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Biochemistry

एकल-अणु अध्ययन के लिए दोहरे ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64023
Automatic Translation
1
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Nebraska Medical Center

Summary

माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों के माध्यम से अध्ययन किए गए दृश्य, एकल-अणु जैव रसायन को ग्लास बैरल, गैस-तंग सिरिंज, प्रवाह कोशिकाओं के लिए ट्यूबिंग के स्थिर कनेक्शन और सिरिंज और ट्यूबिंग के बीच स्विचिंग वाल्व रखकर बुलबुले के उन्मूलन का उपयोग करके बहुत सुविधा प्रदान की जाती है। प्रोटोकॉल दोहरे ऑप्टिकल जाल का वर्णन करता है जो डीएनए लेनदेन और इंटरमॉलिक्युलर इंटरैक्शन के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करता है।

Abstract

दृश्य जैव रसायन एकल एंजाइमों या एंजाइम परिसरों के स्टोकेस्टिक गुणों को देखने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है जो थोक-चरण अध्ययनों में होने वाले औसत में अस्पष्ट हैं। विज़ुअलाइज़ेशन प्राप्त करने के लिए, दोहरी ऑप्टिकल चिमटी, जहां एक जाल तय किया जाता है और दूसरा मोबाइल होता है, एक उल्टे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के चरण पर स्थित मल्टी-स्ट्रीम माइक्रोफ्लुइडिक चैंबर के एक चैनल में केंद्रित होता है। ऑप्टिकल चिमटी फ्लोरोसेंटली लेबल डीएनए के एकल अणुओं को फंसाते हैं और कक्ष के माध्यम से द्रव प्रवाह करते हैं और फंसे हुए मोतियों से आगे बढ़ते हैं, डीएनए को बी-फॉर्म (न्यूनतम बल के तहत, यानी, 0 पीएन) तक फैलाते हैं, जिसमें न्यूक्लिक एसिड को एक काली पृष्ठभूमि के खिलाफ सफेद स्ट्रिंग के रूप में देखा जाता है। डीएनए अणुओं को एक धारा से दूसरी धारा में ले जाया जाता है, प्रवाह के लंबवत चरण का अनुवाद करके ताकि नियंत्रित तरीके से प्रतिक्रियाओं की शुरुआत को सक्षम किया जा सके। सफलता प्राप्त करने के लिए, ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट चैनलों वाले माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को सिरिंज पंप में जगह में रखे गए ग्लास सिरिंज से जोड़ा जाता है। इष्टतम परिणाम प्रवाह सेल से स्थायी रूप से बंधे कनेक्टर्स का उपयोग करते हैं, ट्यूबिंग जो यांत्रिक रूप से कठोर और रासायनिक रूप से प्रतिरोधी है, और जो स्विचिंग वाल्व से जुड़ा हुआ है जो बुलबुले को खत्म करता है जो लैमिनर प्रवाह को रोकते हैं।

Introduction

एकल-अणु स्तर पर और वास्तविक समय में प्रोटीन-डीएनए इंटरैक्शन की कल्पना करने की क्षमता ने जीनोम स्थिरता 1,2 में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है। एक समय में डीएनए के एकल अणुओं के साथ काम करने के अलावा, आस-पास के व्यक्तिगत अणुओं के बीच लेनदेन को देखने की क्षमता अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान करती है 3,4,5। अतिरिक्त डीएनए अणुओं के हेरफेर के लिए अतिरिक्त ऑप्टिकल ट्रैप के साथ-साथ उच्च गुणवत्ता वाले, मल्टी-चैनल, माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह कोशिकाओं दोनों की आवश्यकता होतीहै।

एक से अधिक ऑप्टिकल ट्रैप उत्पन्न करने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। इनमें गैल्वेनोमीटर स्कैनिंग मिरर, ध्वनिक ऑप्टिक मॉड्यूलेटर और डिफ्रेक्टिव ऑप्टिक्स शामिल हैं, जो होलोग्राफिक ऑप्टिकल ट्वीज़र 4,7,8,9 उत्पन्न करते हैं। अक्सर, स्कैनिंग दर्पण और ध्वनिक ऑप्टिक मॉड्यूलेटर जाल का उत्पादन करते हैं जो टाइमशेयर करते हैं। यहां वर्णित सेटअप में, एकल एनडी: याग लेजर की बीम को ध्रुवीकरण पर विभाजित किया जाता है, और फिर गैल्वेनोमीटर लेजर स्कैनिंग दर्पण मोबाइल ट्रैप (चित्रा 1)4 नामक स्थिति को नियंत्रित करते हैं। माइक्रोस्कोप उद्देश्य के पिछले एपर्चर पर ट्रैपिंग बीम को निर्देशित करने के लिए दर्पण और फिल्टर की स्थिति की सुविधा के लिए, एक हेने लेजर का उपयोग किया जाता है। यह समग्र संरेखण को आसान बनाता है क्योंकि हेन बीम नग्न आंखों को दिखाई देता है, जबकि अवरक्त बीम नहीं होते हैं। हेन बीम दर्पण और अन्य घटकों की स्थिति को कम तनावपूर्ण बनाने के साथ काम करने के लिए भी सुरक्षित है। प्रारंभ में, इस लेजर के लिए बीम पथ 1064 एनएम बीम से अलग है, लेकिन इसे एक ही बीम पथ में पेश किया जाता है, और फिर माइक्रोस्कोप उद्देश्य में। एक बार भौतिक संरेखण प्राप्त हो जाने के बाद, हेन बीम के शीर्ष पर 1064 एनएम बीम की स्थिति बनाई जाती है और यह बीम की स्थिति और गुणवत्ता की कल्पना करने के लिए एक इन्फ्रारेड व्यूअर और विभिन्न बीम इमेजिंग टूल के उपयोग से सुगम होता है। फिर, बीम विस्तारक पेश किया जाता है, और परिणामस्वरूप विस्तारित इन्फ्रारेड बीम को उद्देश्य के पिछले एपर्चर पर संरेखित किया जाता है। अंत में, उद्देश्य को हटा दिया जाता है और प्रत्येक ध्रुवीकृत बीम में शक्ति को मापा जाता है और बराबर होने के लिए λ/2 तरंग प्लेटों का उपयोग करके समायोजित किया जाता है (चित्रा 1 सी)। उद्देश्य वापस आने के बाद शक्ति माप भी किया जाता है और आम तौर पर 53% बिजली की हानि होती है। हालांकि, फोकल प्लेन (चित्रा 1 डी) में स्थिर स्थिर और गतिशील ऑप्टिकल जाल बनाने के लिए पर्याप्त शक्ति है।

डीएनए लेनदेन की छवि बनाने के लिए, माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह कोशिकाएं एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं क्योंकि वे उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ एकल-अणु स्तर पर नियंत्रित माप की अनुमति देते हैं (चित्रा 2)। माइक्रोफ्लुइडिक शब्द 5-500 μm10,11 से लेकर आयामों के साथ एक या अधिक चैनलों में तरल पदार्थों में हेरफेर करने की क्षमता को संदर्भित करता है। धारा शब्द एक चैनल के भीतर वास्तविक तरल पदार्थ को संदर्भित करता है और चैनल भौतिक चैनल को संदर्भित करता है जिसमें एक द्रव धारा या धाराएं चलती हैं। एकल-चैनल प्रवाह सेल डिजाइन में एक सामान्य, भौतिक चैनल होता है जहां प्रतिक्रियाएं देखी जाती हैं और आमतौर पर केवल एक द्रव प्रवाह मौजूद होता है। इस प्रकार, इन डिजाइनों को एकल-धारा प्रवाह कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है। इसके विपरीत, बहु-धारा प्रवाह कोशिकाओं को एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के रूप में परिभाषित किया जाता है जिसमें दो या दो से अधिक प्रवेश चैनल एक एकल, सामान्य, भौतिक चैनल (चित्रा 2 ए) में अभिसरण करते हैं। सामान्य चैनल के भीतर, अलग-अलग चैनलों से उत्पन्न होने वाली द्रव धाराएं एक दूसरे के समानांतर बहती हैं, और प्रसार के कारण होने वाले उनके बीच केवल न्यूनतम मिश्रण के साथ अलग रहती हैं (चित्रा 2 बी)। प्रयोगात्मक सेटअपों के बहुमत में, एक एकल पंप प्रत्येक चैनल में एक ही गति से तरल पदार्थ को धक्का देता है। इसके विपरीत, जब सीमा स्टीयरिंग का उपयोग किया जाता है, तो तीन या अधिक, स्वतंत्र रूप से नियंत्रित पंप चैनलों के माध्यम से तरल पदार्थ को धक्का देते हैं। हालांकि, प्रत्येक पंप एक अलग गति से संचालित होता है लेकिन सामान्य चैनल में शुद्ध प्रवाह दर स्थिर12 है। यह पंप की गति को बदलकर मुख्य चैनल घटकों के तेजी से आदान-प्रदान की अनुमति देता है।

लैमिनार प्रवाह के अलावा, एक और महत्वपूर्ण कारक लैमिनार द्रव धारा के भीतर परवलयिक वेग प्रोफ़ाइल है। उच्चतम प्रवाह वेग धारा के मध्य में होता है और सबसे धीमा सतहों के बगल में होता है (चित्रा 2 सी)13। इस प्रोफ़ाइल को एक डीएनए अणु को पूरी तरह से फैलाने के लिए माना जाना चाहिए जो फ्लोरोसेंट डीएनए के सटीक विज़ुअलाइज़ेशन और सटीक एकल-अणु विश्लेषण के लिए धारा में आयोजित एक मोती से जुड़ा हुआ है। यहां, डीएनए को बी-फॉर्म तक फैलाया जाता है और बल के 0 पीएन के तहत रखा जाता है। इसे प्राप्त करने के लिए, ऑप्टिकल ट्रैप स्थिति पर ध्यान केंद्रित करना नीचे कवरस्लिप सतह (चित्रा 2 डी) से 10-20 μm की स्थिति में होना चाहिए। देखभाल की जानी चाहिए ताकि डीएनए अणु बी-फॉर्म से परे न फैले क्योंकि यह एंजाइम प्रतिक्रियाओं को रोक सकता है। विशिष्ट बफर स्थितियों के तहत, डीएनए14 का 1 μm = 3,000 bp। इसके अलावा, कवरस्लिप से 10-20 μm को फंसाकर, डीएनए कॉम्प्लेक्स को सतह से दूर स्थित किया जाता है जिससे सतह की बातचीत कम हो जाती है।

माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस चैनल बनाने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया गया है और इन्हें प्रयोगशाला में किया जा सकता है या प्रवाह कोशिकाओं को वाणिज्यिक स्रोतों 6,15,16,17 से खरीदा जा सकता है। प्रवाह कोशिकाओं के निर्माण के लिए उपयोग की जाने वाली इष्टतम सामग्री यांत्रिक रूप से कठोर, कम प्रतिदीप्ति के साथ ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी और कार्बनिक सॉल्वैंट्स6 के लिए अभेद्य होनी चाहिए। अक्सर, बोरोसिलिकेट फ्लोट ग्लास, या फ्यूज्ड सिलिका का उपयोग विस्तारित समय के लिए एक स्थिर प्रवाह वातावरण प्रदान करने के लिए किया जाता है जो ऑप्टिकल ट्रैपिंग, विज़ुअलाइज़ेशन और फोर्स डिटेक्शन के लिए उपयुक्त है। ये सामग्री सतह गीला करने और हवा के बुलबुले को हटाने को सरल बनाने के लिए गैर-जलीय सॉल्वैंट्स (जैसे, स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ग्रेड मेथनॉल) के उपयोग की भी अनुमति देती है, और प्रवाह सेल को साफ करने के लिए विकृतेंट्स (जैसे, 6 एम गुआनिडिनियम हाइड्रोक्लोराइड) या डिटर्जेंट। अंत में, प्रवाह कोशिकाओं में तरल पदार्थों को पेश करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियां जटिल वैक्यूम पंप सिस्टम से एकल सिरिंज पंप 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 तक भिन्न होती हैं। यहां वर्णित दृष्टिकोण में, एक सिरिंज पंप जो 10 सिरिंज तक समायोजित कर सकता है, का उपयोग किया जाता है (चित्रा 3 ए)। यह एकल-चैनल प्रवाह कोशिकाओं या कई इनलेट चैनलों के साथ प्रवाह कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है। यहां, एक तीन-चैनल प्रवाह सेल का उपयोग किया जाता है और पॉली-ईथर-ईथर-कीटोन (पीईके) ट्यूबिंग (चित्रा 3 ए-सी) का उपयोग करके सिरिंज पंप पर रखी गई सिरिंज से जुड़ा होता है। तरल पदार्थों के प्रवाह को चार-तरफा स्विचिंग वाल्व द्वारा नियंत्रित किया जाता है और इस प्रकार प्रवाह सेल (चित्रा 3 ए, डी) में बुलबुले की शुरूआत को कम करने के लिए काम करता है। इसके अलावा, हैमिल्टन गैसटाइट सिरिंज जिनमें कठोर कांच की दीवारें और पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) लेपित प्लंजर्स होते हैं, की सिफारिश की जाती है क्योंकि वे असाधारण चिकनी प्लंजर गति प्रदान करते हैं जो एक चिकनी प्रवाह14,27 प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।

वर्णित प्रयोगात्मक प्रणाली में, दो से पांच इनलेट चैनलों के साथ प्रवाह कोशिकाओं का उपयोग किया गया है। इनलेट चैनलों की संख्या किए जा रहे प्रयोग से तय होती है। RecBCD और Hop2-Mnd1 के अध्ययन के लिए, दो स्ट्रीम चैनल पर्याप्त14,28 थे। हेलिकेस के लिए, एंजाइम को डीएनए के मुक्त छोर से बांधा गया था और स्थानांतरण और आराम शुरू करने के लिए मैग्नीशियम और एटीपी युक्त एक धारा में अनुवादित किया गया था। हॉप 2-एमएनडी 1 के लिए, ऑप्टिकल रूप से फंसे डीएनए को आसन्न द्रव प्रवाह में अनुवादित किया गया था जिसमें प्रोटीन और बफर ± द्विसंयोजक धातु आयन शामिल थे। तीन-चैनल प्रवाह कोशिकाओं का उपयोग किसी को स्ट्रीम 1 में डीएनए को फंसाने में सक्षम बनाता है, प्रोटीन बाइंडिंग की अनुमति देने के लिए डीएनए को स्ट्रीम 2 में अनुवाद करता है, और फिर स्ट्रीम 3 में जहां एटीपी मौजूद है, उदाहरण के लिए, प्रतिक्रियाएं शुरू करने के लिए। उपरोक्त पर एक भिन्नता चैनल 2 में फ्लोरोसेंट-टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग करना है, जिसके परिणामस्वरूप द्रव प्रवाह पूरी तरह से सफेद हो जाता है और डीएनए के विज़ुअलाइज़ेशन को रोकता है। जब इस अणु को धारा 3 में अनुवादित किया जाता है, तो प्रतिक्रियाएं शुरू होने पर प्रोटीन और डीएनए दोनों अब दिखाई देते हैं।

द्रव प्रवाह को नियंत्रित करने के लिए चार-तरफा स्विचिंग वाल्व का उपयोग प्रवाह कोशिकाओं में बुलबुले को खत्म करने के लिए सिस्टम का एक महत्वपूर्ण घटक है। बुलबुले स्थिर द्रव प्रवाह के लिए हानिकारक होते हैं क्योंकि वे अप्रत्याशित तरीकों से अनुबंध और विस्तार करते हैं जिसके परिणामस्वरूप प्रवाह वेग में तेजी से परिवर्तन होता है और अशांति की शुरूआत होती है। जब वाल्व को सिरिंज और इनलेट टयूबिंग के बीच तैनात किया जाता है, तो सिरिंज बदलने पर वाल्व की स्थिति को बदलकर प्रवाह पथ को डिस्कनेक्ट कर दिया जाता है। जब नई सिरिंज लगाई जाती है, तो प्लंजर को मैन्युअल रूप से उदास किया जा सकता है ताकि >6 μL को बाहर निकाल दिया जाए (वाल्व की मृत मात्रा) और यह बुलबुले को लगभग पूरी तरह से समाप्त कर देता है।

प्रवाह कोशिकाओं के लिए कनेक्टर्स का लगाव अक्सर प्रवाह सेल उपयोग में दर-सीमित कदम होता है। हम दो प्रकार के कनेक्टर के उपयोग का वर्णन करते हैं: हटाने योग्य जिसे प्रेस-फिट और स्थायी (नैनोपोर्ट असेंबली) के रूप में जाना जाता है। हटाने योग्य कनेक्टर्स एक प्रवाह सेल का पालन करने के लिए सरल हैं और अनुशंसित पीटीएफई के अलावा विभिन्न प्रकार के लचीले टयूबिंग का परीक्षण इन कनेक्टर्स के साथ किया जा सकता है। यह अधिक महंगे ग्लास प्रवाह कोशिकाओं का त्याग किए बिना टयूबिंग और कनेक्टर्स का परीक्षण करने का एक तेज़ और लागत प्रभावी तरीका है। इसके विपरीत, नैनोपोर्ट असेंबली स्थायी रूप से जुड़ी होती हैं, 1,000 पीएसआई तक दबाव का सामना करती हैं, और, हमारे हाथों में, उनका उपयोग विभिन्न व्यास के पीईके ट्यूबिंग तक सीमित है। यह एक नुकसान नहीं है क्योंकि पीईके ट्यूबिंग अधिमानतः उपयोग की जाती है। स्थायी असेंबली के साथ एक एकल ग्लास फ्लो सेल को सावधानीपूर्वक उपयोग के साथ 1 वर्ष से अधिक समय तक पुन: उपयोग किया जा सकता है।

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Protocol

1. पॉलीस्टाइनिन मोतियों के साथ लेजर ट्रैप संरेखण और परीक्षण

नोट: सेटअप के लिए, चित्रा 1 ए, बी देखें।

चेतावनी: प्रयोगवादी को लेजर बीम संरेखण के दौरान उचित सुरक्षात्मक चश्मा या लेजर सुरक्षा चश्मा पहनना चाहिए। जैसा कि यहां वर्णित ऑप्टिकल ट्वीज़र सिस्टम हेन और आईआर बीम दोनों का उपयोग करता है, लेजर सुरक्षा ग्लासवेयर के दो अलग-अलग सेट की आवश्यकता होती है।

  1. HeNe बीम संरेखण
    1. ब्रेडबोर्ड पर सभी ऑप्टिकल घटकों को रखें। ब्रेडबोर्ड को संरेखित करें ताकि यह माइक्रोस्कोप के सापेक्ष यथासंभव 90 ° कोण के करीब हो।
    2. उद्देश्य और टेलन लेंस युक्त संभोग ट्यूब को माइक्रोस्कोप से संलग्न करें (चित्रा 1 ए -11,12)।
      नोट: टेलन लेंस एक लेंस प्रणाली है जिसका उपयोग आंखों के टुकड़ों में मध्यवर्ती छवि विमान पर छवि को केंद्रित करने के लिए किया जाता है।
    3. हेन लेजर चालू करें और शटर खोलें (चित्रा 1 ए -18)। बीम को 54 मिमी की ऊंचाई पर फ़िल्टर (चित्रा 1 ए -3) पर हमला करना चाहिए जो दर्पण 5 (चित्रा 1 ए -5) पर प्रकाश का 50% प्रतिबिंबित करता है। बीम का शेष 50% दर्पण 4 (चित्र 1A-4) दर्पण 3 के समान ऊंचाई पर प्रहार करता है।
    4. दर्पण 4 (चित्र 1A-4) समायोजित करें ताकि बीम 51 मिमी की ऊंचाई पर दर्पण 6 (चित्र 1A-6) पर प्रहार करे।
    5. दर्पण 6 (चित्रा 1 ए -6) को समायोजित करें ताकि बीम को 51 मिमी की ऊंचाई पर निचले गैल्वेनिक दर्पण पर निर्देशित किया जा सके। ऊपरी गैल्वेनिक दर्पण से बाहर निकलने वाली बीम 57.5 मिमी पर होगी।
    6. दर्पण 3 (चित्र 1A-3) समायोजित करें ताकि यह बीम 57.5 मिमी की ऊंचाई पर दर्पण 5 (चित्र 1A-5) पर प्रहार करे। एक बार दर्पण 5 से प्रतिबिंबित होने के बाद, बीम को उसी ऊंचाई पर दर्पण 9 (चित्रा 1 ए -9) पर प्रहार करना चाहिए। बीम को प्रभावी रूप से दर्पण 9 पर पुन: संयोजित किया जाता है, उद्देश्य से गुजरता है, और दर्पण 21 (चित्रा 1 ए -21) पर टेलन लेंस सिस्टम होता है, जो इसे उद्देश्य में दर्शाता है।
    7. माइक्रोस्कोप के चरण पर एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें। कैमरा चालू करें और स्क्रीन पर व्यक्तिगत रूप से फिक्स्ड और स्कैनिंग बीम के बीम की छवि बनाएं। दर्पण 3 से शुरू होकर, फिर 5 और 9, अंत में 21, स्क्रीन के केंद्र में निश्चित बीम को रखने के लिए छोटे समायोजन करते हैं।
    8. यह सुनिश्चित करने के लिए कि बीम का कोण 21 से बाहर निकलने वाला कोण 90 ° है, माइक्रोस्कोप की जेड-ऊंचाई को बदलें और स्लाइड की ऊपरी और निचली सतहों पर छवि बनाई गई बीम को रखें। जब वे समान होते हैं, तो बीम सही स्थिति में होता है, जो चरण के लंबवत होता है। शटर 19 (चित्रा 1 ए -19) का उपयोग करके इस बीम को बंद करें।
    9. दर्पण 4 और 6 से शुरू करके, स्क्रीन के केंद्र में निश्चित बीम को रखने के लिए छोटे समायोजन करें। इस बीम को बंद करें।
  2. इन्फ्रारेड (आईआर) बीम संरेखण
    चेतावनी: सुरक्षा कारणों से कम लेजर शक्ति पर सभी चरणों का प्रदर्शन करें।
    1. बीम स्प्लिटर 2 (चित्रा 1 ए -2) पर विभाजित होने वाले प्रेषित और परावर्तित बीम के अनुपात को समायोजित करने के लिए तरंग प्लेट 14 (चित्रा 1 ए -14) समायोजित करें। बीम स्प्लिटर 2 लेजर बीम के एस-घटक को दर्शाता है और पी-घटक को प्रसारित करता है।
    2. बीम जो 2 से गुजरता है, दर्पण 7 (चित्रा 1 ए -7) पर हमला करता है, जो बीम को निचले गैल्वेनिक दर्पण पर विक्षेपित करता है। इसे दर्पण 21 पर हेन बीम के मार्ग का पालन करना चाहिए। इस स्थिति को प्राप्त करने के लिए दर्पण 7 के छोटे आंदोलनों का प्रदर्शन करें।
    3. दर्पण 2 को समायोजित करें ताकि दर्पण 2 द्वारा प्रतिबिंबित बीम, 57.5 मिमी की ऊंचाई पर दर्पण 10 (चित्र 1 ए -10) पर प्रहार करे।
    4. बीम दर्पण 10 से दर्पण 8 (चित्र 1A-8) पर 57.5 मिमी की ऊंचाई पर परिलक्षित होता है। बाद की बीम को उसी ऊंचाई पर दर्पण 9 पर प्रहार करना चाहिए। यदि नहीं, तो आवश्यकतानुसार दर्पण 10 और 8 में छोटे समायोजन करें।
    5. उद्देश्य को हटा दें और उद्देश्य बुर्ज में बंदरगाह के ऊपर बिजली मीटर के सिर को रखें।
    6. प्रत्येक लेजर बीम की शक्ति को समायोजित करने के लिए प्लेट 14, 15 और 16 (चित्रा 1 ए -14,15,16) का उपयोग करें ताकि वे चित्रा 1 सी में दिखाए गए बराबर हों।
    7. बीम एक्सपेंडर 1 (चित्रा 1 ए -1) को जगह में रखें। विस्तारित लेजर बीम को किसी भी कोमा या अस्थिरता के बिना गोलाकार होने के लिए समायोजित करें।
    8. ऑप्टिकल जाल का परीक्षण करने के लिए, पानी में निलंबित 1 μm पॉलीस्टाइनिन मोतियों का समाधान बनाएं। फिर, माइक्रोस्कोप स्लाइड पर इस घोल के 10 μL रखें, शीर्ष पर एक कवरस्लिप रखें और नेल पॉलिश के साथ सील करें। माइक्रोस्कोप चरण पर स्लाइड रखें और इन 1 μm मोतियों को फंसाकर ऑप्टिकल जाल का परीक्षण करें। सुनिश्चित करें कि मोतियों को जाल में खींचा जाता है और मंच को स्थानांतरित करने पर स्थिर रूप से रखा जाता है। ट्रैपिंग जाल के सभी किनारों से समान रूप से कुशलता से होना चाहिए।

2. माइक्रोफ्लुइडिक कक्ष की तैयारी

  1. यदि प्रवाह सेल एक व्यावसायिक रूप से निर्मित उपकरण है जो कवरस्लिप पर पॉलीडिमेथिलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) से बना है, तो चरण 3 पर आगे बढ़ें। यदि यह कनेक्टर के साथ एक ग्लास डिवाइस है, तो चरण 4 पर आगे बढ़ें।
  2. यदि प्रवाह सेल में कनेक्टर्स संलग्न नहीं हैं, तो उन्हें पहले माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्रवेश छेद से बांधें। कनेक्टर अनुलग्न करने के चरणों के लिए चरण 3 देखें।

3. पीडीएमएस फ्लो सेल का उपयोग करके फ्लो सेल कनेक्शन

नोट: सेटअप के लिए, चित्रा 2 डी देखें।

  1. प्रवाह सेल को एक साफ सपाट सतह पर रखें। पीटीएफई ट्यूबिंग को बल के साथ मुक्त छोर से 3 मिमी पकड़ो। ट्यूबिंग को पूर्वनिर्मित पोर्ट में धकेलें (पोर्ट 2 बार लाइन दबाव का समर्थन कर सकता है)।
  2. शेष पोर्ट में से प्रत्येक के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ। इनलेट पोर्ट को सिरिंज पंप से और आउटलेट को एक अपशिष्ट बोतल से कनेक्ट करें (चित्रा 4 ए, बी)।
  3. प्रत्येक ग्लास सिरिंज को 1 एमएल स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ग्रेड मेथनॉल से भरें। प्रत्येक सिरिंज को स्विचिंग वाल्व से संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि वाल्व में आउटलेट को 50 μL मेथनॉल (चित्रा 4 सी, बंद स्थिति) के साथ प्रत्येक लाइन को बर्बाद करने और शुद्ध करने के लिए निर्देशित किया गया है।
  4. आउटलेट की स्थिति को प्रवाह सेल (चित्रा 4 सी, खुली स्थिति) में स्विच करें। सतहों को गीला करने और बुलबुले को खत्म करने के लिए 100 μL / घंटा की प्रवाह दर पर प्रवाह सेल के माध्यम से मेथनॉल के 800 μL पंप करें।
  5. अगले दिन, अल्ट्राप्योर पानी के 800 μL का उपयोग करके इस प्रक्रिया को दोहराएं। प्रवाह सेल अब उपयोग के लिए तैयार है।

4. प्रेस फिट ट्यूबिंग कनेक्टर का अनुलग्नक

नोट: सेटअप के लिए, चित्रा 2 एफ देखें।

  1. यदि प्रेस-फिट ट्यूबिंग कनेक्टर का उपयोग किया जाना है, तो कनेक्टर के एक तरफ से चिपकने वाले टेप को सावधानीपूर्वक हटा दें और इसे माइक्रोस्कोप स्लाइड में छेद पर रखें। कुछ सेकंड के लिए दबाएं। शेष कनेक्टर के लिए प्रक्रिया दोहराएँ।
  2. प्रवाह सेल को एक साफ सपाट सतह पर रखें। पीटीएफई ट्यूबिंग को बल के साथ मुक्त छोर से 3 मिमी पकड़ो। ट्यूबिंग को बंदरगाह में पूर्वनिर्मित छेद में धकेलें और शेष बंदरगाहों में से प्रत्येक के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  3. इनलेट्स से स्विचिंग वाल्व तक टयूबिंग संलग्न करें। चरण 7 पर आगे बढ़ें।

5. स्थायी विधानसभाओं की कुर्की

नोट: सेटअप के लिए, चित्रा 2 ए-सी देखें।

  1. बॉन्डिंग के दौरान प्रवाह सेल और कनेक्टर्स को रखने के लिए एक साफ, सपाट सतह पर या कस्टम-निर्मित कई गुना पर संलग्नक करें।
  2. प्रवाह कोशिका को एक साफ सपाट सतह पर या मैनिफोल्ड के अवकाश खंड में रखें (चित्रा 2 बी)। असेंबली के तल पर कांच के गोंद की एक छोटी मात्रा रखें और सील डालें।
  3. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर प्रवेश छेदों में से एक पर नैनोपोर्ट रखें। धीरे से नीचे धकेलें और बिना पार्श्व गति के जगह पर पकड़ें। शेष पोर्ट के लिए प्रक्रिया दोहराएँ।
  4. कई गुना में जगह में सूखने या क्लैंप करने दें। धीरे से प्रवाह सेल को कई गुना से हटा दें और सुनिश्चित करें कि असेंबली प्रवाह सेल में प्रवेश बंदरगाहों के साथ अच्छी तरह से संरेखित हों। तैयार होने पर चरण 7 पर आगे बढ़ें।

6. फ्लो सेल कनेक्शन और तैयारी

नोट: सेटअप के लिए, चित्रा 4 ए, बी देखें।

  1. माइक्रोस्कोप स्टेज पर एक फ्लो सेल रखें। उंगली-तंग कनेक्टर का उपयोग करके टयूबिंग संलग्न करें।
  2. प्रत्येक ग्लास सिरिंज को 1 एमएल स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ग्रेड मेथनॉल से भरें। प्रत्येक सिरिंज को स्विचिंग वाल्व से संलग्न करें। सुनिश्चित करें कि वाल्व में आउटलेट को 50 μL मेथनॉल (चित्रा 4 सी, बंद स्थिति) के साथ प्रत्येक लाइन को बर्बाद करने और शुद्ध करने के लिए निर्देशित किया गया है।
  3. आउटलेट की स्थिति को प्रवाह सेल (चित्रा 4 सी, खुली स्थिति) में स्विच करें। सतहों को गीला करने और बुलबुले को खत्म करने के लिए 100 μL / घंटा की प्रवाह दर पर प्रवाह सेल के माध्यम से मेथनॉल के 800 μL पंप करें।
  4. अगले दिन, अल्ट्राप्योर पानी के 800 μL का उपयोग करके इस प्रक्रिया को दोहराएं। प्रवाह सेल अब उपयोग के लिए तैयार है।

7. द्रव प्रवाह का नियंत्रण

  1. स्विचिंग वाल्व को बंद स्थिति में बदलें (चित्रा 4 सी)। सिरिंज को हटा दें, अवशिष्ट पानी को त्याग दें, और सिरिंज को प्रयोगात्मक समाधानों से भरें, उदाहरण के लिए, डीएनए-मोती; किण्वक; और एटीपी। सीरिंज को पंप पर वापस करें और उन्हें स्विचिंग वाल्व से कनेक्ट करें।
  2. इस स्थिति में, किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए मैन्युअल रूप से प्लंजर्स को 5-10 μL से नीचे मजबूर करें। स्विचिंग वाल्व स्थिति को खोलने के लिए बदलें।
  3. तालिका 1 में उल्लिखित ट्रैपिंग और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए इष्टतम द्रव प्रवाह गति प्राप्त करने के लिए प्रवाह दर योजना का उपयोग करें। ऑप्टिकल ट्रैपिंग के लिए इष्टतम द्रव प्रवाह मोतियों के स्थिर ट्रैपिंग को सक्षम करना चाहिए और एक बार डीएनए फैलने के बाद, यह बी-फॉर्म (~ 3,000 बीपी /

8. एकल डीएनए अणुओं के साथ पॉलीस्टाइनिन मोतियों को फंसाना

  1. 10x आवर्धन पर, चैनल प्रवेश बिंदुओं के करीब द्रव धाराओं के बीच की सीमा का पता लगाएं। 100x उद्देश्य में तेल जोड़ें और उच्च आवर्धन पर स्विच करें।
  2. ऑप्टिकल ट्रैप (या तो एक समय में दोनों या एक) के लिए शटर खोलें। केंद्रित लेजर बीम को मोतियों को फंसाना चाहिए और डीएनए को तुरंत फैलना चाहिए।
  3. एक बार जब एक परिसर फंस जाता है, तो प्रवाह के लंबवत चरण का अनुवाद करें (चित्रा 3 ए, सी, इनसेट)। यह डीएनए मोती समाधान से फंसे हुए परिसर को धारा 2 में ले जाएगा। आगे का अनुवाद परिसर को स्ट्रीम 3 में ले जाएगा।

9. फ्लो सेल सफाई

नोट: इसे दैनिक करें।

  1. प्रयोग पूरा होने पर पंप बंद कर दें। स्विचिंग वाल्व को बंद स्थिति में बदलें (चित्रा 4 सी)।
  2. सिरिंज निकालें और उन्हें खाली करें। फ़िल्टर किए गए आसुत जल से तीन बार धोएं।
  3. सिरिंज को सफाई के घोल से भरें। पंप में सिरिंज रखें और स्विचिंग वाल्व से कनेक्ट करें।
  4. स्विचिंग वाल्व को शुद्ध करें और खोलने के लिए स्थिति बदलें। पंप 800 μL सफाई समाधान आमतौर पर रात भर 100 μL / घंटा की प्रवाह दर पर।
  5. अगले दिन, स्विचिंग वाल्व बंद करें, और फिर पानी से सिरिंज को हटा दें और कुल्ला करें। प्रवाह सेल और लाइनों को 400-800 μL / घंटा की प्रवाह दर पर 4-800 μL पानी के साथ धोएं। यदि प्रवाह कोशिकाओं की अधिक ज़ोरदार सफाई की आवश्यकता होती है, तो सफाई समाधान को 6 एम गुआनिडियम हाइड्रोक्लोराइड के साथ बदलें।

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Representative Results

ट्रैप संरेखण और ताकत का प्रारंभिक परीक्षण 1 μm, गैर-फ्लोरोसेंट पॉलीस्टाइनिन मोतियों के साथ किया जाता है। चूंकि प्रयोगशाला में किए गए अधिकांश शोध प्रतिदीप्ति का उपयोग करते हैं, इसलिए हम आगे 1 μm, ड्रैगन ग्रीन पॉलीस्टाइनिन मोती (चित्रा 1 डी, ई) का उपयोग करके जाल की ताकत का परीक्षण करते हैं। इसके बाद डीएनए-बीड कॉम्प्लेक्स के ऑप्टिकल ट्रैपिंग में काम बदल जाता है जहां डीएनए को बिस-इंटरकैलेटिंग डाई योयो -1 14,29 से दाग दिया जाता है। जब ये परिसर एक माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह सेल में कवरस्लिप सतह से 10-15 μ m ऊपर फंस जाते हैं, तो मोती के ऊपर द्रव प्रवाह डीएनए को फैलाता है (आंकड़े 3B, C)। द्रव-विस्तारित डीएनए की लंबाई को मापना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि यह अपनी बी-फॉर्म लंबाई तक फैला हुआ है, जो अपेक्षित लंबाई है। उदाहरण के लिए, बैक्टीरियोफेज लैम्ब्डा डीएनए के लिए, पूरी लंबाई 16 μm से थोड़ी लंबी है, जो 48,504 bp14 से मेल खाती है।

द्रव प्रवाह को चिह्नित करने के लिए, फ्लोरोसेंट मोतियों को विभिन्न पंप गति और विभिन्न चिपचिपाहट के समाधानों का उपयोग करके कवरस्लिप सतह से ऊपर 15 μm की फोकस ऊंचाई के साथ प्रवाह कोशिकाओं में पेश किया गया था। मोती की स्थिति की फिल्मों को कैप्चर किया गया था, और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मोती की स्थिति को ट्रैक किया गया था। परिणाम बताते हैं कि 1 μm व्यास के मोतियों के लिए, रैखिक वेग को 10% -50% (चित्रा 5 ए) तक सुक्रोज समाधानों में 100 μL / h की पंप प्रवाह दर पर सटीक रूप से ट्रैक किया जा सकता है। इसी तरह की परिस्थितियों में, मोती पर बल की गणना की जा सकती है और पंप प्रवाह दर और समाधान चिपचिपाहट (चित्रा 5 बी) के आधार पर 10 से 400 पीएन तक पाया जा सकता है। अंत में, बल पर 120 से 970 एनएम तक के मोती व्यास के प्रभाव का मूल्यांकन सुक्रोज की विभिन्न सांद्रता में किया गया था। डेटा से पता चलता है कि 1-27 पीएन तक के बलों को मोटर प्रोटीन में विभिन्न व्यास के मोतियों को संलग्न करके और मोटर को द्रव प्रवाह के खिलाफ उस मोती को खींचने के लिए कहकर मापा जा सकता है (चित्रा 5 सी)।

Figure 1
चित्र 1: ऑप्टिकल लेआउट और ट्रैपिंग गतिविधि का प्रदर्शन। (A) लाल रंग में IR बीम और काले रंग में HeNe बीम के साथ ऑप्टिकल लेआउट का योजनाबद्ध। (बी) ब्रेडबोर्ड पर लगाए गए ऑप्टिकल घटकों की तस्वीर। पैनल ए और बी में घटक संख्याएं निम्नानुसार हैं: 1), बीम विस्तारक; 2), हस्तक्षेप दर्पण (रुपयेअधिकतम = 1064 एनएम; टीपीअधिकतम = 1064 एनएम); 3), हस्तक्षेप दर्पण (633 एनएम; आर = 50%; टी = 50%; 4-6), हस्तक्षेप दर्पण (आरअधिकतम = 633 एनएम); 7), हस्तक्षेप दर्पण (आरअधिकतम = 1064 एनएम; टीअधिकतम = 633 एनएम); 8), हस्तक्षेप दर्पण (आरएसअधिकतम = 1064 एनएम; टीपीअधिकतम = 1064 एनएम, टीमैक्स = 633 एनएम); 9), हस्तक्षेप दर्पण (आरअधिकतम = 1064 एनएम, 633 एनएम; टीअधिकतम = 1064 एनएम, 633 एनएम); 10), हस्तक्षेप दर्पण (आरअधिकतम = 1064 एनएम); 11), उद्देश्य लेंस, एफ = 110 एनएम; 12), टेलन लेंस; 13), गैल्वेनिक दर्पण; 14-16), रोटेटर (/2); 17), आईआर स्कैनिंग चैनल शटर; 18), दृश्य चैनल शटर; 19), आईआर फिक्स्ड चैनल शटर; 20), बीम स्टॉप और 21), हस्तक्षेप दर्पण (आरअधिकतम = 1064 एनएम; टीअधिकतम = 633 एनएम)। (ग) विद्युत उत्पादन का मापन। लेजर से पावर आउटपुट को ऑप्टिकल लेआउट में लेजर हेड स्थापित करने से पहले मापा जाता है। एक बार ट्रैप संरेखण हो जाने के बाद, बीम पावर को प्रत्येक जाल के लिए 100x उद्देश्य के बाद मापा जाता है। (डी) और (ई) छवियां 1 μm फ्लोरोसेंट मोतियों के स्थिर, ऑप्टिकल ट्रैपिंग का प्रदर्शन करती हैं। एफ, फिक्स्ड ट्रैप और एम, 30 मेगाहर्ट्ज पर एक छोटे (डी) या बड़े (ई) सर्कल के माध्यम से स्कैनिंग मोड में मोबाइल ट्रैप के साथ मोबाइल ट्रैप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रोफ्लुइडिक प्रवाह कोशिकाएं। (ए) बोरोसिलिकेट ग्लास से बने तीन-चैनल प्रवाह सेल की असेंबली। (बी) कनेक्टर बॉन्डिंग के दौरान प्रवाह कोशिकाओं को स्थिर रूप से स्थिति में रखने के लिए कई गुना। शीर्ष पर, एल्यूमीनियम का आधार 1 मिमी के साथ कई गुना प्रवाह सेल को पार्श्व रूप से स्थान देने के लिए है। चार पद (प्रत्येक कोने में एक) कई गुना के ढक्कन को स्थिति में निर्देशित करते हैं, जबकि अधिक केंद्रीय रूप से रखे गए थ्रेडेड बोल्ट का उपयोग ढक्कन को जगह में दबाने के लिए किया जाता है। नीचे, मैनिफोल्ड बेस पर पोस्ट और बोल्ट से मेल खाने के लिए ड्रिल किए गए छेद के साथ कई गुना ढक्कन। (1), नट जो कई गुना बेस बोल्ट से जुड़ते हैं; (2) बंधन प्रक्रिया के दौरान हल्का तनाव प्रदान करने के लिए नट्स और मैनिफोल्ड ढक्कन के बीच रखे गए स्प्रिंग्स। (सी) पहले से जुड़े कनेक्टर्स के साथ ग्लास फ्लो सेल में एक सामान्य एकल द्रव धारा में इनलेट चैनलों के अभिसरण का एक क्लोज-अप दृश्य। एक संदर्भ के रूप में प्रवाह सेल के बगल में एक चौथाई रखा जाता है। (डी) पीडीएमएस प्रवाह सेल की एक छवि। पीडीएमएस परतें 3 मिमी मोटी होती हैं। (ई) ल्यूर कनेक्टर्स के साथ एक फ्यूज्ड सिलिका फ्लो सेल। (एफ) प्रेस-फिट कनेक्टर्स के साथ एक बोरोसिलिकेट ग्लास फ्लो सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ग्लास प्रवाह सेल के माध्यम से द्रव प्रवाह विशेषताएं। (ए) प्रवाह कोशिका के भीतर द्रव प्रवाह लैमिनार है। योजनाबद्ध ऊपर से प्रवाह सेल को दिखाता है ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि अंतर-चैनल प्रसार आसन्न द्रव धाराओं के बीच मिश्रण का मुख्य स्रोत है। प्रवाह की दिशा नीले तीरों द्वारा इंगित की जाती है और व्यक्तिगत धाराएं सफेद, हल्के भूरे और सफेद रंग की होती हैं। चैनलों के बीच अनुप्रस्थ प्रसार के चौड़े क्षेत्रों को लाल रंग में इंगित किया गया है। इनसेट निचली धारा में फ्लोरोसेंट-लेबल डीएनए-बीड कॉम्प्लेक्स और केवल ऊपरी धारा में बफर के साथ 10 एक्स आवर्धन पर आसन्न द्रव धाराओं की एक प्रतिदीप्ति छवि दिखाता है। ऊपरी धारा में सफेद धब्बे सीसीडी कैमरे से शॉट शोर हैं। (बी) लैमिनार प्रवाह कोशिकाओं में प्रवाह प्रोफ़ाइल (हल्का बैंगनी) परवलयिक है। प्रवाह सेल को साइड से देखा जाता है और प्रवाह की दिशा प्रत्येक सेल के ऊपर इंगित की जाती है। सबसे तेज द्रव वेग केंद्र में स्थित प्रवाह कोशिका में होते हैं जबकि प्रवाह सेल सतहों के बगल में सबसे धीमे द्रव वेग होते हैं। नतीजतन, प्रवाह कोशिका के केंद्र में स्थित एक ऑप्टिकल रूप से फंसे डीएनए-बीड कॉम्प्लेक्स के लिए, द्रव प्रवाह बैक्टीरियोफेज डीएनए अणु (48,504 बीपी) को 16 μm (B-form) तक फैलाता है ताकि स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन किया जा सके (बाएं छवि)। इसके विपरीत, प्रवाह कोशिका की सतह के पास स्थित एक ही अणु कम प्रवाह दर का अनुभव करता है और इसे फैलाया नहीं जा सकता है। (सी) एक एकल डीएनए मोती परिसर एक प्रवाह कोशिका के भीतर स्थित है। विभिन्न गहराई प्रवाह कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है लेकिन, प्रत्येक मामले में, बीम संरेखण सेट किया जा सकता है ताकि इष्टतम ट्रैपिंग कवरस्लिप सतह से 10-20 μm ऊपर हो, जो सतह के प्रभाव को समाप्त करता है और स्थिर प्रवाह होता है ताकि डीएनए अणुओं को बी-फॉर्म तक बढ़ाया जा सके। जैसा कि (सी) में बाईं छवि में दर्शाया गया है, स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करने के लिए डीएनए को फैलाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: माइक्रोस्कोप चरण में प्रवाह कोशिका के भीतर ऑप्टिकल रूप से फंसे डीएनए का प्रवाह और प्रतिक्रिया नियंत्रण। (A) एक सिरिंज पंप में प्रवाह सेल का संभोग। तीन-तरफा स्विचिंग वाल्व के माध्यम से सिरिंज पंप से जुड़े तीन-चैनल प्रवाह सेल की एक तस्वीर प्रस्तुत की गई है। प्रवाह सेल को एक उल्टे माइक्रोस्कोप में मोटर चालित चरण पर रखा जाता है। प्रवाह सेल एक अपशिष्ट रेखा (बाएं) और स्विचिंग वाल्व (डैश्ड सियान सर्कल) से नारंगी, 500 μm टयूबिंग (हरे टेप के साथ इंगित) के माध्यम से जुड़ा हुआ है। वाल्वों को सिरिंज पंप उपकरण के अनुकूल एक कस्टम-निर्मित कई गुना पर स्थिर रूप से रखा जाता है, जिसमें 1 एमएल गैसटाइट सिरिंज (पीले तीर सीमांकित प्लंजर) होते हैं। अपशिष्ट लाइनों का उपयोग हवा के बुलबुले को हटाने के लिए किया जाता है जो सिरिंज परिवर्तन के दौरान स्विचिंग वाल्व में फंस सकते हैं। (बी) तीन-चैनल प्रवाह सेल का क्लोज-अप दृश्य। द्रव धाराओं के विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा के लिए, बाहरी लोगों को केवल पानी युक्त केंद्रीय धारा के साथ खाद्य रंग के साथ रंगीन किया गया है। ज़ूम क्षेत्र इंगित करता है कि कैसे एक ऑप्टिकल रूप से फंसे हुए मोती-डीएनए अणु परिसर को प्रवाह (काला तीर) के लंबवत चरण का अनुवाद करके एक द्रव धारा से दूसरे (नीले तीर) में अनुवादित किया जाता है। (सी) तीन-तरफा स्विचिंग वाल्वों की योजनाबद्धता उनकी परिचालन स्थिति को दर्शाती है। अक्षर पदनाम एफ, एस और डब्ल्यू दिशा द्रव के अनुरूप हैं और क्रमशः प्रवाह सेल, सिरिंज और अपशिष्ट में प्रवाह कर सकते हैं। प्रत्येक योजनाबद्ध के शीर्ष पर काले प्लग द्वारा इंगित एक पोर्ट स्थायी रूप से बंद है। ओपन या ऑपरेशनल स्थिति (बाएं पैनल) में, द्रव प्रवाह सीधे सिरिंज (एस) से फ्लो सेल (एफ) तक स्विचिंग वाल्व के माध्यम से गुजरता है। बंद स्थिति (दाएं पैनल) में, डायल को चालू किया जाता है ताकि प्रवाह कक्ष पर्यावरण से सील हो जाए। इस स्थिति में, प्रवाह को बर्बाद करने के लिए निर्देशित किया जाता है और प्रवाह सेल में हवा के बुलबुले पेश किए बिना सिरिंज को बंद किया जा सकता है। चूंकि वाल्वों में 6 μL मृत मात्रा होती है, इसलिए ओपन कॉन्फ़िगरेशन पर लौटने से पहले लाइनों को शुद्ध करते समय बहुत कम समाधान बर्बाद हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: मोती की गति और विरोधी बल द्रव प्रवाह से प्रभावित होते हैं। (ए) रैखिक मोती वेग पंप गति और सुक्रोज एकाग्रता से प्रभावित होता है। (बी) एक मोती पर विरोधी बल घोल चिपचिपाहट से प्रभावित होता है। (ग) मोती व्यास प्रवाह के तहत मोतियों पर बल को प्रभावित करता है। सभी प्रयोगों में, फ्लोरोसेंट मोतियों का उपयोग किया गया था (ड्रैगन ग्रीन)। (ए) और (बी) में, 0.97 μm व्यास के मोतियों का उपयोग किया गया था और (C) में, विभिन्न व्यास के मोतियों का उपयोग किया गया था। सुक्रोज समाधान अल्ट्राप्योर पानी में बनाए गए थे, 0.2 μm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किए गए थे और एक हैंडहेल्ड रिफ्रैक्टोमीटर का उपयोग करके अपवर्तक सूचकांक मापा गया था, जिसमें ISCO टेबल्स का उपयोग करके सेंटीपोइज़ में चिपचिपाहट निर्धारित की गई थी और अंत में mPa.s में एसआई इकाइयों में परिवर्तित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्रवाह दर (μL/h)b समय प्रति कदम (मिनट) वॉल्यूम डिस्पेंसर (μL)
800 5 67
400 5 33
200 5 17
100 5 8
50 5 4
25 5 2
15 5 या अधिक 1 या अधिक
एक। ये सिरिंज पंप सॉफ्टवेयर द्वारा गणना की गई द्रव प्रवाह दर हैं और उपयोग किए गए प्रत्येक सिरिंज व्यास के लिए अद्वितीय हैं। प्रवाह दर लाइनों और प्रवाह कक्ष (800 μl / hr) को तेजी से भरने में सक्षम बनाती है, इसके बाद ट्रैपिंग और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए आदर्श प्रवाह दर में क्रमिक कमी आती है
b. सिरिंज पंप को कीपैड से या विक्रेता द्वारा प्रदान किए गए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है।

तालिका 1: बुलबुले को कम करने और स्थिर ट्रैपिंग प्राप्त करने के लिए द्रव प्रवाह दर।

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Discussion

प्रयोग 4,6 के सफल परिणाम के लिए प्रवाह प्रणाली की सावधानीपूर्वक असेंबली महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल के सबसे चुनौतीपूर्ण पहलुओं में से एक कांच की सतह पर कनेक्टर का लगाव है। इसके लिए, हम निम्नलिखित दो दृष्टिकोणों का उपयोग करते हैं: प्रेस-फिट फिट ट्यूबिंग कनेक्टर और नैनोपोर्ट असेंबली। प्रेस-फिट कनेक्टर्स आसानी से ग्लास का पालन करते हैं, इसके बाद पीटीएफई ट्यूबिंग को फोर्सप्स का उपयोग करके पूर्वनिर्मित छेदों में धकेल दिया जाता है। जब अधिक स्थिर लगाव की आवश्यकता होती है, तो नैनोपोर्ट असेंबली के संबंध को प्राथमिकता दी जाती है। सावधानीपूर्वक उपयोग और सफाई के साथ, स्थायी असेंबली के साथ एक ग्लास फ्लो सेल का उपयोग 1 वर्ष से अधिक समय तक किया जा सकता है। यदि प्रवाह कोशिकाओं को अधिक बार स्विच करने की आवश्यकता होती है, तो पीडीएमएस प्रवाह कोशिकाओं का उपयोग किया जा सकता है क्योंकि वे एक उत्कृष्ट और सस्ता विकल्प हैं। उनका पुन: उपयोग किया जा सकता है लेकिन पीडीएमएस सूजन के लिए अतिसंवेदनशील है, जो समय के साथ द्रव प्रवाह व्यवहार को बदल सकता है।

ग्लास और पीडीएमएस प्रवाह कोशिकाएं दोनों अविनाशी नहीं हैं। प्रयोगशाला में, उपयोग की जाने वाली अधिकतम प्रवाह दर 800 μL / h है। यदि यह दैनिक और / या विस्तारित अवधि के लिए पार हो जाता है, तो फ्लो सेल वापिंग (ग्लास फ्लो सेल) और पीडीएमएस का विरूपण हो सकता है। जबकि मेथनॉल और पानी के साथ प्रारंभिक गीला करने की प्रक्रिया में समय लगता है, यह अच्छी तरह से इसके लायक है क्योंकि सभी बुलबुले समाप्त हो जाते हैं, और कनेक्टर्स पर लीक का भी पता लगाया जा सकता है। यहां वर्णित प्रवाह कोशिकाएं किए जा रहे प्रयोगों को लचीलापन प्रदान करती हैं। विभिन्न प्रवाह कोशिकाओं, ट्यूबिंग और विभिन्न कनेक्टर्स के लगाव के इन दृष्टिकोणों का उपयोग करके, प्रयोगात्मक स्थितियों को आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है और इष्टतम डेटा प्राप्त करने के लिए जल्दी से अनुकूलित किया जा सकता है। वाई-आकार के चैनल प्रवाह कोशिकाओं को प्रस्तुत किया जाता है लेकिन माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस डिज़ाइन की एक बड़ी श्रृंखला कई कंपनियों से उपलब्ध है। यह अन्वेषक को प्रयोगात्मक डिजाइन में और भी अधिक लचीलापन प्रदान करता है।

चार-तरफ़ा स्विचिंग वाल्व का उपयोग एक सरल और प्रभावी तरीका है जो यह सुनिश्चित करता है कि एक बार प्रवाह प्रणाली को इकट्ठा करने और परीक्षण करने के बाद, यह प्रभावी रूप से एक बंद वातावरण बन जाता है, जहां संदूषण कम से कम होता है, और बुलबुले समाप्त हो जाते हैं। उत्तरार्द्ध महत्वपूर्ण है क्योंकि बुलबुले एक प्रयोग के दौरान यादृच्छिक रूप से संपीड़ित और डीकंप्रेस करते हैं और यह द्रव प्रवाह को परेशान करता है जिससे फंसे हुए डीएनए अणु अप्रत्याशित तरीकों से स्थानांतरित होते हैं और यहां तक कि टूट भी जाते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए कि उन्हें सिस्टम में बनने से रोका जाए।

अंत में, यहां वर्णित प्रणाली को दृश्य जैव रसायन के लिए अनुकूलित किया गया है जहां डीएनए, प्रोटीन या फ्लोरोसेंट-टैग प्रोटीन से जुड़े मोतियों का सावधानीपूर्वक विश्लेषण किया जा सकता है। यद्यपि सिस्टम को दोहरे जाल और क्वाड्रंट फोटोडिटेक्टरों के अतिरिक्त बल माप करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है, उदाहरण के लिए, डीएनए मोटर प्रोटीन में विभिन्न व्यास के मोतियों को जोड़कर बलों को मापा जा सकता है, और मोटर को द्रव प्रवाह के खिलाफ इस मोती को खींचने के लिए कहा जा सकता है। घोल चिपचिपाहट, द्रव प्रवाह और मोती व्यास को अलग-अलग करके, मोटर प्रोटीन फ़ंक्शन (चित्रा 5) में विस्तृत अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए विरोधी बलों की एक बड़ी श्रृंखला लागू की जा सकती है। यह जैविक लेनदेन से जुड़े बलों को मापने का एक सरल और सस्ता तरीका है, लेकिन इसमें अधिक संवेदनशील दृष्टिकोण से जुड़ी सटीकता का अभाव है। जब दृश्य जैव रासायनिक दृष्टिकोण को संवेदनशील बल का पता लगाने के तरीकों के साथ जोड़ा जाता है, तो जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं के अधिक पूर्ण चित्र प्रदान किए जा सकते हैं।

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Disclosures

लेखक ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

बियांको प्रयोगशाला में अनुसंधान एनआईएच अनुदान जीएम 100156 और जीएम 144414 द्वारा पीआरबी को समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x objective Leica 506318 or 506038 Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective Leica 506263 Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads Bangs Labs FSDG004 Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads Bangs Labs CPO1004 Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective Leica 506081 Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser Lumentum 1100 series 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera Amscope MU303 A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software Hamamatsu HCImage Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4 Hamamatsu c13440-20cu CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera Spot imaging solutions DE50CMT Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube Semrock cy5-404a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube Semrock fitc/txred-2x-b-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing Grace Bio 46004 PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube Semrock gfp-3035b-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells Translume Custom Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue Loctite 233841 Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells CIDRA Precision services Custom design Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution Hamilton 18311 Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software Media cybernetics Image Pro Premiere Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software Fiji/NIH Image/Image J Shareware Analysis of images and single molecule tracking
Image display card Melles Griot 06 DLA 001 Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil Zeiss 444960 Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools Thor labs FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1  Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer Canadian Photonics labs IR 3150 Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter Thor labs Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe) Thor labs LG7 or 8 Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR) Thor labs LG11 Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube Semrock mcherry-a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope Leica DMIRE2 DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software  UCSF/shareware uManager Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly IDEX N333 Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support Thor Labs PA52502 Active isolation table support
Optics and lenses Solar TII Various Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells ufluidix Custom Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing IDEX 1532 Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube Semrock lf488/543/635-3x-a-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors GraceBio 46003 Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors GSI Lumonics VM500 Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 68042-08 Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves IDEX V-101T Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold Machine shop None Custom built
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software Harvard Apparatus 70-6000 Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes Hamilton 81320 Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top Thor Labs T36H Optical table top or breadboard
Trapping laser Newport/Spectra Physics J-series; BL106C Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser

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References

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जैव रसायन अंक 189
एकल-अणु अध्ययन के लिए दोहरे ऑप्टिकल ट्वीज़र्स और माइक्रोफ्लुइडिक्स का उपयोग
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Bianco, P. R. Use of Dual Optical… More

Bianco, P. R. Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies. J. Vis. Exp. (189), e64023, doi:10.3791/64023 (2022).

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