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Biochemistry

Utilisation de pincettes optiques doubles et de microfluidique pour les études sur une seule molécule

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64023
Automatic Translation
1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

Summary

La biochimie visuelle à molécule unique étudiée à travers des chambres microfluidiques est grandement facilitée à l’aide d’un baril en verre, de seringues étanches aux gaz, de connexions stables de tubes aux cellules d’écoulement et d’élimination des bulles en plaçant des vannes de commutation entre les seringues et les tubes. Le protocole décrit deux pièges optiques qui permettent de visualiser les transactions d’ADN et les interactions intermoléculaires.

Abstract

La biochimie visuelle est une technique puissante pour observer les propriétés stochastiques d’enzymes uniques ou de complexes enzymatiques qui sont obscurcis dans la moyenne qui a lieu dans les études en phase en vrac. Pour réaliser la visualisation, deux pinces optiques, où un piège est fixe et l’autre mobile, sont focalisés dans un canal d’une chambre microfluidique multiflux positionnée sur la platine d’un microscope à fluorescence inversée. Les pinces optiques piègent des molécules uniques d’ADN marqué par fluorescence et un flux de fluide à travers la chambre et au-delà des billes piégées, étire l’ADN à la forme B (sous une force minimale, c’est-à-dire 0 pN) avec l’acide nucléique observé comme une ficelle blanche sur un fond noir. Les molécules d’ADN sont déplacées d’un flux à l’autre, en traduisant l’étage perpendiculairement à l’écoulement pour permettre l’initiation des réactions de manière contrôlée. Pour réussir, des dispositifs microfluidiques avec des canaux optiquement transparents sont accouplés à des seringues en verre maintenues en place dans une pompe à seringues. Les résultats optimaux utilisent des connecteurs collés en permanence à la cellule d’écoulement, des tubes mécaniquement rigides et résistants aux produits chimiques, et connectés à des vannes de commutation qui éliminent les bulles qui empêchent l’écoulement laminaire.

Introduction

La capacité de visualiser les interactions protéine-ADN au niveau d’une seule molécule et en temps réel a fourni des informations significatives sur la stabilité du génome 1,2. En plus de travailler avec des molécules d’ADN uniques une à la fois, la possibilité de visualiser les transactions entre molécules individuelles à proximité fournit des informations supplémentaires 3,4,5. La manipulation de molécules d’ADN supplémentaires nécessite à la fois des pièges optiques supplémentaires ainsi que des cellules à flux microfluidique multicanaux de haute qualité6.

Il existe plusieurs méthodes disponibles pour générer plus d’un piège optique. Il s’agit notamment des miroirs à balayage galvanométrique, des modulateurs optiques acoustiques et de l’optique diffractive, qui génèrent des pincettes optiques holographiques 4,7,8,9. Souvent, les miroirs de balayage et les modulateurs optiques acoustiques produisent des pièges à temps partagé. Dans la configuration décrite ici, le faisceau d’un seul laser Nd:YAG est divisé en polarisation, puis les miroirs à balayage laser galvanomètre contrôlent la position de ce que l’on appelle le piège mobile (Figure 1)4. Pour faciliter le positionnement des miroirs et des filtres pour diriger le faisceau de piégeage vers l’ouverture arrière de l’objectif du microscope, un laser HeNe est utilisé. Cela facilite l’alignement global car le faisceau HeNe est visible à l’œil nu, alors que les faisceaux infrarouges ne le sont pas. Le faisceau HeNe est également plus sûr à travailler, ce qui rend le positionnement des miroirs et d’autres composants moins stressant. Initialement, le trajet du faisceau de ce laser est séparé du faisceau de 1064 nm, mais est introduit dans le même trajet du faisceau, puis dans l’objectif du microscope. Une fois l’alignement physique atteint, le positionnement du faisceau de 1064 nm au-dessus du faisceau HeNe est effectué, ce qui est facilité par l’utilisation d’une visionneuse infrarouge et de divers outils d’imagerie du faisceau pour visualiser la position et la qualité du faisceau. Ensuite, l’expanseur de faisceau est introduit et le faisceau infrarouge expansé résultant est aligné sur l’ouverture arrière de l’objectif. Enfin, l’objectif est retiré et la puissance de chaque faisceau polarisé est mesurée et ajustée à l’aide de plaques d’onde λ/2 pour être égale (Figure 1C). Les mesures de puissance sont également effectuées une fois que l’objectif est retourné et il y a généralement une perte de puissance de 53%. Il y a cependant une puissance suffisante pour former des pièges optiques fixes et mobiles stables dans le plan focal (Figure 1D).

Pour imager les transactions d’ADN, les cellules à flux microfluidique jouent un rôle clé car elles permettent des mesures contrôlées au niveau de la molécule unique avec une résolution spatiale et temporelle élevée (Figure 2). Le terme microfluidique désigne la capacité de manipuler des fluides dans un ou plusieurs canaux de dimensions allant de 5 à 500 μm10,11. Le terme flux fait référence au fluide réel dans un canal et le canal fait référence au canal physique dans lequel un flux de fluide ou des flux se déplacent. La conception de cellules d’écoulement à canal unique a un canal physique commun où les réactions sont observées et il n’y a généralement qu’un seul flux de fluide présent. Ainsi, ces conceptions sont connues sous le nom de cellules d’écoulement à flux unique. En revanche, les cellules d’écoulement multiflux sont définies comme un dispositif microfluidique dans lequel deux canaux d’entrée ou plus convergent en un seul canal physique commun (figure 2A). À l’intérieur du canal commun, les flux de fluide qui proviennent des canaux individuels s’écoulent parallèlement les uns aux autres et restent séparés avec seulement un mélange minimal entre eux en raison de la diffusion (Figure 2B). Dans la majorité des configurations expérimentales, une seule pompe pousse les fluides dans chaque canal à la même vitesse. En revanche, lorsque la direction limite est utilisée, trois pompes ou plus, contrôlées indépendamment, poussent les fluides à travers les canaux. Cependant, chaque pompe fonctionne à une vitesse différente, mais le débit net dans le canal commun est constant12. Cela permet l’échange rapide des composants du canal principal simplement en modifiant la vitesse de la pompe.

En plus de l’écoulement laminaire, un autre facteur critique est le profil de vitesse parabolique dans le flux de fluide laminaire. La vitesse d’écoulement la plus élevée se produit au milieu du cours d’eau et la plus lente se produit près des surfaces (figure 2C)13. Ce profil doit être pris en compte pour étirer complètement une molécule d’ADN qui est attachée à une bille maintenue dans le flux pour une visualisation précise de l’ADN fluorescent et des analyses précises d’une seule molécule. Ici, l’ADN est étiré à la forme B et est maintenu en place sous 0 pN de force. Pour ce faire, la position du piège optique doit être focalisée à une position de 10 à 20 μm de la surface inférieure du couvercle (Figure 2D). Des précautions doivent être prises pour que la molécule d’ADN ne soit pas étirée au-delà de la forme B, car cela peut inhiber les réactions enzymatiques. Dans des conditions tampons typiques, 1 μm = 3 000 pb d’ADN14. De plus, en piégeant 10 à 20 μm de la lamelle de couverture, le complexe d’ADN est positionné loin de la surface, minimisant ainsi les interactions de surface.

De nombreuses méthodes ont été utilisées pour créer des canaux de dispositifs microfluidiques et celles-ci peuvent être effectuées en laboratoire ou des cellules d’écoulement peuvent être achetées auprès de sources commerciales 6,15,16,17. Les matériaux optimaux utilisés pour construire les cellules d’écoulement doivent être mécaniquement rigides, optiquement transparents avec une faible fluorescence et imperméables aux solvants organiques6. Fréquemment, le verre flotté borosilicaté ou la silice fondue sont utilisés pour fournir un environnement d’écoulement stable pendant une période prolongée qui convient au piégeage optique, à la visualisation et à la détection de force. Ces matériaux permettent également l’utilisation de solvants non aqueux (p. ex. méthanol de qualité spectrophotométrique) pour simplifier le mouillage de surface et l’élimination des bulles d’air, et de dénaturants (p. ex. chlorhydrate de guanidinium 6M) ou de détergents pour nettoyer la cellule d’écoulement. Enfin, les méthodes utilisées pour introduire des fluides dans les cellules d’écoulement varient des systèmes complexes de pompes à vide aux pompes à seringue unique 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Dans l’approche décrite ici, on utilise une pompe à seringue pouvant accueillir jusqu’à 10 seringues (figure 3A). Cela offre la flexibilité d’utiliser des cellules d’écoulement à canal unique ou des cellules d’écoulement avec plusieurs canaux d’entrée. Ici, une cellule d’écoulement à trois canaux est utilisée et est accouplée à des seringues maintenues en place sur la pompe à seringue à l’aide d’un tube en polyéther-éther-cétone (PEEK) (figure 3A-C). Le débit des fluides est contrôlé par des vannes de commutation à quatre voies et sert ainsi à minimiser l’introduction de bulles dans la cellule d’écoulement (Figure 3A,D). De plus, les seringues étanches aux gaz Hamilton qui ont des parois de verre rigides et des pistons revêtus de polytétrafluoroéthylène (PTFE) sont recommandées car elles fournissent un mouvement de piston exceptionnellement doux qui est essentiel pour obtenir un écoulement régulier14,27.

Dans le système expérimental décrit, des cellules d’écoulement avec deux à cinq canaux d’entrée ont été utilisées. Le nombre de canaux d’entrée est dicté par l’expérience en cours. Pour l’étude de RecBCD et Hop2-Mnd1, deux canaux de flux étaient suffisants 14,28. Pour l’hélicase, l’enzyme a été liée à l’extrémité libre de l’ADN et traduite en un flux contenant du magnésium et de l’ATP pour initier la translocation et le déroulement. Pour Hop2-Mnd1, l’ADN piégé optiquement a été traduit dans le flux de fluide adjacent contenant des protéines et un tampon ± ions métalliques divalents. L’utilisation de cellules d’écoulement à trois canaux permet de piéger l’ADN dans le flux 1, de traduire l’ADN dans le flux 2 pour permettre la liaison aux protéines, puis de lancer le flux 3 où l’ATP est présent, par exemple, pour déclencher des réactions. Une variante de ce qui précède consiste à utiliser une protéine marquée par fluorescence dans le canal 2, ce qui rend le flux de fluide complètement blanc et empêche la visualisation de l’ADN. Lorsque cette molécule est traduite dans le flux 3, les protéines et l’ADN sont maintenant visibles lorsque les réactions sont initiées.

L’utilisation de vannes de commutation à quatre voies pour contrôler le débit de fluide est un élément essentiel du système pour éliminer les bulles dans les cellules d’écoulement. Les bulles nuisent à la stabilité de l’écoulement des fluides car elles se contractent et se dilatent de manière imprévisible, ce qui entraîne des changements rapides de la vitesse d’écoulement et l’introduction de turbulences. Lorsque les vannes sont positionnées entre les seringues et le tube d’admission, le chemin d’écoulement est déconnecté en changeant la position de la vanne lorsque les seringues sont remplacées. Lorsque la nouvelle seringue est mise en place, le piston peut être enfoncé manuellement de sorte que >6 μL est éjecté (le volume mort de la valve) et cela élimine presque entièrement les bulles.

La fixation des connecteurs aux cellules d’écoulement est souvent l’étape limitant la vitesse dans l’utilisation des cellules d’écoulement. Nous décrivons l’utilisation de deux types de connecteurs : amovibles dits press-fit et permanents (assemblages nanoports). Les connecteurs amovibles sont simples à adhérer à une cellule d’écoulement et différents types de tubes flexibles en plus du PTFE recommandé peuvent être testés avec ces connecteurs. Il s’agit d’un moyen rapide et rentable de tester les tubes et les connecteurs sans sacrifier les cellules d’écoulement en verre plus coûteuses. En revanche, les assemblages nanoports sont fixés en permanence, résistent à des pressions allant jusqu’à 1 000 psi et, entre nos mains, leur utilisation est limitée aux tubes en PEEK de différents diamètres. Ce n’est pas un inconvénient car les tubes en PEEK sont utilisés de préférence. Une seule cellule d’écoulement en verre avec des assemblages permanents fixés peut être réutilisée pendant plus de 1 an avec une utilisation prudente.

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Protocol

1. Alignement et test du piège laser avec des billes de polystyrène

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 1A,B.

ATTENTION : L’expérimentateur doit porter des lunettes de protection appropriées ou des lunettes de sécurité laser pendant l’alignement du faisceau laser. Comme le système de pince optique décrit ici utilise à la fois des faisceaux HeNe et IR, deux ensembles distincts de verrerie de sécurité laser sont nécessaires.

  1. Alignement HeNe Beam
    1. Positionnez tous les composants optiques sur la breadboard. Alignez la breadboard de manière à ce qu’elle soit aussi proche que possible d’un angle de 90° par rapport au microscope.
    2. Fixez le tube d’accouplement contenant l’objectif et la lentille telan au microscope (Figure 1A-11,12).
      REMARQUE: L’objectif telan est un système de lentilles qui est utilisé pour focaliser l’image sur le plan d’image intermédiaire dans les oculaires.
    3. Allumez le laser HeNe et ouvrez l’obturateur (Figure 1A-18). Le faisceau doit frapper le filtre (figure 1A-3) à une hauteur de 54 mm réfléchissant 50 % de la lumière sur le miroir 5 (figure 1A-5). Les 50 % restants du faisceau frappent le miroir 4 (figure 1A-4) à la même hauteur que le miroir 3.
    4. Régler le miroir 4 (figure 1A-4) de sorte que le faisceau frappe le miroir 6 (figure 1A-6) à une hauteur de 51 mm.
    5. Régler le miroir 6 (figure 1A-6) de sorte que le faisceau soit dirigé vers le miroir galvanique inférieur à une hauteur de 51 mm. Le faisceau qui sort du miroir galvanique supérieur sera de 57,5 mm.
    6. Régler le miroir 3 (figure 1A-3) de sorte que ce faisceau frappe le miroir 5 (figure 1A-5) à une hauteur de 57,5 mm. Une fois réfléchi par le miroir 5, le faisceau doit frapper le miroir 9 (figure 1A-9) à la même hauteur. Le faisceau est effectivement recombiné au miroir 9, traverse l’objectif et le système de lentilles telan sur le miroir 21 (Figure 1A-21), qui le reflète dans l’objectif.
    7. Placez une lame de microscope propre sur la scène du microscope. Allumez l’appareil photo et imagez les faisceaux des faisceaux fixes et de balayage individuellement sur l’écran. En commençant par le miroir 3, puis 5 et 9, enfin 21, effectuez de petits ajustements pour positionner le faisceau fixe au centre de l’écran.
    8. Pour vous assurer que l’angle du faisceau sortant du miroir 21 est de 90°, modifiez la hauteur Z du microscope et positionnez le faisceau imagé sur les surfaces supérieure et inférieure de la lame. Lorsqu’ils sont identiques, le faisceau est dans la bonne position, qui est perpendiculaire à la scène. Déclenchez ce faisceau à l’aide de l’obturateur 19 (Figure 1A-19).
    9. En commençant par les miroirs 4 et 6, effectuez de petits ajustements pour positionner le faisceau fixe au centre de l’écran. Obturez ce faisceau.
  2. Alignement du faisceau infrarouge (IR)
    ATTENTION : Effectuez toutes les étapes à faible puissance laser pour des raisons de sécurité.
    1. Ajuster la plaque d’onde 14 (figure 1A-14) pour ajuster le rapport entre les faisceaux transmis et réfléchis répartis au niveau du séparateur de faisceau 2 (figure 1A-2). Le séparateur de faisceau 2 réfléchit la composante s du faisceau laser et transmet la composante p.
    2. Le faisceau qui traverse 2, frappe le miroir 7 (Figure 1A-7), qui dévie le faisceau sur le miroir galvanique inférieur. Il devrait suivre la trajectoire du faisceau HeNe sur le miroir 21. Effectuez de petits mouvements de miroir 7 pour réaliser ce positionnement.
    3. Régler le miroir 2 de sorte que le faisceau réfléchi par le miroir 2 frappe le miroir 10 (figure 1A-10) à une hauteur de 57,5 mm.
    4. Le faisceau est réfléchi du miroir 10 sur le miroir 8 (figure 1A-8) à une hauteur de 57,5 mm. Le faisceau suivant doit frapper le miroir 9 à la même hauteur. Si ce n’est pas le cas, apportez de petits ajustements aux miroirs 10 et 8 au besoin.
    5. Retirez l’objectif et placez la tête du capteur de puissance au-dessus du port de la tourelle d’objectif.
    6. Utilisez les plaques 14, 15 et 16 (Figure 1A-14,15,16) pour ajuster la puissance de chaque faisceau laser afin qu’ils soient égaux comme illustré à la Figure 1C.
    7. Mettre en place le détendeur de poutre 1 (figure 1A-1). Ajustez le faisceau laser expansé pour qu’il soit circulaire sans coma ni astigmatisme.
    8. Pour tester les pièges optiques, faites une solution de billes de polystyrène de 1 μm en suspension dans l’eau. Ensuite, placez 10 μL de cette solution sur une lame de microscope, placez une lamelle de couverture sur le dessus et scellez avec du vernis à ongles. Placez la lame sur la platine du microscope et testez les pièges optiques en piégeant ces billes de 1 μm. Assurez-vous que les perles sont aspirées dans les pièges et maintenues de manière stable lorsque la scène est déplacée. Le piégeage devrait se faire de la même manière efficace de tous les côtés du piège.

2. Préparation de la chambre microfluidique

  1. Si la cellule d’écoulement est un dispositif de fabrication commerciale fabriqué à partir de polydiméthylsiloxane (PDMS) sur une lamelle de couverture, passez à l’étape 3. S’il s’agit d’un dispositif en verre avec des connecteurs connectés, passez à l’étape 4.
  2. Si la cellule d’écoulement n’a pas de connecteurs connectés, collez-les d’abord aux trous d’entrée de la lame de microscope. Reportez-vous à l’étape 3 pour connaître la procédure de connexion des connecteurs.

3. Connexions de cellules d’écoulement à l’aide d’une cellule de flux PDMS

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 2D.

  1. Placez la cellule d’écoulement sur une surface plane et propre. Tenez le tube en PTFE à 3 mm de l’extrémité libre à l’aide d’une pince. Poussez le tube dans l’orifice préformé (l’orifice peut supporter une pression de ligne de 2 bars).
  2. Répétez cette procédure pour chacun des ports restants. Raccordez les orifices d’entrée à la pompe de seringue et la sortie à un flacon usagé (Figure 4A,B).
  3. Remplissez chaque seringue en verre avec 1 mL de méthanol de qualité spectrophotométrique. Fixez chaque seringue à une vanne de commutation. Assurez-vous que la sortie de la vanne est dirigée vers les déchets et purgez chaque conduite avec 50 μL de méthanol (figure 4C, position fermée).
  4. Basculez la position de sortie sur la cellule d’écoulement (Figure 4C, position ouverte). Pomper 800 μL de méthanol à travers la cellule d’écoulement à un débit de 100 μL/h pour mouiller les surfaces et éliminer les bulles.
  5. Le lendemain, répétez ce processus en utilisant 800 μL d’eau ultrapure. La cellule d’écoulement est maintenant prête à l’emploi.

4. Fixation des connecteurs de tuyauterie à ajustement de presse

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 2F.

  1. Si des connecteurs de tuyauterie pressables doivent être utilisés, retirez soigneusement le ruban adhésif d’un côté du connecteur et placez-le sur le trou de la lame de microscope. Appuyez pendant quelques secondes. Répétez le processus pour les connecteurs restants.
  2. Placez la cellule d’écoulement sur une surface plane et propre. Tenez le tube en PTFE à 3 mm de l’extrémité libre à l’aide d’une pince. Poussez le tube dans le trou préformé dans l’orifice et répétez cette procédure pour chacun des orifices restants.
  3. Fixez le tube des entrées aux vannes de commutation. Passez à l’étape 7.

5. Attachement des assemblées permanentes

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 2A-C.

  1. Effectuez la fixation sur une surface propre et plane ou sur un collecteur personnalisé pour maintenir la cellule d’écoulement et les connecteurs en place pendant le collage.
  2. Placez la cellule d’écoulement sur une surface plane propre ou dans la section encastrée du collecteur (figure 2B). Placez une petite quantité de colle pour verre sur le fond de l’ensemble et insérez le joint.
  3. Placez le nanoport sur l’un des trous d’entrée de la lame de microscope. Poussez doucement vers le bas et maintenez-le en place sans mouvement latéral. Répétez le processus pour les ports restants.
  4. Laisser sécher ou serrer en place dans le collecteur. Retirez délicatement la cellule d’écoulement du collecteur et assurez-vous que les assemblages s’alignent bien avec les orifices d’entrée de la cellule d’écoulement. Passez à l’étape 7 lorsque vous êtes prêt.

6. Connexions et préparation des cellules d’écoulement

REMARQUE : Pour la configuration, reportez-vous à la figure 4A,B.

  1. Placez une cellule d’écoulement sur la platine du microscope. Fixez le tube à l’aide des connecteurs serrés aux doigts.
  2. Remplissez chaque seringue en verre avec 1 mL de méthanol de qualité spectrophotométrique. Fixez chaque seringue à une vanne de commutation. Assurez-vous que la sortie de la vanne est dirigée vers les déchets et purgez chaque conduite avec 50 μL de méthanol (figure 4C, position fermée).
  3. Basculez la position de sortie sur la cellule d’écoulement (Figure 4C, position ouverte). Pomper 800 μL de méthanol à travers la cellule d’écoulement à un débit de 100 μL/h pour mouiller les surfaces et éliminer les bulles.
  4. Le lendemain, répétez ce processus en utilisant 800 μL d’eau ultrapure. La cellule d’écoulement est maintenant prête à l’emploi.

7. Contrôle de l’écoulement des fluides

  1. Tournez les vannes de commutation en position fermée (figure 4C). Retirez les seringues, jetez l’eau résiduelle et remplissez les seringues avec des solutions expérimentales, par exemple des perles d’ADN; enzyme; et ATP. Remettez les seringues dans la pompe et connectez-les aux vannes de commutation.
  2. Dans cette position, forcez manuellement les pistons vers le bas de 5 à 10 μL pour éliminer les bulles. Réglez la position de la vanne de commutation sur Ouvert.
  3. Utilisez le schéma de débit pour obtenir une vitesse d’écoulement du fluide optimale pour le piégeage et la visualisation, comme indiqué dans le tableau 1. L’écoulement optimal du fluide pour le piégeage optique devrait permettre un piégeage stable des billes et une fois l’ADN étiré, il devrait être de forme B (~ 3 000 bp / μm).

8. Piégeage de billes de polystyrène avec des molécules d’ADN uniques attachées

  1. À un grossissement de 10x, localisez la frontière entre les flux de fluide à proximité des points d’entrée du canal. Ajoutez de l’huile à l’objectif 100x et passez au grossissement plus élevé.
  2. Ouvrez les volets des pièges optiques (les deux ou un à la fois). Les faisceaux laser focalisés devraient piéger les billes et l’ADN devrait s’étirer immédiatement.
  3. Une fois qu’un complexe a été piégé, traduire l’étage perpendiculairement à l’écoulement (Figure 3A,C, encadré). Cela déplacera le complexe piégé de la solution de billes d’ADN dans le flux 2. Une traduction ultérieure déplacera le complexe vers le volet 3.

9. Nettoyage des cellules d’écoulement

REMARQUE: Effectuez cette opération quotidiennement.

  1. Éteignez la pompe lorsque l’expérience est terminée. Tournez les vannes de commutation en position fermée (figure 4C).
  2. Retirez les seringues et videz-les. Rincer trois fois à l’eau distillée filtrée.
  3. Remplissez les seringues avec une solution de nettoyage. Placez les seringues dans la pompe et connectez-les aux vannes de commutation.
  4. Purgez les vannes de commutation et changez la position pour l’ouvrir. Pomper 800 μL de solution de nettoyage à un débit de 100 μL/h généralement pendant la nuit.
  5. Le lendemain, fermez les vannes de commutation, puis retirez et rincez les seringues à l’eau. Rincer la cellule d’écoulement et les conduites avec 4-800 μL d’eau à un débit de 400-800 μL/h. Si un nettoyage plus rigoureux des cellules d’écoulement est nécessaire, remplacer la solution de nettoyage par du chlorhydrate de guanidium 6M.

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Representative Results

Le test initial de l’alignement et de la résistance du piège est effectué avec des billes de polystyrène non fluorescentes de 1 μm. Étant donné que la plupart des recherches effectuées en laboratoire utilisent la fluorescence, nous testons davantage la résistance du piège en utilisant des billes de polystyrène vert dragon de 1 μm (figure 1D, E). Par la suite, les travaux passent au piégeage optique des complexes ADN-billes où l’ADN est coloré avec le colorant bis-intercalant YOYO-1 14,29. Lorsque ces complexes sont piégés à 10-15 μm au-dessus de la surface de la glissière de couverture dans une cellule d’écoulement microfluidique, l’écoulement du fluide au-delà de la bille étire l’ADN (figures 3B, C). Il est important de mesurer la longueur de l’ADN étiré par le liquide pour s’assurer qu’il est étiré à sa longueur de forme B, qui est la longueur attendue. Par exemple, pour l’ADN lambda des bactériophages, la longueur totale est légèrement supérieure à 16 μm, ce qui correspond à 48 504 bp14.

Pour caractériser l’écoulement des fluides, des billes fluorescentes ont été introduites dans les cellules d’écoulement avec une hauteur de foyer de 15 μm au-dessus de la surface de glissement de couverture en utilisant différentes vitesses de pompe et dans des solutions de viscosité différente. Des films de la position des perles ont été capturés et la position des perles a été suivie à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les résultats montrent que pour des billes de 1 μm de diamètre, la vitesse linéaire peut être suivie avec précision à un débit de pompe de 100 μL/h dans des solutions de saccharose allant de 10 % à 50 % (Figure 5A). Dans des conditions similaires, la force exercée sur le cordon peut être calculée et comprise entre 10 et 400 pN, en fonction du débit de la pompe et de la viscosité de la solution (figure 5B). Enfin, l’effet d’un diamètre de bille allant de 120 à 970 nm sur la force a été évalué à différentes concentrations de saccharose. Les données révèlent que des forces allant de 1 à 27 pN pourraient être mesurées en attachant des billes de diamètre différent à une protéine motrice et en demandant au moteur de tirer cette bille contre l’écoulement du fluide (Figure 5C).

Figure 1
Figure 1 : Disposition optique et démonstration de l’activité de piégeage. (A) Schéma de la disposition optique avec le faisceau IR en rouge et le faisceau HeNe en noir. (B) Photographie de composants optiques montés sur une planche à pain. Les numéros des composants des panneaux A et B sont les suivants : 1), expanseur de faisceau; 2), Miroir d’interférence (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm); 3), Miroirs interférents (633 nm; R = 50 %; T = 50 %); 4-6), miroirs d’interférence (Rmax = 633 nm); 7), miroir d’interférence (Rmax = 1064 nm; Tmax= 633 nm); 8), miroir d’interférence (Rsmax = 1064 nm; Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), miroir d’interférence (Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), miroir d’interférence (Rmax = 1064 nm); 11), lentille d’objectif, f = 110 nm; 12), lentille Telan; 13), miroirs galvaniques; 14-16), rotateurs (/2); 17), obturateur de canal de balayage IR; 18), Obturateur à canal visible; 19), obturateur à canal fixe IR; 20), Faisceau s’arrête et 21), Miroir d’interférence (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). C) Mesure de la puissance de sortie. La puissance de sortie du laser est mesurée avant l’installation de la tête laser dans la disposition optique. Une fois l’alignement du piège effectué, la puissance du faisceau est mesurée après l’objectif 100x pour chaque piège. (D) et (E) Images montrant le piégeage optique stable de billes fluorescentes de 1 μm. F, piège fixe et M, piège mobile avec le piège mobile en mode balayage se déplaçant à travers un petit cercle (D) ou grand (E) à 30 mHz. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Cellules d’écoulement microfluidique. (A) Assemblage d’une cellule d’écoulement à trois canaux en verre borosilicate. (B) Un collecteur pour positionner de manière stable les cellules d’écoulement pendant le collage du connecteur. En haut, la base du collecteur en aluminium avec une section encastrée de 1 mm pour positionner latéralement la cellule d’écoulement. Les quatre poteaux (un dans chaque coin) guident le couvercle du collecteur en position, tandis que les boulons filetés plus centraux sont utilisés pour serrer le couvercle en place. Couvercle inférieur du collecteur avec des trous percés pour correspondre aux poteaux et boulons de la base du collecteur. (1), les écrous qui se fixent aux boulons de base du collecteur; (2) des ressorts qui sont placés entre les écrous et le couvercle du collecteur pour fournir une légère tension pendant le processus de collage. (C) Vue rapprochée de la convergence des canaux d’entrée en un flux de fluide unique commun dans une cellule d’écoulement en verre avec des connecteurs déjà fixés. Un quart est placé à côté de la cellule d’écoulement comme référence. (D) Une image de la cellule de flux PDMS. Les couches PDMS ont une épaisseur de 3 mm. (E) Une cellule d’écoulement en silice fondue avec raccords luer. (F) Une cellule d’écoulement en verre borosilicaté avec des connecteurs press-fit en place. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Caractéristiques d’écoulement du fluide à travers une cellule d’écoulement en verre. (A) L’écoulement du fluide à l’intérieur de la cellule d’écoulement est laminaire. Le schéma montre la cellule d’écoulement par le haut pour démontrer que la diffusion intercanal est la principale source de mélange entre les flux de fluide adjacents. La direction de l’écoulement est indiquée par des flèches bleues et les flux individuels sont colorés en blanc, gris clair et blanc. Les régions d’élargissement de la diffusion transversale entre les canaux sont indiquées en rouge. L’encart montre une image de fluorescence de flux de fluides adjacents à un grossissement de 10x avec des complexes ADN-billes marqués par fluorescence dans le flux inférieur et tampon uniquement dans le flux supérieur. Les taches blanches dans le flux supérieur sont le bruit de la caméra CCD. (B) Le profil d’écoulement (violet clair) dans les cellules à flux laminaire est parabolique. La cellule d’écoulement est vue de côté et la direction de l’écoulement est indiquée au-dessus de chaque cellule. Les vitesses de fluide les plus rapides se produisent dans la cellule d’écoulement située au centre, tandis que les vitesses de fluide les plus lentes se produisent à côté des surfaces de la cellule d’écoulement. Par conséquent, pour un complexe ADN-billes optiquement piégé positionné au centre de la cellule d’écoulement, l’écoulement du fluide étire la molécule d’ADN λ du bactériophage (48 504 pb) à 16 μm (forme B) afin que la visualisation claire puisse être faite (image de gauche). En revanche, la même molécule positionnée près de la surface de la cellule d’écoulement connaît de faibles débits et ne peut pas être étirée. (C) Un seul complexe de billes d’ADN est positionné dans une cellule d’écoulement. Différentes cellules d’écoulement en profondeur peuvent être utilisées mais, dans chaque cas, les alignements du faisceau peuvent être réglés de manière à ce que le piégeage optimal se produise à 10-20 μm au-dessus de la surface du glissement de couverture, ce qui élimine les effets de surface et a un écoulement stable afin que les molécules d’ADN puissent être étirées à la forme B. Comme indiqué dans l’image de gauche en (C), l’ADN est étiré pour permettre une visualisation claire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Contrôle de l’écoulement et de la réaction de l’ADN piégé optiquement dans une cellule d’écoulement au microscope. (A) Accouplement de la cellule d’écoulement à une pompe à seringue. Une photographie d’une cellule d’écoulement à trois canaux reliée à une pompe à seringue via des vannes de commutation à trois voies est présentée. La cellule d’écoulement est maintenue en place sur une platine motorisée dans un microscope inversé. La cellule d’écoulement est reliée à une conduite de déchets (à gauche) et à des vannes de commutation (cercle cyan pointillé) via un tube orange de 500 μm (indiqué par du ruban vert). Les vannes sont montées de manière stable sur un collecteur sur mesure adapté à l’appareil de pompe à seringue, qui abrite des seringues étanches au gaz de 1 ml (des flèches jaunes délimitent les pistons). Les conduites de déchets sont utilisées pour éliminer les bulles d’air qui peuvent être piégées dans la vanne de commutation lors des changements de seringue. (B) Vue rapprochée de la cellule d’écoulement à trois canaux. Pour faciliter la visualisation des flux de fluide, les flux extérieurs ont été colorés avec du colorant alimentaire avec le flux central contenant uniquement de l’eau. La région zoomée indique comment un complexe molécule de perles-ADN piégé optiquement est traduit d’un flux fluide à l’autre (flèche bleue) en traduisant l’étage perpendiculairement à l’écoulement (flèche noire). C) Schéma des vannes de commutation à trois voies indiquant leur position opérationnelle. Les désignations de lettres F, S et W correspondent au fluide de direction et peuvent s’écouler vers la cellule d’écoulement, la seringue et les déchets, respectivement. Un port est fermé en permanence comme indiqué par la fiche noire sur le dessus de chaque schéma. En position ouverte ou opérationnelle (panneau de gauche), le flux de fluide passe directement à travers la vanne de commutation de la seringue (S) à la cellule d’écoulement (F). En position fermée (panneau de droite), le cadran est tourné de manière à ce que la cellule d’écoulement soit isolée de l’environnement. Dans cette position, le flux est dirigé vers les déchets et les seringues peuvent être éteintes sans introduire de bulles d’air dans la cellule d’écoulement. Comme les vannes ont un volume mort de 6 μL, très peu de solution est gaspillée lors de la purge des conduites avant de revenir à la configuration Open. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Le mouvement du cordon et la force opposée sont affectés par l’écoulement du fluide. (A) La vitesse linéaire du cordon est affectée par la vitesse de la pompe et la concentration de saccharose. (B) La force opposée sur une bille est affectée par la viscosité de la solution. (C) Le diamètre des billes influence la force exercée sur les billes sous l’écoulement. Dans toutes les expériences, des billes fluorescentes ont été utilisées (vert dragon). Dans (A) et (B), des billes de 0,97 μm de diamètre ont été utilisées et dans (C), des billes de diamètre différent ont été utilisées. Les solutions de saccharose ont été fabriquées dans de l’eau ultrapure, filtrées à travers des filtres de 0,2 μm et l’indice de réfraction mesuré à l’aide d’un réfractomètre portatif, la viscosité étant déterminée en centipoise à l’aide des tables de la CITP et finalement convertie en unités SI en mPa.s. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Débit (μL/h)b Temps par pas (min) Volume distribué (μL)
800 5 67
400 5 33
200 5 17
100 5 8
50 5 4
25 5 2
15 5 ou plus 1 ou plus
un. Il s’agit de débits de fluide calculés par le logiciel de pompe à seringue et uniques pour chaque diamètre de seringue utilisé. Les débits permettent un remplissage rapide des conduites et de la chambre d’écoulement (800 μl/h), suivi d’une diminution progressive jusqu’au débit idéal pour le piégeage et la visualisation
b. La pompe à seringue peut être contrôlée à partir du clavier ou à l’aide d’un logiciel fourni par le fournisseur.

Tableau 1 : Débits de fluide pour minimiser les bulles et obtenir un piégeage stable.

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Discussion

L’assemblage soigneux du système d’écoulement est essentiel au succès des expériences 4,6. L’un des aspects les plus difficiles du protocole est la fixation des connecteurs à la surface du verre. Pour cela, nous utilisons les deux approches suivantes : les connecteurs de tubes press-fit et les assemblages nanoports. Les connecteurs press-fit adhèrent facilement au verre, puis poussent les tubes en PTFE dans les trous préformés à l’aide de pinces. Lorsqu’un accessoire plus stable est nécessaire, le collage des assemblages nanoports est préférable. Avec une utilisation et un nettoyage soigneux, une seule cellule d’écoulement en verre avec des assemblages permanents peut être utilisée pendant plus de 1 an. Si les cellules d’écoulement doivent être changées plus fréquemment, les cellules d’écoulement PDMS peuvent être utilisées car elles constituent une alternative excellente et moins chère. Ils peuvent être réutilisés, mais le PDMS est sensible au gonflement, ce qui peut modifier le comportement de l’écoulement du fluide au fil du temps.

Les cellules d’écoulement en verre et PDMS ne sont pas indestructibles. En laboratoire, le débit maximal utilisé est de 800 μL/h. Si ce chiffre est dépassé quotidiennement et/ou pendant de longues périodes, une déformation des cellules d’écoulement (cellules d’écoulement en verre) et une distorsion du PDMS peuvent se produire. Bien que la procédure initiale de mouillage avec du méthanol et de l’eau prenne du temps, cela en vaut la peine car toutes les bulles sont éliminées et des fuites au niveau des connecteurs peuvent également être détectées. Les cellules d’écoulement décrites ici offrent une flexibilité aux expériences en cours. En utilisant ces approches de différentes cellules d’écoulement, de tubes et de fixation de différents connecteurs, les conditions expérimentales peuvent être facilement adaptées et rapidement optimisées pour garantir l’obtention de données optimales. Des cellules d’écoulement de canal en forme de Y sont présentées, mais une large gamme de conceptions de dispositifs microfluidiques est disponible auprès de plusieurs entreprises, à la fois sans et avec des connecteurs connectés. Cela offre à l’investigateur une flexibilité encore plus grande dans la conception expérimentale.

L’utilisation de vannes de commutation à quatre voies est une méthode simple et efficace qui garantit qu’une fois le système de débit assemblé et testé, il devient effectivement un environnement fermé, où la contamination est minimale et où les bulles sont éliminées. Ce dernier est essentiel car les bulles ont tendance à se comprimer et à se décompresser au hasard au cours d’une expérience, ce qui perturbe l’écoulement du fluide, ce qui fait que les molécules d’ADN piégées se déplacent de manière inattendue et même se brisent. Il faut prendre grand soin de s’assurer qu’ils sont empêchés de se former dans le système.

Enfin, le système décrit ici est optimisé pour la biochimie visuelle où une analyse minutieuse de l’ADN, des billes attachées aux protéines ou des protéines marquées par fluorescence peut être effectuée. Bien que le système ne soit pas conçu pour effectuer des mesures de force avec les pièges doubles et l’ajout de photodétecteurs quadrant, les forces peuvent être mesurées en attachant des billes de diamètre différent aux protéines motrices d’ADN, par exemple, et en demandant au moteur de tirer cette bille contre l’écoulement du fluide. En faisant varier la viscosité de la solution, l’écoulement du fluide et le diamètre du cordon, une large gamme de forces opposées peut être appliquée pour fournir un aperçu détaillé de la fonction des protéines motrices (Figure 5). Il s’agit d’un moyen simple et peu coûteux de mesurer les forces associées aux transactions biologiques, mais il manque la précision associée à des approches plus sensibles. Lorsque l’approche biochimique visuelle est combinée à des méthodes sensibles de détection de force, des images plus complètes des réactions biochimiques peuvent être fournies.

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Disclosures

L’auteur ne déclare aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

La recherche dans le laboratoire Bianco est soutenue par les subventions GM100156 et GM144414 des NIH à P.R.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x objective Leica 506318 or 506038 Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective Leica 506263 Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads Bangs Labs FSDG004 Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads Bangs Labs CPO1004 Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective Leica 506081 Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser Lumentum 1100 series 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera Amscope MU303 A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software Hamamatsu HCImage Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4 Hamamatsu c13440-20cu CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera Spot imaging solutions DE50CMT Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube Semrock cy5-404a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube Semrock fitc/txred-2x-b-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing Grace Bio 46004 PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube Semrock gfp-3035b-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells Translume Custom Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue Loctite 233841 Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells CIDRA Precision services Custom design Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution Hamilton 18311 Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software Media cybernetics Image Pro Premiere Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software Fiji/NIH Image/Image J Shareware Analysis of images and single molecule tracking
Image display card Melles Griot 06 DLA 001 Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil Zeiss 444960 Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools Thor labs FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1  Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer Canadian Photonics labs IR 3150 Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter Thor labs Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe) Thor labs LG7 or 8 Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR) Thor labs LG11 Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube Semrock mcherry-a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope Leica DMIRE2 DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software  UCSF/shareware uManager Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly IDEX N333 Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support Thor Labs PA52502 Active isolation table support
Optics and lenses Solar TII Various Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells ufluidix Custom Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing IDEX 1532 Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube Semrock lf488/543/635-3x-a-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors GraceBio 46003 Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors GSI Lumonics VM500 Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 68042-08 Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves IDEX V-101T Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold Machine shop None Custom built
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software Harvard Apparatus 70-6000 Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes Hamilton 81320 Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top Thor Labs T36H Optical table top or breadboard
Trapping laser Newport/Spectra Physics J-series; BL106C Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser

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References

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Biochimie numéro 189
Utilisation de pincettes optiques doubles et de microfluidique pour les études sur une seule molécule
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Bianco, P. R. Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies. J. Vis. Exp. (189), e64023, doi:10.3791/64023 (2022).

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