Summary
マイクロ流体チャンバーを介して研究される視覚的な単一分子生化学は、ガラスバレル、気密シリンジ、チューブとフローセルへのチューブの安定した接続、およびシリンジとチューブの間に切り替えバルブを配置することによる気泡の除去を使用して大幅に促進されます。このプロトコルは、DNAトランザクションと分子間相互作用の視覚化を可能にするデュアルオプティカルトラップを記述します。
Abstract
視覚生化学は、バルク相研究で行われる平均化では不明瞭な単一酵素または酵素複合体の確率的特性を観察するための強力な手法です。視覚化を実現するために、一方のトラップが固定され、もう一方のトラップが可動であるデュアル光学ピンセットが、倒立蛍光顕微鏡のステージ上に配置されたマルチストリームマイクロ流体チャンバーの1つのチャネルに焦点を合わせられます。光ピンセットは、蛍光標識されたDNAの単一分子をトラップし、チャンバー内を流れてトラップされたビーズを通過し、DNAをB型(最小の力、つまり0 pN)に伸ばし、核酸は黒い背景に対して白いひもとして観察されます。DNA分子は、段階を流れに垂直に変換して、制御された方法で反応を開始できるようにすることで、ある流れから次の流れに移動します。成功を達成するために、光学的に透明なチャネルを備えたマイクロ流体デバイスは、シリンジポンプの所定の位置に保持されたガラスシリンジと嵌合されます。最適な結果を得るには、フローセルに恒久的に接着されたコネクタ、機械的に剛性があり耐薬品性があり、層流を妨げる気泡を除去するスイッチングバルブに接続されたチューブを使用します。
Introduction
タンパク質とDNAの相互作用を1分子レベルかつリアルタイムで可視化できることは、ゲノムの安定性に関する重要な洞察を提供しました1,2。DNAの単一分子を一度に1つずつ扱うことに加えて、近くの個々の分子間のトランザクションを表示する機能は、追加の洞察を提供します3,4,5。追加のDNA分子の操作には、追加の光学トラップと、高品質のマルチチャネルマイクロ流体フローセルの両方が必要です6。
複数の光トラップを生成するには、いくつかの方法があります。これらには、検流計走査ミラー、音響光学変調器、および回折光学系が含まれ、ホログラフィック光ピンセット4、7、8、9を生成します。多くの場合、走査ミラーと音響光学変調器は、タイムシェアするトラップを生成します。ここで説明するセットアップでは、単一のNd:YAGレーザーのビームが偏光で分割され、ガルバノメーターレーザースキャニングミラーがモバイルトラップと呼ばれる位置を制御します(図1)4。トラップビームを顕微鏡対物レンズの背面開口部に向けるためのミラーとフィルターの位置決めを容易にするために、HeNeレーザーが使用されます。これにより、HeNeビームは肉眼で見えるのに対し、赤外線ビームは見えないため、全体的な位置合わせが容易になります。HeNeビームは、ミラーやその他のコンポーネントの位置決めのストレスを軽減するためにもより安全です。最初は、このレーザーのビームパスは1064 nmビームから分離されていますが、同じビームパスに導入され、次に顕微鏡対物レンズに導入されます。物理的な位置合わせが達成されると、HeNeビームの上に1064nmビームを配置し、赤外線ビューアとさまざまなビームイメージングツールを使用してビームの位置と品質を視覚化することで、これが容易になります。次に、ビームエキスパンダーが導入され、結果として生じる拡張された赤外線ビームが対物レンズの背面開口部に位置合わせされます。最後に、対物レンズを取り除き、各偏光ビームのパワーを測定し、λ/2波長板を使用して等しくなるように調整します(図1C)。電力測定は、目標が返されると実行され、通常、53%の電力損失が発生します。ただし、焦点面に安定した固定および移動する光学トラップを形成するのに十分な電力があります(図1D)。
DNAトランザクションを画像化するために、マイクロ流体フローセルは、高い空間分解能と時間分解能で単一分子レベルでの制御された測定を可能にするため、重要な役割を果たします(図2)。マイクロ流体という用語は、5〜500μm10,11の範囲の寸法を有する1つ以上のチャネル内の流体を操作する能力を指す。ストリームという用語は、チャネル内の実際の流体を指し、チャネルは、流体ストリームが移動する物理チャネルを指します。シングルチャンネルフローセル設計には、反応が観察される共通の物理チャネルがあり、通常は流体の流れが1つだけ存在します。したがって、これらの設計はシングルストリームフローセルとして知られています。対照的に、マルチストリームフローセルは、2つ以上の入口チャネルが単一の共通の物理チャネルに収束するマイクロ流体デバイスとして定義されます(図2A)。共通チャネル内では、個々のチャネルから発生する流体の流れは互いに平行に流れ、拡散によって発生するそれらの間の混合を最小限に抑えて分離されたままになります(図2B)。ほとんどの実験セットアップでは、1つのポンプが同じ速度で流体を各チャネルに押し込みます。対照的に、バウンダリーステアリングを使用する場合、3つ以上の独立して制御されたポンプが流体をチャネルに押し込みます。ただし、各ポンプは異なる速度で動作しますが、共通チャネルの正味流量は一定12です。これにより、ポンプ速度を変更するだけで、メインチャネルコンポーネントの迅速な交換が可能になります。
層流に加えて、別の重要な要素は、層流内の放物線速度プロファイルです。最も高い流速は流れの中央で発生し、最も遅い流速はサーフェスの隣で発生します(図2C)13。このプロファイルは、蛍光DNAの正確な可視化と正確な単一分子分析のために、ストリームに保持されたビーズに付着したDNA分子を完全に引き伸ばすために考慮する必要があります。ここでは、DNAはB型に伸張され、0pNの力で所定の位置に保持されます。これを実現するには、光学トラップ位置の焦点を底部カバースリップ面から10〜20μmの位置に配置する必要があります(図2D)。DNA分子がB型を超えて引き伸ばされないように注意する必要があります これは酵素反応を阻害する可能性があるためです。一般的なバッファー条件下では、1 μm = 3,000 bp の DNA14 です。さらに、カバーガラスから10〜20μmをトラップすることにより、DNA複合体は表面から遠くに配置され、それによって表面相互作用が最小限に抑えられます。
マイクロ流体デバイスチャネルを作成するために多くの方法が使用されており、これらは実験室で行うことができ、またはフローセルは市販の供給源から購入することができる6、15、16、17。フローセルの構築に使用される最適な材料は、機械的に剛性があり、光学的に透明で蛍光が低く、有機溶媒を通さないものでなければなりません6。多くの場合、ホウケイ酸フロートガラスまたは溶融シリカは、光学トラップ、視覚化、および力検出に適した安定した流動環境を長時間提供するために使用されます。これらの材料はまた、表面の濡れと気泡の除去を簡素化するための非水溶媒(例えば、分光光度グレードのメタノール)、およびフローセルを洗浄するための変性剤(例えば、6M塩酸グアニジニウム)または洗剤の使用を可能にする。最後に、フローセルに流体を導入するために使用される方法は、複雑な真空ポンプシステムからシングルシリンジポンプ14、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27までさまざまです。ここで説明するアプローチでは、最大10本のシリンジを収容できるシリンジポンプが使用されます(図3A)。これにより、単一チャネルのフローセルまたは複数の入口チャネルを持つフローセルを柔軟に使用できます。ここでは、3チャンネルフローセルを使用し、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)チューブを使用してシリンジポンプの所定の位置に保持されたシリンジに嵌合します(図3A-C)。流体の流れは4方向切換弁によって制御されるため、フローセルへの気泡の導入を最小限に抑えるのに役立ちます(図3A、D)。さらに、硬いガラス壁とポリテトラフルオロエチレン(PTFE)コーティングされたプランジャーを備えたハミルトンの気密シリンジは、スムーズな流れを得るために不可欠な非常に滑らかなプランジャーの動きを提供するため、推奨されます14,27。
記載された実験系では、2〜5個の入口チャネルを有するフローセルが使用されてきた。入口チャネルの数は、実行されている実験によって決まります。RecBCDとHop2-Mnd1の研究では、2つのストリームチャネルで十分でした14,28。ヘリカーゼの場合、酵素はDNAの自由末端に結合し、マグネシウムとATPを含むストリームに翻訳されて、転座と巻き戻しを開始しました。Hop2-Mnd1の場合、光学的にトラップされたDNAは、タンパク質および緩衝液±二価金属イオンを含む隣接する流体流に翻訳されました。3チャンネルフローセルを使用すると、ストリーム1にDNAをトラップし、DNAをストリーム2に翻訳してタンパク質結合を起こし、次にATPが存在するストリーム3に移動して、たとえば反応を開始することができます。上記のバリエーションは、チャネル2で蛍光タグ付きタンパク質を使用することであり、その結果、流体の流れは完全に白色になり、DNAの視覚化が妨げられます。この分子がストリーム3に翻訳されると、反応が開始されたときにタンパク質とDNAの両方が見えるようになります。
流体の流れを制御するための4方向スイッチングバルブの使用は、フローセル内の気泡を除去するためのシステムの重要なコンポーネントです。気泡は予測できない方法で収縮および膨張し、流速の急激な変化と乱流の導入をもたらすため、安定した流体の流れに悪影響を及ぼします。シリンジとインレットチューブの間にバルブを配置すると、シリンジ交換時にバルブ位置を切り替えることで流路が切断されます。新しいシリンジが設置されたら、プランジャーを手動で押し下げて、>6μL(バルブのデッドボリューム)を排出し、気泡をほぼ完全に除去することができます。
フローセルへのコネクタの取り付けは、フローセルの使用における律速ステップであることがよくあります。圧入と呼ばれる取り外し可能なコネクタと恒久的なもの(ナノポートアセンブリ)の2種類のコネクタの使用について説明します。取り外し可能なコネクタはフローセルに簡単に接着でき、推奨されるPTFEに加えて、さまざまなタイプのフレキシブルチューブをこれらのコネクタでテストできます。これは、より高価なガラスフローセルを犠牲にすることなく、チューブとコネクタをテストするための迅速かつ費用効果の高い方法です。対照的に、ナノポートアセンブリは恒久的に取り付けられ、最大1,000psiの圧力に耐え、私たちの手では、それらの使用は異なる直径のPEEKチューブに制限されています。これは、PEEKチューブが好ましく使用されるため、不利ではありません。恒久的なアセンブリが取り付けられた単一のガラスフローセルは、慎重に使用することで1年以上再利用できます。
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Protocol
1.ポリスチレンビーズによるレーザートラップの位置合わせとテスト
メモ: セットアップについては、 図1A、Bを参照してください。
注意: 実験者は、レーザービームの位置合わせ中に適切な保護眼鏡またはレーザー安全メガネを着用する必要があります。本明細書で説明する光ピンセットシステムはHeNeビームとIRビームの両方を使用するため、2セットのレーザー安全ガラス器具が必要です。
- HeNeビームアライメント
- すべての光学部品をブレッドボードに配置します。ブレッドボードを、顕微鏡に対してできるだけ90°の角度に近づけるように位置合わせします。
- 対物レンズとテランレンズが入った相手チューブを顕微鏡に取り付けます(図1A-11,12)。
注意: テランレンズは、接眼レンズの中間像面に画像を焦点合わせるために使用されるレンズシステムです。 - HeNeレーザーをオンにしてシャッターを開きます(図1A-18)。ビームは、光の50%をミラー5(図1A-5)に反射する54mmの高さでフィルター(図1A-5)に当たるはずです。ビームの残りの50%は、ミラー3と同じ高さでミラー4(図1A-4)に当たります。
- ミラー4(図1A-4)を調整して、ビームが51mmの高さでミラー6(図1A-6)に当たるようにします。
- ビームが51mmの高さで下部ガルバニックミラーに向けられるようにミラー6(図1A-6)を調整します。上部ガルバニックミラーから出るビームは57.5mmになります。
- このビームが57.5mmの高さでミラー5(図1A-5)に当たるように、ミラー3(図1A-3)を調整します。ミラー5で反射されると、ビームは同じ高さでミラー9(図1A-9)に当たるはずです。ビームはミラー9で効果的に再結合され、対物レンズとテランレンズシステムを通過してミラー21(図1A-21)に反射し、対物レンズに反射します。
- きれいな顕微鏡スライドを顕微鏡のステージに置きます。カメラの電源を入れ、固定ビームとスキャンビームのビームを画面上で個別に画像化します。ミラー3から始めて、次に5と9、最後に21で、固定ビームを画面の中央に配置するために小さな調整を実行します。
- ビーム出射ミラー21の角度が90°になるようにするには、顕微鏡のZ高さを変更し、スライドの上面と下面に結像したビームを配置します。それらが同一である場合、ビームはステージに垂直な正しい位置にあります。シャッター19を使用してこのビームをシャッターします(図1A-19)。
- ミラー4と6から始めて、固定ビームを画面の中央に配置するために小さな調整を実行します。このビームをシャッターします。
- 赤外線(IR)ビームアライメント
注意: 安全上の理由から、すべての手順を低レーザー出力で実行してください。- 波長板14(図1A-14)を調整して、ビームスプリッタ2で分割される透過ビームと反射ビームの比率を調整します(図1A-2)。ビームスプリッタ2は、レーザ光のs成分を反射し、p成分を透過する。
- 2を通過するビームはミラー7に当たり(図1A-7)、ビームを下部ガルバニックミラーに偏向させます。それはミラー21へのHeNeビームの経路をたどるべきです。この位置決めを達成するために、ミラー7の小さな動きを実行します。
- ミラー2で反射されたビームが57.5mmの高さでミラー10(図1A-10)に当たるようにミラー2を調整します。
- ビームはミラー10から57.5mmの高さでミラー8(図1A-8)に反射されます。後続のビームは同じ高さでミラー9に当たるはずです。そうでない場合は、必要に応じてミラー10と8を微調整します。
- 対物レンズを取り外し、対物レンズ砲塔のポートにパワーメーターのヘッドを置きます。
- プレート14、15、および16(図1A-14、15、16)を使用して、図1Cに示すように、各レーザービームの出力が等しくなるように調整します。
- ビームエキスパンダ1(図1A-1)を所定の位置に取り付けます。拡張されたレーザービームを、コマや乱視のない円形になるように調整します。
- 光学トラップをテストするには、水に懸濁した1μmのポリスチレンビーズの溶液を作ります。次に、この溶液10 μLを顕微鏡スライドに置き、カバーガラスを上に置き、マニキュアで密封します。スライドを顕微鏡ステージに置き、これらの1μmビーズをトラップして光学トラップをテストします。ステージを移動するときにビーズがトラップに吸い込まれ、安定して保持されていることを確認してください。トラップは、トラップのすべての側面から等しく効率的に行う必要があります。
2. マイクロ流体チャンバーの準備
- フローセルがカバーガラス上のポリジメチルシロキサン(PDMS)から作られた市販のデバイスである場合は、手順3に進みます。コネクタが取り付けられたガラスデバイスの場合は、手順4に進みます。
- フローセルにコネクタが取り付けられていない場合は、最初に顕微鏡スライドの入口穴にコネクタを接着します。コネクタを接続する手順については、手順 3 を参照してください。
3. PDMSフローセルを使用したフローセル接続
メモ: セットアップについては、 図 2D を参照してください。
- フローセルをきれいな平らな面に置きます。PTFEチューブを自由端から3mm離して鉗子で保持します。チューブを事前に形成されたポートに押し込みます(ポートは2バールライン圧力をサポートできます)。
- 残りの各ポートについて、この手順を繰り返します。入口ポートをシリンジポンプに接続し、出口を廃棄物ボトルに接続します(図4A、B)。
- 各ガラスシリンジに1 mLの分光光度グレードのメタノールを充填します。各シリンジをスイッチングバルブに取り付けます。バルブに廃棄物に向けられた出口があることを確認し、各ラインに50 μLのメタノールをパージします(図4C、閉位置)。
- 出口位置をフローセルに切り替えます(図4C、開位置)。800 μLのメタノールを100 μL/hの流量でフローセルに通し、表面を濡らして気泡を除去します。
- 翌日、800μLの超純水を用いてこのプロセスを繰り返します。これで、フローセルを使用する準備が整いました。
4. 圧入チューブコネクタの取り付け
メモ: セットアップについては、 図 2F を参照してください。
- 圧入チューブコネクタを使用する場合は、コネクタの片側から粘着テープを慎重にはがし、顕微鏡スライドの穴の上に置きます。数秒間押し下げます。残りのコネクタについてもこのプロセスを繰り返します。
- フローセルをきれいな平らな面に置きます。PTFEチューブを自由端から3mm離して鉗子で保持します。チューブをポートの事前に形成された穴に押し込み、残りのポートごとにこの手順を繰り返します。
- 入口からスイッチングバルブにチューブを取り付けます。手順 7 に進みます。
5.常設総会の添付
メモ: セットアップについては、図 2A-C を参照してください。
- 清潔で平らな面または特注のマニホールドで取り付けを行い、接着中にフローセルとコネクタを所定の位置に保持します。
- フローセルを清潔な平らな面またはマニホールドのくぼんだ部分に置きます(図2B)。アセンブリの底に少量のガラス接着剤を置き、シールを挿入します。
- ナノポートを顕微鏡スライドの入口穴の1つに配置します。ゆっくりと押し下げ、横方向に動かさずに所定の位置に保持します。残りのポートについてもこのプロセスを繰り返します。
- マニホールド内の所定の位置に乾燥またはクランプします。フローセルをマニホールドからそっと取り外し、アセンブリがフローセルの入力ポートとうまく位置合わせされていることを確認します。準備ができたら、手順 7 に進みます。
6. フローセルの接続と準備
メモ: セットアップについては、 図 4A、B を参照してください。
- 顕微鏡ステージにフローセルを置きます。フィンガータイトコネクタを使用してチューブを取り付けます。
- 各ガラスシリンジに1 mLの分光光度グレードのメタノールを充填します。各シリンジをスイッチングバルブに取り付けます。バルブに廃棄物に向けられた出口があることを確認し、各ラインに50 μLのメタノールをパージします(図4C、閉位置)。
- 出口位置をフローセルに切り替えます(図4C、開位置)。800 μLのメタノールを100 μL/hの流量でフローセルに通し、表面を濡らして気泡を除去します。
- 翌日、800μLの超純水を用いてこのプロセスを繰り返します。これで、フローセルを使用する準備が整いました。
7.流体の流れの制御
- スイッチングバルブを閉位置に回します(図4C)。シリンジを取り外し、残留水を廃棄し、シリンジに実験溶液、例えばDNAビーズを充填する。酵素;とATP。シリンジをポンプに戻し、スイッチングバルブに接続します。
- この位置で、プランジャーを手動で5〜10μL押し下げて気泡を取り除きます。スイッチングバルブの位置を オープンに変更します。
- 流量スキームを使用して、 表1に概説されているトラップと視覚化に最適な流体流速を実現します。光トラップに最適な流体の流れは、ビーズの安定したトラップを可能にし、DNAが伸張されると、B型(~3,000 bp/μm)になるはずです。
8. 単一DNA分子を結合させたポリスチレンビーズのトラップ
- 10倍の倍率で、チャネルエントリポイントに近い流体ストリーム間の境界を見つけます。100倍の対物レンズにオイルを加え、高倍率に切り替えます。
- 光トラップのシャッターを開きます(両方または一度に1つ)。集束されたレーザービームはビーズをトラップし、DNAはすぐに伸びるはずです。
- 複合体がトラップされたら、ステージを流れに垂直に移動します(図3A、C、挿入図)。これにより、トラップされた複合体がDNAビーズ溶液からストリーム2に移動します。さらに変換すると、複合体がストリーム3に移動します。
9.フローセルのクリーニング
注:これを毎日実行してください。
- 実験が完了したら、ポンプをオフにします。スイッチングバルブを閉位置に回します(図4C)。
- 注射器を取り外して空にします。ろ過した蒸留水で3回すすいでください。
- シリンジに洗浄液を入れます。シリンジをポンプに入れ、スイッチングバルブに接続します。
- スイッチングバルブをパージし、位置を変更して開きます。800 μLの洗浄液を100 μL/hの流量で通常一晩ポンプで送ります。
- 翌日、スイッチングバルブを閉じてから、シリンジを取り外して水ですすいでください。フローセルとラインを4〜800μLの水で400〜800μLの流量で洗い流します。フローセルのより激しい洗浄が必要な場合は、洗浄液を6 M塩酸グアニジウムと交換してください。
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Representative Results
トラップの位置合わせと強度の初期テストは、1 μmの非蛍光ポリスチレンビーズで行われます。実験室で行われる研究のほとんどは蛍光を使用しているため、1μmのドラゴングリーンポリスチレンビーズを使用してトラップ強度をさらにテストします(図1D、E)。その後、DNAをビスインターカレート色素YOYO-1で染色するDNAビーズ複合体の光学トラップに変わります14,29。これらの複合体がマイクロ流体フローセルのカバーガラス表面から10〜15 μm上にトラップされると、ビーズを通過する流体の流れがDNAを伸ばします(図3B、C)。流体で引き伸ばされたDNAの長さを測定して、予想される長さであるB体の長さまで引き伸ばされていることを確認することが重要です。例えば、バクテリオファージラムダDNAの場合、全長は16μmよりわずかに長く、これは48,504bp14に相当する。
流体の流れを特徴付けるために、蛍光ビーズを、異なるポンプ速度と異なる粘度の溶液を使用して、カバーガラス表面から15μm上の焦点高さのフローセルに導入しました。ビーズ位置の動画を撮影し、画像解析ソフトを用いてビーズ位置を追跡した。結果は、直径1μmのビーズの場合、10%〜50%の範囲のショ糖溶液中で100μL/hのポンプ流量で線速度を正確に追跡できることを示しています(図5A)。同様の条件下で、ビーズにかかる力を計算することができ、ポンプの流量と溶液の粘度に応じて、10〜400 pNの範囲であることがわかります(図5B)。最後に、力に対する120〜970nmの範囲のビーズ直径の影響を、異なる濃度のスクロースで評価した。データは、異なる直径のビーズをモータータンパク質に取り付け、モーターにそのビーズを流体の流れに逆らって引っ張るように要求することによって、1〜27pNの範囲の力を測定できることを示しています(図5C)。
図1:光学レイアウトとトラップ活動のデモンストレーション。 (A)赤のIRビームと黒のHeNeビームを使用した光学レイアウトの概略図。(B)ブレッドボードに実装された光学部品の写真。パネルAとBのコンポーネント番号は次のとおりです:1)、ビームエキスパンダー。2)、干渉ミラー(Rsmax = 1064 nm;Tpmax = 1064 nm);3)、干渉ミラー(633 nm;R = 50%;T = 50%);4-6)、干渉ミラー(Rmax = 633 nm);7)、干渉ミラー(Rmax = 1064 nm;Tmax= 633 nm);8)、干渉ミラー(Rsmax = 1064 nm;Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm);9)、干渉ミラー(Rmax = 1064 nm、633 nm;Tmax = 1064 nm, 633 nm);10)、干渉ミラー(Rマックス= 1064nm);11)、対物レンズ、f = 110 nm;12)、テランレンズ;13)、ガルバニックミラー。14-16)、ローテーター(/ 2);17)、IRスキャンチャンネルシャッター。18)、可視チャンネルシャッター。19)、IR固定チャンネルシャッター。20)、ビームストップおよび21)、干渉ミラー(Rmax = 1064 nm;Tmax = 633 nm)。(C)電力出力の測定。レーザーからのパワー出力は、レーザーヘッドを光学レイアウトに取り付ける前に測定されます。トラップアライメントが完了すると、各トラップの100倍の対物レンズの後にビームパワーが測定されます。(D)および(E)1μm蛍光ビーズの安定した光学的トラップを示す画像。F、固定トラップおよびM、スキャンモードのモバイルトラップが30mHzで小さな(D)または大きな(E)円を通過するモバイルトラップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:マイクロ流体フローセル。 (A)ホウケイ酸ガラス製の3チャンネルフローセルの組み立て。(B)コネクタボンディング中にフローセルを安定に配置するマニホールド。上部、フローセルを横方向に配置する1mm凹部を有するアルミニウムマニホールドの基部。4本の支柱(各コーナーに1本ずつ)がマニホールドの蓋を所定の位置に導き、より中央に配置されたネジ付きボルトを使用して蓋を所定の位置に固定します。マニホールドベースの支柱とボルトに一致するドリル穴を備えた下部のマニホールド蓋。(1)、マニホールドベースボルトに取り付けるナット。(2)ナットとマニホールドリッドの間に配置され、接着プロセス中に軽い張力を提供するスプリング。(C)コネクタがすでに取り付けられているガラスフローセル内の共通の単一の流体流への入口チャネルの収束の拡大図。四分の一は、参照としてフローセルの隣に配置されます。(D)PDMSフローセルの画像。PDMS層の厚さは3mmです。(E)ルアーコネクタ付きの溶融シリカフローセル。(F)圧入コネクタが所定の位置にあるホウケイ酸ガラスフローセル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ガラスフローセルを通る流体の流れ特性。 (A)フローセル内の流体の流れは層流です。回路図は、チャネル間拡散が隣接する流体ストリーム間の混合の主な原因であることを示すために、フローセルを上から示しています。フロー方向は青い矢印で示され、個々のストリームは白、ライト グレー、および白で色付けされます。チャネル間の横方向の拡散領域の拡大領域は赤で示されています。挿入図は、下流に蛍光標識DNAビーズ複合体、上流のみに緩衝液を使用した10倍の倍率での隣接する流体流の蛍光画像を示しています。上流の白い斑点はCCDカメラからのショットノイズです。(B)層流セルの流動プロファイル(薄紫色)は放物線状です。フローセルは側面から見て、フローの方向は各セルの上に示されます。最も速い流体速度は中央にあるフローセルで発生し、最も遅い流体速度はフローセルサーフェスの隣で発生します。その結果、フローセルの中心に位置する光学的にトラップされたDNAビーズ複合体の場合、流体の流れはバクテリオファージλDNA分子(48,504 bp)を16 μm(B型)に伸ばし、明確な視覚化を行うことができます(左の画像)。対照的に、フローセルの表面近くに配置された同じ分子は、低流量を経験し、引き伸ばすことができません。(C)単一のDNAビーズ複合体をフローセル内に配置します。異なるデプスフローセルを使用できますが、いずれの場合も、カバーガラス表面から10〜20μm上で最適なトラップが発生するようにビームアライメントを設定できるため、表面効果が排除され、安定した流れが得られるため、DNA分子をB型に伸ばすことができます。(C)の左の画像に示すように、DNAは引き伸ばされ、明確な可視化が可能です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:顕微鏡ステージのフローセル内の光学的にトラップされたDNAの流れと反応の制御 。 (A)フローセルとシリンジポンプの嵌合。三方切替バルブ を介して シリンジポンプに接続された3チャンネルフローセルの写真が提示されます。フローセルは、倒立顕微鏡の電動ステージ上の所定の位置に保持されます。フローセルは、オレンジ色の500μmチューブ(緑色のテープで表示) を介して 、廃棄物ライン(左)とスイッチングバルブ(シアンの破線の円)に接続されています。バルブは、1mLの気密シリンジ(黄色の矢印はプランジャーを区切る)を収容するシリンジポンプ装置に適合した特注のマニホールドに安定して取り付けられています。廃棄物ラインは、シリンジの交換中にスイッチングバルブに閉じ込められる可能性のある気泡を除去するために使用されます。(B)3チャンネルフローセルの拡大図。流体の流れの視覚化を容易にするために、外側のものは食品着色料で着色され、中央の流れには水のみが含まれています。ズーム領域は、光学的にトラップされたビーズ-DNA分子複合体が、流れに垂直なステージ(黒い矢印)を平行移動することによって、ある流体ストリームから次の流体ストリーム(青い矢印)にどのように変換されるかを示します。(C)動作位置を示す三方切換弁の概略図。文字指定F、S、およびWは方向流体に対応し、それぞれフローセル、シリンジ、および廃棄物に流れることができます。各回路図の上部にある黒いプラグで示されているように、1つのポートが完全に閉じています。オープンまたは操作位置(左パネル)では、流体の流れはシリンジ(S)からフローセル(F)へのスイッチングバルブを直接通過します。閉じた位置(右側のパネル)では、フローセルが環境から密閉されるようにダイヤルが回されます。この位置では、流れは廃棄物に向けられ、フローセルに気泡を導入することなくシリンジを切り替えることができます。バルブのデッドボリュームは6μLであるため、オープン構成に戻す前にラインをパージするときに無駄になるソリューションはほとんどありません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ビードの動きと反対の力は流体の流れの影響を受けます。 (A)線形ビーズ速度は、ポンプ速度とスクロース濃度の影響を受けます。(B)ビードにかかる反対力は、溶液粘度の影響を受けます。(C)ビードの直径は、流れ中のビードにかかる力に影響します。全ての実験において、蛍光ビーズ(ドラゴングリーン)を用いた。(A)と(B)では直径0.97μmのビーズを用い、(C)では直径の異なるビーズを用いた。ショ糖溶液を超純水中で製造し、0.2 μmフィルターでろ過し、ハンドヘルド屈折計を使用して屈折率を測定し、ISCO Tablesを使用してセンチポアズで粘度を測定し、最終的にmPa.sでSI単位に変換しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 流量 (μL/h)b | ステップあたりの時間 (分) | 分注量(μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5名以上 | 1 つ以上 |
| ある。これらは、シリンジポンプソフトウェアによって計算された流体流量であり、使用されるシリンジの直径ごとに一意です。この流量により、ラインとフローチャンバーの迅速な充填(800 μl/hr)が可能になり、その後、トラップと視覚化に理想的な流量まで徐々に減少します。 | ||
| b.シリンジポンプは、キーパッドから、またはベンダーが提供するソフトウェアを使用して制御できます。 | ||
表1:気泡を最小限に抑え、安定したトラップを実現するための流体流量。
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Discussion
フローシステムの慎重な組み立ては、実験4,6の成功結果にとって重要です。プロトコルの最も困難な側面の1つは、ガラス表面へのコネクタの取り付けです。このために、圧入チューブコネクタとナノポートアセンブリの2つのアプローチを使用します。圧入コネクタはガラスに容易に接着し、鉗子を使用してPTFEチューブを事前に形成された穴に押し込みます。より安定した取り付けが必要な場合は、ナノポートアセンブリの接合が好ましい。慎重な使用と洗浄により、恒久的なアセンブリを備えた単一のガラスフローセルを1年以上使用できます。フローセルをより頻繁に切り替える必要がある場合は、PDMSフローセルが優れた安価な代替品であるため、使用できます。それらは再利用できますが、PDMSは膨潤しやすく、時間の経過とともに流体の流れの挙動が変化する可能性があります。
ガラスとPDMSの両方のフローセルは破壊できないわけではありません。実験室では、使用される最大流量は800μL/hです。これを毎日および/または長期間超えると、フローセルの反り(ガラスフローセル)およびPDMSの歪みが発生する可能性があります。メタノールと水での最初の湿潤手順には時間がかかりますが、すべての気泡が除去され、コネクタでの漏れも検出できるため、それだけの価値があります。ここで説明するフローセルは、行われている実験に柔軟性を提供します。さまざまなフローセル、チューブ、さまざまなコネクタの取り付けのこれらのアプローチを使用して、実験条件を容易に調整し、迅速に最適化して、最適なデータを確実に取得できます。Y字型のチャネルフローセルが提示されていますが、コネクタが取り付けられていない場合と接続されている場合の両方で、複数の企業から幅広いマイクロ流体デバイス設計が入手可能です。これにより、研究者は実験デザインにおいてさらに柔軟性が高まります。
四方切換弁の使用は、フローシステムを組み立ててテストすると、汚染が最小限に抑えられ、気泡が除去される閉鎖環境になることを保証するシンプルで効果的な方法です。後者は、気泡が実験中にランダムに圧縮および減圧する傾向があり、これが流体の流れを乱し、閉じ込められたDNA分子が予期しない方法で移動し、さらには壊れる可能性があるため、非常に重要です。それらがシステム内で形成されないように細心の注意を払う必要があります。
最後に、ここで説明するシステムは、DNA、タンパク質に付着したビーズ、または蛍光タグ付きタンパク質の慎重な分析を実行できる視覚生化学用に最適化されています。このシステムは、デュアルトラップと象限光検出器の追加で力を測定するようには設計されていませんが、たとえば、異なる直径のビーズをDNAモータータンパク質に取り付け、モーターにこのビーズを流体の流れに逆らって引っ張るように依頼することで力を測定できます。溶液の粘度、流体の流れ、ビーズの直径を変えることで、広範囲の反対の力を適用して、モータータンパク質の機能に関する詳細な洞察を得ることができます(図5)。これは、生物学的取引に関連する力を測定するための簡単で安価な方法ですが、より感度の高いアプローチに関連する精度に欠けています。視覚的な生化学的アプローチを高感度の力検出方法と組み合わせると、生化学反応のより完全な画像を提供できます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
ビアンコ研究所での研究は、NIHがGM100156およびGM144414をPRBに付与することによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
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