Ende des Fragments sequenziert.
- Laden Sie die erweiterte Bibliothek auf die entsprechende Sequenzierungsplattform für die Clustergenerierung und die anschließende Sequenzierung.
- Bioinformatische Analyse:
- Generieren Sie aus den hochwertigen Daten Scaffolds mit der entsprechenden Plattform.
- Unterziehen Sie diese Gerüste einer bioinformatischen Analyse für die taxonomische Klassifizierung und Identifizierung der ARGs.
HINWEIS: Der Arbeitsablauf für die gesamte metagenomische DNA-Analyse zur Identifizierung der gesamten bakteriellen Diversität und zum Nachweis von ARGs im Metagenom ist in Abbildung 1 dargestellt. Abbildung 2 zeigt ein Flussdiagramm der vollständigen Methodik, die im Manuskript beschrieben ist.
- Bibliotheksvorbereitung und PCR-Amplifikation:
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Representative Results
Gesamtkeimbelastung und Anzahl der antibiotikaresistenten (AR) Bakterien
Die Zählung der Gesamtbakterienbelastung erfolgte durch Verteilen von 10−4- bis 10−6-fachen Verdünnungen der Wasserproben auf R2A-Agar, modifiziertes Medium. Für die Zählung der AR-Bakterienzahl wurden 10−3- bis 10−6-fache Verdünnungen auf antibiotikahaltige Medienplatten aufgetragen (Abbildung 3). Die Gesamt- und AR-Bakterienzahlen wurden als KBE/ml berechnet, und alle Beschichtungsexperimente wurden doppelt durchgeführt. Nach den oben genannten Protokollen zeigte die vorliegende Studie, dass die Gesamtkeimzahl 3,0 × 109 KBE/ml beträgt. Die AR-Keimbelastung erwies sich als hoch im Bereich von 9,6 × 10 5-1,2 × 109 KBE/ml (Tabelle 6).
Identifizierung kultivierbarer Bakterien durch 16S-rRNA-Gensequenzierung
Rohe DNA aus jedem Isolat wurde als Vorlage verwendet, um eine 16S-rRNA-Gen-spezifische PCR durchzuführen. Von den insgesamt 15 sequenzierten AR-Isolaten gehörten 10 zur Familie der Enterobacteriaceae, wobei die meisten Escherichia coli und Klebsiella pneumoniae waren. Seltene opportunistische Bakterien wie Comamonas spp. aus der Familie Comamonadaceae, Micrococcus spp. und Arthrobacter spp. Aus der Wasserprobe wurden auch Aeromonas spp. aus der Familie der Aeromonadaceae identifiziert (Tabelle 7).
Nachweis von Antibiotikaresistenzen in den kultivierbaren Bakterien mittels Antibiotika-Empfindlichkeitstests
Das Antibiotikaresistenzprofil der oben identifizierten Isolate wurde durch die Durchführung von AST unter Verwendung der Scheibendiffusionsmethode erzeugt (Abbildung 4). Von den 15 getesteten Isolaten wiesen 8 einen MAR-Index von ≥0,2 auf, was auf einen hohen Grad an Resistenz hinweist. Darüber hinaus zeigten viele der Isolate Co-Resistenzprofile (Resistenz gegen den gleichen Satz von Antibiotika). Isolate wie Comamonas spp. und Arthrobacter spp. zeigten jedoch keine Resistenz gegen eines der getesteten Antibiotika (Tabelle 8).
Nachweis und Identifizierung von Antibiotikaresistenzgenen in den kultivierbaren Bakterien
Insgesamt wurden 10 AR-Isolate mittels PCR auf das Vorhandensein von ARGs untersucht. Das am weitesten verbreitete ARG in den kultivierbaren Isolaten war blaTEM, das für β-Lactamase kodiert, gefolgt vom Aminoglykosid-Resistenzgen aadA. Andere amplifizierte ARGs waren blaCTX-M, dfr1 und aac(6')-Ib , die eine Resistenz gegen β-Lactame, Trimethoprim bzw. Aminoglykoside verleihen. Die repräsentativen Ergebnisse der Amplifikation der ARGs sind in Abbildung 5 dargestellt. Für die meisten der identifizierten Isolate wurde die phänotypische Resistenz (AST) auf molekularer Ebene mittels PCR-basiertem genotypischem AR-Profiling bestätigt.
Identifizierung der gesamten bakteriellen Diversität in der metagenomischen DNA
Um das Vorhandensein aller möglichen Bakterien (sowohl kultivierbare als auch nicht kultivierbare) zu überprüfen und ihre relativen Häufigkeiten zu identifizieren, wurde eine metagenomische DNA-Analyse für die gesamte bakterielle Diversität durchgeführt. Unter Verwendung des Hochdurchsatz-Next-Generation-Sequencing-Ansatzes (HT-NGS) wurden ~96,94% der gesamten Sequenzlesevorgänge erzielt, was zu einer hohen Abdeckung führte. Eine taxonomische Annotation wurde durchgeführt, um die Reads in verschiedene taxonomische Gruppen von der Stamm- bis zur Gattungsebene zu klassifizieren (Abbildung 6 und Abbildung 7). Insgesamt konnten 50 Stämme im Metagenom identifiziert werden, was auf die hohe bakterielle Diversität in der Wasserprobe hinweist. Proteobakterien waren der dominanteste Stamm, bestehend aus den Klassen Alphaproteobakterien, Betaproteobakterien und Gammaproteobakterien. Auf der Ebene der Ordnung war Burkholderiales die am weitesten verbreitete Ordnung und gehörte zur Klasse der Betaproteobakterien. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium und Comamonas waren einige der reichlich vorhandenen Gattungen, die in der Wasserprobe gefunden wurden.
Nachweis von ARGs aus der metagenomischen DNA
Um den Gesamtpool an ARGs im Metagenom der Wasserprobe zu verstehen, wurde eine vollständige metagenomische Sequenzierung durchgeführt, gefolgt von der Identifizierung von ARGs mit geeigneten bioinformatischen Werkzeugen. Der metagenomische Ansatz stellt sicher, dass die ARGs, die sowohl in kultivierbaren als auch in nicht kultivierbaren Mikroorganismen in der Probe vorhanden sind, nachgewiesen werden. Eine Vielzahl von Genen, die eine Resistenz gegen β-Lactame verleihen (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); Aminogylcoside (AAC(6')-34); Chinolone (qnrS6, qnrVC5); Antibiotika-Efflux-Pumpen-Resistenz-Nodulations-Zellteilung (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), ATP-bindende Kassette (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) und Haupt-Facilitator-Superfamilie (MFS) (abaQ); Trimethoprim-resistente Dihydrofolatreduktase (dfrD, dfrA20); Rifampinphosphotransferase (rphB); und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) (catB10) wurden im Metagenom nachgewiesen. Die mittels PCR nachgewiesenen ARGs in den kultivierbaren Isolaten (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1) wurden ebenfalls durch vollständige metagenomische Sequenzierung nachgewiesen und bestätigten damit ihr Vorhandensein in der Wasserprobe. Die repräsentativen Ergebnisse der im Metagenom identifizierten ARGs unter Verwendung der gesamten metagenomischen DNA-Analyse sind in Tabelle 9 aufgeführt.
Abbildung 1: Arbeitsablauf für die gesamte metagenomische DNA-Analyse. Der schrittweise Arbeitsablauf zur Identifizierung der gesamten bakteriellen Diversität und zum Nachweis der ARGs aus dem Metagenom wird vorgestellt. Die Gesamtschritte umfassen die metagenomische DNA-Vorbereitung, Amplifikation und Identifizierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Flussdiagramm der vollständigen Methodik. Der schrittweise Ablauf der in der vorliegenden Studie verwendeten Methodik. Eine Kombination aus kulturbasierten und nicht-kulturbasierten Techniken wird verwendet, um vollständige Informationen über die bakterielle Vielfalt und die Identität der in der Wasserprobe vorhandenen ARGs zu erhalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von isolierten Kolonien auf antibiotikahaltigem R2A-Agar, modifizierte Platten. Wasserproben, plattiert auf Cefotaxim (3 μg/ml)-haltigem R2A-Agar, modifizierte Platten. Die Probe wurde seriell verdünnt und in Duplikat-A1, A2: 10−4 plattiert; B1, B2: 10−5; C1, C2: 10−6. Nach der entsprechenden Inkubationszeit waren die isolierten Kolonien auf den B1-, B2-, C1- und C2-Platten sichtbar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Antibiotika-Empfindlichkeitstest nach der Bandscheibendiffusionsmethode. Repräsentative Bilder von AST mit der Scheibendiffusionsmethode für ein Escherichia coli-Isolat . AST wurde in Duplikat-A1, A2 durchgeführt: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. Die Durchmesser der ZOIs wurden in Millimetern (mm) gemessen. Um zu interpretieren, ob das Isolat resistent oder anfällig für das verwendete Antibiotikum ist, wurde der ZOI mit den neuesten EUCAST-Tabellen verglichen. Abkürzungen: AST = Antibiotika-Empfindlichkeitstest; CTX = Cefotaxim; IPM = Imipenem; C = Chloramphenicol; CIP = Ciprofloxacin; LE = Levofloxacin; TGC = Tigecyclin; AMP = Ampicillin; GEN = Gentamicin; TR = Trimethoprim; N = Neomycin; K = Kanamycin; CTR = Ceftriaxon; ZOI = Hemmzone; EUCAST = Europäisches Komitee für Antibiotika-Empfindlichkeitstests. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: PCR-Amplifikation von Antibiotikaresistenzgenen aus kultivierbaren Bakterien. Für die Visualisierung von amplifizierten Banden wurde eine Agarose-Gelelektrophorese nach PCR durchgeführt, um das Vorhandensein von ARGs in den Isolaten zu überprüfen. Getrennte Banden von PCR-Amplikons sind auf dem Gel zu sehen. Die Größe der einzelnen PCR-Amplikone wird mit einem geeigneten DNA-Marker verglichen. Spur L1: 100 bp DNA-Leiter; Bahnen 1-5: 1: dfr1 (425 bp); Bahn 2: blaTEM (310 bp); Bahn 3: blaCTX-M (500 bp); Bahn 4: aac(6')-Ib ( 395 bp); Bahn 5: aadA (624 bp). Abkürzung: ARGs = Antibiotikaresistenzgene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Taxonomische Klassifikation für die Stamm- und Klassenebene . (A) Balkendiagramm, das die taxonomische Abundanzverteilung des bakteriellen Metagenoms in der Wasserprobe auf Stammebene zeigt. Insgesamt wurden 50 Bakterienstämme durch die metagenomische Analyse identifiziert. Die ersten 12 dominanten Bakterienstämme sind dargestellt. (B) Balkendiagramm, das die taxonomische Abundanzverteilung des bakteriellen Metagenoms in der Wasserprobe auf Klassenebene zeigt. Insgesamt wurden 50 Bakterienklassen durch die metagenomische Analyse identifiziert. Die ersten 15 dominanten Bakterienklassen sind dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Taxonomische Klassifikation für die Ordnungs- und Gattungsebenen . (A) Balkendiagramm, das die taxonomische Abundanzverteilung des bakteriellen Metagenoms in der Wasserprobe auf Ordnungsebene zeigt. Insgesamt wurden 50 bakterielle Ordnungen durch die metagenomische Analyse identifiziert. Die ersten 14 dominanten Ordnungen von Bakterien sind in der Abbildung dargestellt. (B) Balkendiagramm, das die taxonomische Abundanzverteilung des bakteriellen Metagenoms in der Wasserprobe auf Gattungsebene zeigt. Insgesamt wurden 50 Bakteriengattungen durch die metagenomische Analyse identifiziert. Die ersten 15 dominanten Bakteriengattungen sind in der Abbildung dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| PCR-Reagenzien | Volumen (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 20 |
| Vorwärts-Primer (10 Pico-Mole) | 1.5 |
| Reverse-Primer (10 Pico-Mole) | 1.5 |
| Rohe DNA-Vorlage | 1.5 |
| Steriles molekularbiologisches Wasser | 15.5 |
| Gesamtvolumen | 40 |
Tabelle 1: PCR-Mastermix-Bestandteile. Die Reaktionsmischungszusammensetzung verschiedener PCR-Reagenzien.
| Richtung | Primer Sequenz 5' – 3' | PCR-Bedingungen | Anzahl der Zyklen |
| Vorwärts | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 °C für 10 min | 1 |
| Denaturierung bei 94 °C für 30 s | 35 | ||
| Glühen bei 50 °C für 30 s | |||
| Ausdehnung bei 72 °C für 40 s | |||
| Rückwärts | CTACCGGGGTATCTAATCC | Endverlängerung bei 72 °C für 5 min | 1 |
Tabelle 2: PCR-Zyklusbedingungen für die Amplifikation des 16S-rRNA-Gens. Die PCR-Zyklusbedingungen, die für die 16S-rRNA-Genamplifikation erforderlich sind, werden gezeigt. Die Schritte umfassen einen ersten Denaturierungsschritt, gefolgt von 35 Zyklen der Denaturierung, des Glühens und der Dehnung sowie eines abschließenden Verlängerungsschritts.
| 6x Ladegel | |
| Inhalt | Menge |
| Bromphenolblau | 25 mg |
| 85% Glycerin | 7,06 ml |
| Milli-Q Wasser | 2,94 ml |
| Gesamtvolumen | 10 ml |
| 50x Trisacetat-EDTA (TAE) Zusammensetzung des Lagerpuffers | |
| Inhalt | Menge |
| Tris-Basis | 242 g in 700 ml doppelt destilliertem Wasser |
| Eisessig (GAA) | 57,1 ml |
| 0,5 M (EDTA) pH 8,0 | 100 ml |
| Stellen Sie den pH-Wert auf 8,5 ein und füllen Sie das Volumen mit doppelt destilliertem Wasser auf 1000 ml auf | |
| Für 1x TAE: 20 mL 50x TAE-Puffer + 980 mL doppelt destilliertes Wasser | |
Tabelle 3: Zusammensetzung des 6-fachen Gel-Beladungspuffers und des 50-fachen Tris-Acetat-EDTA-Stammpuffers. Der 6-fache Gel-Ladepuffer wird mit der Probe vermischt, die auf Agarose-Gelelektrophorese getestet werden soll. Es enthält Bromphenolblau als Tracking-Farbstoff. Glycerin erhöht die Dichte der Probe, die für eine ordnungsgemäße Beladung in die Vertiefungen geladen wird. Die Zusammensetzung der verschiedenen Reagenzien, die für die Herstellung des 50xTAE-Vorratspuffers benötigt werden, wird ebenfalls gezeigt. Der TAE-Puffer ist einer der am häufigsten verwendeten Puffer für AGE, hält den pH-Wert bei 8,5 und ermöglicht die Migration von amplifizierter DNA während der AGE. Abkürzungen: TAE = Tris-acetat-EDTA; AGE = Agarose-Gelelektrophorese.
| PCR-Reagenzien | Volumen (μL) |
| 2x Taq Master Mix | 5 |
| Vorwärts-Primer (10 Pico-Mole) | 0.5 |
| Reverse-Primer (10 Pico-Mole) | 0.5 |
| Rohe DNA-Vorlage | 1.5 |
| Steriles Wasser in molekularbiologischer Qualität | 2.5 |
| Gesamtvolumen | 10 |
Tabelle 4: PCR-Mastermix-Zusammensetzung zur Identifizierung von ARGs. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches verschiedener PCR-Reagenzien, die für die Durchführung des PCR-Experiments erforderlich sind.
| Sr. Nr. | Ziel-Gen | Beständigkeit gegen | Fibel | Primer-Sequenz (5'-3') | Amplikon-Größe (bp) | Glühtemperatur (°C) | Referenzen | ||||
| 1 | DFR Ein | Trimethoprim | Vorwärts | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | Racewicz et al., 19 | ||||
| Rückwärts | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | blaTEM | β – Lactame | Vorwärts | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | Gebreyes, Thakur20 | ||||
| Rückwärts | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – Lactame | Vorwärts | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | Li et al. 21 | ||||
| Rückwärts | CGGCTTTCTG GZTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-ib | Aminoglykoside | Vorwärts | TATGAGTGGC TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers et al. 22 | ||||
| Rückwärts | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | AAD Ein | Aminoglykoside | Vorwärts | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | Ciesielczuk 23 | ||||
| Rückwärts | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
Tabelle 5: Primer für die PCR von ARGs in kultivierbaren Bakterien. Die verschiedenen ARGs, die in der vorliegenden Studie verwendet werden, zusammen mit ihren jeweiligen Primer-Sequenzen werden gezeigt. Die erwartete Größe des Amplikons wird in Basenpaaren angegeben. Die Glühtemperatur jedes Primer-Sets wird ebenfalls angegeben.
| Antibiotikum | Konzentration des Antibiotikums (μg/ml) | KBE/ml |
| - | - | 3,0 x 109 Zoll |
| CTX | 3 | 4,5 x 107 |
| CIP | 0.5 | 3,2 x 108 Zoll |
| K | 15 | 9,6 x 105 |
| E | 20 | 1,6 x 108 |
| VA | 3 | 1,2 x 109 |
Tabelle 6: Gesamtzahl der Keime und der Anzahl der antibiotikaresistenten Bakterien. Für die initiale Isolierung der antibiotikaresistenten Bakterien aus der Wasserprobe wurden fünf Antibiotika eingesetzt. Die Gesamtkeimzahl (ohne Antibiotika) und die AR-Bakterienzahl werden in koloniebildenden Einheiten pro Milliliter (KBE/ml) angegeben. Abkürzungen: AR = antibiotikaresistent; KBE = koloniebildende Einheiten; CTX = Cefotaxim; CIP = Ciprofloxacin; K = Kanamycin; E = Erythromycin; VA = Vancomycin.
| Isolieren von Code | Mikroorganismen | Familie |
| 1 | Escherichia Coli | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 2 | Escherichia Coli | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 3 | Escherichia Coli | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 4 | Escherichia Coli | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 5 | Escherichia Coli | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 6 | Escherichia Coli | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 7 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 9 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 10 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae (Enterobacteriaceae) |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae (Süßwassergewächse) |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae (Süßwassergewächse) |
| 13 | Micrococcus spp. | Micrococcaceae (Mikrokokkengewächse) |
| 14 | Arthrobacter spp. | Micrococcaceae (Mikrokokkengewächse) |
| 15 | Aeromonas spp. | Aeromonadaceae (Aeromonadaceae) |
Tabelle 7: Identifizierung von antibiotikaresistenten Isolaten durch 16S-rRNA-Gensequenzierung. Für jedes Isolat wurde eine Kolonie-PCR unter Verwendung von 16S-rRNA-Gen-spezifischen Primern durchgeführt. Die erhaltenen Amplikone wurden dann sequenziert und mit geeigneten bioinformatischen Werkzeugen identifiziert.
| Isolate Nr. | Isolieren | CTX | AMPERE | LE | C | TGC | CTR | IPM | GEN | N | TR | CIP | VERDERBEN | MAR-Index | ||
| 1 | Escherichia Coli | 13R | 0R | 0R | 28 SEK. | 23Sek. | 11R | 39 SEK. | 20ER JAHRE | 18 SEK. | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Escherichia Coli | 31 SEK. | 0R | 12R | 29Sek. | 23Sek. | 32 SEK. | 37Sek. | 19ER JAHRE | 16 SEK. | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Escherichia Coli | 14R | 0R | 14R | 14R | 21Sek. | 10R | 34 SEK. | 17 SEK. | 11R | 24 SEK. | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Escherichia Coli | 28 SEK. | 13R | 18R | 26 SEK. | 21Sek. | 28 SEK. | 32 SEK. | 16R | 11R | 24 SEK. | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Escherichia Coli | 11R | 0R | 12R | 26 SEK. | 21Sek. | 10R | 31 SEK. | 17 SEK. | 16 SEK. | 22Sek. | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Escherichia Coli | 27Sek. | 0R | 12R | 12R | 22Sek. | 30ER JAHRE | 32 SEK. | 19ER JAHRE | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | Klebsiella pneumoniae | 28 SEK. | 0R | 17R | 27Sek. | 22Sek. | 30ER JAHRE | 32 SEK. | 18 SEK. | 22Sek. | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 29Sek. | 11R | 26 SEK. | 24 SEK. | 22Sek. | 30ER JAHRE | 28 SEK. | 17 SEK. | 16 SEK. | 24 SEK. | 23Sek. | 1 | 0.1 | ||
| 9 | Klebsiella pneumoniae | 29Sek. | 13R | 25 SEK. | 24 SEK. | 22Sek. | 28 SEK. | 29Sek. | 18 SEK. | 17 SEK. | 24 SEK. | 25 SEK. | 1 | 0.1 | ||
| 10 | Klebsiella pneumoniae | 33Sek. | 14Sek. | 26 SEK. | 28 SEK. | 22Sek. | 31 SEK. | 32 SEK. | 19ER JAHRE | 20ER JAHRE | 24 SEK. | 29Sek. | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23Sek. | - | - | 37Sek. | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27Sek. | - | - | 42 SEK. | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | Micrococcus spp. | 25 SEK. | 17R | 24 SEK. | 32 SEK. | 22Sek. | 34 SEK. | 28 SEK. | 20ER JAHRE | - | 21Sek. | 26 SEK. | 1 | 0.1 | ||
| 14 | Arthrobacter spp. | 45ER | 57Sek. | 28 SEK. | 26 SEK. | 34 SEK. | 27Sek. | 39 SEK. | 26 SEK. | - | 28 SEK. | 28 SEK. | 0 | 0 | ||
| 15 | Aeromonas spp. | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
Tabelle 8: Antibiotikaresistenz-Phänotyp der von AST analysierten Bakterienisolate. Die phänotypische Resistenz in den Isolaten wurde mit der Scheibendiffusionsmethode analysiert. Die Zahlen geben den ZOI in Millimetern (mm) an. Für den MAR-Index geben die Zahlen die Gesamtzahl der Antibiotika an, gegen die ein Isolat resistent ist. Abkürzungen: AST = Antibiotika-Empfindlichkeitstest; CTX = Cefotaxim; AMP = Ampicillin; LE = Levofloxacin; C = Chloramphenicol; TGC = Tigecyclin; CTR = Ceftriaxon; IPM = Imipenem; GEN = Gentamicin; N = Neomycin; TR = Trimethoprim; CIP = Ciprofloxacin; R = widerstandsfähig; S = sensibel; MAR = multiple Antibiotikaresistenz; ZOI = Zone der Hemmung.
| AMR-GENFAMILIE | GENE(S) |
| SMB Beta-Lactamase | SMB-1 |
| Beta-Lactamase vom ampC-Typ | ampC1 |
| VIM Beta-Lactamase | VIM-20 |
| CcrA Beta-Lactamase | ccrA |
| NmcA Beta-Lactamase | nmcR |
| ARL Beta-lactamase | ARL-1 |
| blaZ Beta-Lactamase | blaZ |
| blaTEM Beta-Lactamase | blaTEM* |
| blaCTX Beta-Lactamase | blaCTX |
| AAC(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| AMEISE (3'') | aadA |
| Chinolon-Resistenz-Protein (QNR) | qnrS6, qnrVC5 |
| Resistenz-Nodulation-Zellteilung (RND) Antibiotika-Efflux-Pumpe | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| ATP-bindende Kassette (ABC) Antibiotika-Efflux-Pumpe | oleC, macB, patA, bcrA |
| Major Facilitator Superfamily (MFS) antibiotische Efflux-Pumpe | abaQ |
| Trimethoprim-resistente Dihydrofolatreduktase DFR | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| Rifampin-Phosphotransferase | rphB |
| Proteine, die mit Undecaprenylpyrophosphat verwandt sind | bcrC |
| Methicillin-resistentes PBP2 | mecD |
| vanJ Membranprotein | vanJ |
| Tetracyclin-resistentes ribosomales Schutzprotein | tetT |
| Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) | Kat B10 |
| Erm 23S ribosomale RNA-Methyltransferase | ähm(37) |
| Glykopeptid-Resistenz-Gen-Cluster | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCR-Phosphoethanolamin-Transferase | MCR-9 |
| Sulfonamidbeständiges Sul | sul3 |
| *Unterstrichene Gene wurden auch in den kultivierbaren Mikroorganismen nachgewiesen | |
Tabelle 9: ARGs, die mittels metagenomischer DNA-Analyse identifiziert wurden. Das gesamte Metagenom der Wasserprobe wurde für die gesamte metagenomische Sequenzierung verwendet, und die erhaltenen Sequenzen wurden mit der entsprechenden ARG-Datenbank annotiert. Die repräsentativen Ergebnisse einiger der wichtigen ARGs, die in der metagenomischen DNA identifiziert wurden, werden gezeigt. Die unterstrichenen Gene wurden auch in den kultivierbaren Mikroorganismen nachgewiesen. Abkürzung: ARG = Antibiotika-resistentes Gen.
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Discussion
Die Probenentnahme und -verarbeitung spielt eine wichtige Rolle und kann die Ergebnisse und die Interpretation der Studie beeinflussen. Um eine Variabilität der Proben auszuschließen, ist es daher wichtig, die Probenahme an mehreren Stellen des untersuchten Süßwasserkörpers durchzuführen. Die Aufrechterhaltung geeigneter aseptischer Umgebungsbedingungen bei der Handhabung solcher Proben kann eine Kontamination verhindern. Um Veränderungen in der Bakterienzusammensetzung zu vermeiden, die die Qualität und Quantität der extrahierten Nukleinsäuren beeinflussen können, sollten die Transitbedingungen bei 4 °C gehalten werden, wobei eine minimale Zeitspanne von der Probenentnahme bis zur anschließenden Verarbeitung einzuhalten ist. Mehrere Studien haben gezeigt, dass diese Übergangszeit zwischen Probenentnahme und -verarbeitung in späteren Phasen der Analyse zu unterschiedlichen Ergebnissen führen kann, wenn sie nicht sorgfältig durchgeführt wird12,13.
Die Verwendung einer Reihe von Verdünnungen für die Beschichtung stellt sicher, dass die Kolonien weder verklumpen noch zu wenige Kolonien vorhanden sind, um sie zu zählen. Die Durchführung der Experimente in doppelter Ausführung ist notwendig, um Variationen der KBE/ml zu berücksichtigen, die aufgrund von Pipettier-/Handhabungsfehlern auftreten können. Darüber hinaus werden für jedes Experiment Kontrollplatten vorgehalten, um sicherzustellen, dass die verwendeten Antibiotika effektiv wirken und falsch-positive Ergebnisse eliminiert werden. Daher sollten die Kontrollplatten kein sichtbares Koloniewachstum aufweisen. Dies gibt Aufschluss über die Wirksamkeit der eingesetzten Antibiotika.
Während der AST können die Inokulumkulturdichte und die Dicke der Agarplatte den Durchmesser des ZOI und damit die Interpretation der Ergebnisse beeinflussen. Daher sollte bei der Durchführung der AST-Experimente darauf geachtet werden, dass diese beiden Faktoren einheitlich bleiben. Der kritischste Aspekt ist die Anzahl der Bakterienzellen, die im Inokulum vorhanden sind. Im Allgemeinen werden 1 × 10 8-2 × 108 KBE/ml Zellen als Inokulum verwendet, was dem 0,5 McFarland-Standard14 entspricht. Diese Konzentration des Inokulums muss konstant gehalten werden, um eine Abweichung der Ergebnisse zu vermeiden. Jede Konzentration, die höher oder niedriger als die erforderliche Konzentration ist, muss mit Hilfe einer sterilen Kochsalzlösung verdünnt und innerhalb von 15 Minuten sofort zur Impfung verwendet werden. Beim Verteilen des Inokulums auf den Agarplatten muss darauf geachtet werden, dass eine übermäßige Menge an Inokulum vermieden wird. Überschüssiges Inokulum kann entfernt werden, indem der Tupfer auf die Seiten des bakteriellen Suspensionsröhrchens gedrückt wird, bevor es auf die MHA-Platte geimpft wird. Jede Abweichung vom Standard-AST-Verfahren kann sich erheblich auf die Daten auswirken, die aus solchen Protokollen11,15 gewonnen werden. Eine frühere Studie zeigte, dass ein MAR-Indexwert von ≥0,2 auf eine hohe Resistenz in den Isolaten16 hinweist. Da die Interpretation der Ergebnisse der AST auf der ZOI basiert, sollte eine Unter- oder Überinokulation der Kultur vermieden werden.
Für die PCR sollte der Mastermix auf einem Eisblock hergestellt werden, um die Wahrscheinlichkeit eines Abbaus der Inhaltsstoffe und eines Aktivitätsverlustes des Enzyms zu minimieren. Das Tragen von Handschuhen während des Einstellens der Reaktion minimiert die Wahrscheinlichkeit einer externen Kontamination17. Die Spannung während der AGE sollte nicht zu hoch sein, da dies zu einem Erwärmungseffekt und einer Verschlechterung der geladenen Proben führen kann. Die Durchführung der AGE bei einer optimalen Spannung stellt sicher, dass die Bänder gut getrennt und scharf sind, ohne dass es zu Ziehenden oder Verwischen kommt.
In den letzten Jahrzehnten durchgeführte Studien haben gezeigt, dass die 16S-rRNA-Genamplikon-Sequenzierung zur Identifizierung verschiedener Mikroorganismen verwendet wird. Bei der 16S-rRNA-Gensequenzierung kann die Wahl der Methode zur Extraktion der Template-DNA zu Verzerrungen führen, die sich wiederum auf die nachgelagerte Analyse auswirken können. Grampositive Bakterien haben eine dicke Peptidoglykan-Zellwand, die es schwierig machen kann, die Nukleinsäure zu extrahieren. Daher sollte die Extraktionsmethode so gewählt werden, dass sie alle Arten mikrobieller DNA effektiv erfasst. Die traditionelle Siedemethode zur Extraktion von roher Template-DNA ist eine solche effiziente Methode, um den Inhalt der Zelle zu extrahieren und so Verzerrungen in den Ergebnissen zu reduzieren.
Um die gesamte Bakteriengemeinschaft des Gewässers zu verstehen, wurde in dieser Studie die Hochdurchsatz-Next-Generation-Sequencing-Technik (HT-NGS) verwendet. Die gesamte metagenomische DNA-Analyse ermöglicht die Untersuchung des gesamten Metagenoms einer bestimmten Probe. Kulturbasierte Techniken geben hauptsächlich eine aerobe Zählung der Bakterienbelastung an, die die mikrobiologische Qualität einer Probe angibt. Kultivierbare Mikroorganismen machen jedoch nur 1% der gesamten Mikroorganismen aus. Die verbleibende Mikroflora, die eine Vielzahl von Arten, einschließlich Anaerobier, umfasst, ist schlecht charakterisiert und wird oft ignoriert. Diese Mikroorganismen könnten AR-Merkmale tragen. Darüber hinaus sind kommensale Mikroorganismen ein Reservoir von AR-Genen, die über verschiedene genetische Austauschereignisse auf Krankheitserreger übertragen werden können18. Viele dieser Kommensalen sind nicht kultivierbar und können durch einen metagenomischen Ansatz mit HT-NGS untersucht werden, der eine größere Abdeckung für die Identifizierung verschiedener Mikroflora in jeder Probe bietet. Mittels metagenomischer Analyse wurde ein detailliertes Profil der bakteriellen Taxa erstellt, das die kultivierbaren Daten ergänzte. Darüber hinaus können solche komplementären Ansätze eine Vorstellung vom Gesamtzustand des untersuchten Gewässers vermitteln.
In der vorliegenden Studie konnten wir mit einer Kombination aus konventionellen kulturbasierten und nicht-kulturbasierten metagenomischen Techniken die gesamte bakterielle Vielfalt, verschiedene antibiotikaresistente Bakterien und den gesamten Pool an wasserbasierten ARGs identifizieren. Die in dieser Studie beschriebene Methodik kann repliziert und angepasst werden, um AR-Krankheitserreger in jeder anderen Wasserquelle zu identifizieren - Küstengewässer, natürliches Wasser und künstliches Trinkwasser. Es kann auch zur Verfolgung der Übertragung von wasserbürtigen nosokomialen Krankheitserregern und zur Überwachung von Krankenhausinfektionen in Krankenhäusern und Kliniken durch Wasserquellen wie Waschbecken, Toiletten, Badewannen und Luftbefeuchter verwendet werden. Dies wird bei der Überwachung antimikrobieller Resistenzen und der Identifizierung wasserbasierter Antibiotikaresistenzen helfen.
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Disclosures
Die Autoren haben keine widersprüchlichen Interessen offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch finanzielle Zuschüsse des Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme der University of Mumbai unterstützt. Devika Ghadigaonkar arbeitete als Projektstipendiatin im Rahmen des Programms. Die technische Hilfe von Harshali Shinde, Senior Research Fellow unter der Projektnummer CRG/2018/003624 des Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB), wird gewürdigt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
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