Summary
Tunneling nanobuisjes (TNT's) zijn voornamelijk open-end F-actine membraan nanobuizen die naburige cellen verbinden, waardoor intercellulaire communicatie wordt vergemakkelijkt. Het opvallende kenmerk dat TNT's onderscheidt van andere celuitsteeksels is de zwevende aard van de nanobuisjes tussen cellen. Hier karakteriseren we TNT's door een 3D-volumeweergave van confocale z-stack-afbeeldingen te construeren.
Abstract
Recente ontdekkingen hebben aangetoond dat cellen directe, intercellulaire overdracht op lange afstand uitvoeren via nanoschaal, actine-membraankanalen, namelijk "tunneling nanobuisjes" (TNT's). TNT's worden gedefinieerd als open einde, lipide bilayer-omcirkelde membraanuitbreidingen die de continuïteit bemiddelen tussen naburige cellen met diameters variërend tussen 50 nm en 1 μm. TNT's werden aanvankelijk aangetoond in neuronale cellen, maar opeenvolgende studies hebben het bestaan van TNT's aangetoond in verschillende celtypen en ziekten, zoals neurodegeneratieve ziekten, virale infecties en kanker. Verschillende studies hebben verwezen naar close-ended, elektrisch gekoppelde membraan nanostructuren tussen naburige cellen als TNT's of TNT-achtige structuren.
De opheldering van ultrastructuur in termen van membraancontinuïteit op het eindpunt is technisch uitdagend. Bovendien zijn studies over cel-celcommunicatie een uitdaging in termen van de karakterisering van TNT's met behulp van conventionele methoden vanwege het ontbreken van specifieke markers. TNT's worden voornamelijk gedefinieerd als op F-actine gebaseerde, open membraanuitsteeksels. Een belangrijke beperking is echter dat F-actine aanwezig is in alle soorten uitsteeksels, waardoor het een uitdaging is om TNT's van andere uitsteeksels te onderscheiden. Een van de opmerkelijke kenmerken van op F-actine gebaseerde TNT's is dat deze structuren tussen twee cellen zweven zonder het substraat aan te raken. Daarom kunnen verschillende F-actine-gekleurde TNT's gemakkelijk worden onderscheiden van andere uitsteeksels zoals filopodia en neurieten op basis van hun zweven tussen cellen.
We hebben onlangs aangetoond dat de internalisatie van oligomere amyloïde-β1-42 (oAβ) via actine-afhankelijke endocytose geactiveerde p21-geactiveerde kinase-1 (PAK1) stimuleert, wat de vorming van F-actine-bevattende TNT's bemiddelt die gecoexpresseerd zijn met fosfo-PAK1 tussen SH-SY5Y neuronale cellen. Dit protocol schetst een 3D-volumeanalysemethode om TNT's te identificeren en te karakteriseren uit de vastgelegde z-stackbeelden van F-actine- en fosfo-PAK1-immunogekleurde membraanuitsteeksels in met oAβ behandelde neuronale cellen. Verder onderscheiden TNT's zich van het ontwikkelen van neurieten en neuronale uitwassen op basis van F-actine- en β-III tubuline-immunostained membraankanalen.
Introduction
Tunneling nanobuizen (TNT's) zijn op F-actine gebaseerde, voornamelijk open membraankanalen en spelen een vitale rol bij de intercellulaire overdracht van lading en organellen1. Het unieke kenmerk van TNT's is dat ze naburige cellen verbinden zonder enig contact met het substraat; ze zijn meer dan 10-300 μm lang en hun diameters variëren tussen 50 nm en 1 μm 2,3. TNT's zijn voorbijgaande structuren en hun levensduur duurt tussen enkele minuten tot enkele uren. TNT's werden voor het eerst aangetoond in PC12 neuronale cellen1; later toonden talrijke studies hun bestaan aan in verschillende celtypen in vitro en in vivo 4,5. Verschillende studies hebben de pathologische betekenis van TNT's in verschillende ziektemodellen aangetoond, zoals neurodegeneratieve ziekten, kanker en virale infecties 6,7,8.
De structurele heterogeniteiten van TNT's zijn aangetoond door verschillende studies in verschillende cellulaire systemen9. De verschillen zijn gebaseerd op de samenstelling van het cytoskelet, het vormingsmechanisme en de overgedragen ladingtypen10. In de eerste plaats wordt de open, F-actine-positieve membraancontinuïteit die zweeft tussen twee naburige cellen en organellen overdraagt, beschouwd als bestaande uit TNT's11. Het gebrek aan duidelijkheid of diversiteit dat wordt waargenomen bij de vorming van TNT's draagt echter bij aan de moeilijkheid om TNT-specifieke markers te ontwikkelen. Het is dus moeilijk om TNT-structuren te identificeren met conventionele detectiemethoden en membraannanobuisjes te onderscheiden in termen van open en close-ended uitsteeksels12. Het kenmerk van TNT's om te zweven als F-actine membraanuitsteeksels tussen twee cellen is echter relatief gemakkelijker en haalbaarder om te identificeren met behulp van conventionele beeldvormingstechnieken. Andere op actine gebaseerde cellulaire uitsteeksels zoals filopodia en dorsale filopodia kunnen niet zweven tussen twee verre cellen, vooral wanneer cellen vast zijn. Van belang is dat close-end, elektrisch gekoppelde, ontwikkelende neurieten vaak TNT-achtige structuren13 worden genoemd.
Het is bekend dat F-actine een belangrijke rol speelt bij de vorming van TNT en verschillende studies hebben aangetoond dat de F-actineremmer cytochalasine D de vorming van TNT's14,15 remt. Daarentegen hebben remmers van microtubuli geen effect op TNT-vorming16. De afgelopen 2 decennia hebben verschillende rapporten gezien over de belangrijke rol die TNT's spelen bij de verspreiding van pathologie en tumorresistentie en therapie17. Daarom is er een nooit eindigende vraag naar betere technieken voor TNT-karakterisering.
Het ontbreken van specifieke markers van TNT's en de diversiteit in morfologie en cytoskeletsamenstelling maken het moeilijk om een unieke methode van karakterisering te ontwikkelen. Sommige studies hebben geautomatiseerde beelddetectie en TNT-kwantificeringstechnieken gebruikt18,19. Er zijn echter verschillende voordelen van de huidige 3D-volume handmatige analysemethode ten opzichte van automatische beeldanalyse voor de detectie en kwantificering van TNT's. Vaak kunnen getrainde menselijke ogen deze zwevende nanostructuren gemakkelijker herkennen dan een geautomatiseerde beelddetectiemethode. Bovendien kunnen automatische detectiemethoden moeilijk te implementeren zijn in laboratoria zonder algoritme-expertise. De huidige methode kan op grote schaal worden toegepast door onderzoekers vanwege de precisie en reproduceerbaarheid.
In een recente studie toonden we aan dat oAβ de biogenese van TNT's in neuronale cellen bevordert via een PAK1-gemedieerd, actine-afhankelijk, endocytosemechanisme12. oAβ-geïnduceerde TNT's drukken ook geactiveerd PAK1 (of fosfo-PAK1) uit. We ontwikkelden een 3D volume view beeldreconstructiemethode om oAβ-geïnduceerde, F-actine- en fosfo-PAK1-immunostained TNT's te onderscheiden. β-III tubuline-positieve, ontwikkelende neurieten lijken vaak op TNT-achtige zwevende structuren20. Daarom onderscheidden we verder op F-actine gebaseerde TNT's van β-III tubuline-positieve neurieten en andere TNT-achtige uitsteeksels. 3D-volumeweergavebeelden zijn gebruikt om TNT's te identificeren op basis van hun kenmerken van zweven over het substraat en verbonden blijven tussen twee naburige cellen. Dit artikel beschrijft de identificatie en detectie van actine-bevattende membraankanalen of TNT's met behulp van confocale z-stack-afbeeldingen en, ten slotte, handmatige kwantificering van de geïdentificeerde structuren uit 3D-volumeweergavereconstructiebeelden. De gepresenteerde methode kan geen onderscheid maken tussen open-ended juiste TNT's en close-ended TNT-achtige structuren; deze methode helpt bij het identificeren van TNT's in in vitro 2D-celcultuur op een platte ondergrond. De methode is echter eenvoudig te implementeren en te reproduceren en kan op grote schaal worden gebruikt voor de nauwkeurige kwantificering van alleen op actine gebaseerde TNT's en om ze te onderscheiden van neurieten en β-tubulinepositieve TNT-achtige structuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: SH-SY5Y-cellen gekweekt in DMEM/F-12-media werden gedifferentieerd met 10 μM retinoïnezuur gedurende 7 dagen en behandeld met 1 μM oAβ-oligomeren gedurende 2 uur bij 37 °C (5% CO2). Na de behandeling werden de cellen gefixeerd met Karnovsky's fixatieve oplossing en dubbel-immunos gekleurd met fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antilichaam en F-actine-bindende falloïdine. Later werden confocale z-stack beelden gemaakt met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. De TNT's werden gekwantificeerd door handmatig tellen en onderscheiden van andere neurieten / celuitsteeksels door 3D-volumeweergavebeelden te construeren en de structuren te identificeren aan de hand van hun kenmerk van zweven tussen twee cellen zonder het substraat aan te raken (figuur 1).
1. Celkweek en differentiatie
- Kweek de SH-SY5Y neuronale cellen in DMEM/F12 (Ham's) media 1:1 met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-neomycine mengsel (PSN). Zaai de cellen in een 35 mm beeldvormende schaal met een 14 mm put bestaande uit een # 1,5 coverslip in het midden van de schaal bevestigd aan de onderkant. Zaai de cellen op de beeldvormingsschaal in een concentratie van 12.000 cellen / cm2 en voer de experimenten uit met 60% -70% samenvloeiing.
- Differentiëren de cellen gedeeltelijk met 10 μM retinoïnezuur (RA) uit een 100 mM stamoplossing (5 mg RA in 15 ml dimethylsulfoxide [DMSO]). Incubeer vervolgens de cellen gedurende 7 dagen bij 37 °C (5% CO2) voor differentiatie met mediaverandering om de 2 dagen.
OPMERKING: Wees voorzichtig met het handhaven van de confluentie (60% -70%) van de cellen (zowel ongedifferentieerde als gedeeltelijk gedifferentieerde cellen). Celdichtheid kan de vorming van TNT's tussen de cellen beïnvloeden.
2. Bereiding van oligomeren van amyloïde-β1-42 (oAβ) voor de behandeling van neuronale cellen
- Los Aβ 1-42 (1 mg) op in 200 μL van 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol en verdeel de oplossing in 20 aliquots, die elk 0,05 mg peptiden bevatten. Lyofiliseer en bewaar de aliquots bij −20 °C voor later gebruik.
- Bereid de stamoplossing (5 mM) van de gelyofiliseerde Aβ 1-42 in DMSO door 2,2 μL DMSO toe te voegen aan 0,05 mg gelyofiliseerd peptide. Om de peptiden zorgvuldig op te lossen, vortex de oplossing en soniceer gedurende 2 minuten in een waterbad sonicator.
- Verdun de stamoplossing tot een concentratie van 100 μM in DMEM, pH 7,4, en vortex om de peptiden om te zetten in monomeren, gevolgd door incubatie bij 4 °C gedurende 24 uur om oligomeren van Aβ 1-42 (oAβ)12,21,22 te verkrijgen.
- Karakteriseer oAβ vóór de experimenten zoals eerder gemeld21,22 door transmissie-elektronenmicroscopie beeldvorming.
- Behandel de gedeeltelijk gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen met 1 μM oAβ. Verwijder het medium voor de behandelingen en voeg verse FBS-vrije DMEM toe. Voeg na de mediumverandering eerder bereide oAβ (100 μM) toe aan het medium tot een eindconcentratie van 1 μM. Incubeer de cellen met 1 μM oAβ gedurende 2 uur bij 37 °C (5% CO2). Neem een negatieve controle op in de vorm van onbehandelde cellen.
3. Immunostaining van F-actine en geactiveerd-PAK1 voor de karakterisering van TNT's
- Voer differentiële immunostaining uit met behulp van fosfo-PAK1 (Thr423) / PAK2 (Thr402) antilichaam en F-actine-bindende fallotoxine phalloidine.
- Was de controle- en oAβ-behandelde cellen met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 2 x 2 min vóór de fixatie. Bereid de Fixatieve oplossing van Karnovsky met behulp van 2% formaline fixatief en 2,5% glutaaraldehyde opgelost in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,2. Bevestig vervolgens de cellen in de beeldvormingsschaal door karnovsky's fixatieve oplossing (net genoeg om de cellen te bedekken) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur toe te voegen.
- Was de vaste cellen 2 x 2 min met incubatiebuffer. Bereid de incubatiebuffer (20x) voor door 0,1 g saponine op te lossen in 5 ml FBS en verdun tot 1x door 95 ml 1x PBS toe te voegen.
- Voeg na fixatie het eerste antilichaam tegen phopho-PAK1 toe bij een verdunning van 1:250 in de incubatiebuffer en incubeer een nacht bij 4 °C in een donkere vochtige kamer.
- De volgende dag, na 24 uur incubatie, was de cellen 2 x 2 min met de incubatiebuffer; voeg vervolgens secundair antilichaam toe dat is geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 (1:1.000 verdunning) en falloidine 555 (1:1.000 verdunning). Incubeer de cellen in de donkere vochtige kamer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur.
- Was na de incubatie de cellen 2 x 2 min met incubatiebuffer. Kleur de kern door 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe te voegen in een verdunning van 1:2.000 en incubeer gedurende 5 min tot 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Bereid DABCO montagemedium met 25 mg DABCO in 90% glycerol en 10% 1x PBS. Om goed op te lossen, stelt u de pH in op 8,6 met behulp van spectrofotometrische kwaliteit, verdunt u HCl (verdund 1:20 met water) en houdt u de oplossing op een rocker om te mengen.
- Voeg als antibleekmiddel het DABCO-montagemedium rechtstreeks toe aan de beeldvormende schaal met de coverslip aan de onderkant. Wacht minstens 1-2 uur en ga direct verder met het uitvoeren van confocale beeldvorming.
OPMERKING: Er zijn geen lijmen nodig om de coverslips te bevestigen.
4. Immunostaining van F-actine en β-III tubuline om TNT's van neurieten te onderscheiden
- Voer differentiële immunostaining uit met β-III tubuline-antilichaam en F-actinebindend fallotoxine phalloïdine.
- Was de met oAβ behandelde cellen 2x met 1x PBS voordat u de fixatieve oplossing van Karnovsky toevoegt. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten op kamertemperatuur en was de cellen 2 x 2 min met incubatiebuffer.
- Voeg na fixatie het antilichaam tegen β-III tubuline (TUBb3) toe bij een verdunning van 1:250 in de incubatiebuffer en incubeer bij 4 °C 's nachts in de donkere vochtige kamer.
- Was de volgende dag de cellen met incubatiebuffer (2 x 2 min) en voeg secundair antilichaam geconjugeerd aan Alexa Fluor 488 (1:1.000 verdunning) en falloidin 555 (1:1.000 verdunning) samen toe aan hetzelfde gerecht. Incubeer vervolgens de cellen gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur in de donkere vochtige kamer.
- Was de cellen 2x met incubatiebuffer en voeg nucleair kleurende DAPI toe in een verdunning van 1:2.000 gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Voeg antibleekmiddel DABCO toe in montagemedium zoals hierboven vermeld en wacht 2 uur voordat u het in beeld brengt.
5. Beeldvorming met confocale microscopie
- Om TNT's te identificeren, legt u z-stackbeelden van immunogekleurde cellen vast met behulp van een confocale laserscanmicroscoop. Maak de beelden met behulp van 40x/1.40 Olie DIC objectief met DAPI, fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) en tetramethylrhodamine (TRITC) filtersets.
- Selecteer eerst de kanalen door achtereenvolgens op de vereiste lasers te klikken in de vensters Track 1, Track 2 en Track 3 in de confocale software. Klik op de optie T-PMT onder het Track 1-venster om de DIC-beelden (Differential Interference Contrast) met fluorescentiekanalen te maken.
OPMERKING: DIC-beelden worden vastgelegd door een andere detector met het label T-PMT. - Selecteer het acquisitietabblad van de software, klik op het tabblad Z-stack en wacht tot er een venster wordt geopend. Klik vervolgens op live scan om de cellen onder aan de schotel scherp te stellen. Selecteer die gefocuste afbeelding als de eerste stapel. Focus vervolgens omhoog om het bovenste deel van de cel te zien en selecteer dat als de laatste stapel. Stop het live scannen en klik op het nummer naast het optimale tabblad om de stapgrootte van de stapels te bepalen. Stapgrootte bepaalt het aantal segmenten en de intervallen op basis van de dikte van de cellen.
OPMERKING: Stapgrootte wordt geselecteerd op basis van Nyquist-bemonstering om voldoende plakjes te nemen en ervoor te zorgen dat er geen openingen tussen de twee stapels zijn. Nyquist-bemonstering wordt bepaald op basis van het doel en de golflengten van de lichten23. - Maak sequentiële beelden van drie kanalen van DAPI, FITC en TRITC met 405 nm, 488 nm en 561 nm lasers en leg vast met een pixel dwell time van 1,02 μs. Leg beelden vast in het DIC-kanaal met fluorescentiekanalen om de celgrens te observeren.
- Leg een stapel beelden vast met de afmetingen x: 224,92 μm en y: 224,92 μm, met elke pixel van 220 nm2 grootte en z-scaling van 415 nm.
- Maak afbeeldingen van verschillende z-stacks (15-22 stacks) van de onderkant naar de bovenkant van de cellen. Verkrijg ten minste 10 afbeeldingen uit het willekeurige veld van de kweekschaal om een totaal van ~ 200-300 cellen te krijgen.
- Analyseer de vastgelegde beelden offline om de TNT's te identificeren door middel van 3D-volumeweergaveanalyse
6. Analyse van confocale z-stack beelden om TNT's te identificeren en te kwantificeren
- Open de confocale afbeeldingen die zijn opgeslagen in .czi-gegevensformaat in Fiji-software voor analyse.
- Selecteer de Optie Hyperstack om elke z-stack en elk kanaal van de afbeelding te zien. Zoek naar de hyperstacks van de z-stacks en kanalen, die in één venster worden geopend, zoals weergegeven in figuur 2. Blader door de schuifbalken kanaal (aangegeven door rode en groene pijlen) en z-stack (aangegeven met blauwe pijlen) om de exacte stapel van een bepaald interessant kanaal te selecteren.
OPMERKING: In vaste cellen, omdat de zwevende TNT's of membraankanalen boven het oppervlak blijven, zijn de structuren niet zichtbaar in de onderste delen van de z-stacks. In vaste cellen liggen neurieten echter op het oppervlak en zijn ze detecteerbaar in de onderste delen van de z-stacks (z = 0 tot 2). Zie figuur 2 voor de identificatiestappen. - Zoals weergegeven in figuur 2, selecteert u eerst het met F-actine bevlekte kanaal (aangegeven met rode pijlen) door door de kanaalbalk te schuiven. Blader vervolgens handmatig door de z-stacks (aangegeven door blauwe pijlen) om elke stapel één voor één te zien. Identificeer de F-actine-gekleurde structuren die cellen lijken te verbinden, zichtbaar zijn in de onderste delen van de z-stacks en zich dicht bij het oppervlak van de beeldvormingsschaal bevinden (z = 2) als neurieten (aangegeven met witte pijlen).
OPMERKING: De meerderheid van de neurieten zijn gemakkelijk te identificeren omdat ze verschijnen als uitgebreide uitsteeksels (aangegeven door roze pijlen). - Identificeer de TNT's, de F-actine-positieve, zwevende cel-naar-cel-leidingen, door de z-stacks naar boven te scrollen (van z = 4 in figuur 2; aangegeven met gele pijlen). Zoek naar neurieten in de buurt van de onderste delen van de z-stacks naar het oppervlak en merk op dat ze beginnen te verdwijnen met het scrollen van z-stacks naar boven (bij z = 6 in figuur 2; neurieten zijn niet duidelijk zichtbaar).
- Identificeer fosfo-PAK1-positieve TNT's op dezelfde manier als F-actine-positieve TNT's door de zwevende aard van de leidingen uit de z-stacks te analyseren. Omdat fosfo-PAK1-kleuring zwakker is dan F-actinekleuring, zoekt u naar phopho-PAK1-gekleurde TNT's bij z = 4 (vaag zichtbaar) en bij z = 6 (prominent).
- Observeer verder de DIC-beelden om te verifiëren dat de F-actine- en fosfo-PAK1-gekleurde TNT-structuren membraankanalen tussen cellen zijn (figuur 3). Voeg daarnaast F-actine (rood) en fosfo-PAK1 (groen) kanalen samen om te controleren of de geïdentificeerde TNT's F-actine en fosfo-PAK1 co-gekleurde structuren zijn (figuur 3).
- Om de TNT's te kwantificeren, telt u de totale celnummers en de geïdentificeerde TNT's handmatig en geeft u de getallen weer als percentages.
- Om F-actine-positieve TNT's en β-III tubuline (TUBb3)-positieve, TNT-achtige zwevende leidingen te onderscheiden van z-stack-afbeeldingen, voegt u F-actine (rood) en TUBb3 (groen) kanalen samen (figuur 4). Analyseer vervolgens de z-stacks van de samengevoegde afbeeldingen.
- Zoek naar uitsluitend F-actine-gekleurde TNT's die vaag zichtbaar zijn bij z = 3 en prominent bij z = 6 en z = 9 (gele pijlen). Identificeer op dezelfde manier F-actine en β-III tubuline (TUBb3) dubbel-positieve, TNT-achtige zwevende leidingen op z = 6 en z = 9 (cyaanpijlen). Identificeer andere F-actine- en β-III tubuline-gekleurde, niet-zwevende uitsteeksels van de onderste delen van de z-stapels (witte pijlen).
- Meet de diameter van de TNT's met behulp van het lijngereedschap in Fiji. Controleer de meetschaal door te klikken op Analyseren | Stel Schaal zo in dat "afstand in pixels" automatisch wordt ingesteld vanaf de .czi-afbeeldingen. Meet de diameters van de TNT's op het xy-vlak.
OPMERKING: De meeste diameters liggen tussen 1 pixel en 4 pixels (d.w.z. 220-880 nm); elke pixel is 220 nm. Zie figuur 5 voor een samenvatting van het protocol voor de analyse van z-stack confocale afbeeldingen.
7.3D reconstructie van z-stack-afbeeldingen om TNT's te karakteriseren
- Gebruik de volume viewer plugin in Fiji, die 3D reslicing en drempel-enabled 3D visualisatie mogelijk maakt (Figuur 6).
- Splits de z-stack-afbeeldingen op in afzonderlijke kanalen. Snijd vervolgens de z-stack-afbeeldingen met één kanaal (F-actinekanaal) bij om de 3D-reconstructieweergave te gebruiken om een of twee TNT's of neurieten tegelijk te markeren. Schakel de plug-in voor volumeweergave in om xy-, yz- en xz-weergaven te visualiseren.
- Pin een enkele TNT of neuriet in het xy-vlak (witte pijlen vertegenwoordigen neurieten in figuur 6A; gele pijlen vertegenwoordigen TNT's in figuur 6B) en markeer xz (rood) en yz (groen) asdoorsneden. Observeer de neurieten onderaan het xz-vlak in de xz- en yz-vlakken (witte pijlen, figuur 6A) en de TNT's in de bovenste z-stacks (gele pijlen, figuur 6B).
- Selecteer de afzonderlijke TNT of neuriet om de 3D-volumeweergave in het xz-vlak te reconstrueren (figuur 6C, D). Observeer in de 3D-reconstructie de neurieten aan de onderkant van het z-vlak (witte pijlen, figuur 6C) en de TNT's die verschijnen als zwevende structuren die twee cellen verbinden zonder het onderste z-vlak aan te raken (gele pijlen, figuur 6D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier identificeren en karakteriseren we oAβ-geïnduceerde TNT's in SH-SY5Y neuronale cellen door 3D-volumeweergaven te construeren uit confocale z-stack-afbeeldingen (figuur 1). De cellen waren dubbel-immunostained met F-actine en fosfo-PAK1. Confocale z-stack beelden van immunogekleurde cellen werden geanalyseerd om TNT's te identificeren (figuur 2). Verder werden DIC-beelden geanalyseerd om te verifiëren dat de F-actine- en fosfo-PAK1-gekleurde TNT-structuren membraankanalen tussen cellen waren (figuur 3). Verder waren de cellen dubbel-immunoskleurd met F-actine en β-III tubuline (figuur 4). De TNT-achtige F-actine en β-III tubuline dubbelpositieve membraankanalen werden onderscheiden van alleen F-actine-positieve TNT's (figuur 4). De TNT's die samen met fosfo-PAK1 (of geactiveerd PAK1) en F-actine werden uitgedrukt, werden onderscheiden van andere neurieten / celuitsteeksels door 3D-volumeweergavebeelden te construeren op basis van hun kenmerk van zweven tussen twee cellen zonder het substraat aan te raken (figuur 6). De geïdentificeerde TNT's werden handmatig gespot en het percentage TNT's werd nauwkeurig berekend op basis van de 3D-volumeweergavebeelden. De diameter en de lengte van de TNT's werden ook bepaald door de individueel geïdentificeerde TNT's te analyseren.
Figuur 1: Schematisch diagram dat de protocolsamenvatting van de detectiemethode van TNT's weergeeft. Schaalbalk = 100 μm voor microscopiebeelden (boven); 10 μm (3D-volumeweergaven). Afkortingen: oAβ = oligomere amyloïde-β1-42; PAK1 = p21-geactiveerd kinase-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van confocale z-stack beelden om TNT's te identificeren en te kwantificeren. Confocale z-stack beelden werden geanalyseerd in Fiji software. Hyperstacks van z-stacks en kanalen geopend in een enkel venster met (A) F-actine en (B) fosfo-PAK1. Door het scrollen van de kanaalbalken (aangegeven door rode en groene pijlen) en z-stack (aangegeven met blauwe pijlen) werden de afzonderlijke stapels van een bepaald interessant kanaal geanalyseerd. (A) De F-actine-gekleurde structuren die cellen verbinden, zichtbaar in de onderste delen van de z-stacks, en beschouwd als dicht bij het oppervlak van de afbeeldingsschaal (z = 2) werden geïdentificeerd als neurieten (aangegeven met witte pijlen). Daarentegen werden zwevende cel-naar-cel-verbonden leidingen die zichtbaar waren op hogere delen van de z-stacks geïdentificeerd als TNT's (aangegeven door gele pijlen). (B) Evenzo werden fosfo-PAK1-gekleurde neurieten en TNT's geïdentificeerd. Andere F-actine-positieve korte uitsteeksels die niet verbonden zijn met naburige cellen worden aangegeven met roze pijlen. Schaalstaven = 10 μm. Afkortingen: TNT = tunneling nanobuisjes; PAK1 = p21-geactiveerd kinase-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse van DIC-beelden om TNT's te bevestigen. (A) DIC-beelden werden waargenomen om te verifiëren dat de F-actine- en fosfo-PAK1-gekleurde TNT's en neurietuitsteeksels inderdaad membraankanalen waren. (B) Daarnaast werden F-actine (rood) en fosfo-PAK1 (groen) kanalen samengevoegd om te verifiëren dat de geïdentificeerde, oAβ-geïnduceerde TNT's F-actine en fosfo-PAK1 co-gekleurde structuren waren. Schaalstaven = 10 μm. Afkortingen: TNT = tunneling nanobuisjes; DIC = differentieel interferentiecontrast; PAK1 = p21-geactiveerd kinase-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Confocale z-stack beelden geanalyseerd met behulp van Fiji software om alleen F-actine-gekleurde TNT's te onderscheiden van β-III tubuline en F-actine dubbel-gekleurde, TNT-achtige zwevende leidingen. Eerst werden de F-actine (rood) en TUBb3 (groen) kanalen van de hyperstacks samengevoegd. Vervolgens werden de samengevoegde afbeeldingen in één venster geopend. Door te scrollen op de z-stack schuifbalken werden exclusief F-actine-gekleurde TNT's geïdentificeerd; deze waren vaag zichtbaar bij z = 3 en prominent bij z = 6 en z = 9 (gele pijlen, B). Evenzo waren F-actine en TUBb3 dubbel-positieve, TNT-achtige zwevende leidingen detecteerbaar bij z = 6 en z = 9 (cyaanpijlen, A). Andere F-actine- en β-III tubuline-gekleurde, niet-zwevende uitsteeksels werden geïdentificeerd uit de onderste delen van de z-stacks (witte pijlen). Schaalstaven = 10 μm. Afkortingen: TNT's = tunneling nanobuisjes; TUBb3 = β-III tubuline. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Schematische samenvatting van het gedetailleerde protocol voor de analyse van z-stack confocale afbeeldingen. Afkorting: TNT's = tunneling nanotubes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: 3D-reconstructieweergave om één of twee TNT's of neurieten tegelijk te markeren. De "volume view" plugin in Fiji wordt gebruikt om xy, yz en xz weergaven te visualiseren. De 3D-reconstructie toont neuriet dat aan de onderkant van het z-vlak ligt (witte pijlen in de panelen A en C), terwijl TNT's verschijnen als zwevende structuren die twee cellen verbinden zonder het onderste z-vlak aan te raken (gele pijl in de panelen B en D). Schaalstaven = 10 μm. Afkorting: TNT's = tunneling nanotubes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende onderzoekers in de afgelopen 2 decennia hebben geprobeerd de structuur van TNT's18 te begrijpen en te karakteriseren. Het ontbreken van specifieke markers belemmert de vooruitgang en er is een toenemende vraag naar een handige, gestandaardiseerde methode die kan worden gebruikt om TNT's te identificeren, karakteriseren en kwantificeren. TNT's worden gedefinieerd als op F-actine gebaseerde membraankanalen die tussen twee cellen zweven. Studies hebben aangetoond dat β-tubuline-positieve, close-ended, zich ontwikkelende neurieten zweven tussen twee verre cellen en lijken op TNT-achtige structuren12,13. Daarom worden TNT's geïdentificeerd en onderscheiden van neurieten en andere TNT-achtige structuren op basis van hun positiviteit voor alleen actine en omdat ze membraankanalen zijn die tussen twee verre cellen zweven. Onderzoekers vinden het vaak een uitdaging om intacte TNT-structuren te verkrijgen tijdens fixatie vóór beeldvorming24. Om dit probleem op te lossen, gebruikten we een gemodificeerde fixatieve oplossing met 2,5% glutaaraldehyde (Karnovsky's fixatief) om de SH-SY5Y neuronale cellen te repareren die in dit protocol worden gebruikt25.
Een cruciale stap van elk immunohistochemie/immunocytochemie-experiment is de fixatie van het monster, die afhankelijk is van de selectie van het juiste fixatieve middel. Onvolmaakte fixatie van het monster kan leiden tot snelle proteolytische afbraak van de doeleiwitten en een vermindering van de specifieke immunoreactiviteit. Overfixatie veroorzaakt maskering van het epitoop en onzekerheid in specifieke etikettering veroorzaakt door de niet-specifieke achtergrond. Methode, timing of duur, temperatuur en pH beïnvloeden ook de juiste fixatie van de cellen26.
Paraformaldehyde wordt op grote schaal gebruikt als fixatief middel bij het immunostainen van cellen. De nadelen van het gebruik van paraformaldehyde als fixatief middel omvatten het verlies van antigeniciteit en veranderingen in morfologie. Glutaaraldehyde heeft een lagere osmotische druk, is stabieler in oplossing en kruist gemakkelijk, waardoor betere resultaten worden verkregen27. Een combinatie van formaldehyde-glutaaraldehyde (in fosfaatbuffer) fixatief resulteert in uitzonderlijke fixatie van een breed scala aan weefsel/ celmonsters. Deze combinatie maakt een snelle stabilisatie van de ultrastructuur van de cel mogelijk door formaldehyde, gevolgd door een permanente fixatie door de langzamere penetrerende werking van glutaaraldehyde28.
TNT's die positief zijn voor F-actine en fosfo-PAK1 worden onderscheiden van neurieten op basis van hun kenmerk van zweven tussen twee cellen in in vitro 2D-celcultuur op een plat substraat. De geïdentificeerde TNT's werden handmatig gespot met 3D-volumeweergaveanalyse en de percentages TNT's die werden gevormd, werden berekend door handmatig te tellen. De handmatige methode maakt de kwantificering van grote hoeveelheden gegevens moeilijk omdat het immense mankracht vereist19. Getrainde ogen kunnen TNT's echter efficiënt herkennen en onderscheiden van neurieten met een betere precisie dan automatische detectiemethoden. De bestaande automatische detectiemethoden zijn ook moeilijk te implementeren in elk laboratorium zonder de beschikbare expertise om een algoritme te ontwikkelen en /of het bestaande algoritme te wijzigen zoals vereist voor de experimentele opstelling. De handmatige 3D-volumeweergaveanalysemethode maakt het gemakkelijker om de membraanstructuren te identificeren die tussen cellen in de onderste delen van de z-stacks liggen en die in de middelste en hogere delen van de z-stacks zweven om duidelijk onderscheid te maken tussen neurieten en TNT's.
TNT's kunnen worden onderscheiden van andere membraanuitsteeksels zoals neurieten of tumormicrobuisjes. Het is echter moeilijk om onderscheid te maken tussen open en close-ended, nano-size, diameter-membraanbuizen, wat de volgende vraag oproept: zijn het TNT's of TNT-achtige structuren? Sinds het afgelopen decennium is een enorme hoeveelheid gegevens verzameld om de onvermijdelijke rol van TNT's bij de verspreiding van pathologie, kankerresistentie en therapie aan te tonen17. Daarom zijn onderzoekers op zoek naar de ontwikkeling van specifieke makers die het veld van directe, intercellulaire communicatie over lange afstand zullen veranderen. Tot die tijd is er veel vraag naar reproduceerbare beeldvormingsmethoden voor karakterisering om de weg vrij te maken voor continue vooruitgang in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.
Acknowledgments
D.K.V en A.R bedanken de Manipal Academy of Higher Education voor de TMA Pai fellowship. We bedanken de Science and Engineering Research Board of India voor SERB-SRG (#SRG/2021/001315), evenals de Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) en het Intramurale fonds van de Manipal Academy of Higher Education, Manipal, India. We bedanken JNCASR's (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, India) confocale faciliteit en B. Suma voor de confocale microscopie in JNCASR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
- Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
- Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
- Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
- Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
- Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
- Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
- Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
- Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
- Zurzolo, C.
- Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
- Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
- Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
- Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
- Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
- Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
- Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
- Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
- Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
- Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
- Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
- Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
- Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
- Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).
