Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di batteri resistenti agli antibiotici dall'acqua e la caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici (ARG). L'uso di tecniche basate su colture e non basate su colture (analisi metagenomica) fornisce informazioni complete sulla diversità batterica totale e sul pool totale di diversi ARG presenti nelle acque dolci di Mumbai, in India.
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Articolo metodologico
Isolamento e identificazione di batteri resistenti agli antibiotici trasportati dall'acqua e caratterizzazione molecolare dei loro geni di resistenza agli antibiotici
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo e la diffusione della resistenza agli antibiotici (AR) attraverso il microbiota associato ai corpi d'acqua dolce è una delle principali preoccupazioni per la salute globale. Nel presente studio, sono stati raccolti e analizzati campioni di acqua dolce rispetto alla diversità batterica totale e ai geni AR (ARG) utilizzando sia tecniche convenzionali basate sulla coltura che un approccio metagenomico indipendente dalla coltura ad alto rendimento. Questo articolo presenta un protocollo sistematico per l'enumerazione dei batteri coltivabili totali e resistenti agli antibiotici da campioni di acqua dolce e la determinazione della resistenza fenotipica e genotipica negli isolati coltivabili. Inoltre, riportiamo l'uso dell'intera analisi metagenomica del DNA metagenomico totale estratto dal campione di acqua dolce per l'identificazione della diversità batterica complessiva, compresi i batteri non coltivabili, e l'identificazione del pool totale di diversi ARG (resistoma) nel corpo idrico. Seguendo questi protocolli dettagliati, abbiamo osservato un elevato carico di batteri resistenti agli antibiotici nell'intervallo di 9,6 × 10 5-1,2 × 109 CFU / ml. La maggior parte degli isolati erano resistenti ai molteplici antibiotici testati, tra cui cefotaxime, ampicillina, levofloxacina, cloramfenicolo, ceftriaxone, gentamicina, neomicina, trimetoprim e ciprofloxacina, con indici multipli di resistenza agli antibiotici (MAR) di ≥0,2, indicando alti livelli di resistenza negli isolati. Il sequenziamento dell'rRNA 16S ha identificato potenziali patogeni umani, come Klebsiella pneumoniae, e batteri opportunisti, come Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. e Aeromonas spp. La caratterizzazione molecolare degli isolati ha mostrato la presenza di vari ARG, quali blaTEM, blaCTX-M (β-lattamici), aadA, aac (6')-Ib (aminoglicosidi) e dfr1 (trimetoprims), confermata anche dall'analisi metagenomica del DNA. Nel DNA metagenomico è stata rilevata anche un'elevata prevalenza di altri ARG che codificano per le pompe di efflusso antibiotico - mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lattamasi - SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, il gene cloramfenicolo acetiltransferasi catB10 e il gene di resistenza alla rifampicina rphB - . Con l'aiuto dei protocolli discussi in questo studio, abbiamo confermato la presenza di batteri MAR trasportati dall'acqua con diversi tratti fenotipici e genotipici dell'AR. Pertanto, l'analisi metagenomica del DNA completo può essere utilizzata come tecnica complementare alle tecniche convenzionali basate sulla coltura per determinare lo stato complessivo di AR di un corpo idrico.
Introduzione
La resistenza antimicrobica (AMR) è stata identificata come uno dei problemi globali più urgenti. La rapida evoluzione della resistenza antimicrobica e la sua diffusione a livello mondiale rappresentano una delle maggiori minacce per la salute umana e l'economia globale in termini di costi sanitari ad essa associati1. L'uso eccessivo e l'abuso di antibiotici hanno portato ad un aumento dell'AR. Ciò è stato evidenziato dalla pandemia di COVID-19, durante la quale il trattamento delle infezioni secondarie associate, in molti casi, è stato enormemente compromesso a causa della resistenza antimicrobica nei pazienti colpiti2.....
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Protocollo
1. Raccolta ed elaborazione dei campioni
- Raccolta di campioni
- Raccogliere il volume appropriato del campione d'acqua in contenitori sterili, assicurandosi che non siano riempiti più di 3/4 del contenitore.
- Trasportare i campioni in laboratorio in condizioni asettiche il più presto possibile dopo la raccolta e trattarli immediatamente.
- Elaborazione dei campioni
- Filtrare asetticamente il campione d'acqua attraverso un panno di mussola sterile per rimuovere qualsiasi particella.
- Effettuare adeguate diluizioni seriali dell'acqua filtrata per ulteriori analisi.
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Risultati
Carica batterica totale e conteggio dei batteri resistenti agli antibiotici (AR)
Il calcolo della carica batterica totale è stato effettuato diffondendo da 10−4 a 10−6 diluizioni dei campioni d'acqua su R2A Agar, mezzo modificato. Per l'enumerazione della conta dei batteri AR, sono state distribuite diluizioni da 10−3 a 10−6 volte su piastre contenenti antibiotici (Figura 3). I conteggi totali e dei batteri AR sono stati calcola.......
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Discussione
La raccolta e l'elaborazione dei campioni svolgono un ruolo significativo e potrebbero influenzare i risultati e l'interpretazione dello studio. Pertanto, per escludere la variabilità nei campioni, è importante effettuare campionamenti in più punti del corpo d'acqua dolce studiato. Mantenere condizioni ambientali asettiche adeguate durante la manipolazione di tali campioni può prevenire la contaminazione. Inoltre, per evitare cambiamenti nella composizione batterica che possono influenzare la qualità e la quantità degli .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi contrastanti da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da sovvenzioni finanziarie del Department of Science and Technology-Promotion of University Research and Scientific Excellence (DST-PURSE) Scheme dell'Università di Mumbai. Devika Ghadigaonkar ha lavorato come Project Fellow nell'ambito del programma. Si riconosce l'aiuto tecnico fornito da Harshali Shinde, Senior Research Fellow presso il progetto n. del Department of Science and Technology-Science and Engineering Research Board (DST-SERB): CRG/2018/003624.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Scala DNA 100 bp | Himedia | MBT049-50LN | Per la stima delle dimensioni degli ampliconi |
| 2x PCR Taq mastermix | HiMedia | MBT061-50R | Per la preparazione di miscele di reazione PCR |
| 37 gradi C Incubatore | GS-192, Gayatri Scientific | NA | Per l'incubazione dei batteri |
| 6x Gel Loading Buffer | HiMedia | ML015-1ML | Colorante di caricamento e tracciamento che aiuta ad appesantire il campione di DNA e a monitorare l'andamento dell'elettroforesi |
| Polvere di agarosio | Himedia | MB229-50G | Per la risoluzione degli ampliconi durante l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE) |
| Disco antibiotico per ampicillina | HiMedia | SD002 | Per l'esecuzione |
| AST Autoclave | Equitron | NA | Necessario per la sterilizzazione di terreni, lastre di vetro, provette, ecc |
| Bioanalizzatore 2100 | Agilent Technologies | NA | Per verificare la qualità e la quantità della libreria amplificata |
| Bisafety B2 Cabinet | IMSET | IMSET BSC-Classe II Tipo B2 | Utilizzato per lavori microbiologici come la coltura batterica, AST ecc. |
| Disco antibiotico Cefotaxime | HiMedia | SD295E-5VL | Per l'esecuzione AST |
| Polvere antibiotica Cefotaxime | HiMedia | TC352-5G | Per la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento dei batteri resistenti agli antibiotici |
| Disco antibiotico Ceftriaxone | HiMedia | SD065 | Per l'esecuzione |
| centrifuga AST Minispin | Eppendorf | Minispin Plus-5453 | Utilizzato per pellettare i detriti durante la preparazione del DNA grezzo |
| Disco antibiotico cloramfenicolo | HiMedia | SD006-5x50DS | Per l'esecuzione |
| disco antibiotico AST ciprofloxacina | HiMedia | SD060-5x50DS | Per l'esecuzione |
| polvere antibiotica AST ciprofloxacina | HiMedia | TC447-5G | Per la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di antibiotici resistenti batteri |
| Colorimetro | Quest | NA | Per il controllo dell'OD delle sospensioni di coltura Database |
| completo di resistenza agli antibiotici (CARD) database | annotazione funzionale degli ARG; https://card.mcmaster.ca/ | ||
| Incubatore per agitatore di raffreddamento | BTL41 Allied Scientific | NA | Per l'incubazione di piastre di terreno per la coltura di batteri |
| Congelatore (-40 ° C) | Haier | DW40L, Haier Biomedicals | Per la conservazione delle scorte di glicerolo |
| Kit di preparazione della libreria di DNA | NEB Next Kit di preparazione della libreria di DNA Ultra per Illumina | NA | Preparazione della libreria di sequenziamento paired-end |
| EDTA | HiMedia | GRM1195-100G | Per la preparazione del tampone di corsa in gel per l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE) |
| Apparecchio per elettroforesi | TechResource | Vassoio | di colata in gel da 15 cmPer fare il gel di agarosio ed eseguire l'elettroforesi |
| Elettroforesi Alimentatore con elettrodi | Genei | NA | Per l'esecuzione dell'AGE |
| Disco antibiotico per eritromicina | HiMedia | SD222-5VL | Per l'esecuzione di AST |
| Polvere antibiotica per eritromicina | HiMedia | CMS528-1G | Per la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di batteri resistenti agli antibiotici |
| Polvere antibiotica per eritromicina | HiMedia | TC024-5G | Per la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di batteri resistenti agli antibiotici batteri |
| Escherichia coli ATCC 25922 | HiMedia | 0335X-1 | Utilizzato come controllo durante l'esecuzione dell'AST |
| Etidio Bromuro | HiMedia | MB071-1G | Agente intercalante e visualizzazione del DNA dopo l'elettroforesi sotto il sistema di documentazione su gel |
| Fluorimetro | Qubit 2.0 | NA | Per determinare la concentrazione del DNA metagenomico estratto |
| Sistema di documentazione su gel | BioRad | Utilizzato per la visualizzazione di ampliconi PCR dopo l'elettroforesi | |
| Disco antibiotico per gentamicina | HiMedia | SD170-5x50DS | Per l'esecuzione di AST |
| Acido acetico glaciale | HiMedia | AS119-500ML | Per la preparazione di tampone di corsa in gel per l'elettroforesi su gel di agarosio (AGE) |
| Glicerolo | HiMedia | GRM1027-500ML | Per la produzione di scorte di glicerolo |
| Disco | antibiotico ImipenemHiMedia | SD073 | Per l'esecuzione di AST |
| Kaiju Database | NA | NA Per | la classificazione tassonomica delle read; disco antibiotico https://kaiju.binf.ku.dk/ |
| Kanamicina | HiMedia | SD017-5x50DS | Per l'esecuzione di AST |
| Kanamicina antibiotica in polvere | HiMedia | MB105-5G | Per la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di batteri resistenti agli antibiotici |
| Disco antibiotico Levofloxacina | HiMedia | SD216-5VL | Per l'esecuzione |
| AST Luria Bertani brodo | Himedia | M1245-500G | Per l'arricchimento delle colture |
| McFarland Standard | Himedia | R092-1No | Per confrontare la densità della sospensione di coltura |
| Biologia molecolare acqua | HiMedia | TCL018-500ML | Per la produzione di miscele |
| di reazioni PCRMueller-Hinton Agar (MHA) | HiMedia | M173-500G | Per l'esecuzione di test di suscettibilità antibiotc (AST) |
| Disco antibiotico alla neomicina | HiMedia | SD731-5x50DS | Per l'esecuzione di AST |
| PCR Gradient Thermal Cycler | Eppendorf | Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz | Utilizzato per eseguire la PCR per l'amplificazione della regione 16S rRNA e di vari geni di resistenza agli antibiotici |
| Inneschi | Xcelris | NA | per l'amplificazione PCR |
| R2A Agar, | HiMedia | M1743 | Per la preparazione di piastre di terreno per l'isolamento della carica batterica totale e resistente agli antibiotici (AR) Generazione di |
| scaffold CLC | Genomics Workbench 6.0 | NA | Per la generazione di scaffold |
| Sequenziatore | Piattaforma Illumina (2 x 150 bp chimica) | NA | Sequenziamento di libreria amplificata |
| Cloruro di sodio | HiMedia | TC046-500G | Per la preparazione di soluzione salina allo 0,85% per la diluizione seriale del campione d'acqua |
| Kit di isolamento del DNA del suolo | Xcelgen | NA | Per l'estrazione dell'intero DNA metagenomico dal campione di acqua filtrata |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 | HiMedia | 0365P | Utilizzato come controllo durante l'esecuzione |
| classificazione tassonomica | Kaiju ioinformatics tool | NA | Per la classificazione delle letture in diversi gruppi tassonomici dal phylum al livello di genere |
| Il database completo di resistenza agli antibiotici (CARD) | NA | NA | Per l'annotazione funzionale degli ARG |
| Disco antibiotico tigeciclina | HiMedia | SD278 | Per l'esecuzione |
| disco antibiotico AST Trimetoprim | HiMedia | SD039-5x50DS | Per l'esecuzione della base AST |
| Tris | HiMedia | TC072-500G | Per la preparazione del tampone di corsa Gel per il gel di agarosio Elettroforesi (AGE) |
| Polvere antibiotica vancomicina | HiMedia | CMS217 | Per la preparazione della soluzione madre antibiotica necessaria durante l'isolamento di batteri resistenti agli antibiotici |
| Bilancia di pesata | Mettler Toledo | ME204 Mettler Toledo | Utilizzata per pesare polveri di fluidi, polveri reagenti, ecc. |
| NA - Non applicabile |
Riferimenti
- Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
- Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife.
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Ristampe e permessi
