Summary
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o isolamento e identificação de bactérias resistentes a antibióticos da água e a caracterização molecular de seus genes de resistência a antibióticos (ARGs). O uso de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura (análise metagenômica) fornece informações completas sobre a diversidade bacteriana total e o pool total de diferentes ARGs presentes em águas doces de Mumbai, Índia.
Abstract
O desenvolvimento e disseminação da resistência aos antibióticos (RA) através da microbiota associada a corpos de água doce é uma grande preocupação de saúde global. No presente estudo, amostras de água doce foram coletadas e analisadas com relação à diversidade bacteriana total e aos genes AR (ARGs) usando técnicas convencionais baseadas em cultura e uma abordagem metagenômica independente de cultura de alto rendimento. Este trabalho apresenta um protocolo sistemático para a enumeração das bactérias cultiváveis totais e resistentes a antibióticos de amostras de água doce e a determinação da resistência fenotípica e genotípica em isolados cultiváveis. Além disso, relatamos o uso de análise metagenômica completa do DNA metagenômico total extraído da amostra de água doce para a identificação da diversidade bacteriana geral, incluindo bactérias não cultiváveis, e a identificação do pool total de diferentes ARGs (resistoma) no corpo d'água. Seguindo esses protocolos detalhados, observamos uma alta carga bacteriana resistente a antibióticos na faixa de 9,6 × 10 5-1,2 × 109 UFC/mL. A maioria dos isolados foi resistente aos múltiplos antibióticos testados, incluindo cefotaxima, ampicilina, levofloxacina, cloranfenicol, ceftriaxona, gentamicina, neomicina, trimetoprima e ciprofloxacina, com múltiplos índices de resistência a antibióticos (MAR) de ≥0,2, indicando altos níveis de resistência nos isolados. O sequenciamento do RNAr 16S identificou potenciais patógenos humanos, como Klebsiella pneumoniae, e bactérias oportunistas, como Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. e Aeromonas spp. A caracterização molecular dos isolados mostrou a presença de vários ARGs, como blaTEM, blaCTX-M (β-lactâmicos), aadA, aac (6')-Ib (aminoglicosídeos) e dfr1 (trimetoprims), o que também foi confirmado por toda a análise metagenômica de DNA. Uma alta prevalência de outros ARGs que codificam bombas de efluxo de antibióticos - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamases-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, o gene da cloranfenicol acetiltransferase catB10 e o gene de resistência à rifampicina rphB - também foi detectada no DNA metagenômico. Com a ajuda dos protocolos discutidos neste estudo, confirmamos a presença de bactérias MAR transmitidas pela água com diversas características fenotípicas e genotípicas da RA. Assim, a análise metagenômica completa do DNA pode ser usada como uma técnica complementar às técnicas convencionais baseadas em cultura para determinar o status geral de RA de um corpo d'água.
Introduction
A resistência antimicrobiana (RAM) tem sido identificada como um dos problemas globais mais prementes. A rápida evolução da RAM e a sua propagação mundial são uma das maiores ameaças à saúde humana e à economia global em termos dos custos de saúde que lhe estão associados1. O uso excessivo e indevido de antibióticos levaram a um aumento da RA. Isso foi destacado pela pandemia de COVID-19, durante a qual o tratamento de infecções secundárias associadas, em muitos casos, foi extremamente comprometido devido à RAM nos pacientes afetados2. Além do uso/uso indevido direto de antibióticos por seres humanos, o uso excessivo e indevido de antibióticos na agricultura e pecuária e sua descarga inadequada no meio ambiente, incluindo corpos d'água, são uma grande preocupação3. O surgimento de novas características de resistência e multirresistência em bactérias destaca urgentemente a necessidade de uma melhor compreensão dos fatores que levam ao desenvolvimento da RA e sua disseminação. Múltiplas bactérias resistentes a antibióticos, que muitas vezes carregam múltiplos genes AR (ARGs) em elementos genéticos móveis, como plasmídeos, podem transferir esses genes de resistência para microrganismos não resistentes, incluindo potenciais patógenos humanos, levando ao surgimento de superbactérias que são intratáveis mesmo com antibióticos de último recurso4. Essas múltiplas bactérias resistentes a antibióticos, se presentes nos ecossistemas aquáticos, podem entrar diretamente no intestino humano através do consumo de alimentos contaminados à base de água, como peixes, caranguejos e moluscos. Estudos anteriores mostraram que a disseminação de bactérias RA em sistemas de água que ocorrem naturalmente também pode atingir outros suprimentos de água, incluindo água potável, e, assim, pode entrar na cadeia alimentar humana 5,6,7.
O objetivo do presente estudo é fornecer um protocolo abrangente usando uma combinação de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura (análise metagenômica completa) para obter informações completas sobre a diversidade bacteriana total e o pool total de diferentes ARGs presentes em um corpo d'água em Mumbai, Índia. Convencionalmente, técnicas baseadas em cultura têm sido usadas para estudar a diversidade bacteriana em corpos d'água. Como os microrganismos cultiváveis constituem apenas uma pequena porcentagem da microbiota total em qualquer nicho, para ter uma melhor compreensão do status geral da diversidade bacteriana e das várias características resistentes prevalentes em qualquer amostra, várias técnicas baseadas em cultura e independentes da cultura devem ser usadas em conjunto. Uma dessas técnicas robustas e confiáveis independentes de cultura é a análise metagenômica completa do DNA. Esse método de alto rendimento tem sido utilizado com sucesso em diversos estudos sobre diversidade bacteriana ou anotações funcionais de vários ARGs 8,9. Esta técnica utiliza o metagenoma (o material genético total de uma amostra) como matéria-prima para várias análises e, por isso, é independente da cultura. Os protocolos do presente estudo podem ser utilizados para análise metagenômica completa de DNA para obtenção de informações sobre a diversidade bacteriana total e vários ARGs (resistoma) em amostras de água.
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Protocol
1. Recolha e processamento de amostras
- Coleta de amostras
- Recolher o volume adequado da amostra de água no(s) recipiente(s) de amostra estéril(s), assegurando que não mais de 3/4 do recipiente estão cheios.
- Transportar as amostras para o laboratório em condições assépticas o mais rapidamente possível após a colheita e processá-las imediatamente.
- Processamento de amostras
- Filtre assepticamente a amostra de água através de um pano de musselina estéril para remover qualquer material particulado.
- Efectuar diluições em série adequadas da água filtrada para uma análise mais aprofundada.
2. Estimativa da carga bacteriana total e da contagem de bactérias resistentes a antibióticos
- Determinação da carga bacteriana total
- Suspender 18,12 g de Agar R2A, pó modificado em 1.000 mL de água duplamente destilada e dissolver a mistura por aquecimento. Autoclave a mistura dissolvida a 121 °C, 15 psi por 20 min. Prepare o ágar R2A, Placas modificadas derramando a quantidade apropriada da mistura autoclavada em placas de Petri estéreis (por exemplo, adicione aproximadamente 20 mL de meio estéril autoclavado a uma placa de Petri estéril de 90 mm).
- Espalhar uniformemente 100 μL das diluições apropriadas da amostra de água filtrada no ágar R2A, placa modificada uma vez que o meio se solidifica. Execute o experimento em duplicata.
- Incubar todas as placas acima a 35-37 °C durante 48 h (variar a temperatura e o tempo de incubação dependendo do meio utilizado para o isolamento).
- Exprimir a carga bacteriana total em termos de unidades formadoras de colónias por mililitro (UFC/ml) utilizando a equação (1):
(1)
- Determinação da contagem bacteriana de RA
- Siga as etapas 2.1.1-2.1.4. No entanto, em vez de Agar R2A, placas modificadas, use ágar R2A, placas modificadas suplementadas individualmente com cinco antibióticos diferentes, a saber, cefotaxima (3 μg/mL), ciprofloxacina (0,5 μg/mL), eritromicina (20 μg/mL), canamicina (15 μg/mL) e vancomicina (3 μg/mL).
- Adicionar os antibióticos separadamente em tubos contendo 20 ml de ágar R2A fundido estéril, modificado (com a temperatura do ágar R2A fundido, modificado a ≤40 °C) para atingir a concentração final do antibiótico, tal como mencionado na etapa 2.2.1.
- Redemoinho para misturar uniformemente e despeje em placas de Petri estéreis antes que o ágar se solidifique. Execute o experimento em duplicata.
- Incubar todas as placas acima a 35-37 °C durante 48 h (se utilizar um meio diferente, a temperatura e o tempo de incubação podem variar).
- Para controle de qualidade e verificação da eficácia dos antibióticos, espalhe 100 μL de suspensões bacterianas das cepas Escherichia coli ATCC 25922 e Staphylococcus aureus ATCC 29213 em suas respectivas placas R2A contendo antibióticos, Placas modificadas (certifique-se de que a densidade da cultura fresca usada para a inoculação seja OD = 0,5 a 600 nm).
- Determinar a contagem bacteriana resistente aos antibióticos em termos de UFC/ml, conforme descrito no passo 2.1.4.
- Existências de glicerol dos isolados
- Selecione colônias de RA morfologicamente distintas.
- Suspender uma única colônia isolada em 2 mL de caldo estéril de Luria-Bertani contendo o respectivo antibiótico (por exemplo, se uma colônia foi selecionada de uma placa contendo cefotaxima, inocular a colônia a partir da etapa 2.3.1 em caldo estéril de Luria-Bertani contendo cefotaxima em sua respectiva concentração).
- Incubar os tubos inoculados a 37 °C a 80 rpm até que o OD600 atinja 0,5.
- Preparar as reservas de glicerol dos isolados misturando 750 μL da suspensão de cultura da fase 2.3.3 em 250 μL de glicerol estéril a 100% em condições assépticas.
- Conservar as existências de glicerol a -80 °C até uma análise mais aprofundada.
NOTA: Para o renascimento das culturas das unidades populacionais de glicerol, descongelar as reservas de glicerol a 4 °C. Inocular uma alça deste estoque em 2 mL de caldo estéril de Luria-Bertani contendo o respectivo antibiótico e deixe crescer.
(1)3. Identificação de bactérias cultiváveis por sequenciamento do gene 16S rRNA
- Preparação do molde de DNA dos isolados para PCR
NOTA: O protocolo descrito para a preparação do molde de DNA para PCR para o isolamento do DNA bruto das bactérias é dado por Carlson et al.10.- Usando um palito de dente estéril, pegue uma única colônia isolada e pura do isolado que cresce em uma placa de Petri. Suspender a colônia bacteriana em 100 μL de água estéril duplamente destilada em um tubo de microcentrífuga estéril e ferver por 10 min.
- Centrifugar a suspensão a 10.000 × g durante 2 minutos para peletizar os detritos e transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga estéril fresco para utilização como molde de ADN bruto.
- Amplificação por PCR direcionada da região V3 do gene 16S rRNA e sequenciamento
- Preparar 40 μL da mistura de reação em um tubo de PCR para amplificação por PCR, conforme mencionado na Tabela 1.
NOTA: A preparação do DNA deve ser realizada em um bloco de gelo, minimizando a chance de contaminação (use luvas ao manusear os reagentes e limpe a superfície de trabalho completamente com etanol a 70%). - Coloque o tubo no bloco térmico e execute o programa apropriado no termociclador de PCR. Veja a Tabela 2 para as condições padronizadas de ciclo de PCR e as informações do primer para a amplificação das regiões V3 dos genes 16S rRNA.
- Para resolver os amplificadores e visualização, realizar eletroforese em gel de agarose (AGE). Misture 10 μL do produto de PCR amplificado e 2 μL de tampão de carga de gel 6x (Tabela 3) e carregue essa mistura em poços em gel de agarose a 1,5% (dissolver 1,5 g de pó de agarose em 100 mL de tampão TAE 1x [Tabela 3]) contendo 5 μL de brometo de etídio de 10 mg/mL (EtBr) até uma concentração final de 0,5 μg/mL de EtBr em 100 mL do gel de agarose.
CUIDADO: EtBr é um potente carcinógeno. As luvas devem ser usadas em todos os momentos durante o manuseio de EtBr e géis contendo EtBr. - Adicione a escada de DNA para a estimativa do tamanho dos amplificadores.
- Realize a eletroforese do gel em um tampão de tanque TAE a 80-100 V.
- Uma vez que o corante de rastreamento executa 3/4 do gel, pare a eletroforese e visualize as bandas de amplificador sob um transiluminador UV.
- Use o produto de PCR (amplicon) para sequenciamento do gene 16S rRNA para identificar o isolado.
- Quantificar o amplicon submetendo-o à análise espectrofotométrica usando a equação (2).
(2) - Para verificar a pureza do ADN, calcule a relação A260/A280.
NOTA: Idealmente, esse número deve estar acima de 1,5 e, de preferência, entre 1,8 e 2,0. - Para identificar os isolados, compare as sequências obtidas com bancos de dados de sequência usando uma ferramenta de pesquisa de alinhamento apropriada.
- Preparar 40 μL da mistura de reação em um tubo de PCR para amplificação por PCR, conforme mencionado na Tabela 1.
(2)4. Detecção de resistência a antibióticos nos isolados utilizando testes de sensibilidade a antibióticos
NOTA: Este protocolo descreve o método para o teste de suscetibilidade a antibióticos (AST) por difusão em disco. Foram utilizados os seguintes discos antibióticos: cefotaxima (5 μg), ampicilina (10 μg), levofloxacina (5 μg), cloranfenicol (30 μg), tigeciclina (15 μg), ceftriaxona (30 μg), imipenem (10 μg), gentamicina (10 μg), neomicina (10 μg), trimetoprim (5 μg) e ciprofloxacina (5 μg).
- Preparação do inóculo para a AST
- Inocular assepticamente uma única colônia de RA purificada isolada usando uma alça estéril em 2 mL de um meio estéril não seletivo, como o caldo de Luria-Bertani (sem qualquer antibiótico), e incubar a 37 °C a 80 rpm durante a noite.
- Ressuspender tomando 100-150 μL da cultura cultivada durante a noite (aproximadamente, OD 600 = 1,8-2,0) em 2 mL de caldo fresco não seletivo de Luria-Bertani e incubar por 2-4 h (até que a OD600 atinja 0,4-0,5).
- Diluir esta suspensão de cultura recém-cultivada usando solução salina estéril a 0,85%, de modo que a densidade da cultura seja igual a 0,5 padrão de McFarland (aproximadamente, OD600 = 0,1), o que corresponde aproximadamente a 1-2 × 108 células/mL.
- Misture suavemente a suspensão bacteriana para uma distribuição celular uniforme.
- Utilize a suspensão acima referida no prazo de 15 minutos após a diluição.
- Inoculação das placas de ágar
- Preparar placas de ágar Mueller-Hinton (MHA) para a realização do AST misturando 38 g de MHA em 1.000 mL de água duplamente destilada e dissolver a mistura por aquecimento. Autoclave a mistura dissolvida a 121 °C, 15 psi durante 15 min.
- Certifique-se de que a profundidade do MHA nas placas seja de 4 mm (25 mL de meio por placa).
- Simultaneamente, retire os discos antibióticos do congelador e aqueça-os à temperatura ambiente.
NOTA: Os discos de antibióticos devem ser gradualmente descongelados descongelando inicialmente os discos a 4 °C e posteriormente à temperatura ambiente para reduzir qualquer perigo potencial de condensação nos discos, o que pode subsequentemente afectar a zona de inibição (ZOI). - Em condições assépticas, mergulhe um cotonete estéril no inóculo preparado na etapa 4.1 e remova o excesso de suspensão para evitar a inoculação excessiva das placas.
- Espalhe a cultura uniformemente nas placas, começando do topo da placa MHA e indo e voltando de ponta a ponta. Gire a placa em 60° enquanto balança.
- Aplicação dos discos antibióticos
- Com a ajuda de pinças esterilizadas por chama, transfira assepticamente os discos antibióticos para as placas MHA inoculadas e pressione os discos suavemente para garantir o contato completo do nível com o ágar.
NOTA: Este procedimento deve ser feito dentro de 15 min da inoculação da cultura nas placas. - Coloque o número apropriado de discos de antibióticos na placa de ágar, levando em conta o organismo, o antibiótico usado e o tamanho da placa para evitar a sobreposição das zonas de inibição.
NOTA: Quatro a cinco discos podem ser acomodados em uma placa circular de 90 mm.
- Com a ajuda de pinças esterilizadas por chama, transfira assepticamente os discos antibióticos para as placas MHA inoculadas e pressione os discos suavemente para garantir o contato completo do nível com o ágar.
- Incubação das placas
- No prazo de 15 minutos após a aplicação dos discos antibióticos, inverter as placas e incubar a 37 °C durante a noite.
- Interpretação dos resultados
- Medir o diâmetro do ZOI em milímetros (mm) e interpretar de acordo com os valores do ponto de interrupção indicados pelo EUCAST11. Veja os dois exemplos dados abaixo.
- O ponto de ruptura do diâmetro da zona (mm) para um disco antibiótico ciprofloxacina (5 μg) para Enterobacterales é S ≥ 25 e R < 22, o que significa que é considerado sensível (S) se o ZOI ≥ 25 mm, enquanto é resistente (R) se o ZOI < 22 mm. Se o diâmetro do ZOI cair entre 22 e 25, o isolado é considerado intermediário (I).
- O ponto de ruptura do diâmetro da zona (mm) para um disco antibiótico cloranfenicol (30 μg) para Staphylococcus spp. é S ≥ 18 e R < 18, o que significa que é considerado sensível se o ZOI ≥ 18 mm, enquanto é resistente se o ZOI < 18 mm.
- Determine o índice de resistência múltipla a antibióticos (MAR) encontrando a proporção do número de antibióticos aos quais o isolado é resistente ao número total de antibióticos aos quais o isolado está exposto.
NOTA: Para o controle de qualidade, E. coli ATCC 25922 e S. áureo ATCC 29213 são usados como cepas de referência seguindo o protocolo como na etapa 4.
- Medir o diâmetro do ZOI em milímetros (mm) e interpretar de acordo com os valores do ponto de interrupção indicados pelo EUCAST11. Veja os dois exemplos dados abaixo.
5. Detecção baseada em PCR de genes de resistência a antibióticos nos isolados
- Utilizar um protocolo de PCR padrão para a identificação de ARGs nos isolados. Preparar o molde de ADN utilizando o protocolo indicado no passo 3.1.
NOTA: As condições de ciclagem por PCR utilizadas neste estudo foram de 94 °C por 10 min, seguidas por 35 ciclos de 94 °C por 30 s, recozimento por 30 s na temperatura apropriada (conforme padronizado para cada conjunto de primer), extensão a 72 °C por 40 s e extensão final a 72 °C por 5 min. A mistura de reação está descrita na Tabela 4. A lista de ARGs, primers e temperaturas de recozimento é apresentada na Tabela 5. - Para resolver, visualizar e verificar a pureza dos amplificadores, siga as etapas 3.2.3-3.2.10.
6. Análise metagenômica completa do DNA para a identificação da diversidade bacteriana total e a detecção de ARGs no metagenoma
- Extração do DNA total (metagenoma) da amostra de água
- Extraia o DNA metagenômico das amostras de água filtrada.
NOTA: No presente estudo, o DNA metagenômico (DNA total) foi extraído das amostras de água filtrada usando o kit de isolamento de DNA referenciado seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). - Verifique a qualidade do DNA carregando 3 μL do DNA metagenômico extraído em um gel de agarose a 0,8% e execute o gel a 80-110 V por aproximadamente 30 min.
- Verifique a presença de uma única banda intacta.
- Verifique a concentração de DNA usando um fluorômetro.
- Extraia o DNA metagenômico das amostras de água filtrada.
- Determinação da diversidade bacteriana e detecção de ARGs usando sequenciamento de DNA metagenômico completo
- Preparação da biblioteca e amplificação por PCR:
- Prepare uma biblioteca de sequenciamento final emparelhada usando o kit de preparação da biblioteca de DNA referenciada (consulte a Tabela de Materiais).
- Prepare o DNA para a ligadura do adaptador, pegando 200 ng de DNA e cortando-o mecanicamente em fragmentos menores, seguido por uma etapa contínua de reparo final na qual um "A" é adicionado às extremidades de 3'.
- Dependendo da plataforma usada para sequenciamento, ligue adaptadores específicos para ambas as extremidades dos fragmentos de DNA.
Observação : sequências cruciais para vincular bibliotecas de código de barras duplas a uma célula de fluxo para sequenciamento estão presentes nesses adaptadores. Isso permite a amplificação por PCR dos fragmentos ligados ao adaptador e a ligação dos primers de sequenciamento padrão. - Para verificar a qualidade e a quantidade, analise a biblioteca amplificada usando um chip de DNA de alta sensibilidade, de acordo com as instruções do fabricante.
- Geração e sequenciamento de clusters:
- Carregue a biblioteca amplificada na plataforma de sequenciamento apropriada para geração de cluster e sequenciamento subsequente.
NOTA: As moléculas da biblioteca ligam-se aos oligos do adaptador complementar na célula de fluxo final emparelhada. Durante o sequenciamento, os fios dianteiros são seletivamente clivados após a ressíntese do fio reverso. Essa fita reversa copiada é então sequenciada a partir da extremidade oposta do fragmento.
- Carregue a biblioteca amplificada na plataforma de sequenciamento apropriada para geração de cluster e sequenciamento subsequente.
- Análise bioinformática:
- Gere andaimes a partir de dados de alta qualidade usando a plataforma apropriada.
- Submeter estes andaimes à análise bioinformática para a classificação taxonómica e identificação dos ARGs.
NOTA: O fluxo de trabalho para toda a análise metagenômica de DNA para a identificação da diversidade bacteriana total e a detecção de ARGs no metagenoma é dado na Figura 1. Um fluxograma da metodologia completa descrita no manuscrito é apresentado na Figura 2.
- Preparação da biblioteca e amplificação por PCR:
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Representative Results
Carga bacteriana total e contagem de bactérias resistentes a antibióticos (AR)
A enumeração da carga bacteriana total foi realizada espalhando diluições de 10−4 a 10−6 vezes das amostras de água em Agar R2A, meio modificado. Para a enumeração da contagem de bactérias AR, diluições de 10−3 a 10−6 vezes foram espalhadas em placas de meio contendo antibióticos (Figura 3). As contagens de bactérias totais e de RA foram calculadas como UFC/mL, e todos os experimentos de plaqueamento foram realizados em duplicata. Seguindo os protocolos acima, o presente estudo mostrou que a contagem total de bactérias foi de 3,0 × 109 UFC/mL. A carga bacteriana de RA mostrou-se elevada, na faixa de 9,6 × 10 5-1,2 × 109 UFC/mL (Tabela 6).
Identificação de bactérias cultiváveis por sequenciamento do gene 16S rRNAgene
O DNA bruto de cada isolado foi usado como molde para a realização da PCR específica do gene 16S rRNA. No total de 15 isolados de RA sequenciados, 10 pertenciam à família Enterobacteriaceae, sendo a maioria Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae. Bactérias oportunistas raras, como Comamonas spp., pertencentes à família Comamonadaceae, Micrococcus spp. e Arthrobacter spp. pertencentes à família Micrococcaceae e Aeromonas spp., pertencentes à família Aeromonadaceae, também foram identificadas a partir da amostra de água (Tabela 7).
Detecção de resistência a antibióticos em bactérias cultiváveis usando testes de suscetibilidade a antibióticos
O perfil de resistência aos antibióticos dos isolados acima identificados foi gerado pela realização de TSA pelo método de difusão em disco (Figura 4). Dos 15 isolados testados, 8 apresentaram índice MAR de ≥0,2, indicando alto grau de resistência. Além disso, muitos dos isolados apresentaram perfis de co-resistência (resistência ao mesmo conjunto de antibióticos). Entretanto, isolados como Comamonas spp. e Arthrobacter spp. não apresentaram resistência a nenhum dos antibióticos testados (Tabela 8).
Detecção e identificação de genes de resistência a antibióticos em bactérias cultiváveis
Um total de 10 isolados de RA foram rastreados quanto à presença de ARGs por PCR. O ARG mais prevalente nos isolados cultiváveis foi o blaTEM codificando para β-lactamase, seguido pelo gene de resistência a aminoglicosídeos aadA. Outros ARGs amplificados foram blaCTX-M, dfr1 e aac(6')-Ib conferindo resistência a β-lactâmicos, trimetoprima e aminoglicosídeos, respectivamente. Os resultados representativos da amplificação dos ARGs são mostrados na Figura 5. Para a maioria dos isolados identificados, a resistência fenotípica (AST) foi confirmada em nível molecular por meio do perfil de RA genotípica baseado em PCR.
Identificação da diversidade bacteriana total no DNA metagenômico
Para verificar a presença de todas as bactérias possíveis (cultiváveis e não cultiváveis) e identificar suas abundâncias relativas, foi realizada uma análise metagenômica de DNA para a diversidade bacteriana total. Usando a abordagem de sequenciamento de próxima geração de alto rendimento (HT-NGS), ~96,94% das leituras totais da sequência foram obtidas, resultando em alta cobertura. A anotação taxonômica foi realizada para classificar as leituras em diferentes grupos taxonômicos, do filo ao nível do gênero (Figura 6 e Figura 7). Um total de 50 filos pôde ser identificado no metagenoma, indicando a alta diversidade bacteriana na amostra de água. Proteobacteria foi o filo mais dominante, consistindo das classes Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria e Gammaproteobacteria. No nível da ordem, Burkholderiales foi a ordem mais prevalente, pertencente à classe Betaproteobacteria. Pseudomonas, Acinetobacter, Pedobacter, Prosthecobacter, Limnohabitans, Flavobacterium e Comamonas foram alguns dos gêneros abundantes encontrados na amostra de água.
Detecção de ARGs a partir do DNA metagenômico
Para entender o conjunto total de ARGs no metagenoma da amostra de água, foi realizado o sequenciamento metagenômico completo, seguido da identificação de ARGs usando ferramentas de bioinformática apropriadas. A abordagem metagenômica garante que os ARGs presentes em microrganismos cultiváveis e não cultiváveis na amostra sejam detectados. Uma variedade de genes que conferem resistência a β-lactâmicos (SMB-1, ampC1, VIM-20, ccrA, nmcR, ARL-1, blaZ); aminogilcosides [aac(6')-34); quinolonas (qnrS6, qnrVC5); bombas de efluxo de antibióticos-resistência-nodulação-divisão celular (RND) (evgA, mtrA, mdtA, acrD), de ligação a ATP (ABC) (oleC, macB, patA, bcrA) e superfamília facilitadora principal (MFS) (abaQ); diidrofolato redutase resistente a trimetoprima (dfrD, dfrA20); rifampicina fosfotransferase (rphB); e cloranfenicol acetiltransferase (CAT) (catB10) foram detectados no metagenoma. Os ARGs detectados via PCR nos isolados cultiváveis (blaTEM, blaCTX-M, aadA, aac(6')-Ib, dfr1) também foram detectados por sequenciamento metagenômico completo, confirmando sua presença na amostra de água. Os resultados representativos dos ARGs identificados no metagenoma utilizando a análise de DNA metagenômico completo são apresentados na Tabela 9.
Figura 1: Fluxo de trabalho para análise de DNA metagenômico completo. O fluxo de trabalho stepwise para a identificação da diversidade bacteriana total e a detecção dos ARGs do metagenoma é apresentado. As etapas gerais envolvem a preparação, amplificação e identificação do DNA metagenômico. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxograma da metodologia completa. O fluxo de trabalho stepwise da metodologia utilizada no presente estudo. Uma combinação de técnicas baseadas em cultura e não baseadas em cultura é usada para obter informações completas sobre a diversidade bacteriana e a identidade dos ARGs presentes na amostra de água. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas de colônias isoladas em ágar R2A contendo antibióticos, placas modificadas. Amostras de água banhadas em cefotaxima (3 μg/mL) contendo Agar R2A, Placas modificadas. A amostra foi diluída em série e banhada em duplicata-A1, A2: 10−4; B1, B2: 10−5; C1, C2: 10−6. Após o período de incubação adequado, as colônias isoladas foram visíveis nas placas B1, B2, C1 e C2. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Teste de suscetibilidade a antibióticos pelo método de difusão em disco. Imagens representativas de AST pelo método de difusão em disco para um isolado de Escherichia coli . A AST foi realizada em duplicata-A1, A2: CTX, IPM, C, CIP; B1, B2: LE, TGC, AMP, GEN; C1, C2: TR, N, K, CTR. Os diâmetros das ZOIs foram medidos em milímetros (mm). Para interpretar se o isolado é resistente ou suscetível ao antibiótico utilizado, o ZOI foi comparado com os últimos quadros EUCAST. Abreviaturas: AST = teste de suscetibilidade a antibióticos; CTX = cefotaxima; MIP = imipenem; C = cloranfenicol; PIC = ciprofloxacina; LE = levofloxacina; TGC = tigeciclina; AMP = ampicilina; GEN = gentamicina; TR = trimetoprim; N = neomicina; K = canamicina; CTR = ceftriaxona; ZOI = zona de inibição; EUCAST = Comité Europeu de Testes de Suscetibilidade a Antibióticos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Amplificação por PCR de genes de resistência a antibióticos de bactérias cultiváveis. A eletroforese em gel de agarose pós-PCR foi realizada para a visualização de bandas amplificadas para verificar a presença de ARGs nos isolados. Bandas separadas de amplificadores de PCR podem ser vistas no gel. O tamanho dos amplificadores de PCR individuais é comparado com um marcador de DNA apropriado. Faixa L1: escada de DNA de 100 pb; Faixas 1-5: 1: dfr1 (425 pb); Faixa 2: blaTEM (310 pb); Pista 3: blaCTX-M (500 pb); Faixa 4: aac(6')-Ib ( 395 pb); Faixa 5: aadA (624 pb). Abreviação: ARGs = genes de resistência a antibióticos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Classificação taxonômica para os níveis de filo e classe. (A) Gráfico de barras mostrando a distribuição da abundância taxonômica em nível filológico do metagenoma bacteriano na amostra de água. Um total de 50 filos bacterianos foram identificados pela análise metagenômica. Os primeiros 12 filos dominantes de bactérias são mostrados. (B) Gráfico de barras mostrando a distribuição da abundância taxonômica em nível de classe do metagenoma bacteriano na amostra de água. Um total de 50 classes bacterianas foram identificadas pela análise metagenômica. As primeiras 15 classes dominantes de bactérias são mostradas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Classificação taxonômica para os níveis de ordem e gênero . (A) Gráfico de barras mostrando a distribuição da abundância taxonômica em nível de ordem do metagenoma bacteriano na amostra de água. Um total de 50 ordens bacterianas foram identificadas pela análise metagenômica. As primeiras 14 ordens dominantes de bactérias são mostradas na figura. (B) Gráfico de barras mostrando a distribuição da abundância taxonômica em nível de gênero do metagenoma bacteriano na amostra de água. Um total de 50 gêneros bacterianos foram identificados pela análise metagenômica. Os primeiros 15 gêneros dominantes de bactérias são mostrados na figura. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagentes de PCR | Volume (μL) |
| 2x Taq Master Mix | | 20 |
| Primer para a frente (10 pico mole) | 1.5 |
| Primer reverso (10 pico mole) | 1.5 |
| Modelo de DNA bruto | 1.5 |
| Água estéril de biologia molecular | 15.5 |
| Volume total | 40 |
Tabela 1: Constituintes do mastermix de PCR. A composição da mistura de reação de vários reagentes de PCR.
| Direção | Sequência de Primer 5' – 3' | Condições de PCR | N.º de ciclos |
| Encaminhar | GGAGGCAGCAGTAAGGAAT | 94 °C durante 10 min | 1 |
| Desnaturação a 94 °C durante 30 s | 35 | ||
| Recozimento a 50 °C durante 30 s | |||
| Extensão a 72 °C por 40 s | |||
| Inverter | CTACCGGGGTATCTAATCC | Extensão final a 72 °C durante 5 min | 1 |
Tabela 2: Condições do ciclo de PCR para amplificação do gene 16S rRNA. As condições do ciclo de PCR necessárias para a amplificação do gene 16S rRNA são mostradas. As etapas incluem uma etapa inicial de desnaturação, seguida por 35 ciclos de desnaturação, recozimento e extensão, e uma etapa final de extensão.
| 6x gel de carregamento | |
| Conteúdo | Quantidade |
| Azul de bromofenol | 25 mg |
| 85% Glicerol | 7,06 mL |
| Água Milli-Q | 2,94 mL |
| Volume total | 10 mL |
| 50x composição do reservatório de tris-acetato-EDTA (TAE) | |
| Conteúdo | Quantidade |
| Base Tris | 242 g em 700 mL de água duplamente destilada |
| Ácido Acético Glacial (GAA) | 57,1 mL |
| 0,5 M (EDTA) pH 8,0 | 100 mL |
| Ajustar o pH para 8,5 e completar o volume para 1000 ml com água destilada dupla | |
| Para 1x TAE: 20 mL de 50x tampão TAE + 980 mL de água duplamente destilada | |
Tabela 3: Composição do tampão de carga de gel 6x e do tampão de estoque Tris-acetato-EDTA de 50x. O tampão de carregamento de gel 6x é misturado com a amostra a ser executada em eletroforese em gel de agarose. Contém azul de bromofenol como corante de rastreamento. O glicerol aumenta a densidade da amostra que está sendo carregada para o carregamento adequado nos poços. A composição dos vários reagentes necessários para a preparação do amortecedor de existências 50xTAE é também apresentada. O tampão TAE é um dos tampões mais comuns usados para AGE, e mantém o pH em 8,5 e permite a migração de DNA amplificado durante o AGE. Abreviaturas: TAE = Tris-acetato-EDTA; AGE = eletroforese em gel de agarose.
| Reagentes de PCR | Volume (μL) |
| 2x Taq Master Mix | | 5 |
| Primer para a frente (10 pico mole) | 0.5 |
| Primer reverso (10 pico mole) | 0.5 |
| Modelo de DNA bruto | 1.5 |
| Água estéril de grau de biologia molecular | 2.5 |
| Volume total | 10 |
Tabela 4: Composição do mastermix de PCR para a identificação de ARGs. A composição da mistura de reação de vários reagentes de PCR necessários para a realização do experimento de PCR.
| Ir. Não. | Gene alvo | Resistência a | Cartilha | Sequência de primer (5'-3') | Tamanho do Amplicon (pb) | Temperatura de recozimento (°C) | Referências | ||||
| 1 | dfr Um | Trimetoprim | Encaminhar | TGGTAGCTATATC GAAGAATGGAGT |
425 | 59 | Racewicz et al., 19 | ||||
| Inverter | TATGTTAGAGGCG AAGTCTTGGGTA |
||||||||||
| 2 | blaTEM | β – lactâmicos | Encaminhar | GCACGAGTGGG TTACATCGA |
310 | 60 | Gebreyes, Thakur20 | ||||
| Inverter | GGTCCTCCGAT CGTTGTCAG |
||||||||||
| 3 | blaCTX-M | β – lactâmicos | Encaminhar | CGATGGGACG ATGTCACTG |
500 | 52 | Li e col. 21 | ||||
| Inverter | CGGCTTTCTG CCTTAGGTT |
||||||||||
| 4 | aac(6')-Ib | Aminoglicosídeos | Encaminhar | TATGAGTGGC TAAATCGAT |
395 | 50 | Akers e col. 22 | ||||
| Inverter | CCCGCTTTCT CGTAGCA |
||||||||||
| 5 | aad Um | Aminoglicosídeos | Encaminhar | ACCGTAAGGC TTGATGAAACA |
624 | 58 | Ciesielczuk 23 | ||||
| Inverter | GCCGACTACC TTGGTGATCTC |
||||||||||
Tabela 5: Primers para a PCR de ARGs em bactérias cultiváveis. As diferentes ARGs utilizadas no presente estudo, juntamente com suas respectivas sequências de primer, são mostradas. O tamanho esperado do amplificão é dado em pares de bases. A temperatura de recozimento de cada conjunto de primer também é mencionada.
| Antibiótico | Concentração de antibiótico (μg/mL) | UFC/mL |
| - | - | 3,0 x 109 |
| CTX | 3 | 4,5 x 107 |
| CIP | 0.5 | 3,2 x 108 |
| K | 15 | 9,6 x 105 |
| E | 20 | 1,6 x 108 |
| VA | 3 | 1,2 x 109 |
Tabela 6: Contagem total e de bactérias resistentes a antibióticos. Cinco antibióticos foram utilizados para o isolamento inicial das bactérias resistentes a antibióticos da amostra de água. As contagens totais de bactérias (sem antibióticos) e as contagens de bactérias AR são apresentadas em termos de unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL). Abreviaturas: AR = resistente a antibióticos; UFC = unidades formadoras de colônias; CTX = cefotaxima; PIC = ciprofloxacina; K = canamicina; E = eritromicina; AV = vancomicina.
| Isolar código | Microorganismos | Família |
| 1 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 2 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 3 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 4 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 5 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 6 | Escherichia coli | Enterobacteriaceae |
| 7 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 9 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 10 | Klebsiella pneumoniae | Enterobacteriaceae |
| 11 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 12 | Comamonas spp. | Comamonadaceae |
| 13 | Micrococcus spp. | Micrococcaceae |
| 14 | Arthrobacter spp. | Micrococcaceae |
| 15 | Aeromonas spp. | Aeromonadaceae |
Tabela 7: Identificação de isolados resistentes a antibióticos pelo sequenciamento do gene 16S rRNA. A PCR colônia foi realizada para cada isolado usando primers específicos do gene 16S rRNA. Os amplificadores obtidos foram então sequenciados e identificados utilizando ferramentas de bioinformática apropriadas.
| Isolar Não. | Isolar | CTX | AMP | LE | C | TGC | CTR | IPM | GEN | N | TR | CIP | MARÇO | Índice MAR | ||
| 1 | Escherichia coli | 13R | 0R | 0R | 28S | 23S | 11R | 39S | Anos 20 | 18S | 0R | 0R | 6 | 0.5 | ||
| 2 | Escherichia coli | 31S | 0R | 12R | 29S | 23S | 32S | 37S | 19S | 16S | 0R | 14R | 4 | 0.4 | ||
| 3 | Escherichia coli | 14R | 0R | 14R | 14R | 21S | 10R | 34S | 17S | 11R | 24S | 16R | 7 | 0.6 | ||
| 4 | Escherichia coli | 28S | 13R | 18R | 26S | 21S | 28S | 32S | 16R | 11R | 24S | 19R | 5 | 0.4 | ||
| 5 | Escherichia coli | 11R | 0R | 12R | 26S | 21S | 10R | 31S | 17S | 16S | 22S | 11R | 5 | 0.4 | ||
| 6 | Escherichia coli | 27S | 0R | 12R | 12R | 22S | Anos 30 | 32S | 19S | 11R | 0R | 14R | 6 | 0.5 | ||
| 7 | Klebsiella pneumoniae | 28S | 0R | 17R | 27S | 22S | Anos 30 | 32S | 18S | 22S | 0R | 16R | 4 | 0.4 | ||
| 8 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 11R | 26S | 24S | 22S | Anos 30 | 28S | 17S | 16S | 24S | 23S | 1 | 0.1 | ||
| 9 | Klebsiella pneumoniae | 29S | 13R | 25S | 24S | 22S | 28S | 29S | 18S | 17S | 24S | 25S | 1 | 0.1 | ||
| 10 | Klebsiella pneumoniae | 33S | 14S | 26S | 28S | 22S | 31S | 32S | 19S | Anos 20 | 24S | 29S | 0 | 0 | ||
| 11 | Comamonas spp. | - | - | - | 23S | - | - | 37S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 12 | Comamonas spp. | - | - | - | 27S | - | - | 42S | - | - | - | - | 0 | 0 | ||
| 13 | Micrococcus spp. | 25S | 17R | 24S | 32S | 22S | 34S | 28S | Anos 20 | - | 21S | 26S | 1 | 0.1 | ||
| 14 | Arthrobacter spp. | 45S | 57S | 28S | 26S | 34S | 27S | 39S | 26S | - | 28S | 28S | 0 | 0 | ||
| 15 | Aeromonas spp. | - | - | 20R | - | - | - | - | - | - | - | 20R | 2 | 1 | ||
Tabela 8: Fenótipo de resistência a antibióticos dos isolados bacterianos analisados pela AST. A resistência fenotípica nos isolados foi analisada pelo método de difusão em disco. Os números indicam o ZOI em milímetros (mm). Para o índice MAR, os números indicam o número total de antibióticos aos quais um isolado é resistente. Abreviaturas: AST = teste de suscetibilidade a antibióticos; CTX = cefotaxima; AMP = ampicilina; LE = levofloxacina; C = cloranfenicol; TGC = tigeciclina; CTR = ceftriaxona; MIP = imipenem; GEN = gentamicina; N = neomicina; TR = trimetoprim; PIC = ciprofloxacina; R = resistente; S = sensível; MAR = resistência múltipla a antibióticos; ZOI = zona de inibição.
| FAMÍLIA DE GENES AMR | GENE(S) |
| SMB beta-lactamase | SMB-1 |
| beta-lactamase do tipo ampC | ampC1 |
| VIM beta-lactamase | VIM-20 |
| CcrA beta-lactamase | ccrA |
| NmcA beta-lactamase | nmcR |
| ARL Beta-lactamase | ARL-1 |
| blaZ beta-lactamase | blaZ |
| blaTEM beta-lactamase | blaTEM* |
| blaCTX beta-lactamase | blaCTX |
| AAC(6') | aac(6')-Ib, aac(6')-34 |
| FORMIGA(3'') | aadA |
| proteína de resistência à quinolona (qnr) | qnrS6, qnrVC5 |
| bomba de efluxo antibiótico resistência-nodulação-divisão celular (RND) | evgA, mtrA, mdtA, acrD |
| Bomba de efluxo antibiótico de ligação a ATP (ABC) | oleC, macB, patA, bcrA |
| bomba de efluxo antibiótico da superfamília facilitadora principal (MFS) | abaQ |
| diidrofolato redutase resistente a trimetoprim dfr | dfr1, dfrD, dfrA20 |
| rifampicina fosfotransferase | rphB |
| proteínas relacionadas com o pirofosfato de undecaprenil | bcrC |
| PBP2 resistente à meticilina | mecD |
| proteína de membrana vanJ | vanJ |
| proteína de proteção ribossomal resistente à tetraciclina | tetT |
| cloranfenicol acetiltransferase (CAT) | catB10 |
| Erm 23S RNA ribossomal metiltransferase | erm(37) |
| cluster de genes de resistência a glicopeptídeos | vanRB, vanRE, vanRD |
| MCR fosfoetanolamina transferase | mcr-9 |
| sul-resistente à sulfonamida | sul3 |
| *genes sublinhados também foram detectados nos microrganismos cultiváveis | |
Tabela 9: ARGs identificados usando análise de DNA metagenômica completa. O metagenoma total da amostra de água foi utilizado para o sequenciamento metagenômico completo, e as sequências obtidas foram anotadas usando o banco de dados ARG apropriado. Os resultados representativos de alguns dos ARGs importantes identificados no DNA metagenômico são mostrados. Os genes sublinhados também foram detectados nos microrganismos cultiváveis. Abreviação: ARG = gene resistente a antibióticos.
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Discussion
A coleta e o processamento da amostra desempenham um papel significativo e podem afetar os resultados e a interpretação do estudo. Assim, para descartar a variabilidade nas amostras, é importante realizar a amostragem em vários locais do corpo de água doce em estudo. Manter condições ambientais assépticas adequadas ao manusear essas amostras pode evitar a contaminação. Além disso, para evitar alterações na composição bacteriana que possam influenciar a qualidade e a quantidade de ácidos nucleicos extraídos, as condições de trânsito devem ser mantidas a 4 °C, com um lapso de tempo mínimo desde o ponto de recolha da amostra até ao processamento subsequente. Diversos estudos têm destacado que esse período intermediário entre a coleta e o processamento da amostra pode dar resultados variáveis durante as etapas posteriores da análise se não for feito com cuidado12,13.
O uso de uma variedade de diluições para chapeamento garante que as colônias não se aglomerem nem haja poucas colônias para contar. A realização dos experimentos em duplicata é necessária para levar em conta as variações na UFC/mL que podem surgir devido a erros de pipetagem/manuseio. Além disso, placas de controle são mantidas para cada experimento para garantir que os antibióticos utilizados estejam funcionando de forma eficaz e que os resultados falso-positivos sejam eliminados. Assim, as placas de controle não devem ter crescimento de colônia visível. Isso indica a eficácia dos antibióticos utilizados.
Durante a AST, a densidade de cultura de inóculo e a espessura da placa de ágar podem influenciar o diâmetro do ZOI e, consequentemente, a interpretação dos resultados. Portanto, deve-se tomar cuidado para manter esses dois fatores uniformes ao realizar os experimentos de AST. O aspecto mais crítico é o número de células bacterianas presentes no inóculo. Geralmente, 1 × 10 8-2 × 108 UFC/mL de células são usadas como inóculo, o que é igual ao padrão de 0,5 McFarland14. Esta concentração do inóculo deve ser mantida constante para evitar qualquer variação nos resultados. Qualquer concentração superior ou inferior à concentração requerida deve ser diluída com a ajuda de solução salina estéril e utilizada imediatamente para inoculação no prazo de 15 minutos. Ao espalhar o inóculo nas placas de ágar, deve-se tomar cuidado para evitar uma quantidade excessiva de inóculo. O excesso de inóculo pode ser removido pressionando o cotonete nas laterais do tubo de suspensão bacteriana antes de inoculá-lo na placa MHA. Qualquer desvio do procedimento padrão de AST pode impactar significativamente os dados obtidos a partir de tais protocolos11,15. Estudo prévio mostrou que um valor do índice MAR de ≥0,2 indica alta resistência nos isolados16. Uma vez que a interpretação dos resultados do AST é baseada no ZOI, a sub-inoculação ou sobre-inoculação da cultura deve ser evitada.
Para a PCR, o mastermix deve ser preparado em um bloco de gelo para minimizar a chance de degradação dos ingredientes e perda de atividade da enzima. O uso de luvas durante a configuração da reação minimiza a chance de contaminação externa17. A tensão durante o AGE não deve ser muito alta, pois isso pode levar a um efeito de aquecimento e degradação das amostras carregadas. Executar o AGE em uma tensão ideal garante que as bandas estejam bem separadas e sejam nítidas sem efeitos de arrasto ou borramento.
Estudos realizados nas últimas décadas têm demonstrado o uso do sequenciamento do amplificador do gene 16S rRNA para a identificação de diferentes microrganismos. Para o sequenciamento do gene 16S rRNA, a escolha do método para a extração do DNA molde pode causar vieses, que, por sua vez, podem afetar a análise a jusante. As bactérias Gram-positivas têm uma parede celular peptidoglicana espessa que pode dificultar a extração do ácido nucleico. Portanto, a escolha do método de extração deve ser tal que ele efetivamente capture todos os tipos de DNA microbiano. O método tradicional de ebulição para extrair DNA molde bruto é um desses métodos eficientes para extrair o conteúdo da célula, reduzindo assim os vieses nos resultados.
Para entender a comunidade bacteriana completa do corpo d'água, a técnica de sequenciamento de próxima geração de alto rendimento (HT-NGS) foi usada neste estudo. A análise de DNA metagenômico completo permite o estudo de todo o metagenoma de uma determinada amostra. Técnicas baseadas em cultura fornecem principalmente uma contagem aeróbia da carga bacteriana, indicando a qualidade microbiológica de uma amostra. No entanto, os microrganismos cultiváveis constituem apenas 1% do total de microrganismos. A microflora restante, que compreende uma gama diversificada de espécies, incluindo anaeróbios, são mal caracterizadas e muitas vezes ignoradas. Esses microrganismos podem transportar características de RA. Além disso, os microrganismos comensais são um reservatório de genes da RA que podem ser transmitidos a patógenos por meio de vários eventos de troca genética18. Muitos desses comensais são não cultiváveis e podem ser estudados por uma abordagem metagenômica envolvendo HT-NGS, proporcionando maior cobertura para a identificação de microflora diversificada em qualquer amostra. Utilizando a análise metagenômica, obteve-se um perfil detalhado dos táxons bacterianos, que complementou os dados cultiváveis. Além disso, tais abordagens complementares podem fornecer uma ideia do estado geral da RA da massa de água em estudo.
No presente estudo, usando uma combinação de técnicas metagenômicas convencionais baseadas em cultura e não baseadas em cultura, fomos capazes de identificar a diversidade bacteriana total, diferentes bactérias resistentes a antibióticos e o pool total de ARGs transmitidos pela água. A metodologia descrita neste estudo pode ser replicada e personalizada para a identificação de patógenos de RA em qualquer outra fonte de água - água costeira, água natural e água potável artificial. Ele também pode ser usado para rastrear a transmissão de patógenos nosocomiais transmitidos pela água e para monitorar infecções associadas a hospitais em ambientes hospitalares e clínicos através de fontes de água, como pias, banheiros, banheiras e umidificadores. Tal ajudará na vigilância da RAM e na identificação de centros de registo de RAM à base de água.
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Disclosures
Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado por doações financeiras do Departamento de Ciência e Tecnologia-Promoção da Pesquisa Universitária e Excelência Científica (DST-PURSE) Esquema da Universidade de Mumbai. Devika Ghadigaonkar trabalhou como bolsista do projeto sob o esquema. É reconhecida a ajuda técnica prestada por Harshali Shinde, investigador sénior do Departamento de Ciência e Tecnologia-Conselho de Investigação em Ciência e Engenharia (DST-SERB): CRG/2018/003624.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 bp DNA ladder | Himedia | MBT049-50LN | For estimation of size of the amplicons |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | For making PCR reaction mixture |
| 37 °C Incubator | GS-192, Gayatri Scientific | NA | For incubation of bacteria |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis |
| Agarose powder | Himedia | MB229-50G | For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Ampicillin antibiotic disc | HiMedia | SD002 | For performing AST |
| Autoclave | Equitron | NA | Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc |
| Bioanalyzer 2100 | Agilent Technologies | NA | To check the quality and quantity of the amplified library |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Class II Type B2 | Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc. |
| Cefotaxime antibiotic disc | HiMedia | SD295E-5VL | For performing AST |
| Cefotaxime antibiotic powder | HiMedia | TC352-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Ceftriaxone antibiotic disc | HiMedia | SD065 | For performing AST |
| Centrifuge Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Used to pellet the debris during crude DNA preparation |
| Chloramphenicol antibiotic disc | HiMedia | SD006-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD060-5x50DS | For performing AST |
| Ciprofloxacin antibiotic powder | HiMedia | TC447-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Colorimeter | Quest | NA | For checking the OD of culture suspensions |
| Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database | functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Cooling Shaker Incubator | BTL41 Allied Scientific | NA | For incubation of media plates for culturing bacteria |
| Deep Freezer (-40 °C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | For storage of glycerol stocks |
| DNA Library Prep Kit | NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NA | Paired-end sequencing library preparation |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Electrophoresis Apparatus | TechResource | 15 cm gel casting tray | For making the agarose gel and carrying out electrophoresis |
| Electrophoresis Power pack with electrodes | Genei | NA | For running the AGE |
| Erythromycin antibiotic disc | HiMedia | SD222-5VL | For performing AST |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | CMS528-1G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Erythromycin antibiotic powder | HiMedia | TC024-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Used as a control while performing AST |
| Ethidium Bromide | HiMedia | MB071-1G | Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System |
| Fluorometer | Qubit 2.0 | NA | For determining concentration of extracted metagenomic DNA |
| Gel Documentation System | BioRad | Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis | |
| Gentamicin antibiotic disc | HiMedia | SD170-5x50DS | For performing AST |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS119-500ML | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Glycerol | HiMedia | GRM1027-500ML | For making glycerol stocks |
| Imipenem antibiotic disc | HiMedia | SD073 | For performing AST |
| Kaiju Database | NA | NA | For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamycin antibiotic disc | HiMedia | SD017-5x50DS | For performing AST |
| Kanamycin antibiotic powder | HiMedia | MB105-5G | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Levofloxacin antibiotic disc | HiMedia | SD216-5VL | For performing AST |
| Luria Bertani broth | Himedia | M1245-500G | For enrichment of cultures |
| McFarland Standards | Himedia | R092-1No | To compare density of culture suspension |
| Molecular Biology water | HiMedia | TCL018-500ML | For making PCR reaction mixture |
| Mueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST) |
| Neomycin antibiotic disc | HiMedia | SD731-5x50DS | For performing AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes |
| Primers | Xcelris | NA | For PCR amplication |
| R2A Agar, Modified | HiMedia | M1743 | For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load |
| Scaffold generation | CLC Genomics Workbench 6.0 | NA | For generation of scaffolds |
| Sequencer | Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) | NA | Sequencing of amplified library |
| Sodium Chloride | HiMedia | TC046-500G | For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample |
| Soil DNA isolation Kit | Xcelgen | NA | For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Used as a control while performing AST |
| Taxonomical Classification | Kaiju ioinformatics tool | NA | For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level |
| The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) | NA | NA | For functional annotation of ARGs |
| Tigecycline antibiotic disc | HiMedia | SD278 | For performing AST |
| Trimethoprim antibiotic disc | HiMedia | SD039-5x50DS | For performing AST |
| Tris base | HiMedia | TC072-500G | For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE) |
| Vancomycin antibiotic powder | HiMedia | CMS217 | For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria |
| Weighing Balance | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Used for weighing media powders, reagent powders etc. |
| NA - Not Applicable |
References
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
- Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
- Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
- Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
- Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
- de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
- Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
- Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. , Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022).
- Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
- Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
- Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2015).
- Bayot, M., Bragg, B.
- Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
- Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
- Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
- Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
- Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
- Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
- Ciesielczuk, H. Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , Queen Mary University of London. PhD thesis (2015).
