Summary
터널링 나노 튜브 (TNT)는 주로 인접한 세포를 연결하여 세포 간 통신을 촉진하는 개방형 F- 액틴 막 나노 튜브입니다. TNT를 다른 세포 돌출부와 구별하는 주목할만한 특징은 세포 사이의 나노 튜브의 호버링 특성입니다. 여기에서는 컨포칼 z-스택 이미지의 3D 볼륨 뷰를 구성하여 TNT의 특성을 분석합니다.
Abstract
최근의 발견에 따르면 세포는 나노 크기의 액틴-막 도관, 즉 "터널링 나노 튜브"(TNT)를 통해 직접적이고 장거리 세포 간 전달을 수행합니다. TNT는 50nm에서 1μm 사이의 직경을 가진 이웃 세포 사이의 연속성을 매개하는 개방형 지질 이중층으로 둘러싸인 막 확장으로 정의됩니다. TNT는 처음에는 신경 세포에서 입증되었지만 연속적인 연구에서 신경 퇴행성 질환, 바이러스 감염 및 암과 같은 여러 세포 유형 및 질병에서 TNT의 존재가 밝혀졌습니다. 여러 연구에서 이웃 세포 사이의 폐쇄형, 전기 결합 막 나노 구조를 TNT 또는 TNT 유사 구조로 언급했습니다.
종말점에서의 막 연속성 측면에서 미세 구조의 해명은 기술적으로 어렵습니다. 또한, 세포-세포 통신에 대한 연구는 특정 마커가 없기 때문에 종래의 방법을 사용한 TNT의 특성 분석 측면에서 도전적이다. TNT는 주로 F- 액틴 기반의 개방형 막 돌출부로 정의됩니다. 그러나 한 가지 주요 한계는 F- 액틴이 모든 유형의 돌출부에 존재하여 TNT를 다른 돌출부와 구별하기가 어렵다는 것입니다. F- 액틴 기반 TNT의 주목할만한 특징 중 하나는 이러한 구조가 지층을 건드리지 않고 두 세포 사이를 맴돌고 있다는 것입니다. 따라서, 별개의 F- 액틴 염색 TNT는 세포 사이의 호버링에 기초하여 필로 포디아 및 신경 돌기와 같은 다른 돌출부와 편리하게 구별 될 수있다.
우리는 최근 액틴 의존성 엔도 사이토 시스를 통한 올리고머 아밀로이드 -β1-42 (oAβ)의 내재화가 활성화 된 p21- 활성화 키나아제 -1 (PAK1)을 자극하여 SH-SY5Y 신경 세포 사이에서 phospho-PAK1과 공동 발현되는 F- 액틴 함유 TNT의 형성을 매개한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 oAβ 처리된 신경 세포에서 F-액틴 및 포스포-PAK1-면역염색 막 돌출부의 캡처된 z-스택 이미지에서 TNT를 식별하고 특성화하기 위한 3D 부피 분석 방법을 설명합니다. 또한, TNT는 F- 액틴 - 및 β -III 튜 불린 - 면역 염색 막 도관을 기반으로 한 신경 돌기 및 신경 세포 파생물을 개발하는 것과 구별된다.
Introduction
터널링 나노 튜브 (TNT)는 F- 액틴 기반의 주로 개방형 막 도관이며화물 및 세포 기관의 세포 간 이동에 중요한 역할을합니다1. TNT의 독특한 특징은 지층과의 접촉없이 이웃 세포를 연결한다는 것입니다. 길이는 10-300 μm 이상이며 직경은 50 nm에서 1 μm 2,3 사이입니다. TNT는 일시적인 구조이며 수명은 몇 분에서 몇 시간 사이입니다. TNT는 PC12 뉴런 세포1에서 처음 입증되었습니다. 나중에 수많은 연구에서 시험관 내 및 생체 내여러 세포 유형에서 존재하는 것으로 나타났습니다 4,5. 여러 연구에서 신경 퇴행성 질환, 암 및 바이러스 감염 6,7,8과 같은 다양한 질병 모델에서 TNT의 병리학 적 중요성이 밝혀졌습니다.
TNT의 구조적 이질성은 다양한 세포 시스템에서 여러 연구에 의해 입증되었습니다9. 차이점은 세포 골격 구성, 형성 메커니즘 및 이송 된화물 유형을 기반으로합니다10. 주로, 두 개의 인접한 세포 사이를 맴돌고 세포 기관을 전달하는 개방형 F- 액틴 양성 막 연속성은 TNT11로 구성된 것으로 간주됩니다. 그러나 TNT 형성에서 관찰되는 명확성 또는 다양성의 부족은 TNT 특이 적 마커를 개발하는 데 어려움을 더합니다. 따라서, 종래의 검출 방법에 의해 TNT 구조를 동정하고, 개방형 및 폐쇄 단부 돌출부(12)의 관점에서 막 나노튜브를 구별하는 것은 어렵다. 그러나, 두 세포 사이의 F-액틴 막 돌출부로서 호버링하는 TNTs의 특성은 종래의 이미징 기술을 사용하여 식별하기가 상대적으로 쉽고 실현 가능하다. 필로포디아 및 등쪽 필로포디아와 같은 다른 액틴 기반 세포 돌출부는 특히 세포가 고정된 경우 멀리 있는 두 세포 사이를 맴돌 수 없습니다. 참고로, 폐쇄되고 전기적으로 결합되어 발달하는 신경돌기는 종종 TNT 유사 구조(13)라고 불립니다.
F- 액틴은 TNT 형성에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 여러 연구에서 F- 액틴 억제제 사이토 칼라 신 D가 TNT14,15의 형성을 억제한다는 것이 밝혀졌습니다. 대조적으로, 미세소관의 억제제는 TNT 형성16에 어떠한 영향도 미치지 않는다. 지난 2 년 동안 TNT가 병리학 및 종양 내성 및 치료의 확산에서 중요한 역할을한다는 여러 보고서가있었습니다17. 따라서 TNT 특성화를 위한 더 나은 기술에 대한 끝없는 요구가 있습니다.
TNT의 특정 마커가 부족하고 형태 및 세포 골격 구성의 다양성으로 인해 고유 한 특성 분석 방법을 개발하기가 어렵습니다. 일부 연구는 자동 이미지 검출 및 TNT 정량화 기술을 사용했습니다18,19. 그러나, TNT의 검출 및 정량화를 위한 자동 이미지 분석에 비해 현재의 3D 부피 수동 분석 방법의 몇 가지 장점이 있다. 종종 훈련된 인간의 눈은 자동화된 이미지 감지 방법보다 이러한 호버링 나노 구조를 더 쉽게 발견할 수 있습니다. 또한 자동 검출 방법은 알고리즘 전문 지식이 부족한 실험실에서 구현하기 어려울 수 있습니다. 현재의 방법은 정밀도와 재현성으로 인해 연구자들에 의해 널리 채택 될 수 있습니다.
최근 연구에서 우리는 oAβ가 PAK1 매개 액틴 의존성 엔도 사이토 시스 메커니즘을 통해 신경 세포에서 TNT의 생물 발생을 촉진한다는 것을 보여주었습니다12. oAβ-유도 TNT는 또한 활성화된 PAK1 (또는 포스포-PAK1)을 발현한다. 우리는 oAβ 유도, F- 액틴 및 포스 포 -PAK1- 면역 염색 TNT를 구별하기 위해 3D 부피보기 이미지 재구성 방법을 개발했습니다. β-III 튜 불린 양성, 발달 신경돌기는 종종 TNT와 같은 호버링 구조와 유사합니다20. 따라서 우리는 F- 액틴 기반 TNT를 β-III 튜 불린 양성 신경 돌기 및 기타 TNT 유사 돌출부와 구별했습니다. 3D 볼륨 뷰 이미지는 지층 위로 마우스를 가져가고 인접한 두 셀 사이에 연결된 상태를 유지하는 특성을 기반으로 TNT를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 백서에서는 컨포칼 z-스택 이미지를 사용하여 액틴 함유 막 도관 또는 TNT를 식별 및 검출하고, 마지막으로 3D 볼륨 뷰 재구성 이미지에서 식별된 구조를 수동으로 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 제시된 방법은 개방형 적절한 TNT와 폐쇄형 TNT 유사 구조를 구별할 수 없습니다. 이 방법은 평평한 지층에서 시험 관 내 2D 세포 배양에서 TNT를 식별하는 데 도움이 됩니다. 그러나 이 방법은 구현 및 재현이 용이하며 액틴계 TNT만을 정밀하게 정량하고 신경돌기 및 β튜불린 양성 TNT 유사 구조와 구별하는 데 널리 사용될 수 있습니다.
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Protocol
참고: DMEM/F-12 배지에서 배양된 SH-SY5Y 세포를 7일 동안 10μM 레티노산으로 분화시키고 37°C(5%CO2)에서 2시간 동안 1μM oAβ 올리고머로 처리했습니다. 처리 후, 세포를 카르노프스키의 고정 용액으로 고정하고, 포스포-PAK1 (Thr423)/PAK2 (Thr402) 항체 및 F-액틴-결합 팔로이딘으로 이중 면역염색하였다. 나중에 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 컨포칼 z-스택 이미지를 촬영했습니다. TNT는 수동 계수로 정량화되었으며 3D 볼륨 뷰 이미지를 구성하고 지층을 건드리지 않고 두 세포 사이를 호버링하는 특성에서 구조를 식별하여 다른 신경돌기/세포 돌출부와 구별되었습니다(그림 1).
1. 세포 배양 및 분화
- SH-SY5Y 뉴런 세포를 DMEM/F12(Ham's) 배지에서 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신-네오마이신 혼합물(PSN)로 1:1로 배양합니다. 바닥에 부착된 접시 중앙에 #14 커버슬립으로 구성된 1.5mm 웰이 있는 35mm 이미징 접시에 세포를 파종합니다. 이미징 접시에 세포를 12,000 cells/cm2 의 농도로 시드하고 60%-70% 컨플루언시에서 실험을 수행합니다.
- 세포를 100 mM 스톡 용액(15 mL의 디메틸설폭사이드[DMSO] 중 5 mg의 RA)으로부터 10 μM 레티노산(RA)으로 부분적으로 분화시킨다. 이어서, 배지 교체와 함께 분화를 위해 37°C(5%CO2)에서 7일 동안 세포를 배양하여 2일마다 배양한다.
참고: 세포(미분화 세포 및 부분적으로 분화된 세포 모두)의 컨플루언시(60%-70%)를 유지하는 데 주의하십시오. 세포 밀도는 세포 사이의 TNT 형성에 영향을 줄 수 있습니다.
2. 신경세포 치료를 위한 아밀로이드-β1-42 (oAβ)의 올리고머 제조
- Aβ 1-42 (1 mg)를 1,1,1,3,3,3- 헥사 플루오로 -2- 프로판올 200 μL에 용해시키고 용액을 각각 0.05 mg의 펩티드를 함유하는 20 개의 분취량으로 나눕니다. 나중에 사용하기 위해 분취량을 동결 건조 및 -20 ° C에서 보관하십시오.
- 동결건조된 펩티드 0.05 mg에 DMSO 2.2 μL를 첨가함으로써 DMSO 중 동결건조된Aβ1-42의 스톡 용액 (5 mM)을 제조한다. 펩타이드를 조심스럽게 용해시키기 위해 용액을 소용돌이시키고 수조 초음파 처리기에서 2 분 동안 초음파 처리합니다.
- 원액을 DMEM, pH 7.4 및 와동에서 100μM의 농도로 희석하여 펩타이드를 단량체로 전환시킨 다음, 4°C에서 24시간 동안 인큐베이션하여 Aβ1-42(oAβ)12,21,22의 올리고머를 수득하였다.
- 투과 전자 현미경 이미징에 의해 이전에 보고된 바와 같이 실험 전에 oAβ를 특성화한다21,22.
- 부분적으로 분화된 SH-SY5Y 세포를 1 μM oAβ로 처리한다. 처리 전에 배지를 제거하고 새로운 FBS가 없는 DMEM을 추가합니다. 배지 변경 후, 미리 준비된 oAβ (100 μM)를 1 μM의 최종 농도가 되도록 배지에 첨가한다. 세포를 37°C(5%CO2)에서 2시간 동안 1μM oAβ로 배양한다. 처리되지 않은 세포의 형태로 음성 대조군을 포함시킨다.
3. TNT의 특성 분석을 위한 F-액틴 및 활성화된 PAK1의 면역염색
- 포스포-PAK1(Thr423)/PAK2(Thr402) 항체와 F-액틴 결합 팔로톡신 팔로이딘을 사용하여 감별 면역염색을 수행합니다.
- 대조군 및 oAβ 처리된 세포를 고정 전에 2 x 2분 동안 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다. 0.1M 인산염 완충액, pH 7.2에 용해된 2% 포르말린 고정제 및 2.5% 글루타르알데히드를 사용하여 Karnovsky의 고정 용액을 준비합니다. 그런 다음 Karnovsky의 고정 용액(세포를 덮을 만큼)을 실온에서 45분 동안 추가하여 이미징 접시에 세포를 고정합니다.
- 고정된 세포를 배양 완충액을 사용하여 2 x 2분 동안 세척한다. 5 mL의 FBS에 0.1 g의 사포닌을 용해시켜 배양 완충액(20x)을 제조하고, 95 mL의 1x PBS를 첨가하여 1x로 희석한다.
- 고정 후, 인큐베이션 완충액에서 1:250의 희석으로 phopho-PAK1에 대한 첫 번째 항체를 첨가하고, 어두운 습한 챔버에서 4°C에서 밤새 인큐베이션한다.
- 다음날, 배양 24 시간 후, 배양 완충액으로 세포를 2 x 2 분 동안 세척하고; 그런 다음 Alexa Fluor 488(1:1,000 희석) 및 팔로이딘 555(1:1,000 희석)에 접합된 2차 항체를 추가합니다. 세포를 어두운 습한 챔버에서 실온에서 1.5 시간 동안 배양합니다.
- 배양 후, 세포를 배양 완충액으로 2 x 2분 동안 세척한다. 1:2,000 희석액에 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 첨가하여 핵을 염색하고 어두운 곳에서 실온에서 5분 내지 10분 동안 배양합니다.
- 90% 글리세롤 및 10% 1x PBS에 25mg의 DABCO를 사용하여 DABCO 장착 배지를 준비합니다. 적절하게 용해하려면 분광 광도계 등급을 사용하여 pH를 8.6으로 조정하고 HCl (물로 1:20으로 희석)을 희석 한 다음 혼합을 위해 용액을 로커에 보관하십시오.
- 표백 방지제로 DABCO 장착 매체를 하단의 커버슬립이 포함된 이미징 접시에 직접 추가합니다. 최소 1-2 시간 동안 기다렸다가 직접 컨포칼 이미징을 수행하십시오.
알림: 커버슬립을 고정하는 데 접착제가 필요하지 않습니다.
4. TNT와 신경돌기를 구별하기 위한 F-액틴 및 β-III 튜불린의 면역염색
- β-III 튜불린 항체와 F-액틴 결합 팔로톡신 팔로이딘으로 감별 면역염색을 수행합니다.
- Karnovsky의 고정 용액을 추가하기 전에 oAβ 처리된 세포를 1x PBS로 2x 세척합니다. 세포를 실온에서 45분 동안 인큐베이션하고, 배양 완충액으로 세포를 2 x 2분 동안 세척한다.
- 고정 후, 인큐베이션 완충액에서 1:250의 희석으로 β-III 튜불린(TUBb3)에 대한 항체를 첨가하고 어두운 습한 챔버에서 밤새 4°C에서 인큐베이션합니다.
- 다음날, 배양 완충액(2 x 2분)으로 세포를 세척하고, Alexa Fluor 488(1:1,000 희석) 및 팔로이딘 555(1:1,000 희석)에 접합된 2차 항체를 동일한 접시에 함께 첨가한다. 이어서, 세포를 어두운 습윤 챔버에서 실온에서 1.5시간 동안 배양한다.
- 배양 완충액으로 세포를 2x 세척하고 핵 염색 DAPI를 1:2,000 희석하여 어두운 곳에서 실온에서 5-10분 동안 첨가합니다.
- 위에서 언급한 대로 마운팅 매체에 표백 방지제 DABCO를 추가하고 2시간 동안 기다렸다가 이미징합니다.
5. 컨포칼 현미경을 사용한 이미징
- TNT를 식별하려면 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 면역염색된 세포의 z-스택 이미지를 캡처합니다. DAPI, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 테트라메틸로다민(TRITC) 필터 세트와 함께 40x/1.40 Oil DIC 대물렌즈를 사용하여 이미지를 촬영합니다.
- 먼저 공초점 소프트웨어의 트랙 1, 트랙 2 및 트랙 3 창에서 필요한 레이저를 순차적으로 클릭하여 채널을 선택합니다. 트랙 1 창 아래에 있는 T-PMT 옵션을 클릭하여 형광 채널이 있는 미분 간섭 대비(DIC) 이미지를 촬영합니다.
알림: DIC 이미지는 T-PMT로 표시된 다른 감지기로 캡처됩니다. - 소프트웨어의 획득 탭을 선택하고 Z 스택 탭을 클릭한 다음 창이 열릴 때까지 기다립니다. 그런 다음 라이브 스캔 을 클릭하여 접시 하단의 셀에 초점을 맞춥니다. 초점이 맞춰진 이미지를 첫 번째 스택으로 선택합니다. 그런 다음 셀의 맨 위 부분을 볼 수 있도록 초점을 맞추고 마지막 스택으로 선택합니다. 실시간 스캔을 중지하고 최적 탭 옆에 있는 숫자를 클릭하여 스택의 단계 크기를 수정합니다. 단계 크기는 슬라이스 수와 셀의 두께에 따라 간격을 결정합니다.
참고: 스텝 크기는 나이퀴스트 샘플링을 기반으로 선택되어 충분한 슬라이스를 취하고 두 스택 사이에 간격이 없는지 확인합니다. 나이퀴스트 샘플링은 조명(23)의 목적 및 파장에 기초하여 결정된다. - 405nm, 488nm 및 561nm 레이저로 DAPI, FETC 및 TRITC의 3개 채널에 대한 연속 이미지를 촬영하고 1.02μs의 픽셀 체류 시간으로 캡처합니다. 형광 채널이 있는 DIC 채널에서 이미지를 캡처하여 세포 경계를 관찰합니다.
- x: 224.92μm 및 y: 224.92μm 크기의 각 픽셀과 415nm의 z 스케일링을 사용하여 이미지 스택을 캡처합니다.
- 셀의 맨 아래에서 맨 위로 여러 z 스택(15-22개 스택)을 캡처하는 이미지를 촬영합니다. 배양 접시의 무작위 필드에서 최소 10개의 이미지를 획득하여 총 ~200-300개의 세포를 얻습니다.
- 캡처된 이미지를 오프라인으로 분석하여 3D 볼륨 뷰 분석으로 TNT 식별
6. TNT 식별 및 정량화를 위한 컨포칼 z-스택 이미지 분석
- 분석을 위해 피지 소프트웨어에서 .czi 데이터 형식으로 저장된 공초점 이미지를 엽니다.
- 하이퍼스택 옵션을 선택하여 이미지의 각 z 스택 및 채널을 확인합니다. 그림 2와 같이 단일 창에서 열리는 z-스택 및 채널의 하이퍼스택을 찾습니다. 채널(빨간색 및 녹색 화살표로 표시) 및 z-스택(파란색 화살표로 표시) 스크롤 막대를 스크롤하여 관심 있는 특정 채널의 정확한 스택을 선택합니다.
참고: 고정 셀에서는 호버링 TNT 또는 멤브레인 도관이 표면 위에 머무르기 때문에 z 스택의 아래쪽 부분에서 구조가 보이지 않습니다. 그러나 고정 된 세포에서 신경 돌기는 표면에 놓여 있으며 z 스택의 하부에서 검출 할 수 있습니다 (z = 0에서 2). 식별 단계는 그림 2 를 참조하십시오. - 그림 2와 같이 먼저 채널 막대를 스크롤하여 F-액틴 염색 채널(빨간색 화살표로 표시됨)을 선택합니다. 그런 다음 z 스택(파란색 화살표로 표시됨)을 수동으로 스크롤하여 각 스택을 하나씩 확인합니다. 세포를 연결하는 것처럼 보이고 z- 스택의 하부에서 볼 수 있으며 신경 돌기 (흰색 화살표로 표시)로 이미징 접시 표면 (z = 2)에 가까운 F- 액틴 염색 구조를 식별합니다.
알림: 대부분의 신경돌기는 확장된 돌출부(분홍색 화살표로 표시됨)로 나타나기 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다. - z-스택을 위쪽으로 스크롤하여 F-액틴 양성, 호버링 세포 간 도관인 TNT를 식별합니다(그림 2의 z = 4, 노란색 화살표로 표시됨). 표면을 향한 z- 스택의 아래쪽 부분 근처에서 신경 돌기를 찾고 z- 스택이 상단으로 스크롤되면 사라지기 시작하는 것을 관찰하십시오 (그림 2의 z = 6, 신경 돌기가 명확하게 보이지 않음).
- z-스택에서 도관의 호버링 특성을 분석하여 포스포-PAK1 양성 TNT를 F-액틴 양성 TNT와 유사하게 식별합니다. phospho-PAK1 염색은 F-액틴 염색보다 약하므로 z = 4 (희미하게 보임) 및 z = 6 (두드러짐)에서 phopho-PAK1 염색된 TNT를 찾으십시오.
- 또한, DIC 이미지를 관찰하여 F-액틴- 및 포스포-PAK1 염색된 TNT 구조가 세포 사이의 막 도관인지 확인하였다(도 3). 또한 F-액틴(빨간색)과 phospho-PAK1(녹색) 채널을 병합하여 식별된 TNT가 F-액틴 및 phospho-PAK1 공동 염색 구조인지 확인합니다(그림 3).
- TNT를 정량화하려면 총 셀 번호와 식별된 TNT를 수동으로 계산하고 숫자를 백분율로 나타냅니다.
- F-액틴 양성 TNT와 β-III 튜불린(TUBb3) 양성, TNT 유사 호버링 도관을 z-스택 이미지에서 구별하려면 F-액틴(빨간색) 및 TUBb3(녹색) 채널을 병합합니다(그림 4). 그런 다음 병합된 이미지의 z 스택을 분석합니다.
- z = 3에서 희미하게 보이고 z = 6 및 z = 9 (노란색 화살표)에서 두드러지는 F- 액틴 염색 TNT만을 찾으십시오. 유사하게, z = 6 및 z = 9 (청록색 화살표)에서 F- 액틴 및 β-III 튜 불린 (TUBb3) 이중 양성, TNT 유사 호버링 도관을 식별합니다. z- 스택 (흰색 화살표)의 하부에서 다른 F- 액틴 및 β-III 튜 불린 염색, 비 호버링 돌출부를 식별하십시오.
- 피지의 라인 도구를 사용하여 TNT의 직경을 측정합니다. | 분석을 클릭하여 측정 규모를 확인합니다 . "픽셀 단위의 거리"가 .czi 이미지에서 자동으로 설정되도록 배율을 설정합니다. xy 평면에서 TNT의 직경을 측정합니다.
참고 : 대부분의 직경은 1 픽셀에서 4 픽셀 (즉, 220-880 nm) 사이입니다. 각 픽셀은 220nm입니다. z-stack 컨포칼 이미지 분석을 위한 프로토콜 요약은 그림 5 를 참조하십시오.
7.3D TNT 특성화를 위한 z-스택 이미지 재구성
- 피지에서 볼륨 뷰어 플러그인을 사용하면 3D 슬라이싱 및 임계값 지원 3D 시각화가 가능합니다(그림 6).
- z 스택 이미지를 개별 채널로 분할합니다. 그런 다음 단일 채널(F-액틴 채널) z-스택 이미지를 잘라 3D 재구성 보기를 사용하여 한 번에 하나 또는 두 개의 TNT 또는 신경돌기를 강조 표시합니다. 볼륨 보기 플러그인을 활성화하여 xy, yz 및 xz 보기를 시각화합니다.
- xy 평면에 단일 TNT 또는 신경돌기를 고정하고(흰색 화살표는 도 6A에서 신경돌기를 나타내고, 노란색 화살표는 도 6B에서 TNT를 나타냄) xz(빨간색) 및 yz(녹색) 축 단면을 표시합니다. xz 및 yz 평면의 xz 평면 하단에 있는 뉴라이트(흰색 화살표, 그림 6A)와 상단 z-스택의 TNT(노란색 화살표, 그림 6B)를 관찰합니다.
- 개별 TNT 또는 신경돌기를 선택하여 xz 평면에서 3D 볼륨 뷰를 재구성합니다(그림 6C, D). 3D 재구성에서 z- 평면의 하단에있는 신경 돌기 (흰색 화살표, 그림 6C)와 하단 z 평면 (노란색 화살표, 그림 6D)을 건드리지 않고 두 세포를 연결하는 호버링 구조로 나타나는 TNT를 관찰하십시오.
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Representative Results
여기에서는 컨포칼 z-스택 이미지에서 3D 볼륨 뷰를 구성하여 SH-SY5Y 신경 세포에서 oAβ 유도 TNT를 식별하고 특성화합니다(그림 1). 세포를 F-액틴 및 포스포-PAK1로 이중 면역염색하였다. 면역염색된 세포의 공초점 z-스택 이미지를 분석하여 TNT를 식별했습니다(그림 2). 또한, DIC 이미지를 분석하여 F-액틴- 및 포스포-PAK1 염색된 TNT 구조가 세포 사이의 막 도관임을 확인하였다(도 3). 또한, 세포를 F-액틴 및 β-III 튜불린으로 이중 면역염색하였다(도 4). TNT 유사 F- 액틴 및 β-III 튜 불린 이중 양성 막 도관은 F- 액틴 양성 TNT와 구별되었습니다 (그림 4). phospho-PAK1(또는 활성화된 PAK1) 및 F-액틴과 함께 발현된 TNT는 지층을 건드리지 않고 두 세포 사이를 호버링하는 특성을 기반으로 3D 볼륨 뷰 이미지를 구성하여 다른 신경돌기/세포 돌출부와 구별되었습니다(그림 6). 식별된 TNT는 수동으로 발견되었으며 TNT의 백분율은 3D 볼륨 뷰 이미지에서 정확하게 계산되었습니다. TNT의 직경과 길이는 또한 개별적으로 식별된 TNT를 분석하여 결정하였다.
그림 1: TNT 검출 방법의 프로토콜 요약을 나타내는 개략도. 스케일 바 = 현미경 이미지의 경우 100μm(상단); 10 μm (3D 볼륨 뷰). 약어: oAβ = 올리고머성 아밀로이드-β1-42; PAK1 = p21- 활성화 된 키나아제 -1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TNT를 식별하고 정량화하기 위한 컨포칼 z-스택 이미지 분석. 공초점 z-스택 이미지는 피지 소프트웨어에서 분석되었습니다. z-스택 및 채널의 하이퍼스택이 단일 창에서 열리면 (A) F-액틴 및 (B) phospho-PAK1이 표시됩니다. 채널(빨간색 및 녹색 화살표로 표시됨) 및 z-스택(파란색 화살표로 표시됨) 스크롤 막대를 스크롤하여 관심 있는 특정 채널의 개별 스택을 분석했습니다. (A) 세포를 연결하는 F- 액틴 염색 구조는 z- 스택의 하부에서 볼 수 있고 이미지 접시 (z = 2)의 표면에 가까운 것으로 간주되어 신경 돌기 (흰색 화살표로 표시)로 확인되었습니다. 대조적으로, z- 스택의 더 높은 부분에서 볼 수있는 호버링 셀 간 연결 도관은 TNT (노란색 화살표로 표시)로 식별되었습니다. (B) 유사하게, 포스포-PAK1-염색된 신경돌기 및 TNT가 확인되었다. 이웃 세포에 연결되지 않은 다른 F- 액틴 양성 짧은 돌출부는 분홍색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어 : TNT = 터널링 나노 튜브; PAK1 = p21- 활성화 된 키나아제 -1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: TNT를 확인하기 위한 DIC 이미지 분석. (A) FIC 이미지를 관찰하여 F-액틴- 및 포스포-PAK1-염색된 TNT 및 신경돌기 돌출부가 실제로 막 도관임을 확인하였다. (B) 또한, F-액틴(적색) 및 포스포-PAK1(녹색) 채널을 병합하여 확인된 oAβ-유도 TNT가 F-액틴 및 포스포-PAK1 공동 염색 구조임을 확인하였다. 스케일 바 = 10 μm. 약어 : TNT = 터널링 나노 튜브; DIC = 차동 간섭 대비; PAK1 = p21- 활성화 된 키나아제 -1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 피지 소프트웨어를 사용하여 분석한 공초점 z-스택 이미지를 분석하여 F-액틴 염색 TNT와 β-III 튜불린 및 F-액틴 이중 염색, TNT 유사 호버링 도관만 구별합니다. 먼저, 하이퍼스택의 F-액틴(적색) 및 TUBb3(녹색) 채널을 병합하였다. 그런 다음 병합 된 이미지가 단일 창에서 열렸습니다. z 스택 스크롤 막대를 스크롤하여 F- 액틴 염색 TNT를 독점적으로 식별했습니다. 이들은 z = 3에서 희미하게 보였고 z = 6 및 z = 9에서 두드러졌습니다 (노란색 화살표, B). 유사하게, F-액틴 및 TUBb3 이중 양성, TNT-유사 호버링 도관은 z=6 및 z=9(시안 화살표, A)에서 검출가능하였다. 다른 F- 액틴 및 β-III 튜 불린 염색, 비 호버링 돌출부가 z- 스택 (흰색 화살표)의 하부에서 확인되었다. 스케일 바 = 10 μm. 약어 : TNT = 터널링 나노 튜브; TUBb3 = β-III 튜불린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: z-stack 컨포칼 이미지 분석을 위한 세부 프로토콜을 나타내는 회로도 요약. 약어 : TNT = 터널링 나노 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 한 번에 하나 또는 두 개의 TNT 또는 신경돌기를 강조 표시하는 3D 재구성 보기. 피지의 "볼륨 보기" 플러그인은 xy, yz 및 xz 보기를 시각화하는 데 사용됩니다. 3D 재구성은 z- 평면의 맨 아래에있는 신경 돌기 (패널 A 및 C의 흰색 화살표)를 보여 주며, TNT는 하단 z 평면 (패널 B 와 D의 노란색 화살표)을 건드리지 않고 두 셀을 연결하는 호버링 구조로 나타납니다. 스케일 바 = 10 μm. 약어 : TNT = 터널링 나노 튜브. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
지난 2 년 동안 여러 연구자들은 TNT18의 구조를 이해하고 특성화하려고 노력해 왔습니다. 특정 마커의 부족은 진행을 방해하고 TNT를 식별, 특성화 및 정량화하는 데 사용할 수 있는 편리하고 표준화된 방법에 대한 수요가 증가하고 있습니다. TNT는 두 세포 사이를 맴도는 F-액틴 기반 막 도관으로 정의됩니다. 연구에 따르면 β 튜 불린 양성, 폐쇄 종말, 발달 신경 돌기는 두 개의 먼 세포 사이를 맴돌며 TNT 유사 구조와 유사합니다12,13. 따라서 TNT는 액틴에 대해서만 양성이고 멀리 떨어진 두 세포 사이를 맴도는 막 도관이라는 점에서 신경돌기 및 기타 TNT 유사 구조와 식별되고 구별됩니다. 연구자들은 종종 이미징 전에 고정 중에 손상되지 않은 TNT 구조를 얻는 것이 어렵다는 것을 발견합니다24. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 2.5 % 글루 타르 알데히드 (Karnovsky의 정착액)로 변형 된 고정 용액을 사용하여이 프로토콜25에 사용 된 SH-SY5Y 신경 세포를 고정했습니다.
모든 면역조직화학/면역세포화학 실험의 중요한 단계는 적절한 고정제의 선택에 의존하는 샘플의 고정입니다. 샘플의 불완전한 고정은 표적 단백질의 빠른 단백질 분해 및 특이적 면역반응성의 감소를 초래할 수 있다. 과고정은 에피토프의 마스킹과 비특이적 배경으로 인한 특정 라벨링의 불확실성을 야기한다. 방법, 타이밍 또는 기간, 온도 및 pH는 또한 세포의 적절한 고정에 영향을 미친다(26).
파라포름알데히드는 세포의 면역염색에서 고정제로 광범위하게 사용됩니다. 파라 포름 알데히드를 고정제로 사용하는 단점은 항원 성의 상실과 형태의 변화를 포함합니다. 글루타르알데히드는 삼투압이 낮고 용액에서 더 안정적이며 쉽게 가교되어 더 나은 결과를 제공합니다27. 포름알데히드-글루타르알데히드(인산염 완충액 내)의 조합은 광범위한 조직/세포 샘플의 탁월한 고정을 초래합니다. 이 조합은 포름 알데히드에 의한 세포의 미세 구조의 신속한 안정화를 가능하게하고, 글루 타르 알데히드28의 느린 침투 작용에 의한 영구적 인 고정을 가능하게한다.
F-액틴 및 포스포-PAK1에 양성인 TNT는 평평한 지층에서 시험 관 내 2D 세포 배양에서 두 세포 사이를 호버링하는 특성에 따라 신경돌기와 구별됩니다. 확인된 TNT는 3D 부피 뷰 분석으로 수동으로 발견되었으며 형성된 TNT의 백분율은 수동 계수로 계산되었습니다. 수동 방법은 엄청난 인력을 필요로하기 때문에 많은 양의 데이터를 정량화하는 것을 어렵게 만듭니다19. 그러나 훈련된 눈은 TNT를 효율적으로 발견하고 자동 검출 방법보다 더 정밀하게 신경돌기와 구별할 수 있습니다. 기존의 자동 검출 방법은 알고리즘을 개발하거나 실험 설정에 필요한 기존 알고리즘을 변경할 수 있는 전문 지식 없이는 모든 실험실에서 구현하기가 어렵습니다. 수동 3D 볼륨 뷰 분석 방법을 사용하면 z-스택의 하부에 있는 세포와 z-스택의 중간 및 위쪽 부분에 떠 있는 세포 사이에 있는 막 구조를 쉽게 식별하여 신경돌기와 TNT를 명확하게 구분할 수 있습니다.
TNT는 신경돌기 또는 종양 마이크로튜브와 같은 다른 막 돌출부와 구별될 수 있습니다. 그러나 개방형 및 폐쇄형, 나노 크기의 직경 멤브레인 튜브를 구별하기가 어렵 기 때문에 TNT 또는 TNT와 같은 구조입니까? 지난 10 년 동안 병리학, 암 내성 및 치료의 확산에서 TNT의 불가피한 역할을 보여주기 위해 엄청난 양의 데이터가 축적되었습니다17. 따라서 연구자들은 직접 장거리 세포 간 통신 분야를 변화시킬 특정 제조업체의 개발을 찾고 있습니다. 그때까지 재현 가능한 이미징 특성화 방법은 현장에서 지속적인 발전을 위한 길을 닦기 위해 수요가 많습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
D.K.V와 A.R은 TMA Pai 펠로우십에 대해 Manipal Academy of Higher Education에 감사드립니다. SERB-SRG(#SRG/2021/001315)에 대한 인도 과학 및 공학 연구 위원회와 인도 의학 연구 위원회(#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) 및 인도 마니팔에 있는 마니팔 고등 교육 아카데미의 교내 기금에 감사드립니다. JNCASR (Jawaharlal Nehru Center for Advanced Scientific Research, India) 공초점 시설과 B. Suma에 JNCASR의 컨포칼 현미경에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
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