Summary
La bioquímica visual de una sola molécula estudiada a través de cámaras microfluídicas se facilita enormemente utilizando barriles de vidrio, jeringas herméticas al gas, conexiones estables de tubos a células de flujo y eliminación de burbujas mediante la colocación de válvulas de conmutación entre las jeringas y el tubo. El protocolo describe trampas ópticas duales que permiten la visualización de transacciones de ADN e interacciones intermoleculares.
Abstract
La bioquímica visual es una técnica poderosa para observar las propiedades estocásticas de enzimas individuales o complejos enzimáticos que están oscurecidos en el promedio que tiene lugar en los estudios de fase masiva. Para lograr la visualización, las pinzas ópticas duales, donde una trampa es fija y la otra es móvil, se enfocan en un canal de una cámara microfluídica multiflujo colocada en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertida. Las pinzas ópticas atrapan moléculas individuales de ADN marcado fluorescentemente y el flujo de fluido a través de la cámara y más allá de las perlas atrapadas, estira el ADN a forma B (bajo una fuerza mínima, es decir, 0 pN) con el ácido nucleico que se observa como una cuerda blanca contra un fondo negro. Las moléculas de ADN se mueven de una corriente a la siguiente, traduciendo la etapa perpendicular al flujo para permitir el inicio de reacciones de manera controlada. Para lograr el éxito, los dispositivos microfluídicos con canales ópticamente claros se acoplan a jeringas de vidrio que se mantienen en su lugar en una bomba de jeringa. Los resultados óptimos utilizan conectores permanentemente unidos a la celda de flujo, tubos que son mecánicamente rígidos y químicamente resistentes, y que están conectados a válvulas de conmutación que eliminan las burbujas que prohíben el flujo laminar.
Introduction
La capacidad de visualizar las interacciones proteína-ADN a nivel de molécula única y en tiempo real ha proporcionado información significativa sobre la estabilidad del genoma 1,2. Además de trabajar con moléculas individuales de ADN de una en una, la capacidad de ver las transacciones entre moléculas individuales cercanas proporciona información adicional 3,4,5. La manipulación de moléculas de ADN adicionales requiere tanto trampas ópticas adicionales como células de flujo microfluídico multicanal de alta calidad6.
Hay varios métodos disponibles para generar más de una trampa óptica. Estos incluyen espejos de escaneo galvanómetro, moduladores ópticos acústicos y óptica difractiva, que generan pinzas ópticas holográficas 4,7,8,9. A menudo, los espejos de escaneo y los moduladores ópticos acústicos producen trampas de tiempo compartido. En la configuración descrita aquí, el haz de un solo láser Nd: YAG se divide en la polarización, y luego los espejos de escaneo láser del galvanómetro controlan la posición de lo que se denomina la trampa móvil (Figura 1) 4. Para facilitar el posicionamiento de espejos y filtros para dirigir el haz de atrapamiento a la abertura posterior del objetivo del microscopio, se utiliza un láser HeNe. Esto facilita la alineación general, ya que el haz HeNe es visible a simple vista, mientras que los rayos infrarrojos no lo son. El haz HeNe también es más seguro para trabajar con lo que hace que el posicionamiento de los espejos y otros componentes sea menos estresante. Inicialmente, la trayectoria del haz para este láser está separada del haz de 1064 nm, pero se introduce en la misma trayectoria del haz y luego en el objetivo del microscopio. Una vez que se logra la alineación física, se realiza el posicionamiento del haz de 1064 nm en la parte superior del haz HeNe y esto se facilita mediante el uso de un visor infrarrojo y varias herramientas de imágenes de haz para visualizar la posición y la calidad del haz. Luego, se introduce el expansor de haz y el haz infrarrojo expandido resultante se alinea en la abertura posterior del objetivo. Finalmente, se retira el objetivo y la potencia en cada haz polarizado se mide y ajusta utilizando placas de onda λ/2 para que sea igual (Figura 1C). Las mediciones de potencia también se realizan una vez que se devuelve el objetivo y, por lo general, hay una pérdida de potencia del 53%. Sin embargo, hay suficiente potencia para formar trampas ópticas fijas y móviles estables en el plano focal (Figura 1D).
Para obtener imágenes de las transacciones de ADN, las células de flujo microfluídico desempeñan un papel clave, ya que permiten mediciones controladas a nivel de molécula única con alta resolución espacial y temporal (Figura 2). El término microfluídico se refiere a la capacidad de manipular fluidos en uno o más canales con dimensiones que van desde 5-500 μm10,11. El término corriente se refiere al fluido real dentro de un canal y el canal se refiere al canal físico en el que se mueve una corriente o corrientes de fluido. El diseño de celda de flujo de un solo canal tiene un canal físico común donde se observan las reacciones y, por lo general, solo hay una corriente de fluido presente. Por lo tanto, estos diseños se conocen como células de flujo de flujo único. En contraste, las células de flujo múltiple se definen como un dispositivo microfluídico en el que dos o más canales de entrada convergen en un solo canal físico común (Figura 2A). Dentro del canal común, las corrientes de fluido que se originan en los canales individuales fluyen paralelas entre sí, y permanecen separadas con una mezcla mínima entre ellas debido a la difusión (Figura 2B). En la mayoría de las configuraciones experimentales, una sola bomba empuja fluidos en cada canal a la misma velocidad. Por el contrario, cuando se utiliza la dirección límite, tres o más bombas controladas independientemente empujan los fluidos a través de los canales. Sin embargo, cada bomba funciona a una velocidad diferente, pero el caudal neto en el canal común es constante12. Esto permite el intercambio rápido de los componentes del canal principal simplemente alterando la velocidad de la bomba.
Además del flujo laminar, otro factor crítico es el perfil de velocidad parabólica dentro de la corriente de fluido laminar. La velocidad de flujo más alta ocurre en el medio de la corriente y la más lenta ocurre junto a las superficies (Figura 2C)13. Se debe considerar que este perfil estira completamente una molécula de ADN que está unida a una cuenta sostenida en la corriente para una visualización precisa del ADN fluorescente y análisis precisos de una sola molécula. Aquí, el ADN se estira a la forma B y se mantiene en su lugar bajo 0 pN de fuerza. Para lograr esto, el enfoque de la posición de la trampa óptica debe ser a una posición de 10-20 μm de la superficie del cubreobjetos inferior (Figura 2D). Se debe tener cuidado para que la molécula de ADN no se estire más allá de la forma B, ya que esto puede inhibir las reacciones enzimáticas. En condiciones típicas de amortiguación, 1 μm = 3.000 pb de ADN14. Además, al atrapar 10-20 μm del cubreobjetos, el complejo de ADN se coloca lejos de la superficie, minimizando así las interacciones superficiales.
Se han utilizado muchos métodos para crear canales de dispositivos microfluídicos y estos se pueden hacer en el laboratorio o las células de flujo se pueden comprar de fuentes comerciales 6,15,16,17. Los materiales óptimos utilizados para construir las células de flujo deben ser mecánicamente rígidos, ópticamente transparentes con baja fluorescencia e impermeables a los disolventes orgánicos6. Con frecuencia, el vidrio flotado de borosilicato o sílice fundida se utilizan para proporcionar un entorno de flujo estable durante un tiempo prolongado que es adecuado para la captura óptica, la visualización y la detección de fuerza. Estos materiales también permiten el uso de solventes no acuosos (por ejemplo, metanol de grado espectrofotométrico) para simplificar la humectación de la superficie y la eliminación de burbujas de aire, y desnaturalizantes (por ejemplo, clorhidrato de guanidinio 6M) o detergentes para limpiar la celda de flujo. Finalmente, los métodos utilizados para introducir fluidos en las celdas de flujo varían desde complejos sistemas de bombas de vacío hasta bombas de una sola jeringa 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. En el enfoque descrito aquí, se utiliza una bomba de jeringa que puede acomodar hasta 10 jeringas (Figura 3A). Esto proporciona flexibilidad para usar celdas de flujo de un solo canal o celdas de flujo con múltiples canales de entrada. Aquí, se utiliza una celda de flujo de tres canales y se acopla a jeringas mantenidas en su lugar en la bomba de jeringa utilizando tubos de poli-éter-éter-cetona (PEEK) (Figura 3A-C). El flujo de fluidos es controlado por válvulas de conmutación de cuatro vías y, por lo tanto, sirven para minimizar la introducción de burbujas en la celda de flujo (Figura 3A, D). Además, se recomiendan las jeringas estancas al gas Hamilton que tienen paredes de vidrio rígido y émbolos recubiertos de politetrafluoroetileno (PTFE), ya que proporcionan un movimiento de émbolo excepcionalmente suave que es esencial para obtener un flujo suave14,27.
En el sistema experimental descrito, se han utilizado células de flujo con dos a cinco canales de entrada. El número de canales de entrada está dictado por el experimento que se está realizando. Para el estudio de RecBCD y Hop2-Mnd1, dos canales de corriente fueron suficientes14,28. Para la helicasa, la enzima se unió al extremo libre del ADN y se tradujo en una corriente que contiene magnesio y ATP para iniciar la translocación y el desenrollamiento. Para Hop2-Mnd1, el ADN atrapado ópticamente se tradujo en la corriente de fluido adyacente que contiene proteínas y amortiguador ± iones metálicos divalentes. El uso de células de flujo de tres canales permite atrapar el ADN en la corriente 1, traducir el ADN en la corriente 2 para permitir que ocurra la unión a las proteínas, y luego a la corriente 3 donde el ATP está presente, por ejemplo, para iniciar reacciones. Una variación de lo anterior es usar proteína marcada con fluorescencia en el canal 2, lo que hace que la corriente de fluido sea completamente blanca e impide la visualización del ADN. Cuando esta molécula se traduce en la corriente 3, tanto las proteínas como el ADN son ahora visibles cuando se inician las reacciones.
El uso de válvulas de conmutación de cuatro vías para controlar el flujo de fluido es un componente crítico del sistema para eliminar las burbujas en las celdas de flujo. Las burbujas son perjudiciales para el flujo estable de fluidos, ya que se contraen y expanden de manera impredecible, lo que resulta en cambios rápidos en la velocidad del flujo y la introducción de turbulencias. Cuando las válvulas se colocan entre las jeringas y el tubo de entrada, la trayectoria del flujo se desconecta cambiando la posición de la válvula cuando se cambian las jeringas. Cuando se coloca la nueva jeringa, el émbolo se puede presionar manualmente para expulsar >6 μL (el volumen muerto de la válvula) y esto elimina las burbujas casi por completo.
La fijación de conectores a las celdas de flujo es con frecuencia el paso limitante de la velocidad en el uso de la celda de flujo. Describimos el uso de dos tipos de conectores: extraíbles conocidos como press-fit y permanentes (conjuntos de nanopuertos). Los conectores extraíbles son fáciles de adherir a una celda de flujo y se pueden probar diferentes tipos de tubos flexibles además del PTFE recomendado con estos conectores. Esta es una forma rápida y rentable de probar tubos y conectores sin sacrificar celdas de flujo de vidrio más caras. En contraste, los ensamblajes de nanopuertos están unidos permanentemente, soportan presiones de hasta 1,000 psi y, en nuestras manos, su uso está restringido a tubos PEEK de diferentes diámetros. Esto no es una desventaja, ya que preferiblemente se utiliza un tubo PEEK. Una sola celda de flujo de vidrio con ensamblajes permanentes unidos se puede reutilizar durante más de 1 año con un uso cuidadoso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Alineación y prueba de trampas láser con perlas de poliestireno
NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 1A,B.
PRECAUCIÓN: El experimentador debe usar gafas protectoras adecuadas o gafas de seguridad láser durante la alineación del rayo láser. Como el sistema de pinzas ópticas descrito en este documento utiliza haces HeNe e IR, se requieren dos juegos separados de cristalería de seguridad láser.
- Alineación del haz HeNe
- Coloque todos los componentes ópticos en la placa de pruebas. Alinee la placa de pruebas para que esté lo más cerca posible de un ángulo de 90° en relación con el microscopio.
- Conecte el tubo de acoplamiento que contiene el objetivo y la lente telen al microscopio (Figura 1A-11,12).
NOTA: La lente telan es un sistema de lente que se utiliza para enfocar la imagen en el plano intermedio de la imagen en los oculares. - Encienda el láser HeNe y abra el obturador (Figura 1A-18). El haz debe golpear el filtro (Figura 1A-3) a una altura de 54 mm reflejando el 50% de la luz en el espejo 5 (Figura 1A-5). El 50% restante del haz golpea el espejo 4 (Figura 1A-4) a la misma altura que el espejo 3.
- Ajuste el espejo 4 (Figura 1A-4) para que el haz golpee el espejo 6 (Figura 1A-6) a una altura de 51 mm.
- Ajuste el espejo 6 (Figura 1A-6) para que el haz se dirija al espejo galvánico inferior a una altura de 51 mm. El haz que sale del espejo galvánico superior será de 57,5 mm.
- Ajuste el espejo 3 (Figura 1A-3) para que este haz incida en el espejo 5 (Figura 1A-5) a una altura de 57,5 mm. Una vez reflejado en el espejo 5, el haz debe golpear el espejo 9 (Figura 1A-9) a la misma altura. El haz se recombina efectivamente en el espejo 9, pasa a través del objetivo y el sistema de lentes telan en el espejo 21 (Figura 1A-21), que lo refleja en el objetivo.
- Coloque un portaobjetos de microscopio limpio sobre el escenario del microscopio. Encienda la cámara e imagenee los haces de los haces fijos y de escaneo individualmente en la pantalla. Comenzando con el espejo 3, luego 5 y 9, finalmente 21, realice pequeños ajustes para colocar el haz fijo en el centro de la pantalla.
- Para asegurarse de que el ángulo del haz que sale del espejo 21 sea de 90°, modifique la altura Z del microscopio y coloque el haz fotografiado en las superficies superior e inferior del portaobjetos. Cuando son idénticos, el haz está en la posición correcta, que es perpendicular al escenario. Obture este haz usando el obturador 19 (Figura 1A-19).
- Comenzando con los espejos 4 y 6, realice pequeños ajustes para colocar el haz fijo en el centro de la pantalla. Obturar este haz.
- Alineación del haz infrarrojo (IR)
PRECAUCIÓN: Realice todos los pasos a baja potencia láser por razones de seguridad.- Ajuste la placa de onda 14 (Figura 1A-14) para ajustar la relación de haces transmitidos y reflejados que se dividen en el divisor de haz 2 (Figura 1A-2). El divisor de haz 2 refleja el componente s del rayo láser y transmite el componente p.
- El haz que pasa a través de 2, golpea el espejo 7 (Figura 1A-7), que desvía el haz hacia el espejo galvánico inferior. Debe seguir la trayectoria del haz HeNe en el espejo 21. Realiza pequeños movimientos del espejo 7 para lograr este posicionamiento.
- Ajuste el espejo 2 para que el haz reflejado por el espejo 2 golpee el espejo 10 (Figura 1A-10) a una altura de 57,5 mm.
- El haz se refleja desde el espejo 10 sobre el espejo 8 (Figura 1A-8) a una altura de 57,5 mm. El haz posterior debe golpear el espejo 9 a la misma altura. Si no es así, haga pequeños ajustes en los espejos 10 y 8 según sea necesario.
- Retire el objetivo y coloque la cabeza del medidor de potencia sobre el puerto en la torreta del objetivo.
- Utilice las placas 14, 15 y 16 (Figura 1A-14,15,16) para ajustar la potencia de cada rayo láser de modo que sean iguales como se muestra en la Figura 1C.
- Coloque el expansor de haz 1 (Figura 1A-1) en su lugar. Ajuste el rayo láser expandido para que sea circular sin coma ni astigmatismo.
- Para probar las trampas ópticas, haga una solución de perlas de poliestireno de 1 μm suspendidas en agua. Luego, coloque 10 μL de esta solución en un portaobjetos de microscopio, coloque un cubreobjetos en la parte superior y selle con esmalte de uñas. Coloque el portaobjetos en la platina del microscopio y pruebe las trampas ópticas atrapando estas perlas de 1 μm. Asegúrese de que las cuentas sean aspiradas por las trampas y mantenidas de manera estable cuando se mueva el escenario. La captura debe ocurrir de manera igualmente eficiente desde todos los lados de la trampa.
2. Preparación de la cámara microfluídica
- Si la celda de flujo es un dispositivo construido comercialmente hecho de polidimetilsiloxano (PDMS) en un cubreobjetos, continúe con el paso 3. Si se trata de un dispositivo de vidrio con conectores conectados, continúe con el paso 4.
- Si la celda de flujo no tiene conectores conectados, conéctelos primero a los orificios de entrada en el portaobjetos del microscopio. Consulte el paso 3 para conocer los pasos para conectar conectores.
3. Conexiones de celda de flujo utilizando una celda de flujo PDMS
NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 2D.
- Coloque la celda de flujo sobre una superficie plana y limpia. Sostenga el tubo de PTFE a 3 mm del extremo libre con pinzas. Empuje el tubo en el puerto preformado (el puerto puede soportar una presión de línea de 2 bar).
- Repita este procedimiento para cada uno de los puertos restantes. Conecte los puertos de entrada a la bomba de jeringa y la salida a una botella de residuos (Figura 4A, B).
- Llene cada jeringa de vidrio con 1 ml de metanol de grado espectrofotométrico. Conecte cada jeringa a una válvula conmutadora. Asegúrese de que la válvula tenga la salida dirigida a los residuos y purgue cada línea con 50 μL de metanol (Figura 4C, posición cerrada).
- Cambie la posición de salida a la celda de flujo (Figura 4C, posición abierta). Bombear 800 μL de metanol a través de la celda de flujo a un caudal de 100 μL/h para humedecer las superficies y eliminar burbujas.
- Al día siguiente, repita este proceso utilizando 800 μL de agua ultrapura. La celda de flujo ya está lista para su uso.
4. Fijación de conectores de tubos de ajuste a presión
NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 2F.
- Si se van a utilizar conectores de tubería de ajuste a presión, retire con cuidado la cinta adhesiva de un lado del conector y colóquela sobre el orificio en el portaobjetos del microscopio. Presione hacia abajo durante unos segundos. Repita el proceso para los conectores restantes.
- Coloque la celda de flujo sobre una superficie plana y limpia. Sostenga el tubo de PTFE a 3 mm del extremo libre con pinzas. Empuje el tubo en el orificio preformado en el puerto y repita este procedimiento para cada uno de los puertos restantes.
- Conecte el tubo de las entradas a las válvulas de conmutación. Continúe con el paso 7.
5. Fijación de asambleas permanentes
NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 2A-C.
- Realice la fijación en una superficie limpia y plana o en un colector personalizado para mantener la celda de flujo y los conectores en su lugar mientras se produce la unión.
- Coloque la celda de flujo sobre una superficie plana limpia o en la sección empotrada del colector (Figura 2B). Coloque una pequeña cantidad de pegamento de vidrio en la parte inferior del conjunto e inserte el sello.
- Coloque el nanopuerto sobre uno de los orificios de entrada en el portaobjetos del microscopio. Empuje suavemente hacia abajo y manténgalo en su lugar sin movimiento lateral. Repita el proceso para los puertos restantes.
- Dejar secar o sujetar en su lugar en el colector. Retire suavemente la celda de flujo del colector y asegúrese de que los conjuntos se alineen bien con los puertos de entrada en la celda de flujo. Continúe con el paso 7 cuando esté listo.
6. Conexiones y preparación de células de flujo
NOTA: Para la configuración, consulte la Figura 4A,B.
- Coloque una celda de flujo en la etapa del microscopio. Conecte el tubo con los conectores apretados para los dedos.
- Llene cada jeringa de vidrio con 1 ml de metanol de grado espectrofotométrico. Conecte cada jeringa a una válvula conmutadora. Asegúrese de que la válvula tenga la salida dirigida a los residuos y purgue cada línea con 50 μL de metanol (Figura 4C, posición cerrada).
- Cambie la posición de salida a la celda de flujo (Figura 4C, posición abierta). Bombear 800 μL de metanol a través de la celda de flujo a un caudal de 100 μL/h para humedecer las superficies y eliminar burbujas.
- Al día siguiente, repita este proceso utilizando 800 μL de agua ultrapura. La celda de flujo ya está lista para su uso.
7. Control del flujo de fluido
- Gire las válvulas de conmutación a la posición cerrada (Figura 4C). Retire las jeringas, deseche el agua residual y llene las jeringas con soluciones experimentales, por ejemplo, perlas de ADN; enzima; y ATP. Devuelva las jeringas a la bomba y conéctelas a las válvulas de conmutación.
- En esta posición, fuerce manualmente los émbolos hacia abajo 5-10 μL para eliminar cualquier burbuja. Cambie la posición de la válvula de conmutación a Abrir.
- Utilice el esquema de caudal para lograr una velocidad de flujo de fluido óptima para el atrapamiento y la visualización como se describe en la Tabla 1. El flujo de fluido óptimo para la captura óptica debe permitir la captura estable de perlas y una vez que el ADN se estira, debe ser en forma B (~ 3,000 pb / μm).
8. Captura de perlas de poliestireno con moléculas individuales de ADN unidas
- Con un aumento de 10x, ubique el borde entre las corrientes de fluido cerca de los puntos de entrada del canal. Agregue aceite al objetivo 100x y cambie al aumento más alto.
- Abra las persianas de las trampas ópticas (ambas o una a la vez). Los rayos láser enfocados deben atrapar cuentas y el ADN debe estirarse inmediatamente.
- Una vez que un complejo ha quedado atrapado, traduzca la etapa perpendicular al flujo (Figura 3A,C, recuadro). Esto moverá el complejo atrapado de la solución de perlas de ADN a la corriente 2. Una traducción adicional moverá el complejo a la corriente 3.
9. Limpieza de células de flujo
NOTA: Realice esto diariamente.
- Apague la bomba cuando finalice el experimento. Gire las válvulas de conmutación a la posición cerrada (Figura 4C).
- Retire las jeringas y vacíelas. Enjuague tres veces con agua destilada filtrada.
- Llene las jeringas con solución limpiadora. Coloque las jeringas en la bomba y conéctelas a las válvulas de conmutación.
- Purgue las válvulas de conmutación y cambie la posición para abrir. Bombee 800 μL de solución de limpieza a un caudal de 100 μL/h normalmente durante la noche.
- Al día siguiente, cierre las válvulas de conmutación y luego retire y enjuague las jeringas con agua. Enjuague la celda de flujo y las líneas con 4-800 μL de agua a un caudal de 400-800 μL/h. Si se requiere una limpieza más extenuante de las células de flujo, reemplace la solución de limpieza con clorhidrato de guanidio 6 M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La prueba inicial de la alineación y resistencia de la trampa se realiza con perlas de poliestireno no fluorescentes de 1 μm. Dado que la mayor parte de la investigación realizada en el laboratorio utiliza fluorescencia, probamos aún más la resistencia de la trampa utilizando perlas de poliestireno verde dragón de 1 μm (Figura 1D, E). Posteriormente, el trabajo cambia a la captura óptica de complejos ADN-perla donde el ADN se tiñe con el colorante intercalante bis-YOYO-114,29. Cuando estos complejos quedan atrapados a 10-15 μm por encima de la superficie del cubreobjetos en una célula de flujo microfluídico, el flujo de fluido más allá del cordón estira el ADN (Figuras 3B, C). Es importante medir la longitud del ADN estirado en fluido para asegurarse de que se estire a su longitud en forma B, que es la longitud esperada. Por ejemplo, para el ADN lambda del bacteriófago, la longitud total es ligeramente superior a 16 μm, lo que corresponde a 48.504 pb14.
Para caracterizar el flujo de fluido, se introdujeron perlas fluorescentes en celdas de flujo con una altura de enfoque de 15 μm por encima de la superficie del cubreobjetos utilizando diferentes velocidades de bomba y en soluciones de diferente viscosidad. Se capturaron películas de la posición de las cuentas y se realizó un seguimiento de la posición de las cuentas mediante un software de análisis de imágenes. Los resultados muestran que para perlas de 1 μm de diámetro, la velocidad lineal se puede rastrear con precisión a un caudal de bomba de 100 μL / h en soluciones de sacarosa que van desde 10% -50% (Figura 5A). En condiciones similares, se puede calcular la fuerza sobre el cordón y se puede encontrar que varía de 10 a 400 pN, dependiendo del caudal de la bomba y la viscosidad de la solución (Figura 5B). Finalmente, se evaluó el efecto del diámetro de la perla que varía de 120 a 970 nm sobre la fuerza en diferentes concentraciones de sacarosa. Los datos revelan que las fuerzas que van desde 1-27 pN podrían medirse uniendo perlas de diferente diámetro a una proteína motora y pidiéndole al motor que tire de esa cuenta contra el flujo de fluido (Figura 5C).
Figura 1: Diseño óptico y demostración de la actividad de captura. (A) Esquema del diseño óptico con el haz IR en rojo y el haz HeNe en negro. (B) Fotografía de componentes ópticos montados en una placa de pruebas. Los números de componente en los paneles A y B son los siguientes: 1), expansor de haz; 2), espejo de interferencia (Rsmax = 1064 nm; Tpmax = 1064 nm); 3), espejos de interferencia (633 nm; R = 50%; T = 50%); 4-6), espejos de interferencia (Rmax = 633 nm); 7), espejo de interferencia (Rmax = 1064 nm; Tmáx.= 633 nm); 8), espejo de interferencia (Rsmax = 1064 nm; Tp max = 1064 nm, Tmax = 633 nm); 9), espejo de interferencia (Rmax = 1064 nm, 633 nm; Tmax = 1064 nm, 633 nm); 10), espejo de interferencia (Rmax = 1064 nm); 11), lente objetiva, f = 110 nm; 12), lente Telan; 13), espejos galvánicos; 14-16), Rotadores (/2); 17), obturador de canal de escaneo IR; 18), obturador de canal visible; 19), obturador de canal fijo IR; 20), Beam stops y 21), espejo de interferencia (Rmax = 1064 nm; Tmax = 633 nm). (C) Medición de la potencia de salida. La potencia de salida del láser se mide antes de instalar el cabezal láser en el diseño óptico. Una vez que se realiza la alineación de la trampa, la potencia del haz se mide después del objetivo 100x para cada trampa. (D) y (E) Imágenes que demuestran un atrapamiento óptico estable de perlas fluorescentes de 1 μm. F, trampa fija y M, trampa móvil con la trampa móvil en modo de escaneo moviéndose a través de un círculo pequeño (D) o grande (E) a 30 mHz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Células de flujo microfluídico. (A) Montaje de una celda de flujo de tres canales hecha de vidrio de borosilicato. (B) Un colector para posicionar de manera estable las celdas de flujo durante la unión del conector. Arriba, la base del colector de aluminio con una sección empotrada de 1 mm para posicionar lateralmente la celda de flujo. Los cuatro postes (uno en cada esquina) guían la tapa del colector a su posición, mientras que los pernos roscados colocados más centralmente se utilizan para sujetar la tapa en su lugar. Parte inferior, tapa del colector con orificios perforados para que coincida con los postes y pernos en la base del colector. (1), tuercas que se unen a los pernos de la base del colector; (2) resortes que se colocan entre las tuercas y la tapa del colector para proporcionar una ligera tensión durante el proceso de unión. (C) Una vista de cerca de la convergencia de los canales de entrada en una sola corriente de fluido común en una celda de flujo de vidrio con conectores ya conectados. Un cuarto se coloca junto a la celda de flujo como referencia. (D) Una imagen de la celda de flujo PDMS. Las capas PDMS tienen un grosor de 3 mm. (E) Una celda de flujo de sílice fundida con conectores luer. (F) Una celda de flujo de vidrio de borosilicato con conectores de ajuste a presión en su lugar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Características del flujo de fluido a través de una celda de flujo de vidrio. (A) El flujo de fluido dentro de la celda de flujo es laminar. El esquema muestra la celda de flujo desde la parte superior para demostrar que la difusión entre canales es la principal fuente de mezcla entre corrientes de fluido adyacentes. La dirección del flujo se indica con flechas azules y las corrientes individuales son de color blanco, gris claro y blanco. Las regiones de ensanchamiento de la difusión transversal entre canales se indican en rojo. El recuadro muestra una imagen de fluorescencia de corrientes de fluido adyacentes con un aumento de 10x con complejos de perlas de ADN marcados con fluorescencia en la corriente inferior y amortiguación solo en la corriente superior. Las manchas blancas en la corriente superior son ruido de disparo de la cámara CCD. (B) El perfil de flujo (púrpura claro) en las células de flujo laminar es parabólico. La celda de flujo se ve desde un lado y la dirección del flujo se indica encima de cada celda. Las velocidades de fluido más rápidas ocurren en la celda de flujo ubicada en el centro, mientras que las velocidades de fluido más lentas ocurren junto a las superficies de la celda de flujo. En consecuencia, para un complejo de perlas de ADN atrapado ópticamente colocado en el centro de la célula de flujo, el flujo de fluido estira la molécula de ADN λ del bacteriófago (48,504 pb) a 16 μm (forma B) para que se pueda hacer una visualización clara (imagen izquierda). En contraste, la misma molécula colocada cerca de la superficie de la celda de flujo experimenta bajos caudales y no se puede estirar. (C) Un solo complejo de perlas de ADN se coloca dentro de una célula de flujo. Se pueden usar diferentes celdas de flujo de profundidad, pero, en cada caso, las alineaciones del haz se pueden ajustar de modo que el atrapamiento óptimo ocurra a 10-20 μm por encima de la superficie del cubreobjetos, lo que elimina los efectos de la superficie y tiene un flujo estable para que las moléculas de ADN se puedan estirar a forma B. Como se indica en la imagen de la izquierda en (C), el ADN se estira para permitir una visualización clara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Control de flujo y reacción del ADN atrapado ópticamente dentro de una célula de flujo en la etapa de microscopio. (A) Acoplamiento de la celda de flujo a una bomba de jeringa. Se presenta una fotografía de una celda de flujo de tres canales conectada a una bomba de jeringa a través de válvulas de conmutación de tres vías. La celda de flujo se mantiene en su lugar en una plataforma motorizada en un microscopio invertido. La celda de flujo está conectada a una línea de descarga (izquierda) y válvulas de conmutación (círculo cian discontinuo) a través de un tubo naranja de 500 μm (indicado con cinta verde). Las válvulas están montadas de forma estable en un colector hecho a medida adaptado al aparato de bomba de jeringa, que alberga jeringas herméticas a gas de 1 ml (las flechas amarillas demarcan los émbolos). Las líneas de residuos se utilizan para eliminar las burbujas de aire que pueden quedar atrapadas en la válvula de conmutación durante los cambios de jeringa. (B) Vista en primer plano de la celda de flujo de tres canales. Para facilitar la visualización de las corrientes de fluidos, las externas se han coloreado con colorante alimentario con la corriente central que contiene agua solamente. La región ampliada indica cómo un complejo molécula de ADN-cuenta atrapado ópticamente se traduce de una corriente de fluido a la siguiente (flecha azul) traduciendo la etapa perpendicular al flujo (flecha negra). C) Esquemas de las válvulas de conmutación de tres vías que indiquen sus posiciones operativas. Las designaciones de letras F, S y W corresponden al fluido de dirección y pueden fluir hacia la celda de flujo, la jeringa y los desechos, respectivamente. Un puerto está cerrado permanentemente como lo indica el enchufe negro en la parte superior de cada esquema. En la posición abierta u operativa (panel izquierdo), el flujo de fluido pasa directamente a través de la válvula de conmutación desde la jeringa (S) hasta la celda de flujo (F). En la posición Cerrado (panel derecho), el dial se gira para que la celda de flujo quede sellada del entorno. En esta posición, el flujo se dirige a los residuos y las jeringas se pueden cambiar sin introducir burbujas de aire en la celda de flujo. Como las válvulas tienen un volumen muerto de 6 μL, se desperdicia muy poca solución al purgar las líneas antes de volver a la configuración Open. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: El movimiento de la cuenta y la fuerza opuesta se ven afectados por el flujo del fluido. (A) La velocidad lineal del talón se ve afectada por la velocidad de la bomba y la concentración de sacarosa. (B) La fuerza opuesta en una perla se ve afectada por la viscosidad de la solución. (C) El diámetro del cordón influye en la fuerza sobre las perlas bajo flujo. En todos los experimentos, se utilizaron cuentas fluorescentes (verde dragón). En (A) y (B), se utilizaron perlas de 0,97 μm de diámetro y en (C), se utilizaron perlas de diferente diámetro. Las soluciones de sacarosa se hicieron en agua ultrapura, se filtraron a través de filtros de 0,2 μm y el índice de refracción se midió con un refractómetro de mano, con viscosidad determinada en centipoise utilizando tablas ISCO y finalmente se convirtió en unidades SI en mPa.s. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Caudal (μL/h)b | Tiempo por paso (min) | Volumen dispensado (μL) |
| 800 | 5 | 67 |
| 400 | 5 | 33 |
| 200 | 5 | 17 |
| 100 | 5 | 8 |
| 50 | 5 | 4 |
| 25 | 5 | 2 |
| 15 | 5 o más | 1 o más |
| un. Estos son caudales de fluido calculados por el software de la bomba de jeringa y son únicos para cada diámetro de jeringa utilizado. Los caudales permiten un llenado rápido de las líneas y la cámara de flujo (800 μl/h), seguido de una disminución gradual del caudal ideal para el atrapamiento y la visualización | ||
| b. La bomba de jeringa se puede controlar desde el teclado o utilizando el software proporcionado por el proveedor. | ||
Tabla 1: Caudales de fluidos para minimizar las burbujas y lograr una captura estable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El montaje cuidadoso del sistema de flujo es fundamental para el resultado exitoso de los experimentos 4,6. Uno de los aspectos más desafiantes del protocolo es la fijación de conectores a la superficie del vidrio. Para ello, utilizamos los dos enfoques siguientes: conectores de tubos de ajuste a presión y conjuntos de nanopuertos. Los conectores de ajuste a presión se adhieren fácilmente al vidrio seguido de empujar el tubo de PTFE en los orificios preformados con pinzas. Cuando se requiere un accesorio más estable, se prefiere la unión de ensamblajes de nanopuertos. Con un uso y limpieza cuidadosos, una sola celda de flujo de vidrio con ensamblajes permanentes se puede usar durante más de 1 año. Si las células de flujo necesitan ser cambiadas con más frecuencia, se pueden usar celdas de flujo PDMS, ya que son una alternativa excelente y más barata. Se pueden reutilizar, pero PDMS es susceptible a la hinchazón, lo que puede alterar el comportamiento del flujo de fluido con el tiempo.
Tanto las células de flujo de vidrio como las PDMS no son indestructibles. En el laboratorio, el caudal máximo utilizado es de 800 μL/h. Si esto se excede diariamente y / o durante largos períodos de tiempo, puede ocurrir una deformación de la celda de flujo (celdas de flujo de vidrio) y una distorsión del PDMS. Si bien el procedimiento inicial de humectación con metanol y agua lleva tiempo, vale la pena ya que se eliminan todas las burbujas y también se pueden detectar fugas en los conectores. Las celdas de flujo descritas aquí proporcionan flexibilidad a los experimentos que se están realizando. Utilizando estos enfoques de diferentes celdas de flujo, tubos y conexión de diferentes conectores, las condiciones experimentales se pueden adaptar fácilmente y optimizar rápidamente para garantizar que se obtengan datos óptimos. Se presentan células de flujo de canal en forma de Y, pero una amplia gama de diseños de dispositivos microfluídicos están disponibles en múltiples compañías, tanto sin conectores como con conectores. Esto proporciona al investigador una flexibilidad aún mayor en el diseño experimental.
El uso de válvulas de conmutación de cuatro vías es un método simple y efectivo que garantiza que una vez que el sistema de flujo se ensambla y prueba, se convierte efectivamente en un ambiente cerrado, donde la contaminación es mínima y se eliminan las burbujas. Esto último es crítico ya que las burbujas tienden a comprimirse y descomprimirse aleatoriamente durante un experimento y esto perturba el flujo de fluidos haciendo que las moléculas de ADN atrapadas se muevan de maneras inesperadas e incluso se rompan. Se debe tener mucho cuidado para garantizar que se evite que se formen en el sistema.
Finalmente, el sistema descrito aquí está optimizado para la bioquímica visual donde se puede realizar un análisis cuidadoso del ADN, las perlas unidas a proteínas o las proteínas marcadas con fluorescencia. Aunque el sistema no está diseñado para realizar mediciones de fuerza con las trampas duales y la adición de fotodetectores de cuadrante, las fuerzas se pueden medir uniendo perlas de diferente diámetro a las proteínas motoras del ADN, por ejemplo, y pidiéndole al motor que tire de esta cuenta contra el flujo de fluido. Al variar la viscosidad de la solución, el flujo de fluido y el diámetro del cordón, se puede aplicar una amplia gama de fuerzas opuestas para proporcionar una visión detallada de la función de la proteína motora (Figura 5). Esta es una forma simple y económica de medir las fuerzas asociadas con las transacciones biológicas, pero carece de la precisión asociada con los enfoques más sensibles. Cuando el enfoque bioquímico visual se combina con métodos de detección de fuerza sensible, se pueden proporcionar imágenes más completas de las reacciones bioquímicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
El autor declara no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
La investigación en el laboratorio de Bianco está respaldada por las subvenciones de los NIH GM100156 y GM144414 a P.R.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x objective | Leica | 506318 or 506038 | Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging |
| 10X Objective | Leica | 506263 | Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell |
| 1 mm fluorescent beads | Bangs Labs | FSDG004 | Used for tap performance, focal position determination |
| 1 mm polystyrene beads | Bangs Labs | CPO1004 | Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules |
| 63x objective | Leica | 506081 | Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens |
| Alignment laser | Lumentum | 1100 series | 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics |
| Beam alignment camera | Amscope | MU303 | A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position |
| Camera control and Image capture software | Hamamatsu | HCImage | Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching |
| Camera; Orca flash 4 | Hamamatsu | c13440-20cu | CCD camera for imaging of single-molecule experiments |
| C-mount for the beam alignment camera | Spot imaging solutions | DE50CMT | Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment |
| C-mount for the Orca Flash 4 camera | Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects. | ||
| Cy5 fluorescence filter cube | Semrock | cy5-404a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only |
| Fitc-Txred fluorescence filter cube | Semrock | fitc/txred-2x-b-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed |
| Fluidics tubing | Grace Bio | 46004 | PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used |
| GFP fluorescence filter cube | Semrock | gfp-3035b-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only |
| Glass flow cells | Translume | Custom | Clear flow channels for imaging (Fig. 2E) |
| Glass glue | Loctite | 233841 | Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells |
| Glass/PDMS sandwich flow cells | CIDRA Precision services | Custom design | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C) |
| Hamilton Cleaning solution | Hamilton | 18311 | Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Illumination system | Sutter Instrument | Lamda DG4 | Discontinued so recommend Lambda 721 |
| Image analysis software | Media cybernetics | Image Pro Premiere | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image analysis software | Fiji/NIH Image/Image J | Shareware | Analysis of images and single molecule tracking |
| Image display card | Melles Griot | 06 DLA 001 | Alternate product from Thorlabs: VRC5 |
| Immersion oil | Zeiss | 444960 | Immersol 518 F fluorescence free |
| Laser beam alignment tools | Thor labs | FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1 | Used to ensure beams are horizontal and at the correct height |
| Laser beam viewer | Canadian Photonics labs | IR 3150 | Used to image IR beam spots on mirrors and targets |
| Laser power meter | Thor labs | Measurement of laser output as well as trap strength | |
| Laser safety glasses (HeNe) | Thor labs | LG7 or 8 | Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm |
| Laser safety glasses (IR) | Thor labs | LG11 | Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm |
| Mcherry fluorescence filter cube | Semrock | mcherry-a-lsc-zero | Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only |
| Microscope | Leica | DMIRE2 | DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror |
| Microscope control software | UCSF/shareware | uManager | Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control |
| Nanoport assembly | IDEX | N333 | Connectors that are bonded to flow cells |
| Optical table support | Thor Labs | PA52502 | Active isolation table support |
| Optics and lenses | Solar TII | Various | Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system |
| PDMS flow cells | ufluidix | Custom | Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D) |
| PEEK tubing | IDEX | 1532 | Provides excellent connection to flow cells and switching valves |
| Pinkel fluorescence filter cube | Semrock | lf488/543/635-3x-a-000 | Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly |
| Press fit tubing connectors | GraceBio | 46003 | Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass |
| Scanning mirrors | GSI Lumonics | VM500 | Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific |
| Stage | Leica | ||
| Stage micrometer | Electron Microscopy Sciences | 68042-08 | Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration |
| Switching valves | IDEX | V-101T | Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells |
| Syringe and valve manifold | Machine shop | None | Custom built |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Controls fluid flow through flow cells |
| Syringe pump software | Harvard Apparatus | 70-6000 | Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow |
| Syringes | Hamilton | 81320 | Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers |
| Table top | Thor Labs | T36H | Optical table top or breadboard |
| Trapping laser | Newport/Spectra Physics | J-series; BL106C | Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser |
References
- Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
- Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. 491 (2019).
- Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
- Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
- Vermeulen, K. C., Mameren, J. v Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
- Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
- Weibel, D. B., Whitesides, G. M.
- Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
- Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
- Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
- Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
- Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
- Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
- Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
- Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
- Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
- Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
- Merenda, F., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G. , 6483 (2007).
- Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
- Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
- Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
- Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
- Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).
