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Biology

3 डी वॉल्यूम व्यू छवियों का उपयोग करके टनलिंग नैनोट्यूब का पता लगाना और परिमाणीकरण

Published: August 31, 2022 doi: 10.3791/63992
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, India
* These authors contributed equally

Summary

टनलिंग नैनोट्यूब (टीएनटी) मुख्य रूप से ओपन-एंडेड एफ-एक्टिन झिल्ली नैनोट्यूब हैं जो पड़ोसी कोशिकाओं को जोड़ते हैं, अंतरकोशिकीय संचार की सुविधा प्रदान करते हैं। उल्लेखनीय विशेषता जो टीएनटी को अन्य सेल प्रोट्रूशियंस से अलग करती है, कोशिकाओं के बीच नैनोट्यूब की मंडराती प्रकृति है। यहां, हम कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों के 3 डी वॉल्यूम दृश्य का निर्माण करके टीएनटी को चिह्नित करते हैं।

Abstract

हाल की खोजों से पता चला है कि कोशिकाएं नैनो-स्केल, एक्टिन-झिल्ली नाली, अर्थात् "टनलिंग नैनोट्यूब" (टीएनटी) के माध्यम से प्रत्यक्ष, लंबी दूरी, अंतरकोशिकीय हस्तांतरण करती हैं। टीएनटी को ओपन-एंडेड, लिपिड बाइलेयर-घेरे हुए झिल्ली विस्तार के रूप में परिभाषित किया गया है जो 50 एनएम और 1 μm के व्यास की पड़ोसी कोशिकाओं के बीच निरंतरता का मध्यस्थता करते हैं। TNTs को शुरू में न्यूरोनल कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया था, लेकिन लगातार अध्ययनों ने कई सेल प्रकारों और बीमारियों, जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों, वायरल संक्रमण और कैंसर में टीएनटी के अस्तित्व का खुलासा किया है। कई अध्ययनों ने पड़ोसी कोशिकाओं के बीच क्लोज-एंडेड, विद्युत युग्मित झिल्ली नैनोस्ट्रक्चर को टीएनटी या टीएनटी जैसी संरचनाओं के रूप में संदर्भित किया है।

समापन बिंदु पर झिल्ली निरंतरता के संदर्भ में अल्ट्रास्ट्रक्चर का स्पष्टीकरण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, विशिष्ट मार्करों की कमी के कारण पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके टीएनटी के लक्षण वर्णन के संदर्भ में सेल-सेल संचार पर अध्ययन चुनौतीपूर्ण हैं। टीएनटी को मुख्य रूप से एफ-एक्टिन-आधारित, ओपन-एंडेड मेम्ब्रेन प्रोट्रूशियंस के रूप में परिभाषित किया गया है। हालांकि, एक बड़ी सीमा यह है कि एफ-एक्टिन सभी प्रकार के प्रोट्रूशियंस में मौजूद है, जिससे टीएनटी को अन्य प्रोट्रूशियंस से अलग करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। एफ-एक्टिन-आधारित टीएनटी की उल्लेखनीय विशेषताओं में से एक यह है कि ये संरचनाएं सबस्ट्रेटम को छूने के बिना दो कोशिकाओं के बीच मंडराती हैं। इसलिए, अलग-अलग एफ-एक्टिन-दाग वाले टीएनटी को आसानी से कोशिकाओं के बीच उनके मंडराने के आधार पर फिलोपोडिया और न्यूरॉइट्स जैसे अन्य प्रोट्रूशियंस से अलग किया जा सकता है।

हमने हाल ही में दिखाया है कि एक्टिन-निर्भर एंडोसाइटोसिस के माध्यम से ऑलिगोमेरिकएमिलॉयड-β 1-42 (ओए) का आंतरिककरण सक्रिय पी 21-सक्रिय किनेज -1 (पीएके 1) को उत्तेजित करता है, जो एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोनल कोशिकाओं के बीच फॉस्फो-पीएके 1 के साथ सह-व्यक्त एफ-एक्टिन युक्त टीएनटी के गठन की मध्यस्थता करता है। यह प्रोटोकॉल ओए-उपचारित न्यूरोनल कोशिकाओं में एफ-एक्टिन- और फॉस्फो-पीएके 1-इम्यूनोस्टेन्ड झिल्ली प्रोट्रूशियंस की कैप्चर की गई जेड-स्टैक छवियों से टीएनटी की पहचान और विशेषता के लिए एक 3 डी वॉल्यूम विश्लेषण विधि की रूपरेखा तैयार करता है। इसके अलावा, टीएनटी को एफ-एक्टिन- और β-III ट्यूबुलिन-इम्यूनोस्टेन्ड झिल्ली नाली के आधार पर न्यूरॉइट्स और न्यूरोनल आउटग्रोथ विकसित करने से अलग किया जाता है।

Introduction

टनलिंग नैनोट्यूब (टीएनटी) एफ-एक्टिन-आधारित हैं, मुख्य रूप से ओपन-एंडेड झिल्ली नाली और कार्गो और ऑर्गेनेल के अंतरकोशिकीय हस्तांतरण में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाते हैं। टीएनटी की अनूठी विशेषता यह है कि वे सबस्ट्रेटम के साथ किसी भी संपर्क के बिना पड़ोसी कोशिकाओं को जोड़ते हैं; वे लंबाई में 10-300 μm से अधिक हैं और उनके व्यास 50 nm से 1 μm 2,3 के बीच भिन्न होते हैं। टीएनटी क्षणिक संरचनाएं हैं, और उनका जीवनकाल कुछ मिनटों से कई घंटों के बीच रहता है। टीएनटी को पहली बार पीसी 12 न्यूरोनल कोशिकाओं में प्रदर्शित किया गया था; बाद में, कई अध्ययनों ने विट्रो और विवो 4,5 में कई सेल प्रकारों में अपना अस्तित्व दिखाया। कई अध्ययनों ने विभिन्न रोग मॉडलों में टीएनटी के पैथोलॉजिकल महत्व का खुलासा किया है, जैसे कि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, कैंसर और वायरल संक्रमण 6,7,8।

विभिन्न सेलुलर प्रणालियों में कई अध्ययनों द्वारा टीएनटी की संरचनात्मक विषमताओं का प्रदर्शन किया गयाहै। अंतर साइटोस्केलेटन संरचना, गठन के तंत्र और स्थानांतरित कार्गोप्रकारों पर आधारित हैं। मुख्य रूप से, ओपन-एंडेड, एफ-एक्टिन-पॉजिटिव झिल्ली निरंतरता जो दो पड़ोसी कोशिकाओं के बीच मंडराती है और ऑर्गेनेल को स्थानांतरित करती है, उसे टीएनटी11 से मिलकर माना जाता है। हालांकि, टीएनटी के गठन में देखी गई स्पष्टता या विविधता की कमी टीएनटी-विशिष्ट मार्करों को विकसित करने में कठिनाई को बढ़ाती है। इस प्रकार, पारंपरिक पहचान विधियों द्वारा टीएनटी संरचनाओं की पहचान करना और ओपन-एंडेड और क्लोज-एंडेड प्रोट्रूशियंस12 के संदर्भ में झिल्ली नैनोट्यूब को अलग करना मुश्किल है। हालांकि, दो कोशिकाओं के बीच एफ-एक्टिन झिल्ली प्रोट्रूशियंस के रूप में मंडराने के लिए टीएनटी की विशेषता पारंपरिक इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके पहचानना अपेक्षाकृत आसान और अधिक संभव है। अन्य एक्टिन-आधारित सेलुलर प्रोट्रूशियंस जैसे फिलोपोडिया और पृष्ठीय फिलोपोडिया दो दूर की कोशिकाओं के बीच नहीं मंडरा सकते हैं, खासकर जब कोशिकाएं तय होती हैं। ध्यान दें, क्लोज-एंडेड, विद्युत रूप से युग्मित, विकासशील न्यूरॉइट्स को अक्सर टीएनटी जैसी संरचनाएंकहा जाता है।

यह ज्ञात है कि एफ-एक्टिन टीएनटी गठन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और कई अध्ययनों से पता चला है कि एफ-एक्टिन अवरोधक साइटोचलासिन डी टीएनटी14,15 के गठन को रोकता है। इसके विपरीत, सूक्ष्मनलिकाएं के अवरोधकों का टीएनटी गठन16 पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। पिछले 2 दशकों में पैथोलॉजी और ट्यूमर प्रतिरोध और चिकित्सा के प्रसार में टीएनटी की महत्वपूर्ण भूमिका पर कई रिपोर्टें देखीगई हैं। इसलिए, टीएनटी लक्षण वर्णन के लिए बेहतर तकनीकों की कभी न खत्म होने वाली मांग है।

टीएनटी के विशिष्ट मार्करों की कमी और आकृति विज्ञान और साइटोस्केलेटल संरचना में विविधता लक्षण वर्णन की एक अनूठी विधि विकसित करना मुश्किल बनाती है। कुछ अध्ययनों ने स्वचालित छवि का पता लगाने और टीएनटी परिमाणीकरण तकनीक18,19 का उपयोग किया है। हालांकि, टीएनटी का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए स्वचालित छवि विश्लेषण पर वर्तमान 3 डी वॉल्यूम मैनुअल विश्लेषण विधि के कई फायदे हैं। अक्सर, प्रशिक्षित मानव आंखें स्वचालित छवि पहचान विधि की तुलना में इन मंडराते नैनो-संरचनाओं को अधिक आसानी से देख सकती हैं। इसके अलावा, एल्गोरिदम विशेषज्ञता की कमी वाली प्रयोगशालाओं में स्वचालित पहचान विधियों को लागू करना मुश्किल हो सकता है। वर्तमान विधि को इसकी सटीकता और प्रजनन क्षमता के कारण शोधकर्ताओं द्वारा व्यापक रूप से अपनाया जा सकता है।

हाल के एक अध्ययन में, हमने दिखाया कि ओएएए पीएके 1-मध्यस्थता, एक्टिन-निर्भर, एंडोसाइटोसिस तंत्र12 के माध्यम से न्यूरोनल कोशिकाओं में टीएनटी के जैवजनन को बढ़ावा देता है। oA-प्रेरित TNT भी सक्रिय PAK1 (या फॉस्फो-PAK1) को व्यक्त करते हैं। हमने ओए-प्रेरित, एफ-एक्टिन- और फॉस्फो-पीएके 1-इम्यूनोस्टेन्ड टीएनटी को अलग करने के लिए एक 3 डी वॉल्यूम व्यू इमेज पुनर्निर्माण विधि विकसित की है। β-III ट्यूबुलिन-पॉजिटिव, विकासशील न्यूरॉइट्स अक्सर टीएनटी जैसी होवरिंग संरचनाओंसे मिलते जुलते हैं। इसलिए, हमने एफ-एक्टिन-आधारित टीएनटी को β-III ट्यूबुलिन-पॉजिटिव न्यूरॉइट्स और अन्य टीएनटी-जैसे प्रोट्रूशियंस से अलग किया। 3 डी वॉल्यूम व्यू छवियों का उपयोग टीएनटी की पहचान करने के लिए किया गया है, जो सबस्ट्रेटम पर मंडराने और दो पड़ोसी कोशिकाओं के बीच जुड़े रहने की उनकी विशेषताओं के आधार पर है। यह पेपर कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों का उपयोग करके एक्टिन युक्त झिल्ली नाली या टीएनटी की पहचान और पता लगाने का वर्णन करता है और अंत में, 3 डी वॉल्यूम व्यू पुनर्निर्माण छवियों से पहचानी गई संरचनाओं की मैन्युअल मात्रा का ठहराव करता है। प्रस्तुत विधि क्लोज-एंडेड टीएनटी जैसी संरचनाओं से ओपन-एंडेड उचित टीएनटी को अलग नहीं कर सकती है; यह विधि एक फ्लैट सबस्ट्रेटम पर इन विट्रो 2 डी सेल कल्चर में टीएनटी की पहचान करने में मदद करती है। हालांकि, विधि को लागू करना और पुन: उत्पन्न करना आसान है और इसका व्यापक रूप से उपयोग केवल एक्टिन-आधारित टीएनटी की सटीक मात्रा के लिए किया जा सकता है और उन्हें न्यूरॉइट्स और β-ट्यूबुलिन पॉजिटिव टीएनटी जैसी संरचनाओं से अलग करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

एफ -12 मीडिया में संवर्धित एसएच-एसवाई 5 वाई कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए 10 μM रेटिनोइक एसिड के साथ विभेदित किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस (5% CO2) पर 2 घंटे के लिए 1 μM oAooomers के साथ इलाज कियागया था। उपचार के बाद, कोशिकाओं को कार्नोवस्की के फिक्सेटिव समाधान के साथ तय किया गया और फॉस्फो-पीएके 1 (टीएचआर 423)/पीएके 2 (टीएचआर 402) एंटीबॉडी और एफ-एक्टिन-बाइंडिंग फेलोइडिन के साथ डबल-इम्यूनोस्टेन्ड किया गया। बाद में, कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों को कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया गया था। टीएनटी को मैन्युअल गिनती द्वारा निर्धारित किया गया था और 3 डी वॉल्यूम व्यू छवियों का निर्माण करके और सबस्ट्रेटम को छूने के बिना दो कोशिकाओं के बीच मंडराने की उनकी विशेषता से संरचनाओं की पहचान करके अन्य न्यूराइट / सेल प्रोट्रूशियंस से अलग किया गया था (चित्रा 1)।

1. सेल संस्कृति और भेदभाव

  1. एफ 12 (हैम) मीडिया 1: 1 में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन-नियोमाइसिन मिश्रण (पीएसएन) के साथ एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोनल कोशिकाओं को कल्चर करें। कोशिकाओं को नीचे से जुड़े पकवान के केंद्र में # 1.5 कवरस्लिप से बने 14 मिमी अच्छी तरह से 14 मिमी इमेजिंग डिश में बीज दें। इमेजिंग डिश पर कोशिकाओं को 12,000 कोशिकाओं / सेमी2 की एकाग्रता पर बीज दें और 60% -70% कंफ्लुएंसी पर प्रयोग करें।
  2. आंशिक रूप से 100 एमएम स्टॉक समाधान से 10 μM रेटिनोइक एसिड (RA) के साथ कोशिकाओं को अलग करें (15 एमएल डाइमिथाइल सल्फोक्साइड [DMSO] में 5 मिलीग्राम आरए)। फिर, हर 2 दिनों में मीडिया परिवर्तन के साथ भेदभाव के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ2) पर 7 दिनों के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: कोशिकाओं (अविभाजित और आंशिक रूप से विभेदित कोशिकाओं दोनों) की संगतता (60% -70%) को बनाए रखने के बारे में सावधान रहें। सेल घनत्व कोशिकाओं के बीच टीएनटी के गठन को प्रभावित कर सकता है।

2. न्यूरोनल कोशिकाओं के इलाज के लिए एमिलॉयड-β1-42 (ओए) के ऑलिगोमर्स की तैयारी

  1. 1,1,1,3,3,3,3-हेक्साफ्लोरो-2-प्रोपेनोल के 200 μL में A1-42 (1 mg) घोलें और घोल को 20 एलिकोट में विभाजित करें, जिनमें से प्रत्येक में 0.05 मिलीग्राम पेप्टाइड्स होते हैं। लियोफिलाइज़ करें और बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट स्टोर करें।
  2. लियोफिलाइज्ड पेप्टाइड के 0.05 मिलीग्राम में डीएमएसओ के 2.2 μL को जोड़कर डीएमएसओ में लियोफिलाइज्ड ए1-42 का स्टॉक समाधान (5 एमएम) तैयार करें। पेप्टाइड्स को सावधानीपूर्वक भंग करने के लिए, घोल को भंवर करें और पानी के स्नान सोनिकेटर में 2 मिनट के लिए सोनिकेट करें।
  3. पेप्टाइड्स को मोनोमर्स में परिवर्तित करने के लिए डीएमईएम, पीएच 7.4 और भंवर में स्टॉक समाधान को 100 μM की एकाग्रता में पतला करें, इसके बाद 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन करें ताकि A3 1-42 (oA)12,21,22 के ऑलिगोमर्स प्राप्त किए जा सकें।
  4. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग द्वारा पहले21,22 की रिपोर्ट के अनुसार प्रयोगों से पहले ओए को चिह्नित करें।
  5. आंशिक रूप से विभेदित SH-SY5Y कोशिकाओं को 1 μM oA के साथ उपचारित करें। उपचार से पहले माध्यम को हटा दें, और ताजा एफबीएस-मुक्त डीएमईएम जोड़ें। मध्यम परिवर्तन के बाद, पहले से तैयार किए गए oA (100 μM) को माध्यम में 1 μM की अंतिम सांद्रता में जोड़ें। कोशिकाओं को 37 °C (5% CO2) पर 2 घंटे के लिए 1 μM oA के साथ इनक्यूबेट करें। अनुपचारित कोशिकाओं के रूप में एक नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें।

3. टीएनटी के लक्षण वर्णन के लिए एफ-एक्टिन और सक्रिय-पीएके 1 का इम्यूनोस्टेनिंग

  1. फॉस्फो-पीएके 1 (टीएचआर 423)/पीएके 2 (टीएचआर 402) एंटीबॉडी और एफ-एक्टिन-बाइंडिंग फेलोटॉक्सिन फेलोइडिन का उपयोग करके विभेदक इम्यूनोस्टेनिंग करें।
  2. निर्धारण से पहले 2 x 2 मिनट के लिए 1x फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ नियंत्रण और ओए-उपचारित कोशिकाओं को धोएं। 0.1 एम फॉस्फेट बफर, पीएच 7.2 में घुले 2% फॉर्मेलिन फिक्सेटिव और 2.5% ग्लूटारल्डिहाइड का उपयोग करके कार्नोव्स्की के फिक्सेटिव समाधान तैयार करें। फिर, कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए कार्नोवस्की के फिक्सेटिव समाधान (कोशिकाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त) जोड़कर इमेजिंग डिश में कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. इनक्यूबेशन बफर का उपयोग करके निश्चित कोशिकाओं को 2 x 2 मिनट धोएं। एफबीएस के 5 एमएल में 0.1 ग्राम सैपोनिन को घोलकर और 1x PBS के 95 mL जोड़कर 1x तक पतला करके इनक्यूबेशन बफर (20x) तैयार करें।
  4. निर्धारण के बाद, इनक्यूबेशन बफर में 1:250 के कमजोर पड़ने पर फोफो-पीएके 1 के खिलाफ पहला एंटीबॉडी जोड़ें और एक गहरे नम कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  5. अगले दिन, इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को इनक्यूबेशन बफर के साथ 2 x 2 मिनट धोएं; फिर, एलेक्सा फ्लूर 488 (1: 1,000 कमजोर पड़ने) और फेलोइडिन 555 (1: 1,000 कमजोर पड़ने) के लिए संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें। कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए गहरे नम कक्ष में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को इनक्यूबेशन बफर के साथ 2 x 2 मिनट धो लें। नाभिक को 1:2,000 कमजोर पड़ने में 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI) जोड़कर दाग दें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5 मिनट से 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. 90% ग्लिसरॉल और 10% 1x PBS में 25 मिलीग्राम DABCO का उपयोग करके DABCO माउंटिंग माध्यम तैयार करें। ठीक से घुलने के लिए, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ग्रेड का उपयोग करके पीएच को 8.6 में समायोजित करें, एचसीएल को पतला करें (पानी के साथ पतला 1:20) और मिश्रण के लिए घोल को एक रॉकर पर रखें।
  8. एंटी-ब्लीचिंग एजेंट के रूप में, डीएबीसीओ माउंटिंग माध्यम को सीधे इमेजिंग डिश पर जोड़ें जिसमें नीचे कवरस्लिप होता है। कम से कम 1-2 घंटे तक प्रतीक्षा करें और सीधे कॉन्फोकल इमेजिंग करने के लिए आगे बढ़ें।
    नोट: कवरलिप्स को ठीक करने के लिए कोई चिपकने वाला आवश्यक नहीं है।

4. न्यूराइट से टीएनटी को अलग करने के लिए एफ-एक्टिन और β-III ट्यूबुलिन का इम्यूनोस्टेनिंग

  1. β-III ट्यूबुलिन एंटीबॉडी और एफ-एक्टिन-बाइंडिंग फेलोटॉक्सिन फेलोइडिन के साथ विभेदक इम्यूनोस्टेनिंग करें।
  2. कार्नोवस्की के फिक्सेटिव समाधान को जोड़ने से पहले 1x PBS के साथ oA-उपचारित कोशिकाओं 2x को धोएं। कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और इनक्यूबेशन बफर के साथ कोशिकाओं को 2 x 2 मिनट धोएं।
  3. निर्धारण के बाद, इनक्यूबेशन बफर में 1:250 के कमजोर पड़ने पर β-III ट्यूबुलिन (टीयूबीबी 3) के खिलाफ एंटीबॉडी जोड़ें और अंधेरे नम कक्ष में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  4. अगले दिन, कोशिकाओं को इनक्यूबेशन बफर (2 x 2 मिनट) के साथ धोएं, और एलेक्सा फ्लूर 488 (1: 1,000 कमजोर पड़ने) और फेलोइडिन 555 (1: 1,000 कमजोर पड़ने) के साथ संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी को एक ही डिश में जोड़ें। फिर, गहरे नम कक्ष में कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. कोशिकाओं को इनक्यूबेशन बफर के साथ 2x धोएं, और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए 1: 2,000 कमजोर पड़ने में परमाणु-धुंधला DAPI जोड़ें।
  6. ऊपर बताए गए माध्यम में एंटी-ब्लीचिंग एजेंट डीएबीसीओ जोड़ें और इमेजिंग से पहले 2 घंटे तक प्रतीक्षा करें।

5. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग

  1. टीएनटी की पहचान करने के लिए, कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इम्यूनोस्टेन्ड कोशिकाओं की जेड-स्टैक छवियों को कैप्चर करें। DAPI, फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (FITC), और टेट्रामेथिलरहोडामाइन (TRITC) फिल्टर सेट के साथ 40x / 1.40 तेल DIC उद्देश्य का उपयोग करके छवियों को लें।
  2. सबसे पहले, कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर में विंडोज ट्रैक 1, ट्रैक 2 और ट्रैक 3 में क्रमिक रूप से आवश्यक लेजर पर क्लिक करके चैनलों का चयन करें। फ्लोरेसेंस चैनलों के साथ डिफरेंशियल इंटरफेरेंस कंट्रास्ट (डीआईसी) छवियों को लेने के लिए ट्रैक 1 विंडो के नीचे विकल्प टी-पीएमटी पर क्लिक करें।
    नोट: डीआईसी छवियों को टी-पीएमटी के रूप में लेबल किए गए एक अलग डिटेक्टर द्वारा कैप्चर किया जाता है।
  3. सॉफ़्टवेयर के अधिग्रहण टैब का चयन करें, Z-स्टैक टैब पर क्लिक करें, और विंडो खुलने की प्रतीक्षा करें। फिर, डिश के निचले भाग में कोशिकाओं को केंद्रित करने के लिए लाइव स्कैन पर क्लिक करें। पहले स्टैक के रूप में उस केंद्रित छवि का चयन करें। फिर, सेल के सबसे ऊपरी हिस्से को देखने के लिए ध्यान केंद्रित करें और इसे अंतिम स्टैक के रूप में चुनें। लाइव स्कैनिंग बंद करें और ढेर के चरण आकार को ठीक करने के लिए इष्टतम टैब के बगल में नंबर पर क्लिक करें। चरण आकार कोशिकाओं की मोटाई के आधार पर स्लाइस की संख्या और अंतराल निर्धारित करता है।
    नोट: पर्याप्त स्लाइस लेने के लिए न्यक्विस्ट नमूनाकरण के आधार पर चरण आकार का चयन किया जाएगा और यह सुनिश्चित किया जाएगा कि दो ढेर के बीच कोई अंतराल नहीं है। नायक्विस्ट नमूनाकरण उद्देश्य और रोशनी के तरंग दैर्ध्य के आधार पर निर्धारित कियाजाता है।
  4. DAPI, FITC और TRITC के तीन चैनलों की अनुक्रमिक छवियां 405 nm, 488 nm और 561 nm लेजर के साथ लें और 1.02 μ के पिक्सेल निवास समय के साथ कैप्चर करें। सेल सीमा का निरीक्षण करने के लिए प्रतिदीप्ति चैनल के साथ डीआईसी चैनल में छवियों को कैप्चर करें।
  5. x: 224.92 μm और y: 224.92 μm के आयामों के साथ छवियों का एक ढेर कैप्चर करें, जिसमें प्रत्येक पिक्सेल 220 nm2 आकार और 415 nm की z-स्केलिंग है।
  6. कोशिकाओं के नीचे से शीर्ष तक कई जेड-स्टैक्स (15-22 ढेर) को कैप्चर करने वाली छवियां लें। कुल ~ 200-300 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए संस्कृति डिश के यादृच्छिक क्षेत्र से कम से कम 10 छवियां प्राप्त करें।
  7. 3 डी वॉल्यूम दृश्य विश्लेषण द्वारा टीएनटी की पहचान करने के लिए ऑफ़लाइन कैप्चर की गई छवियों का विश्लेषण करें

6. टीएनटी की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों का विश्लेषण

  1. विश्लेषण के लिए Fiji सॉफ़्टवेयर में .czi डेटा स्वरूप में सहेजे गए confocal छवियों को खोलें।
  2. छवि के प्रत्येक z-स्टैक और चैनल को देखने के लिए हाइपरस्टैक विकल्प का चयन करें। जेड-स्टैक्स और चैनलों के हाइपरस्टैक्स की तलाश करें, जो चित्र 2 में दिखाए गए अनुसार एक ही विंडो में खुलते हैं। रुचि के एक विशेष चैनल के सटीक स्टैक का चयन करने के लिए चैनल (लाल और हरे तीर द्वारा इंगित) और जेड-स्टैक (नीले तीर द्वारा इंगित) स्क्रॉल बार स्क्रॉल करें।
    नोट: निश्चित कोशिकाओं में, चूंकि मंडराने वाले टीएनटी या झिल्ली नाली सतह से ऊपर रहते हैं, संरचनाएं जेड-स्टैक्स के निचले हिस्सों में दिखाई नहीं देती हैं। हालांकि, निश्चित कोशिकाओं में, न्यूरॉइट्स सतह पर स्थित होते हैं और जेड-स्टैक्स (जेड = 0 से 2) के निचले हिस्सों में पता लगाने योग्य होते हैं। पहचान चरणों के लिए चित्र 2 देखें।
  3. जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, चैनल बार को स्क्रॉल करके पहले एफ-एक्टिन-सना चैनल (लाल तीर द्वारा इंगित) का चयन करें। फिर, प्रत्येक स्टैक को एक-एक करके देखने के लिए जेड-स्टैक्स (नीले तीर द्वारा इंगित) को मैन्युअल रूप से स्क्रॉल करें। एफ-एक्टिन-दाग वाली संरचनाओं की पहचान करें जो कोशिकाओं को जोड़ने वाली प्रतीत होती हैं, जेड-स्टैक्स के निचले हिस्सों में दिखाई देती हैं, और न्यूराइट (सफेद तीर द्वारा इंगित) के रूप में इमेजिंग डिश (जेड = 2) की सतह के करीब होती हैं।
    नोट: अधिकांश न्यूरॉइट्स की पहचान करना आसान है क्योंकि वे विस्तारित प्रोट्रूशियंस (गुलाबी तीर द्वारा इंगित) के रूप में दिखाई देते हैं।
  4. टीएनटी, एफ-एक्टिन-पॉजिटिव, मंडराते सेल-टू-सेल नाली को पहचानें, जेड-स्टैक को शीर्ष की ओर स्क्रॉल करके (चित्रा 2 में जेड = 4 से; पीले तीरों द्वारा इंगित)। सतह की ओर जेड-स्टैक्स के निचले हिस्सों के पास न्यूरॉइट्स की तलाश करें और देखें कि वे शीर्ष की ओर जेड-स्टैक्स के स्क्रॉलिंग के साथ गायब होने लगते हैं (चित्रा 2 में जेड = 6 पर; न्यूराइट स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं देते हैं)।
  5. जेड-स्टैक्स से नाली की होवरिंग प्रकृति का विश्लेषण करके एफ-एक्टिन-पॉजिटिव टीएनटी के समान फॉस्फो-पीएके 1-पॉजिटिव टीएनटी की पहचान करें। चूंकि फॉस्फो-पीएके 1 धुंधला एफ-एक्टिन धुंधला होने की तुलना में कमजोर है, इसलिए z = 4 (बेहोश रूप से दिखाई देने वाला) और z = 6 (प्रमुख) पर फोफो-पीएके 1-दाग वाले टीएनटी की तलाश करें।
  6. इसके अलावा, यह सत्यापित करने के लिए डीआईसी छवियों का निरीक्षण करें कि एफ-एक्टिन- और फॉस्फो-पीएके 1-सना हुआ टीएनटी संरचनाएं कोशिकाओं के बीच झिल्ली नाली हैं (चित्रा 3)। इसके अलावा, एफ-एक्टिन (लाल) और फॉस्फो-पीएके 1 (हरे) चैनलों को विलय करें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि पहचाने गए टीएनटी एफ-एक्टिन और फॉस्फो-पीएके 1 सह-दाग वाली संरचनाएं हैं (चित्रा 3)।
  7. टीएनटी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, कुल सेल संख्याओं और पहचाने गए टीएनटी को मैन्युअल रूप से गिनें और प्रतिशत के रूप में संख्याओं का प्रतिनिधित्व करें।
  8. एफ-एक्टिन-पॉजिटिव टीएनटी और β-III ट्यूबुलिन (टीयूबीबी 3) -पॉजिटिव, टीएनटी जैसी होवरिंग नाली को जेड-स्टैक छवियों से अलग करने के लिए, एफ-एक्टिन (लाल) और टीयूबीबी 3 (हरे) चैनलों को विलय करें (चित्रा 4)। फिर, विलय की गई छवियों के जेड-स्टैक का विश्लेषण करें।
    1. विशेष रूप से एफ-एक्टिन-दाग वाले टीएनटी की तलाश करें जो z = 3 पर बेहोश दिखाई देते हैं और z = 6 और z = 9 (पीले तीर) पर प्रमुख होते हैं। इसी तरह, एफ-एक्टिन और β-III ट्यूबुलिन (टीयूबीबी 3) डबल-पॉजिटिव, टीएनटी जैसी होवरिंग नाली को जेड = 6 और जेड = 9 (सियान तीर) पर पहचानें। जेड-स्टैक्स (सफेद तीर) के निचले हिस्सों से अन्य एफ-एक्टिन- और β-III ट्यूबुलिन-दाग वाले, गैर-होवरिंग प्रोट्रूशियंस की पहचान करें।
  9. फिजी में लाइन टूल का उपयोग करके टीएनटी के व्यास को मापें। विश्लेषण करें क्लिक करके माप के पैमाने की जाँच करें | स्केल सेट करें ताकि "पिक्सेल में दूरी" .czi छवियों से स्वचालित रूप से सेट हो जाए। xy-प्लेन पर TNT के व्यास को मापें।
    नोट: अधिकांश व्यास 1 पिक्सेल और 4 पिक्सेल (यानी, 220-880 एनएम) के बीच हैं; प्रत्येक पिक्सेल 220 एनएम है। जेड-स्टैक कॉन्फोकल छवियों के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल के सारांश के लिए चित्रा 5 देखें।

7.3D टीएनटी को चिह्नित करने के लिए जेड-स्टैक छवियों का पुनर्निर्माण

  1. फिजी में वॉल्यूम व्यूअर प्लगइन का उपयोग करें, जो 3 डी रीस्लाइंग और थ्रेशोल्ड-सक्षम 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन (चित्रा 6) की अनुमति देता है।
  2. जेड-स्टैक छवियों को अलग-अलग चैनलों में विभाजित करें। फिर, एक समय में एक या दो टीएनटी या न्यूरॉइट्स को हाइलाइट करने के लिए 3 डी पुनर्निर्माण दृश्य का उपयोग करने के लिए एकल-चैनल (एफ-एक्टिन चैनल) जेड-स्टैक छवियों को क्रॉप करें। xy, yz, और xz दृश्यों की कल्पना करने के लिए वॉल्यूम दृश्य प्लगइन सक्षम करें।
  3. xy विमान में एक एकल TNT या न्यूराइट पिन करें (सफेद तीर चित्र 6A में न्यूराइट का प्रतिनिधित्व करते हैं; पीले तीर चित्र 6B में TNTs का प्रतिनिधित्व करते हैं) और xz (लाल) और yz (हरे) अक्ष क्रॉस-सेक्शन को चिह्नित करते हैं। xz और yz विमानों (सफेद तीर, चित्रा 6A) में xz विमान के तल पर न्यूरॉइट्स और ऊपरी z-स्टैक्स (पीले तीर, चित्रा 6B) में TNTs का निरीक्षण करें।
  4. xz-प्लेन (चित्रा 6C, D) में 3D वॉल्यूम दृश्य के पुनर्निर्माण के लिए अलग-अलग TNT या न्यूराइट का चयन करें। 3 डी पुनर्निर्माण में, जेड-प्लेन (सफेद तीर, चित्रा 6 सी) के तल पर न्यूरॉइट्स का निरीक्षण करें और टीएनटी नीचे जेड-प्लेन (पीले तीर, चित्रा 6 डी) को छूने के बिना दो कोशिकाओं को जोड़ने वाली होवरिंग संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं।

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Representative Results

यहां, हम कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों (चित्रा 1) से 3 डी वॉल्यूम दृश्यों का निर्माण करके एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोनल कोशिकाओं में ओए-प्रेरित टीएनटी की पहचान और विशेषता करते हैं। कोशिकाओं को एफ-एक्टिन और फॉस्फो-पीएके 1 के साथ डबल-इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था। टीएनटी की पहचान करने के लिए इम्यूनोस्टेन्ड कोशिकाओं की कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों का विश्लेषण किया गया (चित्रा 2)। इसके अलावा, डीआईसी छवियों का विश्लेषण यह सत्यापित करने के लिए किया गया था कि एफ-एक्टिन- और फॉस्फो-पीएके 1-सना हुआ टीएनटी संरचनाएं कोशिकाओं के बीच झिल्ली नाली थीं (चित्रा 3)। इसके अलावा, कोशिकाओं को एफ-एक्टिन और β-III ट्यूबुलिन (चित्रा 4) के साथ डबल-इम्यूनोस्टेन्ड किया गया था। टीएनटी जैसे एफ-एक्टिन और β-III ट्यूबुलिन डबल-पॉजिटिव झिल्ली नाली को केवल एफ-एक्टिन-पॉजिटिव टीएनटी (चित्रा 4) से अलग किया गया था। फॉस्फो-पीएके 1 (या सक्रिय पीएके 1) और एफ-एक्टिन के साथ सह-व्यक्त टीएनटी को अन्य न्यूराइट्स / सेल प्रोट्रूशियंस से अलग किया गया था, जो कि सबस्ट्रेटम को छूने के बिना दो कोशिकाओं के बीच मंडराने की उनकी विशेषता के आधार पर 3 डी वॉल्यूम व्यू छवियों का निर्माण करके किया गया था (चित्रा 6)। पहचाने गए टीएनटी को मैन्युअल रूप से देखा गया था, और टीएनटी के प्रतिशत की गणना 3 डी वॉल्यूम व्यू छवियों से सटीक रूप से की गई थी। टीएनटी का व्यास और लंबाई भी व्यक्तिगत रूप से पहचाने गए टीएनटी का विश्लेषण करके निर्धारित की गई थी।

Figure 1
चित्रा 1: टीएनटी की पहचान विधि के प्रोटोकॉल सारांश का प्रतिनिधित्व करने वाला योजनाबद्ध आरेख। माइक्रोस्कोपी छवियों (शीर्ष) के लिए स्केल बार = 100 μm; 10 μm (3D वॉल्यूम दृश्य). संक्षिप्तरूप: ओए = ऑलिगोमेरिक एमिलॉयड-β1-42; पीएके 1 = पी 21-सक्रिय किनेज -1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: टीएनटी की पहचान और मात्रा निर्धारित करने के लिए कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों का विश्लेषण। फिजी सॉफ्टवेयर में कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों का विश्लेषण किया गया था। जेड-स्टैक्स और चैनलों के हाइपरस्टैक्स एक एकल विंडो में खोले गए जो (ए) एफ-एक्टिन और (बी) फॉस्फो-पीएके 1 दिखाते हैं। चैनल (लाल और हरे तीर द्वारा इंगित) और जेड-स्टैक (नीले तीर द्वारा इंगित) स्क्रॉल सलाखों को स्क्रॉल करके, रुचि के एक विशेष चैनल के व्यक्तिगत ढेर का विश्लेषण किया गया था। (ए) कोशिकाओं को जोड़ने वाली एफ-एक्टिन-दाग वाली संरचनाएं, जेड-स्टैक्स के निचले हिस्सों में दिखाई देती हैं, और छवि डिश (जेड = 2) की सतह के करीब मानी जाती हैं, को न्यूराइट (सफेद तीर द्वारा इंगित) के रूप में पहचाना गया था। इसके विपरीत, जेड-स्टैक के उच्च भागों में दिखाई देने वाले सेल-टू-सेल-कनेक्टेड नाली को टीएनटी (पीले तीर द्वारा इंगित) के रूप में पहचाना गया था। (ख) इसी प्रकार, फॉस्फो-पीएके1-दागयुक्त न्यूरॉइट्स और टीएनटी की पहचान की गई थी। अन्य एफ-एक्टिन-पॉजिटिव शॉर्ट प्रोट्रूशियंस जो पड़ोसी कोशिकाओं से जुड़े नहीं हैं, उन्हें गुलाबी तीर द्वारा इंगित किया जाता है। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षेप: टीएनटी = टनलिंग नैनोट्यूब; पीएके 1 = पी 21-सक्रिय किनेज -1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: टीएनटी की पुष्टि करने के लिए डीआईसी छवियों का विश्लेषण। (ए) डीआईसी छवियों को यह सत्यापित करने के लिए देखा गया था कि एफ-एक्टिन- और फॉस्फो-पीएके 1-सना हुआ टीएनटी और न्यूराइट प्रोट्रूशियंस वास्तव में झिल्ली नाली थे। (ख) इसके अतिरिक्त, एफ-एक्टिन (लाल) और फॉस्फो-पीएके1 (हरा) चैनलों को यह सत्यापित करने के लिए मिला दिया गया था कि पहचाने गए, ओए-प्रेरित टीएनटी एफ-एक्टिन और फॉस्फो-पीएके1 सह-दाग वाली संरचनाएं थीं। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षेप: टीएनटी = टनलिंग नैनोट्यूब; डीआईसी = अंतर हस्तक्षेप विपरीत; पीएके 1 = पी 21-सक्रिय किनेज -1। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: कॉन्फोकल जेड-स्टैक छवियों का विश्लेषण फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया गया ताकि केवल एफ-एक्टिन-दाग वाले टीएनटी को β-III ट्यूबुलिन और एफ-एक्टिन डबल-दाग वाले, टीएनटी जैसी होवरिंग नाली से अलग किया जा सके। सबसे पहले, हाइपरस्टैक्स के एफ-एक्टिन (लाल) और टीयूबीबी 3 (हरे) चैनलों का विलय कर दिया गया था। फिर, विलय की गई छवियों को एक ही विंडो में खोला गया था। जेड-स्टैक स्क्रॉल बार को स्क्रॉल करके, एफ-एक्टिन-दाग वाले टीएनटी को विशेष रूप से पहचाना गया था; ये z = 3 पर और z = 6 और z = 9 (पीले तीर, B) पर प्रमुख रूप से दिखाई दे रहे थे। इसी तरह, एफ-एक्टिन और टीयूबीबी 3 डबल-पॉजिटिव, टीएनटी जैसी होवरिंग नाली जेड = 6 और जेड = 9 (सियान तीर, ए) पर पता लगाने योग्य थी। अन्य एफ-एक्टिन- और β-III ट्यूबुलिन-दाग वाले, गैर-होवरिंग प्रोट्रूशियंस की पहचान जेड-स्टैक्स (सफेद तीर) के निचले हिस्सों से की गई थी। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षेप: टीएनटी = टनलिंग नैनोट्यूब; TUBB3 = β-III ट्यूबुलिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: जेड-स्टैक कॉन्फोकल छवियों के विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करने वाला योजनाबद्ध सारांश। संक्षिप्त नाम: टीएनटी = टनलिंग नैनोट्यूब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एक समय में एक या दो टीएनटी या न्यूरॉइट्स को उजागर करने के लिए 3 डी पुनर्निर्माण दृश्य। फिजी में "वॉल्यूम व्यू" प्लगइन का उपयोग xy, yz और xz दृश्यों की कल्पना करने के लिए किया जाता है। 3 डी पुनर्निर्माण जेड-प्लेन (पैनल ए और सी में सफेद तीर) के निचले हिस्से में न्यूराइट को दर्शाता है, जबकि टीएनटी मंडराती संरचनाओं के रूप में दिखाई देते हैं जो नीचे जेड-प्लेन (पैनल बी और डी में पीला तीर) को छूने के बिना दो कोशिकाओं को जोड़ते हैं। स्केल सलाखों = 10 μm. संक्षिप्त नाम: टीएनटी = टनलिंग नैनोट्यूब। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

पिछले 2 दशकों में कई शोधकर्ता टीएनटी18 की संरचना को समझने और चिह्नित करने की कोशिश कर रहे हैं। विशिष्ट मार्करों की कमी प्रगति में बाधा डालती है, और एक सुविधाजनक, मानकीकृत विधि की बढ़ती मांग है जिसका उपयोग टीएनटी की पहचान, विशेषता और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। टीएनटी को एफ-एक्टिन-आधारित झिल्ली नाली के रूप में परिभाषित किया जाता है जो दो कोशिकाओं के बीच मंडराते हैं। अध्ययनों से पता चला है कि β-ट्यूबुलिन-पॉजिटिव, क्लोज-एंडेड, विकासशील न्यूराइट दो दूर की कोशिकाओं के बीच मंडराते हैं और टीएनटी जैसी संरचनाओं12,13 से मिलते जुलते हैं। इसलिए, टीएनटी को केवल एक्टिन के लिए उनकी सकारात्मकता के आधार पर न्यूरॉइट्स और अन्य टीएनटी जैसी संरचनाओं से पहचाना और अलग किया जाता है और दो दूर की कोशिकाओं के बीच मंडराने वाली झिल्ली नाली होती है। शोधकर्ताओं को अक्सर इमेजिंग 24 से पहले निर्धारण के दौरान बरकरार टीएनटी संरचनाओं को प्राप्त करना चुनौतीपूर्णलगता है। इस समस्या को दूर करने के लिए, हमने इस प्रोटोकॉल 25 में उपयोग किए जाने वाले एसएच-एसवाई 5 वाई न्यूरोनल कोशिकाओं को ठीक करने के लिए2.5% ग्लूटारल्डिहाइड (कार्नोव्स्की के फिक्सेटिव) के साथ एक संशोधित फिक्सेटिव समाधान का उपयोग किया।

इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रयोग का एक महत्वपूर्ण कदम नमूने का निर्धारण है, जो उपयुक्त फिक्सेटिव एजेंट के चयन पर निर्भर करता है। नमूने के अपूर्ण निर्धारण से लक्ष्य प्रोटीन का तेजी से प्रोटियोलिटिक क्षरण हो सकता है और विशिष्ट विकृति में कमी आ सकती है। ओवरफिक्सेशन एपिटोप के मास्किंग और गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि के कारण विशिष्ट लेबलिंग में अनिश्चितता का कारण बनता है। विधि, समय या अवधि, तापमान और पीएच भी कोशिकाओं के उचित निर्धारण को प्रभावित करतेहैं।

पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग बड़े पैमाने पर कोशिकाओं के इम्यूनोस्टेनिंग में एक फिक्सेटिव एजेंट के रूप में किया जाता है। एक फिक्सेटिव एजेंट के रूप में पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करने के नुकसान में एंटीजेनेसिटी का नुकसान और आकृति विज्ञान में परिवर्तन शामिल हैं। ग्लूटारल्डिहाइड में कम आसमाटिक दबाव होता है, समाधान में अधिक स्थिर होता है, और आसानी से क्रॉसलिंक होता है, इस प्रकार बेहतर परिणामदेता है। फॉर्मलाडेहाइड-ग्लूटारल्डिहाइड (फॉस्फेट बफर में) फिक्सेटिव के संयोजन से ऊतक / सेल नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला का असाधारण निर्धारण होता है। यह संयोजन फॉर्मलाडेहाइड द्वारा सेल की अल्ट्रास्ट्रक्चर के तेजी से स्थिरीकरण को सक्षम बनाता है, इसके बाद ग्लूटारल्डिहाइड28 की धीमी मर्मज्ञ कार्रवाई द्वारा एक स्थायी निर्धारण होता है।

टीएनटी जो एफ-एक्टिन और फॉस्फो-पीएके 1 के लिए सकारात्मक हैं, उन्हें एक फ्लैट सबस्ट्रेटम पर इन विट्रो 2 डी सेल कल्चर में दो कोशिकाओं के बीच मंडराने की उनकी विशेषता के आधार पर न्यूरॉइट्स से अलग किया जाता है। पहचाने गए टीएनटी को मैन्युअल रूप से 3 डी वॉल्यूम व्यू विश्लेषण के साथ देखा गया था, और गठित टीएनटी के प्रतिशत की गणना मैन्युअल गिनती द्वारा की गई थी। मैनुअल विधि बड़ी मात्रा में डेटा की मात्रा का परिमाणीकरण मुश्किल बनाती है क्योंकिइसके लिए अत्यधिक जनशक्ति की आवश्यकता होती है। हालांकि, प्रशिक्षित आंखें टीएनटी को कुशलता से देख सकती हैं और उन्हें स्वचालित पहचान विधियों की तुलना में बेहतर परिशुद्धता के साथ न्यूराइट से अलग कर सकती हैं। मौजूदा स्वचालित पहचान विधियों को एक एल्गोरिथ्म विकसित करने और / या प्रयोगात्मक सेटअप के लिए आवश्यक मौजूदा एल्गोरिदम को बदलने के लिए उपलब्ध विशेषज्ञता के बिना हर प्रयोगशाला में लागू करना भी मुश्किल है। मैनुअल 3 डी वॉल्यूम व्यू विश्लेषण विधि जेड-स्टैक्स के निचले हिस्सों में कोशिकाओं के बीच पड़ी झिल्ली संरचनाओं और जेड-स्टैक्स के मध्य और उच्च भागों में मंडराने वाली झिल्ली संरचनाओं की पहचान करना आसान बनाती है ताकि न्यूराइट और टीएनटी के बीच स्पष्ट रूप से अंतर किया जा सके।

टीएनटी को अन्य झिल्ली प्रोट्रूशियंस जैसे न्यूराइट या ट्यूमर माइक्रोट्यूब से अलग किया जा सकता है। हालांकि, ओपन-एंडेड और क्लोज-एंडेड, नैनो-आकार, व्यास-झिल्ली ट्यूबों के बीच अंतर करना मुश्किल है, जो निम्नलिखित प्रश्न उठाता है: क्या वे टीएनटी या टीएनटी जैसी संरचनाएं हैं? पिछले दशक से, पैथोलॉजी, कैंसर प्रतिरोध और चिकित्सा17 के प्रसार में टीएनटी की अपरिहार्य भूमिका को दिखाने के लिए भारी मात्रा में डेटा जमा किया गया है। इसलिए, शोधकर्ता विशिष्ट निर्माताओं के विकास की तलाश कर रहे हैं जो प्रत्यक्ष, लंबी दूरी के अंतरकोशिकीय संचार के क्षेत्र को बदल देंगे। तब तक, लक्षण वर्णन के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग तरीके क्षेत्र में निरंतर प्रगति के लिए मार्ग प्रशस्त करने के लिए उच्च मांग में हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

डीकेवी और एआर टीएमए पाई फैलोशिप के लिए मणिपाल एकेडमी ऑफ हायर एजुकेशन को धन्यवाद देते हैं। हम एसईआरबी-एसआरजी (#SRG/2021/001315) के लिए भारतीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड के साथ-साथ भारतीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद (#5/4-5/तदर्थ/न्यूरो/216/2020-एनसीडी-1) और मणिपाल एकेडमी ऑफ हायर एजुकेशन, मणिपाल, भारत के इंट्राम्यूरल फंड को धन्यवाद देते हैं। हम जेएनसीएएसआर (जवाहरलाल नेहरू सेंटर फॉर एडवांस्ड साइंटिफिक रिसर्च, इंडिया) की कॉन्फोकल फैसिलिटी और बी. सुमा को जेएनसीएएसआर में कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip Cellvis D35-14-1.5-N Imaging dish used to seed cells for staining experiments
Aβ (1-42) 1 mg AnaSpec #64129 Oligomers of amyloid beta to treat the cells
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen A11070 Secondary antibody for phospho-PAK1
Biological Safety Cabinet Thermo Scientific (MSC Advantage) 51025411 Provide aspetic conditions duirng cell culture
CO2 Incubator Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) 51026556 For growing cells at or near body temperature
Confocal Laser Scanning Microscope ZEISS (Carl Zeiss) LSM 880 Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] Merck 8034560100 Anti-bleaching reagent
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Sigma D9542-1MG Neuclear stainer
DMEM media Gibco 11965092 Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42)
 DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) Gibco 12500062 Culture media for SH-SY5Y
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade Cryopur CP-100 Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade Himedia MB058 Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42)
Fetal Bovine Serum Gibco 16000044  Major supplement for Culture media (US origin)
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) Sigma Aldrich HT5014-120ML Component in the Karnovsky's fixative solution
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) Sigma G5882 Component in the Karnovsky's fixative solution
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution TCI H024 Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) National Institute of Health (NIH) Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer".
Lyophilizer Christ, Alpha 2.4 LDplus 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture Thermo fisher Scientific 15640055 Antibiotic mixture
Phalloidin-iFlor 555 Abcam ab176756 F-actin binding stain
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] CST #2601 Primary antibody
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) Cloud clone PAE711Hu01 Primary antibody
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-50MG Differentiating reagent
Saponin Merck 8047-15-2 Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) Ultrasonic Cleaner 3.0 L/3.2 Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42)
ZEN Microscopy software ZEISS (Carl Zeiss) Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation

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References

  1. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  2. Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
  3. Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
  4. Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson's disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
  5. Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
  6. Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
  7. Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
  8. Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
  9. Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
  10. Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
  11. Zurzolo, C. Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity. Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).
  12. Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
  13. Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
  14. Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
  15. Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
  16. Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
  17. Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
  18. Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
  19. Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
  20. Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
  21. Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
  22. Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
  23. Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer. New York, NH. 59-79 (2006).
  24. Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
  25. Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
  26. Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
  27. Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
  28. Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).

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Valappil, D. K., Raghavan, A., Nath, … More

Valappil, D. K., Raghavan, A., Nath, S. Detection and Quantification of Tunneling Nanotubes Using 3D Volume View Images. J. Vis. Exp. (186), e63992, doi:10.3791/63992 (2022).

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