Rasterkraftmikroskopie Cantilever-basierte Nanoindentation: Messungen mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala in Luft und Flüssigkeit

Summary

Die Quantifizierung der Kontaktfläche und der Kraft, die von einer Rasterkraftmikroskop-Sondenspitze (AFM) auf eine Probenoberfläche ausgeübt wird, ermöglicht die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften im Nanobereich. Best Practices zur Implementierung von AFM-Cantilever-basierter Nanoindentation in Luft oder Flüssigkeit an weichen und harten Proben zur Messung des Elastizitätsmoduls oder anderer nanomechanischer Eigenschaften werden diskutiert.

Abstract

Ein Rasterkraftmikroskop (AFM) misst grundlegend die Wechselwirkung zwischen einer nanoskaligen AFM-Sondenspitze und der Probenoberfläche. Wenn die von der Sondenspitze ausgeübte Kraft und ihre Kontaktfläche mit der Probe quantifiziert werden können, ist es möglich, die nanoskaligen mechanischen Eigenschaften (z. B. Elastizität oder Elastizitätsmodul) der zu untersuchenden Oberfläche zu bestimmen. Ein detailliertes Verfahren zur Durchführung quantitativer AFM-Cantilever-basierter Nanoindentationsexperimente wird hier mit repräsentativen Beispielen vorgestellt, wie die Technik zur Bestimmung der Elastizitätsmodule einer Vielzahl von Probentypen, die von kPa bis GPa reichen, angewendet werden kann. Dazu gehören lebende mesenchymale Stammzellen (MSCs) und Zellkerne in physiologischem Puffer, in Harz eingebettete dehydrierte Loblolly-Kiefernquerschnitte und Bakken-Schiefer unterschiedlicher Zusammensetzung.

Darüber hinaus wird die AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation verwendet, um die Bruchfestigkeit (d.h. Durchbruchkraft) von Phospholipid-Doppelschichten zu untersuchen. Wichtige praktische Überlegungen wie Methodenwahl und -entwicklung, Sondenauswahl und -kalibrierung, Identifizierung von Regionen von Interesse, Probenheterogenität, Strukturgröße und Aspektverhältnis, Spitzenverschleiß, Oberflächenrauheit sowie Datenanalyse und Messstatistik werden erörtert, um die ordnungsgemäße Implementierung der Technik zu unterstützen. Schließlich wird die Kolokalisierung von AFM-abgeleiteten nanomechanischen Karten mit elektronenmikroskopischen Techniken demonstriert, die zusätzliche Informationen über die Elementzusammensetzung liefern.

Introduction

Das Verständnis der mechanischen Eigenschaften von Werkstoffen ist eine der grundlegendsten und wesentlichsten Aufgaben im Ingenieurwesen. Für die Analyse von Schüttguteigenschaften stehen zahlreiche Methoden zur Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Werkstoffsystemen zur Verfügung, darunter Zugversuche¹, Druckversuche² und Drei- oder Vierpunkt-Biegeversuche (Biegeversuche)³. Während diese mikroskaligen Tests unschätzbare Informationen über die Eigenschaften des Schüttguts liefern können, werden sie in der Regel bis zum Versagen durchgeführt und sind daher zerstörerisch. Darüber hinaus fehlt ihnen die räumliche Auflösung, die erforderlich ist, um die mikro- und nanoskaligen Eigenschaften vieler heute interessanter Materialsysteme wie dünner Schichten, biologischer Materialien und Nanokomposite genau zu untersuchen. Um einige der Probleme bei groß angelegten mechanischen Prüfungen, vor allem deren zerstörerische Natur, anzugehen, wurden Mikrohärteprüfungen aus der Mineralogie übernommen. Die Härte ist ein Maß für die Widerstandsfähigkeit eines Materials gegen plastische Verformung unter bestimmten Bedingungen. Im Allgemeinen wird bei Mikrohärteprüfungen eine steife Sonde, die normalerweise aus gehärtetem Stahl oder Diamant besteht, verwendet, um in ein Material einzudrücken. Die resultierende Eindringtiefe und/oder -fläche kann dann zur Bestimmung der Härte verwendet werden. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, darunter die Härte Vickers⁴, Knoop⁵ und Brinell⁶ ; Jedes liefert ein Maß für die mikroskalige Materialhärte, jedoch unter unterschiedlichen Bedingungen und Definitionen, und liefert daher nur Daten, die mit Tests verglichen werden können, die unter denselben Bedingungen durchgeführt wurden.

Die instrumentierte Nanoindentation wurde entwickelt, um die relativen Werte zu verbessern, die mit den verschiedenen Mikrohärteprüfmethoden erhalten wurden, die räumliche Auflösung für die Analyse mechanischer Eigenschaften zu verbessern und die Analyse dünner Schichten zu ermöglichen. Wichtig ist, dass durch die Verwendung der zuerst von Oliver und Pharr⁷ entwickelten Methode der Elastizitäts- oder Elastizitätsmodul E eines Probenmaterials durch instrumentierte Nanoindentation bestimmt werden kann. Darüber hinaus kann durch den Einsatz einer dreiseitigen pyramidenförmigen Nanoeindringkörpersonde von Berkovich (deren ideale Spitzenflächenfunktion mit der der vierseitigen Pyramidensonde von Vickers übereinstimmt)⁸ ein direkter Vergleich zwischen nanoskaligen und traditionelleren mikroskaligen Härtemessungen durchgeführt werden. Mit der zunehmenden Popularität des AFM gewann auch die Cantilever-basierte Nanoindentation von AFM an Aufmerksamkeit, insbesondere für die Messung der mechanischen Eigenschaften weicherer Materialien. Wie in Abbildung 1 schematisch dargestellt, sind die beiden heute am häufigsten verwendeten Techniken zur Untersuchung und Quantifizierung nanoskaliger mechanischer Eigenschaften die instrumentierte Nanoindentation (Abbildung 1A) und die AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation (Abbildung 1B)⁹, wobei letztere im Mittelpunkt dieser Arbeit steht.

Abbildung 1: Vergleich von instrumentierten und AFM-Cantilever-basierten Nanoindentationssystemen. Schematische Diagramme, die typische Systeme für die Durchführung von (A) instrumentierter Nanoindentation und (B) AFM-Cantilever-basierter Nanoindentation darstellen. Diese Abbildung wurde von Qian et ^al.51 modifiziert. Abkürzung: AFM = Rasterkraftmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Sowohl instrumentierte als auch AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation verwenden eine steife Sonde, um eine zu untersuchende Probenoberfläche zu verformen und die resultierende Kraft und Verschiebung in Abhängigkeit von der Zeit zu überwachen. Typischerweise wird entweder die gewünschte Last (d. h. Kraft) oder das (Z-Piezo-) Wegprofil vom Benutzer über die Softwareschnittstelle vorgegeben und direkt vom Gerät gesteuert, während der andere Parameter gemessen wird. Die mechanische Eigenschaft, die am häufigsten aus Nanoindentationsexperimenten gewonnen wird, ist der Elastizitätsmodul (E), auch als Elastizitätsmodul bezeichnet, der Druckeinheiten hat. Der Elastizitätsmodul eines Materials ist eine grundlegende Eigenschaft, die sich auf die Verbundsteifigkeit bezieht, und ist definiert als das Verhältnis von Zug- oder Druckspannung (σ, die aufgebrachte Kraft pro Flächeneinheit) zur axialen Dehnung (ε, die proportionale Verformung entlang der Eindringachse) während der elastischen (d. h. reversiblen oder vorübergehenden) Verformung vor dem Einsetzen der plastischen Verformung (Gleichung [1]):

(1)

Es ist zu beachten, dass, da viele Materialien (insbesondere biologische Gewebe) tatsächlich viskoelastisch sind, der (dynamische oder komplexe) Modul in Wirklichkeit sowohl aus elastischen (Lagerung, in Phase) als auch aus viskosen (Verlust, phasenverschoben) Komponenten besteht. In der Praxis wird in einem Nanoindentationsexperiment der reduzierte Modul E * gemessen, der sich auf den wahren Probenmodul E bezieht, wie in Gleichung (2) gezeigt:

(2)

Dabei stehen E-Spitze und ν-Spitze für den Elastizitätsmodul bzw. das Poisson-Verhältnis der Nanoeindringkörperspitze und ν für das geschätzte Poisson-Verhältnis der Probe. Das Poisson-Verhältnis ist das negative Verhältnis der Quer- zur Axialdehnung und gibt somit den Grad der Querdehnung einer Probe an, wenn sie einer axialen Dehnung ausgesetzt wird (z. B. bei einer Nanoindentationsbelastung), wie in Gleichung (3) gezeigt:

(3)

Die Umrechnung vom reduzierten in den tatsächlichen Modul ist notwendig, weil a) ein Teil der axialen Dehnung, die von der Eindringkörperspitze übertragen wird, in Querdehnung umgewandelt werden kann (d. h. die Probe kann sich durch Ausdehnung oder Kontraktion senkrecht zur Belastungsrichtung verformen) und b) die Eindringkörperspitze nicht unendlich hart ist und daher das Eindrücken der Probe zu einer (kleinen) Verformung der Spitze führt. Beachten Sie, dass in dem Fall, in dem die _E-Spitze >> E ist (d. h. die Eindringkörperspitze viel härter ist als die Probe, was bei der Verwendung einer Diamantsonde oft der Fall ist), die Beziehung zwischen dem reduzierten und dem tatsächlichen Probenmodul stark zu E ≈ E*(1 - v²) vereinfacht wird. Während die instrumentierte Nanoindentation in Bezug auf die genaue Kraftcharakterisierung und den Dynamikbereich überlegen ist, ist die Cantilever-basierte Nanoindentation auf AFM-Basis schneller, bietet eine um Größenordnungen höhere Kraft- und Wegempfindlichkeit, ermöglicht eine Bildgebung mit höherer Auflösung und eine verbesserte Lokalisierung von Eindrücken und kann gleichzeitig magnetische und elektrische Eigenschaften im Nanomaßstab untersuchen⁹. Insbesondere die freitragende Nanoindentation auf AFM-Basis eignet sich hervorragend für die Quantifizierung mechanischer Eigenschaften auf der Nanoskala von weichen Materialien (z. B. Polymere, Gele, Lipiddoppelschichten und Zellen oder andere biologische Materialien), extrem dünnen (Sub-μm) Filmen (bei denen Substrateffekte je nach Eindringtiefe ins Spiel kommen können)^10,11 und suspendierten zweidimensionalen (2D) Materialien^12,13,14 wie Graphen ^15,16, Glimmer¹⁷, hexagonales Bornitrid (h-BN)18 oder Übergangsmetalldichalkogenide (TMDCs; z. B. MoS₂)¹⁹. Dies ist auf seine hervorragende Kraft- (sub-nN) und Verschiebungsempfindlichkeit (sub-nm) zurückzuführen, die wichtig ist, um den anfänglichen Kontaktpunkt genau zu bestimmen und innerhalb des elastischen Verformungsbereichs zu bleiben.

Bei der Cantilever-basierten AFM-Nanoindentation wird die Verschiebung einer AFM-Sonde in Richtung der Probenoberfläche durch ein kalibriertes piezoelektrisches Element (Abbildung 1B) betätigt, wobei sich der flexible Cantilever aufgrund der Widerstandskraft, die beim Kontakt mit der Probenoberfläche auftritt, schließlich biegt. Diese Biegung oder Auslenkung des Auslegers wird in der Regel überwacht, indem ein Laser von der Rückseite des Auslegers in einen Photodetektor (positionsempfindlicher Detektor [PSD]) reflektiert wird. Gepaart mit der Kenntnis der Cantilever-Steifigkeit (in nN/nm) und der Durchbiegungsempfindlichkeit (in nm/V) ist es möglich, diese gemessene Cantilever-Auslenkung (in V) in die auf die Probe ausgeübte Kraft (in nN) umzurechnen. Nach dem Kontakt ergibt die Differenz zwischen der Z-Piezobewegung und der Cantilever-Auslenkung die Eindringtiefe der Probe. In Kombination mit der Kenntnis der Spitzenflächenfunktion ermöglicht dies die Berechnung der Spitzen-Probe-Kontaktfläche. Die Steigung der in Kontakt befindlichen Teile der resultierenden Kraft-Weg- oder Kraft-Weg-Kurven (F-D) kann dann mit einem geeigneten Kontaktmechanikmodell (siehe Abschnitt " Datenanalyse" der Diskussion) angepasst werden, um die nanomechanischen Eigenschaften der Probe zu bestimmen. Während die freitragende Nanoindentation auf AFM-Basis einige deutliche Vorteile gegenüber der oben beschriebenen instrumentierten Nanoindentation aufweist, bringt sie auch einige praktische Herausforderungen bei der Implementierung mit sich, wie z. B. Kalibrierung, Spitzenverschleiß und Datenanalyse, die hier diskutiert werden. Ein weiterer potenzieller Nachteil der freitragenden Nanoindentation auf AFM-Basis ist die Annahme einer linearen Elastizität, da der Kontaktradius und die Eindringtiefe viel kleiner sein müssen als der Eindringkörperradius, was bei der Arbeit mit nanoskaligen AFM-Sonden und/oder Proben mit signifikanter Oberflächenrauheit schwierig zu erreichen sein kann.

Traditionell wurde die Nanoindentation auf einzelne Stellen oder kleine Gittereindruckexperimente beschränkt, bei denen eine gewünschte Position (d. h. Region of Interest [ROI]) ausgewählt wird und ein einzelner kontrollierter Eindruck, mehrere Eindrücke an einer einzigen Stelle, die durch eine gewisse Wartezeit getrennt sind, und/oder ein grobes Raster von Einrückungen mit einer Rate in der Größenordnung von Hz durchgeführt werden. Jüngste Fortschritte im AFM ermöglichen jedoch die gleichzeitige Erfassung mechanischer Eigenschaften und Topografie durch die Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Kraftkurven-basierten Bildgebungsmodi (je nach Systemhersteller unter verschiedenen Handelsnamen bezeichnet), bei denen Kraftkurven mit einer kHz-Rate unter Lastkontrolle durchgeführt werden, wobei die maximale Kraft zwischen Spitze und Probe als Bildgebungssollwert verwendet wird. Es wurden auch Point-and-Shoot-Methoden entwickelt, die die Aufnahme eines AFM-Topographiebildes mit anschließender selektiver Nanoindentation an interessanten Punkten innerhalb des Bildes ermöglichen, was eine nanoskalige räumliche Kontrolle über die Position der Nanoindentation ermöglicht. Obwohl dies nicht der Hauptfokus dieser Arbeit ist, werden in den repräsentativen Ergebnissen spezifische ausgewählte Anwendungsbeispiele sowohl der kraftkurvenbasierten Bildgebung als auch der Point-and-Shoot-Cantilever-basierten Nanoindentation vorgestellt, die in Verbindung mit dem unten beschriebenen Protokoll verwendet werden können, sofern dies auf der jeweils verwendeten AFM-Plattform verfügbar ist. Konkret skizziert diese Arbeit ein verallgemeinertes Protokoll für die praktische Implementierung der AFM-Cantilever-basierten Nanoindentation auf jedem leistungsfähigen AFM-System und bietet vier Anwendungsfallbeispiele (zwei in Luft, zwei in Flüssigkeit) der Technik, einschließlich repräsentativer Ergebnisse und einer eingehenden Diskussion der Nuancen, Herausforderungen und wichtigen Überlegungen für den erfolgreichen Einsatz der Technik.

Protocol

HINWEIS: Aufgrund der großen Vielfalt an kommerziell erhältlichen AFMs und der Vielfalt der Probentypen und Anwendungen, die es für die Cantilever-basierte Nanoindentation gibt, ist das folgende Protokoll absichtlich relativ allgemein gehalten und konzentriert sich auf die gemeinsamen Schritte, die für alle Cantilever-basierten Nanoindentationsexperimente unabhängig von Gerät oder Hersteller erforderlich sind. Aus diesem Grund gehen die Autoren davon aus, dass der Leser zumindest über eine grundlegende Vertrautheit mit der Bedienung des spezifischen Instruments verfügt, das für die Durchführung der Cantilever-basierten Nanoindentation ausgewählt wurde. Zusätzlich zu dem unten beschriebenen allgemeinen Protokoll ist jedoch eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Standardarbeitsanweisung (SOP) speziell für das AFM und die hier verwendete Software (siehe Materialtabelle), die sich auf die Cantilever-basierte Nanoindentation von Proben in Flüssigkeit konzentriert, als ergänzendes Material enthalten.

1. Probenvorbereitung und Geräteeinrichtung

1. Bereiten Sie die Probe so vor, dass sowohl die Oberflächenrauheit (idealerweise im Nanometerbereich, ~10x weniger als die beabsichtigte Eindringtiefe) und die Verunreinigung minimiert werden, ohne die mechanischen Eigenschaften der interessierenden Bereiche zu verändern.
2. Wählen Sie eine geeignete AFM-Sonde für die Nanoindentation der gewünschten Probe basierend auf dem Medium (d. h. Luft oder Flüssigkeit), dem erwarteten Modul, der Probentopographie und den relevanten Strukturgrößen aus (siehe Überlegungen zur Sondenauswahl in der Diskussion). Setzen Sie die Sonde auf die Sondenhalterung (siehe Materialtabelle) und befestigen Sie die Sondenhalterung am AFM-Scankopf.
3. Wählen Sie in der AFM-Software einen geeigneten Nanoindentationsmodus aus, der dem Benutzer die Kontrolle über einzelne Rampen (d. h. Kraft-Weg-Kurven) ermöglicht.
   HINWEIS: Der spezifische Modus unterscheidet sich je nach AFM-Hersteller und einzelnen Instrumenten (siehe SOP im Zusatzmaterial für weitere Details und ein spezifisches Beispiel).
4. Richten Sie den Laser auf der Rückseite des Sondenauslegers gegenüber der Position der Sondenspitze und in der PSD aus.
   HINWEIS: Im Anwendungsbeispiel für mesenchymale Stammzellen finden Sie weitere Informationen zu wichtigen Überlegungen bei der Ausrichtung des Lasers und der Durchführung von Nanoindentationen in Flüssigkeiten, insbesondere zur Vermeidung von schwebenden Ablagerungen und/oder Luftblasen, die den Strahl streuen oder brechen können. Möglicherweise muss auch die AFM-Optik angepasst werden, um den Brechungsindex der Flüssigkeit zu kompensieren und einen Zusammenstoß der Sonde beim Einrasten in die Oberfläche zu vermeiden.
   1. Zentrieren Sie den Laserstrahlpunkt auf der Rückseite des Cantilevers, indem Sie die Summenspannung maximieren (Abbildung 2A).
   2. Zentrieren Sie den reflektierten Laserstrahlpunkt auf dem PSD, indem Sie die X- und Y-Ablenksignale (d. h. horizontal und vertikal) so einstellen, dass sie so nahe wie möglich an Null liegen (Abbildung 2A), wodurch der maximal erkennbare Ablenkbereich für die Erzeugung einer Ausgangsspannung bereitgestellt wird, die proportional zur Auslenkung des Cantilevers ist.
5. Wenn Sie sich hinsichtlich der Topographie, der Oberflächenrauheit und/oder der Oberflächendichte (im Falle von Flocken oder Partikeln) der Probe nicht sicher sind, führen Sie vor allen Nanoindentationsexperimenten einen AFM-Topographie-Scan durch, um die Eignung der Probe zu bestätigen, wie in Schritt 1.1 und im Probenvorbereitungsteil der Diskussion beschrieben.

Abbildung 2: Positionsempfindlicher Detektormonitor . (A) PSD-Anzeige, die anzeigt, dass ein korrekt ausgerichteter Laser von der Rückseite des Sonden-Cantilevers auf die Mitte des PSD reflektiert wird (wie durch die große Summenspannung und das Fehlen einer vertikalen oder horizontalen Auslenkung belegt), bevor er auf die Probenoberfläche einrastet (d. h. die Sonde hat keinen Kontakt mit der Probe). (B) Die vertikale Ablenkspannung steigt, wenn der Cantilever ausgelenkt wird (z. B. wenn die Sonde mit der Probe in Kontakt kommt). Abkürzungen: PSD = positionsempfindlicher Detektor; VERT = vertikal; HORIZ = horizontal; AMPL = Amplitude; n/a = nicht zutreffend. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Sonden-Kalibrierung

HINWEIS: Drei Werte sind erforderlich, um die mechanischen Eigenschaften einer Probe anhand der F-D-Kurvendaten zu quantifizieren, die während der Cantilever-basierten Nanoindentation erfasst werden: die Durchbiegungsempfindlichkeit (DS) des Cantilever/PSD-Systems (nm/V oder V/nm), die Cantilever-Federkonstante (nN/nm) und die Sondenkontaktfläche, die häufig als effektiver Sondenspitzenradius (nm) bei einer bestimmten Eindringtiefe ausgedrückt wird, die kleiner ist als der Sondenradius im Falle einer sphärischen Sonde Trinkgeld.

1. Kalibrieren Sie den DS des Sonden-/AFM-Systems durch Rampen auf einem extrem harten Material (z. B. Saphir, E = 345 GPa), so dass die Verformung der Probe minimiert wird und somit die gemessene Z-Bewegung des Piezos nach der Initiierung des Spitzen-Proben-Kontakts ausschließlich in eine Cantilever-Auslenkung umgewandelt wird.
   HINWEIS: Die DS-Kalibrierung muss unter den gleichen Bedingungen wie die geplanten Nanoindentationsexperimente (d. h. Temperatur, Medium usw.) durchgeführt werden, um den DS des Systems während der Experimente genau widerzuspiegeln. Eine lange Aufwärmphase (30 Minuten) des Lasers kann erforderlich sein, um eine maximale Genauigkeit zu erreichen, damit das thermische Gleichgewicht erreicht und eine stabile Laserausgangsleistung und Ausrichtungsstabilität hergestellt werden kann. Der DS muss jedes Mal neu gemessen werden, wenn der Laser neu ausgerichtet wird, auch wenn dieselbe Sonde verwendet wird, da die DS von der Laserintensität und -position auf dem Cantilever sowie von der Qualität der Reflexion von der Sonde (d. h. eine Verschlechterung der Rückseitenbeschichtung der Sonde wirkt sich auf die DS aus) und der Empfindlichkeit des PSD²⁰ abhängt.
   1. Richten Sie die DS-Kalibriereindrücke auf dem Saphir ein und führen Sie sie durch, um ungefähr die gleiche Sondenauslenkung (in V oder nm) wie die geplanten Probeneindrücke zu erreichen, da die gemessene Verschiebung eine Funktion des Ablenkungswinkels der Spitze ist und bei großen Auslenkungen nichtlinear wird.
   2. Bestimmen Sie die DS (in nm/V) oder alternativ die Empfindlichkeit des inversen optischen Hebels (in V/nm) aus der Steigung des linearen Teils des Kontaktbereichs nach dem ersten Kontaktpunkt in der resultierenden F-D-Kurve, wie in Abbildung 3A dargestellt.
   3. Wiederholen Sie die Rampe mindestens 5x und zeichnen Sie jeden DS-Wert auf. Verwenden Sie den Mittelwert der Werte, um eine maximale Genauigkeit zu erzielen. Wenn die relative Standardabweichung (RSD) der Messungen ~1 % überschreitet, messen Sie den DS erneut, da die ersten F-D-Kurven aufgrund der anfänglichen Einführung von Adhäsionskräften manchmal nicht ideal sind.
   4. Wenn die Federkonstante k des Sondencantilevers nicht werkseitig kalibriert ist (z. B. durch Laser-Doppler-Vibrometrie [LDV]), kalibrieren Sie die Federkonstante.
      ANMERKUNG: Die thermische Tune-Methode ist optimal für relativ weiche Ausleger mit k < 10 N/m (siehe den Abschnitt Federkonstante der Diskussion für eine Liste und Beschreibung alternativer Methoden, insbesondere für steife Ausleger mit k > 10 N/m). Wie in Abbildung 3B, C dargestellt, ist die thermische Abstimmung in der Regel in die AFM-Steuerungssoftware integriert.
2. Wenn die Sonde nicht mit einer werkseitig kalibrierten Spitzenradiusmessung ausgestattet ist (z. B. durch Rasterelektronenmikroskop [REM]), messen Sie den effektiven Spitzenradius, R.
   HINWEIS: Es gibt zwei gängige Methoden zur Messung des Spitzenradius (siehe entsprechenden Diskussionsabschnitt), aber die gebräuchlichste für Sondenspitzen im Nanometerbereich ist die BTR-Methode (Blind Tip Reconstruction), bei der ein Rauheitsstandard (siehe Materialtabelle) verwendet wird, der zahlreiche extrem scharfe (Sub-nm) Merkmale enthält, die dazu dienen, die Spitze effektiv abzubilden, anstatt dass die Spitze die Probe abbildet.
   1. Wenn Sie die BTR-Methode verwenden, bilden Sie die Rauheitsprobe (Spitzencharakterisierung) mit einer langsamen Abtastrate (<0,5 Hz) und hohen Rückkopplungsverstärkungen ab, um die Verfolgung der sehr scharfen Merkmale zu optimieren. Wählen Sie eine Bildgröße und Pixeldichte (Auflösung) basierend auf dem erwarteten Spitzenradius (z. B. hat ein 1024 x 1024 Pixel großes Bild eines Bereichs von 3 μm x 3 μm eine laterale Auflösung von ~3 nm).
   2. Verwenden Sie die AFM-Bildanalysesoftware (siehe Materialtabelle), um die Sondenspitze zu modellieren und ihren Endradius und effektiven Spitzendurchmesser bei der erwarteten Probeneindrucktiefe abzuschätzen, wie in Abbildung 3D-F dargestellt.
3. Geben Sie nach Abschluss der Sondenkalibrierung die DS-, k- und R-Werte in die Gerätesoftware ein, wie in Abbildung 4A dargestellt.
   1. Geben Sie eine Schätzung des Poisson-Verhältnisses der Probe, ν, ein, um die Umrechnung des gemessenen reduzierten Moduls in den tatsächlichen Probenmodul⁹ zu ermöglichen. Bei Verwendung eines konischen oder konisphärischen Kontaktmechanikmodells, das auf der Spitzenform und der Eindrucktiefe basiert, ist es auch erforderlich, den Spitzenhalbwinkel einzugeben (Bild 4C).
      ANMERKUNG: Der Modul ist relativ unempfindlich gegenüber kleinen Fehlern oder Unsicherheiten im geschätzten Poisson-Verhältnis. Eine Schätzung von ν = 0,2-0,3 ist ein guter Ausgangspunkt für viele Materialien²¹.

Abbildung 3: Kalibrierung der Sonde. (A) Bestimmung der Ablenkungsempfindlichkeit. Ergebnis einer repräsentativen Messung der Durchbiegungsempfindlichkeit, die an einem Saphirsubstrat (E = 345 GPa) für eine Standard-Abgriffssonde (nominal k = 42 N/m; siehe Materialtabelle) mit einer reflektierenden Aluminiumrückseitenbeschichtung durchgeführt wurde. Dargestellt sind die gemessenen Anfahr- (blaue Kurve) und Ein- bzw. Ausfahrkurven (rote Kurve). Die gemessene Ablenkungsempfindlichkeit von 59,16 nm/V wurde bestimmt, indem die Annäherungskurve zwischen den Kontakt- und Wendepunkten eingepasst wurde, was durch den Bereich zwischen den vertikalen gestrichelten roten Linien angezeigt wird. Der Bereich der negativ gehenden Durchbiegung, der in der Rückzugs-/Rückzugskurve vor dem Abziehen der Oberfläche erkennbar ist, weist auf eine Haftung zwischen Spitze und Probe hin. (B,C) Thermische Abstimmung. Repräsentative freitragende thermische Rauschspektren (blaue Leiterbahnen) mit entsprechenden Passungen (rote Spuren) für zwei verschiedene Sonden. (B) Thermische Abstimmungs- und Anpassungsparameter für eine auf Standardkraftkurve basierende AFM-Bildgebungssonde (siehe Materialtabelle) mit ihrer nominalen Federkonstante k = 0,4 N/m, die als erste Schätzung verwendet wird. Die Anpassung des freitragenden thermischen Rauschspektrums ergibt eine Grundresonanzfrequenz von f 0 = 79,8 kHz, die in einigermaßen guter Übereinstimmung mit dem Nennwert von f₀ = 70 kHz steht. Der gemessene Q-Faktor beträgt 58,1. Die Anpassungsgüte (R² = 0,99) basiert auf der Übereinstimmung der Anpassung mit den Daten zwischen den beiden vertikalen gestrichelten roten Linien. Beachten Sie, dass es wichtig ist, sowohl die Umgebungstemperatur als auch die Durchbiegungsempfindlichkeit zu kennen und einzugeben, um genaue Ergebnisse zu erzielen. (C) Cantilever-Thermal-Rauschspektrum und entsprechende Anpassung (d. h. thermische Abstimmung) mit resultierender berechneter Federkonstante k = 0,105 N/m für einen extrem weichen Cantilever, der zur Durchführung nanomechanischer Messungen an lebenden Zellen und isolierten Zellkernen verwendet wird. Man beachte die deutlich niedrigere Eigenresonanzfrequenz von ~2-3 kHz. (D-F) Rekonstruktion der Blindspitze. Repräsentativer Arbeitsablauf zur Rekonstruktion von Blindspitzen für eine Diamantspitzensonde (nominal R = 40 nm; siehe Materialtabelle). (D) Ein 5 μm x 5 μm großes Bild einer Spitzencharakterisierungsprobe, bestehend aus einer Reihe von extrem scharfen (Sub-nm) Titan-Spikes, die zur Abbildung der AFM-Sondenspitze dienen. (E) Resultierendes rekonstruiertes Modell (invertiertes Höhenbild) der Sondenspitze. (F) Ergebnisse der Rekonstruktion der Blindspitze, einschließlich eines geschätzten Endradius von R = 29 nm und eines effektiven Spitzendurchmessers von 40 nm bei einer vom Benutzer gewählten Höhe von 8 nm (d. h. Eindringtiefe << R) von der Spitzenspitze, berechnet durch Umrechnung der Kontaktfläche zwischen Spitze und Probe in dieser Höhe in einen effektiven Durchmesser unter Annahme eines kreisförmigen Profils (d. h. A = πr 2 = π(d/2)²) zur Verwendung mit Modellen der Kugelkontaktmechanik. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; ETD = effektiver Spitzendurchmesser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Eingänge der Softwareschnittstelle. (A) Kalibrierungskonstanten der Sonde. Software-Benutzeroberfläche (siehe Materialtabelle) zur Eingabe der gemessenen Durchbiegungsempfindlichkeit, der Federkonstante und des Spitzenradius, um quantitative nanomechanische Messungen zu ermöglichen. Das Poisson-Verhältnis von Sonde und Probe ist notwendig, um die Elastizität oder den Elastizitätsmodul der Probe aus den Cantilever-basierten Nanoindentationskraftkurven zu berechnen. (B) Fenster zur Steuerung der Rampe. Software-Benutzeroberfläche (siehe Materialtabelle) zum Einrichten von Cantilever-basierten Nanoindentationsexperimenten, unterteilt in die Parameter, die die Rampe selbst beschreiben (d. h. das Eindringprofil), die Geräteauslösung (z. B. Kraft-Weg-Steuerung), die anschließende Kraftanalyse und die Bewegungsgrenzen (zur Verbesserung der Messempfindlichkeit durch Verengung des Bereichs, über den der A/D-Wandler bei der Steuerung des Z-Piezos und dem Ablesen der PSD-Auslenkung arbeiten muss). (C) Der Halbwinkel der Spitze (basierend auf der Sondengeometrie oder der direkten Messung) ist wichtig, wenn ein konisches, pyramidales oder konisphärisches Modell der Kontaktmechanik (z. B. Sneddon) verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Erfassen von Kraft-Weg-Daten (F-D)

HINWEIS: Die hier dargestellten Parameterwerte (siehe Abbildung 4B) können je nach Kraft und Eindringbereich für eine bestimmte Probe variieren.

1. Navigieren Sie durch die Probe unter dem AFM-Kopf und greifen Sie auf den gewünschten Bereich von Interesse ein.
   1. Überwachen Sie das vertikale Ablenksignal (Abbildung 2B) oder führen Sie eine kleine (~50-200 nm) Anfangsrampe (Abbildung 4B) durch, um zu überprüfen, ob die Spitze und die Probe in Kontakt sind (siehe Abbildung 5A).
   2. Passen Sie die Position des AFM-Kopfes leicht nach oben an (in Schritten, die ~50% der vollen Rampengröße entsprechen) und fahren Sie erneut. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Spitze und die Probe keinen Kontakt mehr haben, was durch eine nahezu flache Rampe (Abbildung 5B) und eine minimale vertikale Auslenkung des Cantilevers (Abbildung 2A) belegt wird.
   3. Sobald keine offensichtliche Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe vorhanden ist (vgl. Abbildung 2A und Abbildung 2B), senken Sie den AFM-Kopf um einen Betrag ab, der ~50 % bis 100 % der Rampengröße entspricht, um sicherzustellen, dass die Sondenspitze beim manuellen Bewegen des AFM-Kopfes nicht gegen die Probe stößt. Wiederholen Sie den Vorgang erneut, bis entweder eine gute Kurve (Abbildung 5D) oder eine Kurve ähnlich wie in Abbildung 5C beobachtet wird. Führen Sie im letzteren Fall eine zusätzliche kleine AFM-Kopfabsenkungseinstellung durch, die ~20%-50% der Rampengröße entspricht, um einen guten Kontakt und eine Kraftkurve ähnlich der in Abbildung 5D gezeigten zu erreichen.
2. Passen Sie die Rampenparameter an (wie unten beschrieben und in Abbildung 4B), um für das Instrument, die Sonde und die Probe zu optimieren und Rampen zu erhalten, die den in Abbildung 5D.
   1. Wählen Sie eine geeignete Rampengröße (d. h. die gesamte Z-Piezo-Bewegung während eines Rampenzyklus) in Abhängigkeit von der Probe (z. B. Dicke, erwarteter Modul, Oberflächenrauheit) und der gewünschten Eindringtiefe.
      HINWEIS: Bei steiferen Proben ist es wahrscheinlich, dass eine geringere Probenverformung (und damit eine größere Sondenauslenkung bei einer bestimmten Z-Piezo-Bewegung) auftritt, sodass die Rampengröße im Allgemeinen kleiner sein kann als bei weicheren Proben. Typische Rampengrößen für steife Proben und Cantilever können Dutzende von nm betragen, während Rampen für weiche Proben und Cantilever Hunderte von nm bis zu einigen μm groß sein können. Ausgewählte Anwendungsbeispiele werden in der Rubrik Repräsentative Ergebnisse vorgestellt. Beachten Sie, dass die minimal und maximal möglichen Rampengrößen instrumentenabhängig sind.
   2. Wählen Sie eine geeignete Rampenrate (1 Hz ist ein guter Ausgangspunkt für die meisten Samples).
      HINWEIS: Die Rampenrate kann durch elektronische Geschwindigkeiten/Bandbreiten der Steuerung und/oder Erkennung begrenzt werden. In Kombination mit der Rampengröße bestimmt die Rampenrate die Spitzengeschwindigkeit. Die Spitzengeschwindigkeit ist besonders wichtig beim Eindrücken weicher Materialien, bei denen viskoelastische Effekte Hystereseartefakte verursachen können ^9,22.
   3. Wählen Sie, ob eine ausgelöste (lastgesteuerte) oder nicht ausgelöste (verlagerungsgesteuerte) Rampe verwendet werden soll.
      HINWEIS: Bei einer getriggerten Rampe nähert sich das System der Probe in benutzerdefinierten Schritten (basierend auf der Rampengröße und -auflösung oder der Anzahl der Datenpunkte), bis die gewünschte Auslöseschwelle (d. h. die Sollwertkraft oder die Cantilever-Auslenkung) erkannt wird, woraufhin sich das System in seine ursprüngliche Position zurückzieht und die F-D-Kurve anzeigt. Bei einer ungetriggerten Rampe verlängert das System den Z-Piezo einfach um den durch die benutzerdefinierte Rampengröße vorgegebenen Abstand und zeigt die gemessene F-D-Kurve an. Getriggerte Rampen werden für die meisten Anwendungsfälle bevorzugt, aber nicht getriggerte Rampen können nützlich sein, wenn weiche Materialien untersucht werden, die keinen scharfen, leicht identifizierbaren Kontaktpunkt aufweisen.
      1. Wenn eine getriggerte Rampe gewählt wird, legen Sie den Trigger-Schwellenwert (benutzerdefinierte maximal zulässige Kraft oder Auslenkung der Rampe) so fest, dass die gewünschte Einkerbung in der Probe erzielt wird.
         HINWEIS: Die Verwendung einer Auslöseschwelle bedeutet, dass eine Rampe beendet werden kann (d. h. die Sonde kann beginnen, sich zurückzuziehen), bevor die angegebene volle Rampengröße (Z-Piezo-Verlängerung) erreicht ist. Die Werte können je nach Tip-Sample-System zwischen einigen nN und einigen μN liegen.
      2. Legen Sie die Rampenposition fest, um den Teil des maximalen Bereichs des Z-Piezos zu bestimmen, der zum Ausführen der Rampe verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass der Gesamtbereich der Rampengröße nicht außerhalb des maximalen Z-Piezobereichs beginnt oder endet (siehe repräsentative Beispiele in Abbildung 6), da sonst ein Teil der F-D-Kurve keine physikalische Messung darstellt (d. h. der Z-Piezo wird vollständig ausgefahren oder eingefahren und bewegt sich nicht).
   4. Stellen Sie die Anzahl der Samples/Rampe ein (z. B. 512 Samples/ Rampe), um die gewünschte Auflösung der Messung zu erreichen (d. h. Punktdichte der F-D-Kurve).
      HINWEIS: Die maximale Anzahl von Samples/Rampen kann durch Software- (Dateigröße) oder Hardwarebeschränkungen (z. B. Wandlungsgeschwindigkeit von analog zu digital [A/D], abhängig von der Rampenrate) begrenzt sein. Es ist auch möglich, den zulässigen Z-Piezo- oder Ablenkungsbereich zu begrenzen (siehe Grenzwertparameter in Abbildung 4B), um die effektive Auflösung des A/D-Wandlers des Systems zu erhöhen.
   5. Stellen Sie die X-Drehung ein, um die Scherkräfte auf die Probe und die Spitze zu reduzieren, indem Sie die Sonde gleichzeitig leicht in X-Richtung (parallel zum Cantilever) bewegen, während sie in Z-Richtung (senkrecht zum Cantilever) eingedrückt wird. Verwenden Sie einen Wert für die X-Drehung, der dem Versatzwinkel des Sondenhalters relativ zur Oberflächennormalen entspricht (12° ist typisch).
      Anmerkungen: Die X-Drehung ist erforderlich, da der Cantilever in einem kleinen Winkel zur Oberfläche in der Sondenhalterung montiert ist, damit der einfallende Laserstrahl in die PSD reflektiert werden kann. Darüber hinaus können der vordere und hintere Winkel der Sondenspitze voneinander abweichen (d. h. die Sondenspitze kann asymmetrisch sein). Genauere Informationen erhalten Sie bei den einzelnen Sonden- und AFM-Herstellern.

Abbildung 5: Optimierung der Trennung zwischen Spitze und Probe nach dem Einrasten, um gute Kraftkurven zu erhalten. Aufeinanderfolgende Beispiele repräsentativer Kraft-Weg-Kurven, die beim Eindrücken in Flüssigkeit (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) auf einem lebenden mesenchymalen Stammzellkern mit einem kalibrierten weichen Siliziumnitrid-Cantilever (nominal k = 0,04 N/m) erhalten wurden, der in einer halbkugelförmigen Spitze mit einem Radius von 5 μm endet (siehe Materialtabelle). Die Kurven wurden während des Eingriffs in die Zelloberfläche und der Optimierung der Injektionsparameter erhalten, wobei der Sondenansatz blau und das Ein- und Ausfahren rot dargestellt wurde. (A) Die Spitze ist bereits vor Beginn der Rampe eingerastet und in Kontakt mit der Probe, was zu einer großen Auslenkung und Kräften des Auslegers führt, ohne dass eine flache Grundlinie vor dem Kontakt vorhanden ist. (B) Nachdem die Spitze manuell ausreichend weit von der Probe entfernt wurde, führt eine nicht ausgelöste 2-μm-Rampe zu einer F-D-Kurve, die nahezu flach ist (d. h. praktisch keine Kraftänderung). Unter Umgebungsbedingungen wäre die Kurve flacher, aber in Flüssigkeiten kann die Viskosität des Mediums während einer Rampe, wie hier zu sehen, zu leichten Auslenkungen des Sondenauslegers führen, auch ohne Oberflächenkontakt. (C) Nach der Annäherung an die Oberfläche vor Beginn der Rampe zeigen die An- und Rückzugskurven eine leichte Kraftzunahme (erhöhte Steigung) in der Nähe des Wendepunkts der Rampe (d. h. Übergang vom Anflug zum Rückzug). Das verräterische Zeichen, auf das man achten sollte, ist, dass sich die Annäherungs- (blau) und Rückzugskurven (rot) zu überlappen beginnen (Bereich durch den schwarzen Kreis gekennzeichnet), was auf eine physikalische Wechselwirkung mit der Oberfläche hinweist. (D) Eine ideale F-D-Kurve, die nach Optimierung der Rampenparameter aufgenommen wurde und sich der Zelloberfläche etwas näher (~1 μm) als in C nähert, so dass die Sonde etwa die Hälfte der Rampe in Kontakt mit der Zelle verbringt, was eine ausreichende Verformung ermöglicht, um den Kontaktteil der Annäherungskurve anzupassen und den Elastizitätsmodul zu bestimmen. Die relativ lange, flache, rauscharme Basislinie erleichtert dem Anpassungsalgorithmus die Bestimmung des Kontaktpunkts. Abkürzung: F-D = Kraft-Weg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Größe und Position der Rampe. Z-Piezo-Monitor, der die Ausdehnung der Rampe (blauer Balken) im Verhältnis zum gesamten verfügbaren Z-Piezo-Bewegungsbereich (grüner Balken) anzeigt. (A) Die Z-Piezo-Position liegt nahe der Mitte seines Bewegungsbereichs, was sowohl dadurch angezeigt wird, dass sich der blaue Balken ungefähr in der Mitte des grünen Balkens befindet, als auch dadurch, dass die aktuelle Z-Piezo-Spannung (-78,0 V) ungefähr zwischen den vollständig eingefahrenen (-212,2 V) und ausgefahren (+102,2 V) Werten liegt. (B) Der Z-Piezo wird relativ zu A erweitert, ohne dass eine Vorspannung angelegt wird. (C) Z-Piezo ist relativ zu A und B eingezogen. (D) Die Z-Piezo-Position ist die gleiche wie in C bei -156,0 V, aber die Rampengröße wurde im Verhältnis zu A-C vergrößert, um den vollen Bewegungsbereich des Z-Piezos besser nutzen zu können. € Die Rampengröße ist zu groß für die aktuelle Rampenposition, was dazu führt, dass der Z-Piezo bis zum Ende seines Bereichs verlängert wird. Dies führt dazu, dass die F-D-Kurve abflacht, da das System den Z-Piezo nicht weiter ausdehnen kann. Abkürzung: F-D = Kraft-Weg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

4. Analyse der F-D-Kurve

1. Wählen Sie ein geeignetes Softwarepaket für die Datenanalyse. Wählen Sie die zu analysierenden Daten aus und laden Sie sie.
   HINWEIS: Viele AFM-Hersteller und AFM-Bildverarbeitungsprogramme verfügen über eine integrierte Unterstützung für die Analyse von F-D-Kurven. Alternativ können die erhöhte Flexibilität und die Funktionen eines speziellen F-D-Kurvenanalysepakets, wie z. B. das Open-Source-Softwarepaket AtomicJ, von Vorteil sein²³, insbesondere für die Stapelverarbeitung und statistische Analyse großer Datensätze oder die Implementierung komplexer kontaktmechanischer Modelle.
2. Geben Sie kalibrierte Werte für die Federkonstante, DS und den Radius der Sondenspitze ein, zusammen mit Schätzungen des Elastizitätsmoduls und des Poisson-Verhältnisses für die Sondenspitze (basierend auf ihrer Materialzusammensetzung) und des Poisson-Verhältnisses der Probe.
   HINWEIS: Bei Verwendung eines Diamantspitzen-Eindringkörpers können die Werte _E-Spitze = 1140 GPa und ν-Spitze = 0,07 verwendet werden^21,24,25,26. Für eine Standard-Siliziumsonde kann typischerweise eine _E-Spitze = 170 GPa und eine ν-Spitze = 0,27 verwendet werden, obwohl der Elastizitätsmodul des Siliziums in Abhängigkeit von der kristallographischen Ausrichtung²⁷ variiert.
3. Wählen Sie ein Modell mit Nanoindentationskontaktmechanik, das für die Spitze und die Probe geeignet ist.
   HINWEIS: Für die vielen gängigen Modelle mit kugelförmiger Spitze (z. B. Hertz, Maugis, DMT, JKR) ist es zwingend erforderlich, dass die Eindrucktiefe in die Probe kleiner als der Spitzenradius ist. Andernfalls weicht die sphärische Geometrie der Sondenspitze einer konischen oder pyramidenförmigen Form (Abbildung 4C). Bei konischen (z. B. Sneddon²⁸) und pyramidenförmigen Modellen ist der Halbwinkel der Spitze (d. h. der Winkel zwischen der Seitenwand der Spitze und einer halbierenden Linie senkrecht zum Spitzenende; Abbildung 4C) muss bekannt sein und ist in der Regel beim Sondenhersteller erhältlich. Weitere Informationen zu Kontaktmechanikmodellen finden Sie im Abschnitt Datenanalyse von thedDiscussion.
4. Führen Sie den Anpassungsalgorithmus aus. Überprüfen Sie, ob die F-D-Kurven richtig passen. Ein geringer Restfehler, der einem durchschnittlichen R2-Wert nahe Eins entspricht (z. B.^R2 > 0,9), weist in der Regel auf eine gute Anpassung an das gewählte Modell^{hin 29,30}. Überprüfen Sie stichprobenartig einzelne Kurven, um die Kurve, die Modellanpassung und die berechneten Kontaktpunkte bei Bedarf visuell zu überprüfen (siehe z. B. Abbildung 7 und den Abschnitt "Datenanalyse" der Diskussion).

Representative Results

Kraft-Weg-Kurven
Abbildung 7 zeigt repräsentative, nahezu ideale F-D-Kurven, die aus Nanoindentationsexperimenten gewonnen wurden, die in Luft an in Harz eingebetteten Loblolly-Kiefernproben (Abbildung 7A) und in Flüssigkeit (phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS]) an mesenchymalen Stammzellkernen (MSC) (Abbildung 7B) durchgeführt wurden. Die Verwendung eines beliebigen kontaktmechanischen Modells beruht auf der genauen und zuverlässigen Bestimmung des anfänglichen Kontaktpunkts zwischen Spitze und Probe. Die relativ flache, rauscharme Basislinie vor dem ersten Kontaktpunkt und die glatte Steigung des Kontaktteils der in Abbildung 7 gezeigten F-D-Kurven machen sie daher ideal für die Analyse zur Extraktion mechanischer Eigenschaften, wie die hervorragende Übereinstimmung zwischen den Annäherungskurven (blaue Kurven) und den entsprechenden Passungen (grüne Spuren) in den Einschüben zeigt.

Umgekehrt gibt es mehrere häufige Probleme, auf die ein Benutzer bei der Durchführung von Cantilever-basierten Nanoindentationen stoßen kann, die zu nicht idealen F-D-Kurven führen. Eines der häufigsten Probleme, insbesondere unmittelbar nach dem Einrasten, besteht darin, dass die Sondenspitze bereits vor der Initiierung einer Rampe mit der Probe in Kontakt kommt (Abbildung 5A), was die Erfassung der für die Bestimmung des ersten Kontaktpunkts erforderlichen Basislinie außerhalb des Kontakts verhindert. Dies kann auch bei nicht ausgelösten (d.h. kontrolliert verschiebbaren) Rampen zu zu großen Kräften führen. Dies ist besonders besorgniserregend, wenn eine große Rampe mit einem steifen Cantilever ausgeführt wird, da die daraus resultierenden Kräfte den Cantilever brechen und/oder die Probe oder Spitze beschädigen können. Um dies zu vermeiden, ist die vertikale Auslenkungsspannung während und nach dem ersten Einrasten zu überwachen. Wenn die gemessene vertikale Ablenkspannung positiv ist (unter der Annahme einer korrekten anfänglichen Ausrichtung), wie in Abbildung 2B gezeigt, wird der Cantilever abgelenkt und die Spitze hat Kontakt mit der Probe. Größere positive Spannungen entsprechen größeren Cantilever-Auslenkungen, aber unabhängig von der Größe der Auslenkung sollte der Benutzer den AFM-Kopf manuell (z. B. durch den Einsatz eines Schrittmotors) von der Probe wegheben. Die vertikale Ablenkspannung sollte langsam abnehmen und kann bei starken Haftkräften zwischen Spitze und Probe sogar vorübergehend unter Null fallen, erreicht aber schließlich 0 V (oder nahe 0 V), sobald die Spitze nicht mehr mit der Probe in Kontakt ist (Abbildung 2A). Von diesem Punkt aus kann der Benutzer mit der Optimierung der Rampenparameter und dem Ausführen von Einrückungen fortfahren.

Ein weiteres häufiges Problem (insbesondere bei nicht getriggerten Rampen) besteht darin, dass die gesamte F-D-Kurve nahezu flach erscheint, ohne offensichtliche Anzeichen einer Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe, wie zuvor in Abbildung 5B gezeigt. Falls auf dem Gerät verfügbar, besteht die Lösung für dieses Problem darin, den SPM-Kopf manuell um ~10 % weniger als die Rampengröße abzusenken (um einen Absturz der Sondenspitze zu vermeiden) und erneut zu rampieren, bis ein deutlicher Kraftanstieg aufgrund der Interaktion zwischen Spitze und Probe beobachtet wird (Abbildung 5C, D), bevor mit der Optimierung anderer Rampenparameter fortgefahren wird.

Verschleiß der Spitzen
Abbildung 8 zeigt ein Beispiel für den Spitzenverschleiß in einer experimentellen Umgebung. Eine einzelne, steife AFM-Sonde im Silizium-Abgriffsmodus (siehe Materialtabelle) wurde verwendet, um mehrere große Bereiche einer Bakken-Schieferprobe (siehe entsprechendes Anwendungsbeispiel für weitere Details) mit einer auf schnellen (kHz-Rate) Kraftkurve basierenden Bildgebungsmethode abzubilden, und die BTR-Methode wurde verwendet, um die Spitzengeometrie zu modellieren und den Radius des Spitzenendes vor und nach jedem der drei aufeinanderfolgenden Bilder abzuschätzen. Die untersuchten Schieferproben bestanden aus einer Matrix aus Ton und organischem Material (E ~5 GPa) mit viel härteren anorganischen Mineraleinschlüssen, die überall verstreut waren (E > 30 GPa). Da die Probe signifikante Variationen in der Oberflächentopographie (±2 μm) über die großen abgebildeten Scanbereiche (85 μm x 85 μm) aufwies, wurde die Scanrate auf das für das verwendete Gerät zulässige Minimum von 0,1 Hz eingestellt. Bei einer Kraftkurve-Erfassungsrate von 2 kHz und einer Scanrate von 0,1 Hz ergaben sich im Verlauf eines einzelnen Bildes mit 1024 x 1024 Pixeln über 20 Millionen Tip-Sample-Wechselwirkungen. Infolgedessen erfuhr die Sondenspitze im Vergleich zu ihrem makellosen Zustand im Laufe der Bildgebung der Probe einen erheblichen Verschleiß (Abbildung 8A), der sich von einem effektiven Endradius von ~11 nm, wie er empfangen wurde, auf ~129 nm am Ende der drei Bilder erhöhte (Abbildung 8D). Während des ersten Bildes scheint die Spitze gebrochen gewesen zu sein, was zu der großen morphologischen Veränderung führt, die in Abbildung 8B zu sehen ist. In jedem weiteren Bild wird die Spitze zunehmend runder, ein hervorragendes Beispiel für das häufigere Phänomen des allmählichen Verschleißes (siehe Diskussion). Die geschätzten Spitzenradien aus den BTR-Modellen sind in Abbildung 8 enthalten.

Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 8E,F BTR-Modelle einer Diamantspitzensonde (siehe Materialtabelle), die im Abstand von 6 Monaten aufgenommen wurden, wobei dazwischen Tausende von Nanoindenten und Hunderte von Millionen von auf Kraftkurven-Bildgebung basierenden Wechselwirkungen zwischen Spitze und Probe auftreten. Wie aus den geschätzten Spitzenradien von 29 nm (Abbildung 8E) und 28 nm (Abbildung 8F) ersichtlich ist, änderte sich der Radius der Sondenspitze nicht innerhalb der Grenzen der BTR-Methode, was die extreme Verschleißfestigkeit von Diamant unterstreicht. Es sollte jedoch beachtet werden, dass Diamantspitzensonden (wie alle AFM-Sonden) anfällig für Verunreinigungen durch lose anhaftende Ablagerungen sind, die die Funktion des Spitzenbereichs und die effektive Härte beeinträchtigen können. Dementsprechend bleibt die Reinheit der Proben für die Konservierung der Spitzen und genaue nanomechanische Messungen von entscheidender Bedeutung.

Anwendungsbeispiele
Durch die umsichtige Wahl der Sondenmaterialzusammensetzung, der Cantilever-Federkonstante sowie der Spitzengeometrie und des Radius kann die Cantilever-basierte Nanoindentation verwendet werden, um die nanoskaligen mechanischen Eigenschaften von Materialien mit elastischen Moduln im Bereich von kPa bis GPa sowohl in Flüssigkeiten als auch unter Umgebungsbedingungen zu quantifizieren. Im Folgenden werden ausgewählte Anwendungsbeispiele vorgestellt, um einige der vielfältigen Anwendungsfälle für die Cantilever-basierte Nanoindentation zu verdeutlichen.

Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von Loblolly-Kiefer für Biokraftstoffanwendungen
Loblolly-Kiefern (Pinus taeda) sind eine schnell wachsende Nadelholzart, die im Süden der Vereinigten Staaten mit einer Fläche von über 13 Millionen Hektar sehr häufig vorkommt³¹. Aufgrund ihrer Fülle sind Loblolly-Kiefern eine wichtige Nutzpflanze im Süden der USA, die häufig sowohl für Schnittholz als auch für Zellstoffholz verwendet wird. Darüber hinaus sind sie eine wichtige Ressource für die Herstellung von Zellulose-Biokraftstoffen der zweiten Generation³². Wichtig ist, dass die Nachfrage nach zellulosehaltigen Biokraftstoffen aufgrund des Energy Independence and Security Act (EISA) von 2007 gestiegen ist, der vorschreibt, dass bis 2022 der Gesamtverbrauch erneuerbarer Kraftstoffe in der US-Transportindustrie 36 Milliarden Gallonen betragen soll, wobei 16 Milliarden Gallonen aus zellulosehaltiger Biomasse gewonnen werden. Aufgrund der schnellen Wachstumsrate der Loblolly-Kiefer und ihrer Eignung für Agroforstprojekte ist sie daher in den letzten Jahren zu einem Rohstoff für Biokraftstoffe von großem Interesse geworden³³. Die Kenntnis der mechanischen Eigenschaften der Loblolly-Kiefer, einschließlich der Variabilität zwischen einzelnen Bäumen, anatomischen Fraktionen (z. B. Weißholz, Rinde, Nadeln) und Zellbereichen (z. B. Zellwand versus Zellinneres), kann eine gezielte Trennung von Biomasseströmen ermöglichen, um die mechanische Verarbeitung und die thermochemische Umwandlung zu optimieren³⁴.

Abbildung 9 zeigt ein repräsentatives AFM-Topographiebild (Höhensensor) (Abbildung 9A) und eine entsprechende Elastizitätsmodulkarte (Abbildung 9B) einer Querschnittsprobe von Weißholz, die von einem Ast einer 23 Jahre alten Loblolly-Kiefer mit einer Diamantspitzensonde mit einem Krümmungsradius von ~30 nm gewonnen wurde, die auf einem Edelstahl-Ausleger (k = 256 N/m). Die Topographie- und Modulkarten wurden simultan unter Verwendung einer auf der Kraftkurve der schnellen kHz-Rate basierenden AFM-Bildgebung erstellt, wobei die Modulkarte semiquantitative Ergebnisse auf der Grundlage von Nennwerten für die Sondenkalibrierungskonstanten (d. h. Federkonstante, Durchbiegungsempfindlichkeit und Spitzenradius) darstellt und die Kraftkurven in Echtzeit an das DMT-Kontaktmechanikmodell³⁵ (Derjaguin, Muller und Toporov) anpasst. Querschnittsproben, die in allen drei Dimensionen (Länge x Breite x Höhe) auf <3 mm getrimmt wurden, wurden für die Bildgebung durch serielle Dehydratisierung mit steigenden Ethanolkonzentrationen (33 %, 55 %, 70 %, 90 % und 100 %)³⁶ vorbereitet, bevor sie mit Harz infiltriert wurden (siehe Materialtabelle) und über Nacht bei 60 °C polymerisierten. Vollständig ausgehärtete, in Harz eingebettete Proben wurden zuerst gemahlen und dann mit einer Diamanttrennscheibe ultramikrotomiert, die mit einer Schnittgeschwindigkeit von ~1 mm/s arbeitete, wobei die Vorschubdicke von 1 μm auf 50-70 nm pro Scheibe abnahm, um eine ebene Oberfläche zu erzeugen, die für die AFM-Bildgebung geeignet war. Wie jedoch an der Farbskala in Abbildung 9A zu sehen ist, ist die resultierende Oberfläche in diesem Fall immer noch relativ rau, möglicherweise aufgrund des Vorhandenseins von Restschmutz auf der Probenoberfläche und/oder der Ultramikrotomklinge, was zu einem "Rattern" der Klingen während des Schneidens führt, während andere Proben eine viel glattere Oberflächentopographie aufwiesen.

Abbildung 9C reproduziert das AFM-Topographiebild aus Abbildung 9A, jedoch mit weißem Fadenkreuz, das die Positionen für acht Arrays von jeweils 50 Nanoindents anzeigt, die entlang ausgewählter Zellwände innerhalb des ROI durchgeführt werden sollen, da das Ziel des fraglichen Projekts darin bestand, zu verstehen, wie sich die nanomechanischen Eigenschaften der Loblolly-Kiefer über verschiedene Gewebetypen und Baumalter hinweg unterscheiden. Für die Rampen wurde typischerweise eine Triggerschwelle von 1 μN verwendet (60 nm nominale Rampengröße bei einer Rampenrate von 1 Hz), was zu einer Eindringtiefe von ~10 nm entlang der Zellwände (8 ± 2 nm über alle untersuchten Proben) oder etwas tiefer (14 ± 4 nm) im Zellinneren führte, die etwas weicher als die Zellwände sind. Die Einkerbungen innerhalb jeder Linie wurden ≥100 nm voneinander entfernt, um sicherzustellen, dass sie gut voneinander getrennt waren, und es wurden 1.024 Datenpunkte pro Rampe gesammelt, um gut charakterisierte An- und Rückzugskurven zu erzeugen. Durch die Kombination von schneller Bildgebung auf der Grundlage von Kraftkurven mit Point-and-Shoot-Cantilever-basierter Nanoindentation war es möglich, Statistiken zu erstellen und Unterschiede in den Modulen zwischen den Zellstrukturen zu bestimmen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde beispielsweise festgestellt, dass der durchschnittliche Elastizitätsmodul des Zellinneren etwa halb so hoch war wie der der Zellwand bei Weißholzproben, die von mehreren Ästen von Bäumen unterschiedlichen Alters stammten.

Probe	Ort	E* (GPa)	E (GPa)	Verformung (nm)	Anzahl (n)
1	Inneres	1,5 ± 0,4	1,4 ± 0,4	14 ± 2	199
	Wand	4.7 ± 1.3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	Inneres	1,3 ± 0,3	1,2 ± 0,3	16 ± 3	198
	Wand	3,2 ± 0,9	2,9 ± 0,9	9 ± 2	199
3	Inneres	1,9 ± 0,6	1,7 ± 0,6	12 ± 3	198
	Wand	5.7 ± 1.2	5.2 ± 1.2	6 ± 1	199
4	Inneres	2,4 ± 0,8	2,2 ± 0,8	11 ± 3	202
	Wand	4.2 ± 2.1	3.8 ± 2.1	9 ± 4	193
5	Inneres	2,6 ± 0,8	2,3 ± 0,8	10 ± 2	198
	Wand	4.3 ± 1.6	3,9 ± 1,6	7 ± 2	199
Durchschnitt	Inneres	1,9 ± 0,6	1,8 ± 0,6	13 ± 3
	Wand	4.4 ± 1.4	4.0 ± 1.4	8 ± 2

Tabelle 1: Statistik des Elastizitätsmoduls der Loblolly-Kiefer: Zellwände versus Zellinneres. Gemessene Elastizitätsmodule der Zellwände im Vergleich zum Zellinneren für fünf Proben von Kiefern-Weißholzzweigen, die von zwei Bäumen unterschiedlichen Alters gesammelt wurden. Alle Modulwerte wurden berechnet, indem der Annäherungsteil der Kraft-Weg-Kurve an das DMT-Modell angepasst und ein Poisson-Verhältnis von 0,3 für die Probe angenommen wurde. Moduli werden als Durchschnitt ± Standardabweichung für jede Probenposition angegeben, wobei die Anzahl der Kraftkurven (Anzahl, n), die analysiert wurden, um das gemeldete Ergebnis zu erhalten, angegeben wird. Die gemessenen reduzierten Moduli (E*) wurden in tatsächliche Probenmoduli (E) umgerechnet, wobei ein Elastizitätsmodul von 1.140 GPa und ein Poisson-Verhältnis von 0,07 für den verwendeten Diamantspitzen-Eindringkörper angenommen wurden. Ebenfalls dargestellt ist die durchschnittliche Probenverformung für die aufgebrachte Last von 1 μN.

Korrelierte Nanomechanik und Elektronenmikrospektroskopie an Bakken-Schiefern
Bakken-Schiefervorkommen befinden sich im Williston-Becken in Montana und North Dakota in den Vereinigten Staaten sowie in Teilen von Saskatchewan in Kanada. Sie sind das zweitgrößte Kohlenwasserstoffreservoir in den Vereinigten Staaten, aber die Erforschung der Lagerstätten steckt noch in den Kinderschuhen³⁷. Eine Untersuchung der nanomechanischen Eigenschaften von Bakken-Schiefer in Abhängigkeit von der Zusammensetzung und der thermischen Reife wurde durch Kolokalisierung der Cantilever-basierten AFM-Nanoindentation mit Rasterelektronenmikroskop (REM)-Bildgebung und energiedispersiver Spektroskopie (EDS) der Elementzusammensetzung durchgeführt, wie in Abbildung 10 dargestellt. Insbesondere wurde die REM-EDS-Kartierung verwendet, um die Elementverteilung zu charakterisieren (Abbildung 10C) und dadurch das Vorhandensein und die Lage verschiedener Mineraleinschlüsse innerhalb der Schiefermatrix zu bestimmen. Die schnelle (kHz-Rate) Kraftkurve-basierte AFM-Bildgebung (Abbildung 10B) wurde mit den REM-EDS-Karten kolokalisiert, indem ein optisch identifizierbarer Ursprung im Sekundärelektronen-REM-Bild (Abbildung 10A) definiert und die Tischbewegung sowohl des AFM als auch des SEM³⁸ verfolgt wurde. Durch die erneute Verwendung einer Diamantspitzensonde, die auf einem steifen Edelstahl-Ausleger montiert war, war die Kartierung von Variationen des Elastizitätsmoduls für große Bereiche (85 μm x 85 μm) möglich, die interessante Einschlüsse enthielten (Abbildung 10D). Beachten Sie, dass die in Abbildung 10D dargestellte Modulkarte eher qualitativer als quantitativer Natur ist, da die richtigen Sondenkalibrierungskonstanten vor der Bildgebung und Datenerfassung nicht in die Software eingegeben wurden.

Die AFM-Bilder in Abbildung 10B und Abbildung 10D verdeutlichen auch einen der Nachteile der verwendeten Diamantspitzensonde, nämlich ihre Unfähigkeit, Merkmale mit hohem Aspektverhältnis (siehe den schwarzen ovalen Bereich in Abbildung 10B) aufgrund ihrer Geometrie der Würfeleckenspitze genau zu verfolgen. Die reduzierte Auflösung und die Unfähigkeit, steile Strukturen genau zu verfolgen, sind in Abbildung 11 deutlicher zu erkennen, wo derselbe allgemeine Bereich einer Bakken-Schieferprobe durch die Diamantspitze der Würfelecke (Abbildung 11A) und eine deutlich schärfere, steife Silizium-AFM-Sonde mit steifem Abgriffsmodus mit höherem Seitenverhältnis (Abbildung 11B) abgebildet wurde. Genauer gesagt wurde das in Abbildung 11B gezeigte Bild mit der in Abbildung 8A-D charakterisierten Sonde zwischen den BTR-Modellen in Abbildung 8A (R = 11 nm) und Abbildung 8B (R = 43 nm) aufgenommen. Zum direkten Vergleich zeigen die Bildpaare Abbildung 11C,D und Abbildung 11E,F vergrößerte Bilder derselben Probenoberflächenmerkmale, die mit der Diamantspitze bzw. der Siliziumsonde aufgenommen wurden, und zeigen den Einfluss der Spitzengeometrie und des Radius auf die Bildauflösung und -treue. Abbildung 11G zeigt ein zusammengesetztes 3D-Bild, das die Oberflächentopographie, die mit der scharfen, hochflächigen Siliziumsonde (Abbildung 8A, B) aufgenommen wurde, und die Modulwerte, die mit der Diamantspitzensonde (Abbildung 8E, F) aufgenommen wurden, kombiniert, die als überlagerte farbige Haut kodiert sind.

Zusätzlich zu den großen Bildern, die in Abbildung 10 und Abbildung 11 gezeigt sind, wurden kleinere (10 μm x 10 μm) Bilder mit schnellen Kraftkurven mit der vollständig kalibrierten Diamantspitzensonde aufgenommen. Diese Bilder konzentrierten sich auf Bereiche ohne optisch sichtbare anorganische Mineraleinschlüsse, um die Eigenschaften der umgebenden organischen Matrix genauer zu untersuchen. Durch die Verwendung einer Pixelauflösung von 512 x 512 (d. h. ~20 nm x 20 nm Abtastpixel) wurden >262.000 einzelne F-D-Kurven erfasst und mit jedem 10 μm x 10 μm großen Bild gespeichert, was eine hervorragende Statistik ermöglicht. Die F-D-Daten wurden stapelweise verarbeitet und mit dem AtomicJ-Softwarepaket²³ analysiert, um das Derjaguin-Muller-Toporov (DMT)35-Kontaktmechanikmodell zu implementieren. Nach der Anpassung wurden die Daten bereinigt, um Kurven zu entfernen, die zu einem berechneten Elastizitätsmodul <0 (nicht physikalisch) oder >30 GPa (da sich die Studie auf den nicht-mineralischen Teil des Schiefers konzentrierte, E << 30 GPa), ähnlich wie in anderen Studien^39,40, sowie Daten mit einer Modellanpassung R² < ^0,7 ergaben. Obwohl der^R2-Grenzwert etwas willkürlich ist, wurde er gewählt, um nur Daten zu entfernen, die das Modell offensichtlich nicht genau anpassen konnte. Mit Ausnahme eines Ausreißers, der einen großen Mineraleinschluss im Bildgebungsbereich enthielt, machten die entfernten Kurven weniger als 0,5 % der Gesamtdaten für jedes Bild aus. Eine Zusammenfassung der statistischen Ergebnisse ist in Tabelle 2 zu finden. Die berechneten Elastizitätsmodule variieren von 3,5 bis 6,1 GPa, innerhalb des Bereichs, den ähnliche Studien ebenfalls gefunden haben ^39,40.

Probe	E (GPa)	Ausbeute nach Datenbereinigung	Anzahl (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5.1 ± 2.6	99.70%	7,84,267
3	3,5 ± 1,9	99.60%	7,83,427

Tabelle 2: Statistik des Elastizitätsmoduls der Bakken-Schiefer. Messung der Elastizitätsmodule der organischen Matrices in drei Bakken-Schieferproben unterschiedlicher Zusammensetzung und thermischer Reife. Probe 1 ist eine Kontrolle, während die Proben 2 und 3 für 12 h bzw. 48 h geglüht wurden, um die thermische Reifung künstlich zu simulieren. Die elastischen Moduli werden als Durchschnitt ± Standardabweichung für jede Probenposition angegeben, wobei die Anzahl der Kraftkurven (Anzahl, n) in die Analyse einbezogen wird, nachdem das im angegebenen Text beschriebene Datenbereinigungsverfahren angewendet wurde. Die berechneten durchschnittlichen Moduli (3,5-6,1 GPa) liegen innerhalb des Bereichs, der in anderen ähnlichen Studien wie der von Li et ^al.40 berichtet wurde, die einen Modulbereich von 2,9-11,8 GPa ergaben.

Die Kernsteifigkeit von mesenchymalen Stammzellen verändert sich durch äußere Reize
Mesenchymale Stammzellen (MSCs) sind Vorläuferzellen, die zu Chondrozyten, Adipozyten, Osteoblasten und Myozyten werden können⁴¹. Die Differenzierung von MSC in diese verschiedenen Gewebetypen wird durch äußere mechanische Reize auf der Zelle über den Linker des Zytoskelett- und Nukleoskelett-Komplexes (LINC) beeinflusst, der die äußere Zellmembran physisch mit der Kernmembran verbindet⁴¹. Der LINC-Komplex besteht aus SUN- und Nesprin-Proteinen, die mit dem Zellzytoskelett interagieren, um physikalische Kräfte auf die Zelle zu erkennen und den Kernimport der mechanosensitiven Faktoren β-Catenin und YAP zu erleichtern, um den Differenzierungsprozess einzuleiten^42,43,44. Neben dem nukleären Import von β-Catenin und YAP nach der Mechanostimulation von Zellen erfährt auch das Zytoskelett eine Umlagerung, einschließlich der Bildung von F-Aktin-Filamenten um den Zellkern sowie der nukleären Translokation von Aktin^44,45,46. Da die Mechanostimulation Veränderungen am Zellzytoskelett und den Kerneintritt von Aktin auslöst, wird die Gesamtsteifigkeit (Modul) von Zellen und Zellkernen beeinflusst und kann durch AFM-Cantilever-basierte Nanoindentation gemessen werden. Frühere Studien haben dies bestätigt, indem sie eine Abnahme des Zell- und Kernmoduls nach Störung des LINC-Komplexes und umgekehrt eine Zunahme des Zell- und Kernmoduls nach der Mechanostimulation von MSCs festgestellt^{haben 47}. Die aktuelle Forschung untersucht noch die Mechanismen des Aktinimports in den Zellkern und wie sich die Aktinpolymerisation auf den Zell- und Kernmodul nach Mechanostimulation auswirkt.

Um die mechanischen Eigenschaften lebender Zellen zu untersuchen, müssen die Experimente in einer Pufferlösung, typischerweise PBS, durchgeführt werden. Die Durchführung von Cantilever-basierten Nanoindentationen in Flüssigkeiten stellt besondere Probleme dar, insbesondere für die Messung von sehr weichen Proben wie MSCs (E≈ 2 kPa). Insbesondere die niedrigen Elastizitätsmodule lebender Zellen erfordern die Verwendung eines großen Sondenradius, um die Belastung der Zellstruktur zu reduzieren und eine Punktion der Membran zu vermeiden. Darüber hinaus sind sehr niedrige federkonstante Ausleger (k = 0,04 N/m) erforderlich, um solche niedrigen Elastizitätsmodule zu messen, was jedoch die Wahrscheinlichkeit eines falschen Einrastens aufgrund des viskosen Widerstands des Fluids erhöht, was zu einer Durchbiegung des weichen Auslegers während des ersten schnellen Absenkschritts des AFM-Einrastvorgangs führt. Um der höheren Neigung zu falschen Eingriffen entgegenzuwirken, kann es erforderlich sein, einen größeren Einrast-Sollwert zu verwenden (d. h. die Auslöseschwelle der Ablenkspannung, um den Einrastvorgang zu beenden). Da weichere Ausleger im Allgemeinen in größerem Maße elastisch verformt werden können als steife Ausleger, ist die größere Biegung, die bei einem höheren Eingriffssollwert in Flüssigkeit auftritt, für solche weichen Sonden im Allgemeinen nicht nachteilig. Darüber hinaus ist es zwingend erforderlich, dass die Lösungen, die in einer flüssigen Umgebung verwendet werden, frei von Schmutz und Blasen sind, da schwimmende Ablagerungen oder Blasen die Übertragung des Lasers durch das Fluid zum PSD vorübergehend stören oder am Cantilever haften und den Laser blockieren können. Eine Interferenz mit dem Laserstrahl wirkt sich negativ auf die resultierenden F-D-Kurven aus und führt häufig zu einer falschen Crash-Erkennung oder einem falschen Einrasten. Schließlich erfordert die Nanoindentation an lebenden Zellen auch mehr Benutzereingaben als an härteren, unbelebten Materialien. Da die Zellen und ihre Flüssigkeitsumgebung viel dynamischer sind, kann es erforderlich sein, die Höhe der Sonde für jede Rampe aktiv anzupassen, um eine gute F-D-Kurve zu erhalten.

Bei der Nanoindentation lebender Zellen ist oft eine viel größere Probenverformung erforderlich, um die gleiche Cantilever-Auslenkung im Vergleich zu steiferen Proben zu erzielen. Diese größere Verformung kann dazu führen, dass die experimentellen Ergebnisse von der Annahme der linearen Elastizität des Hertz-Modells abweichen, und daher muss möglicherweise ein Korrekturfaktor angewendet werden, um das hyperelastische Verhalten für eine genaue F-D-Analyse zu berücksichtigen⁴⁸. Es wurde festgestellt, dass das geometrische Größenverhältnis , wobei _R2 der Radius des Eindringkörpers und _R1 der Radius der Zelle ist (siehe Abbildung 12A), verwendet werden kann, um die Übereinstimmung der resultierenden Daten mit der Hertzschen Mechanik vorherzusagen. Es wurde festgestellt, dass das ideale geometrische Größenverhältnis β = 0,3 beträgt, wobei β Werte <0,3 zu einer Unterschätzung des Elastizitätsmoduls und β Werte > 0,3 zu einer Überschätzung des Elastizitätsmoduls führen, wenn sie mit der Hertz-Kontakttheorie⁴⁸ analysiert werden. Eine gängige Methode zur Vermeidung nichtlinearer Effekte besteht darin, Verformungen klein zu halten. In dieser Studie wurde die Eindringtiefe auf 500 nm-1 μm begrenzt.

Ein repräsentativer Datensatz, der die Ergebnisse eines einzelnen Satzes von Nanoindentationsexperimenten an MSCs und isolierten Kernen zeigt, ist in Abbildung 12B dargestellt. In den in Abbildung 12B dargestellten Daten wurden vorkalibrierte (Federkonstante über LDV und Spitzenradius über REM) hemisphärische Sonden mit einem Radius von 5 μm und einer nominalen Federkonstante von k = 0,04 N/m verwendet, um Modulunterschiede zwischen intakten lebenden MSCs und isolierten MSC-Kernen zu untersuchen, die als Kontrollen dienten, um die Auswirkungen statischer und dynamischer Dehnungen auf die zell- und kernmechanischen Eigenschaften zu testen⁴⁶. Aufgrund von Unterschieden und Herausforderungen bei der Interaktion mit den Zellen und Zellkernen weisen die extrahierten Moduldaten tendenziell eine große Variation (d. h. Verteilung der Werte) auf. Dementsprechend stellt der Datensatz in Abbildung 12B ein 75. Perzentil der erfassten Daten dar^. Aufgrund dieser angeborenen Variabilität zwischen lebenden Zellen und der daraus resultierenden Messstreuung wird empfohlen, Replikationsexperimente mit Nanoindentation an einer großen Anzahl von Proben mit mindestens drei biologischen Wiederholungen durchzuführen, um robuste Statistiken für die Datenanalyse und -interpretation zu generieren³⁰.

Mechanische Eigenschaften von cholesterinhaltigen Lipiddoppelschichten
Gestützte Lipidmembranen mit sehr hohem (>50 mol%) Cholesteringehalt (Chol), typisch für die Zusammensetzung von Augenlinsenmembranen, wurden hergestellt und auf frisch gespaltenem Muskovit-Glimmer^{inkubiert 49}. Ein repräsentatives AFM-Topographiebild einer solchen geträgerten Lipidmembran (SLM), das in einem Chol/POPC-Mischungsverhältnis (POPC = 1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin) von 1 hergestellt wurde, ist in 13A dargestellt, wobei das Höhenprofil entlang der violetten Linie in der unter der Abbildung gezeigten Abbildung dargestellt ist. Das SLM in Abbildung 13A bedeckte die exponierte Glimmeroberfläche vollständig mit ausreichender Inkubationszeit (~25 min) und einer ausreichenden Lipidkonzentration (0,3 mg/ml), was durch das Fehlen unterscheidbarer Merkmale im Topographiebild belegt wird. Ebenso liefert das Höhenprofil über das Bild strukturelle Details zur Rauheit der Membranoberfläche, wobei das SLM wie erwartet glatt ist.

Abbildung 13B zeigt eine Sammlung von Anfahrabschnitten von Kraftkurven, die auf dem in Abbildung 13A gezeigten SLM erfasst wurden. Um eine bessere Statistik über die mechanischen Eigenschaften des SLM zu erhalten, wurden Kraftkurven an äquidistanten Punkten im Abstand von mindestens 100 nm gesammelt, die fast die gesamte Breite des SLM abdecken. Der Abstand zwischen den Punkten (≥10-fache der Einrückungstiefe) wurde gewählt, um zu verhindern, dass der Einzug zu nahe beieinander erfolgt. Die Kraftkurven zeigen ein deutliches Durchbruchsereignis, was durch die Diskontinuität oder den plötzlichen Sprung zwischen den ~0 und ~5 nm Trennabständen im Annäherungsabschnitt der Kraftkurven belegt wird, wo die Kraft steil von ~10 nN auf ~5 nN abfällt. Die durchschnittliche Durchbruchkraft für die in Abbildung 13A dargestellte Membran (Chol/POPC-Mischungsverhältnis von 1) auf der Grundlage der Annäherungskurven in Abbildung 13B wird mit 9,25 ± 0,27 nN berechnet.

Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 13C ein AFM-Topographiebild der Teilmembran oder der Membranflecken, die durch erneute Inkubation von Membranen in einem Chol/POPC-Mischungsverhältnis von 1 gebildet wurden, jedoch bei einer viel niedrigeren Konzentration von Lipiden (~15 μg/ml) und mit einer kürzeren Inkubationszeit (~5-6 min)⁴⁹. Das Höhenprofil entlang der roten Linie über den Membranfleck in der Bildmitte ist unterhalb der Abbildung dargestellt. Die Messung über die partielle Doppelschicht liefert die Dicke des SLM, die durch die schwarzen gestrichelten Linien in Abbildung 13C mit ~7 nm dargestellt ist. Diese gemessene Dicke enthält jedoch auch eine 1–2 nm dicke Wasserschicht zwischen der Membran und der Glimmerscheibe⁵⁰. Es ist zu beachten, dass die Teilmembran oft nur schwach an der Glimmeroberfläche befestigt ist, was dazu führen kann, dass beim Scannen Lipidpartikel vom Rand der Teilmembranpflaster entfernt werden, aber eine etwas längere Inkubationszeit oder eine Verringerung der Abbildungskraft kann diese Schwierigkeit beseitigen.

Die Kalibrierung der AFM-Sonde ist entscheidend, um die mechanischen Eigenschaften von SLM genau zu quantifizieren. Obwohl die Konstante der Spitzenfeder in Luft oder flüssigem Medium konstant bleibt, muss die Durchbiegungsempfindlichkeit in demselben Medium kalibriert werden, in dem die Experimente durchgeführt werden. Es ist von entscheidender Bedeutung, die Ablenkungsempfindlichkeit unmittelbar vor jeder Erfassung von Kraftkurven zu kalibrieren, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten, da sich die Laserausrichtung und/oder das Reflexionsvermögen der Rückseitenbeschichtung im Laufe der Zeit ändern können, insbesondere in Flüssigkeiten. Von sehr scharfen Sonden wird für die Erfassung von Membrankraftkurven abgeraten, da sie das SLM leicht durchstechen und dazu führen können, dass eine fälschlicherweise niedrige Durchbruchkraft oder gar keine Durchbruchskraft gemessen wird. Die wiederholte Verwendung derselben Spitze ohne ordnungsgemäße Reinigung erhöht jedoch die Wahrscheinlichkeit, dass sich Schmutz auf der Spitze ansammelt und dadurch die Spitze stumpf macht oder die Haftkräfte der Spitze an der Probe beeinträchtigt. Das Fehlen von Durchbruchsereignissen, die in den Annäherungskraftkurven erkennbar sind, kann auch darauf zurückzuführen sein, dass nur auf Glimmer und nicht auf die eigentliche Membran gedrückt wird. Daher ist eine visuelle Bestätigung der Membranbildung vor der Erfassung von Kraftkurven erforderlich.

Abbildung 7: Repräsentative Kraft-Weg-Kurven (F-D) in Luft und Fluid. Repräsentative Kraftkurven, die an (A) einer Loblolly-Kiefer in Luft mit begleitender DMT-Modellanpassung und (B) einem lebenden MSC-Kern in PBS mit begleitender Hertz-Modellanpassung erhalten wurden. Einschübe in den Feldern A und B zeigen einen Zoom des Kontaktbereichs der entsprechenden Anfahrkurven (blaue Kurven) mit begleitender Anpassung (grüne Kurven). In jedem Panel wird der anfängliche Kontaktpunkt zwischen Spitze und Probe (wie durch den Anpassungsalgorithmus bestimmt) durch eine grüne Raute angezeigt, während der Wendepunkt (d. h. der Übergang von der Annäherung zum Ein- oder Ausfahren) durch einen cyanfarbenen Kreis angezeigt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Vergleich des Verschleißes der Silizium- und Diamantsondenspitze. (A-D) Silizium-Sondenspitze. Eine Reihe von Modellen, die nach der Rekonstruktionsmethode der Blindspitze nach der Bildgebung einer Probe zur Charakterisierung der Spitze erstellt wurden und die Entwicklung des Radius einer steifen Cantilever-Siliziumspitzensonde (siehe Materialtabelle) aufgrund des fortschreitenden Spitzenverschleißes zeigen, der im Laufe von drei aufeinanderfolgenden 85 μm x 85 μm (1024 x 1024 Pixel) Kraftkurve basierenden Bildern einer Bakken-Schieferprobe aufgetreten ist, durchgeführt mit einer Zeilenabtastrate von 0,1 Hz und einer Kraftkurve-Abtastrate von 2 kHz (d. h. ~20 Millionen Tip-Sample-Wechselwirkungen/Bild). (A) Trinkgeld wie erhalten (nach dem Auspacken), vor dem Gebrauch. R = 11 nm. (B) Spitze nach einem Bild (R = 43 nm). (C) Spitze nach zwei Bildern (R = 94 nm). (D) Spitze nach drei Bildern (R = 129 nm). (E,F) Diamant-Sondenspitze. BTR-Modelle desselben Diamantspitzentasters (siehe Materialtabelle), die im Abstand von ~6 Monaten hergestellt wurden. Zwischen der Aufnahme der Spitzenbilder, die zur Erzeugung der in E und F gezeigten Modelle verwendet wurden, wurden Tausende von Nanoindenten mit der Sonde durchgeführt, und es kam zu Hunderten von Millionen von Wechselwirkungen zwischen Spitze und Probe während der kraftkurvenbasierten Bildgebung. Aufgrund der Härte des Diamanten änderte sich der geschätzte Spitzenendradius von ~30 nm jedoch nicht innerhalb der Unsicherheitsgrenzen der BTR-Technik zwischen der Aufnahme der ersten (E) und der nachfolgenden (F) Bilder der Spitze. Die im früheren Modell beobachtete Unebenheit (dargestellt durch den schwarzen Kreis in Tafel E) ist höchstwahrscheinlich entweder ein Artefakt der BTR-Methode oder auf das Vorhandensein einer nanoskaligen Verunreinigung (z. B. Staubpartikel) an der Seite der Spitze zurückzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: AFM-Topographie- und Modulkarten einer Loblolly-Kiefernprobe. Repräsentative AFM-Daten, die in Luft an einer in Harz eingebetteten Kiefernprobe im Querschnitt aufgenommen wurden, um Cantilever-basierte Nanoindentationsmessungen an Zellwänden zu ermöglichen. (A) AFM-Topographiebild, das mehrere Zellen abdeckt, aufgenommen mit einem auf schnellen Kraftkurven basierenden Bildgebungsmodus, dargestellt als Pseudo-3D-Darstellung. (B) Elastizitäts- oder Elastizitätsmodulkarte, die in Echtzeit von der AFM-Software generiert wird, indem die an jedem Pixel erfasste Kraftkurve analysiert und die Daten an das DMT-Modell angepasst werden, um zu zeigen, dass die Zellwände steifer sind als das Zellinnere. Beachten Sie, dass die nominalen und nicht die gemessenen Sondenkalibrierungsparameter verwendet wurden, so dass die Modulwerte als qualitativ oder nur semiquantitativ behandelt werden sollten. (C) Überblick über die ROI mit Angabe der Stellen (acht Linien, bestehend aus jeweils 50 weißen Fadenkreuzen im Abstand von ≥100 nm), an denen 400 Nanoindenten (60 nm nominale Rampengröße, mit einer Triggerschwelle von 1 μN, die einer durchschnittlichen Eindringtiefe von ~10 nm entspricht) entlang ausgewählter Zellwände nach Aufnahme des AFM-Bildes durchgeführt wurden, um die Lokalisierung von Eindrücken mit nanoskaliger Präzision zu ermöglichen. Maßstabsbalken = 20 μm (A,B). Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; DMT = Derjaguin-Müller-Toporov. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 10: Co-lokalisiertes AFM und REM/EDS einer Bakken-Schieferprobe. (A) Sekundärelektronen-REM-Aufnahme eines Teils einer Bakken-Schieferprobe. (B) AFM-Topographiebild der Region, die durch die Blackbox in A gekennzeichnet ist. Das schwarze Oval weist auf einen Bereich hin, in dem das niedrige Aspektverhältnis der Sonde zur Abbildung der Sondenseitenwand führt und nicht zu der steilen Oberflächentopografie mit hohem Aspektverhältnis. (C) Karte der EDS-Elementzusammensetzung, die für das in A gezeigte REM-Bild erstellt wurde. (D) AFM-abgeleitete elastische oder Elastizitätsmodulkarte, die im Zuge der Aufnahme des AFM-Topographiebildes in B erstellt wurde und zeigt, dass der Mineraleinschluss in der Mitte der Bilder A-D deutlich härter ist als die umgebende organische Matrix. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: AFM = Rasterkraftmikroskopie; REM = Rasterelektronenmikroskopie; EDS = energiedispersive Spektroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 11: Auswirkung des Radius und der Form der Sondenspitze auf das Erscheinungsbild von Merkmalen mit hohem Aspektverhältnis. Vergleich der Merkmalsauflösung, die entweder mit (A) einer R≈ 30 nm niedrigen Aspektverhältnis (Spitzenhalbwinkel = 47°) Diamantspitzensonde (siehe Materialtabelle) oder (B) einer R≈ 10 nm hohen Aspektverhältnis (Spitzenhalbwinkel ≈ 19°) steifer Siliziumsonde (nominal k = 200 N/m; siehe Materialtabelle) erzielt wurde, um dieselbe Stelle auf einer Bakken-Schieferprobe abzubilden. (C-F) Vergrößerte Bilder der blauen (C,D) und orangefarbenen (E,F) Box-Bereiche in A und B, die entweder mit der Diamantspitzensonde mit größerem Krümmungsradius und niedrigem Aspektverhältnis (C,E) oder mit der schärferen, steifen Silizium-Abgriffssonde (D,F) mit höherem Aspektverhältnis aufgenommen wurden, wobei die verringerte Merkmalsauflösung und die Einführung von Artefakten der Spitzenseitenwand in das AFM-Topographiebild hervorgehoben werden, das mit der Diamantspitzensonde aufgrund ihres größeren Spitzenradius und halber Winkel. Die in C-F hervorgehobenen Bereiche enthalten steile, tiefe, wellähnliche Merkmale, die die Kompromisse in Bezug auf laterale Auflösung, genaue Nachführung und Bildtreue zwischen einer leichter stumpfen, anfangs scharfen Siliziumsonde oder einer stumpferen, verschleißfesten Diamantspitzensonde aufzeigen. (G) Zusammengesetztes 3D-Bild, das durch die Kombination der AFM-Topographie, die mit der scharfen, steifen Siliziumsonde mit höherem Aspektverhältnis aufgenommen wurde, mit Moduldaten (überlagerte farbige Haut) erzeugt wurde, die aus der schnellen Kraftkurvenbildgebung desselben Bereichs der Probe mit der Diamantspitzensonde abgeleitet wurden. Die Merkmale, die durch die blauen und weißen Kästchen in A und B hervorgehoben sind, sind auch in G gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 12: Cantilever-basierte Nanoindentation auf Zellen oder Zellkernen. (A) Eine Zelle mit dem Radius _R1, die sich auf einem flachen, starren Substrat befindet, wird durch einen kugelförmigen Eindringkörper mit dem Radius _R2 bis zu einer Tiefe d eingedrückt. Diese Abbildung wurde von Ding et ^al.48 reproduziert. (B) Einzelwertdiagramme repräsentativer Modulmessungen, die aus AFM-Cantilever-basierten Nanoindentationsexperimenten an Maus-MSCs und isolierten Zellkernen, die aus Maus-MSCs extrahiert wurden, gewonnen wurden. Insgesamt wurden 10 Zellen und 10 Kerne jeweils fünfmal bei einer Eindrucktiefe von 500-600 nm gemessen (gewählt, um die Verwendung des Hertz-Kontaktmechanikmodells zu ermöglichen). Die resultierenden F-D-Kurvenrohdaten wurden mit Atomic J²³ verarbeitet, um die Elastizitätsmodule zu berechnen. Aufgrund der großen angeborenen Variabilität der Zellen wird ein 75. Perzentil der Daten aufgetragen^. Zellkerne und isolierte Zellkerne zeigten keinen statistischen Unterschied im Elastizitätsmodul, mit gemessenen durchschnittlichen Modulen von 0,75 ± 0,22 kPa bzw. 0,73 ± 0,22 kPa. Ähnliche Daten wurden gesammelt und analysiert, um Unterschiede in der Kernsteifigkeit aufgrund von mechanischer Stimulation, Protein-Knockouts und chemischen Behandlungen zu bestimmen. Abkürzungen: MSC = mesenchymale Stammzelle; AFM = Rasterkraftmikroskopie; F-D = Kraft-Weg. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 13: Morphologie und nanomechanische Eigenschaften von Lipiddoppelschichten . (A) AFM-Topographiebild, das die minimale Höhenvariation einer vollständig geträgerten Lipidmembran (SLM) aus Chol/POPC in einem Mischungsverhältnis von 1 zeigt, die sich über die gesamte exponierte Glimmeroberfläche mit einer langen Inkubationszeit (~25 min) und einer hohen Lipidkonzentration (0,3 mg/ml) gebildet hat. Das Höhenprofil entlang der violetten Linie in der Mitte des Bildes ist unter der Abbildung dargestellt und zeigt strukturelle Details der Membranoberfläche. Erwartungsgemäß ist das SLM extrem leichtgängig. (B) Sammlung von Anfahrabschnitten von Kraftkurven, die auf dem SLM erfasst wurden, wie in A gezeigt. Die Kraftkurven wurden an äquidistanten Punkten im Abstand von ≥100 nm aufgenommen, die fast die gesamte SLM abdecken. Die Kraftkurven zeigen ein deutliches Durchbruchsereignis, was durch die Diskontinuität oder den plötzlichen Sprung im Anflugabschnitt der Kraftkurven belegt wird. Die durchschnittliche Durchbruchkraft beträgt 9,25 ± 0,27 nN. (C) Teilmembran oder Membranpflaster, die durch Inkubation von Membranen in einem Chol/POPC-Mischungsverhältnis von 1 mit einer kürzeren Inkubationszeit (~5-6 min) und einer niedrigeren Lipidkonzentration (~15 μg/ml) im Vergleich zu A⁴⁹ gebildet werden. Das Höhenprofil entlang der roten Linie auf dem Patch ist unterhalb des Bildes dargestellt. Die partielle Doppelschicht ermöglicht die Messung der Dicke des SLM, dargestellt durch die schwarzen gestrichelten Linien im Höhenprofil. Es ist zu beachten, dass die gemessene Dicke auch eine 1-2 nm dicke Wasserschicht zwischen der Membran und der Glimmerscheibe⁵⁰ enthält. Diese Abbildung wurde von Khadka et ^al.49 mit Genehmigung von Elsevier adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Probenvorbereitung
Zu den gängigen Präparationsmethoden für die Nanoindentation in Luft gehören Kryoschnitt (z. B. Gewebeproben), Schleifen und/oder Polieren mit anschließendem Ultramikrotomieren (z. B. in Harz eingebettete biologische Proben), Ionenmahlen oder fokussierte Ionenstrahlpräparation (z. B. Halbleiter-, poröse oder gemischte Härteproben, die nicht poliert werden können), mechanisches oder elektrochemisches Polieren (z. B. Metalllegierungen) oder Dünnschichtabscheidung (z. B. Atomlagen- oder chemische Gasphasenabscheidung, Molekularstrahl-Epitaxie). Ziel ist es, eine Probe mit minimaler Oberflächenrauheit (idealerweise nm-Skala, ≤0,1x der beabsichtigten Eindringtiefe) zu erzeugen. Bei vielen der oben genannten Methoden muss die Probe möglicherweise anschließend mit hochreinem gefiltertem Lösungsmittel (z. B. HPLC-Qualität) gespült und/oder beschallt und mit ultrahochreinem Stickstoffgas (99,999 %) Stickstoff (N₂) getrocknet werden, um Partikelrückstände zu entfernen. Alternativ können Flocken (z. B. 2D-Materialien) oder Partikel (z. B. Nanopartikel oder Mikrokapseln) aus Lösungen, die mit hochreinen gefilterten Lösungsmitteln hergestellt wurden, spinnbeschichtet oder tropfengegossen werden. In diesem Fall besteht das Ziel darin, eine Oberflächendichte zu erreichen, die mehrere nicht überlappende Flocken oder Partikel innerhalb des Sichtfelds in einem zufällig ausgewählten Bereich der Probe ergibt. Für die Nanoindentation in Flüssigkeit (häufig für biologische Proben, die eine Pufferlösung benötigen, um lebensfähig zu bleiben) ist die Abscheidung oder Vorbereitung von Proben auf einem glatten Substrat (Oberflächenrauheit im Nanometerbereich) (z. B. Objektträger, Petrischale oder frisch gespaltener Muskovitglimmer) erforderlich^46,47,49.

Überlegungen zur Sondenauswahl
Die Auswahl einer geeigneten Sonde ist für die quantitative Analyse von F-D-Kurven von größter Bedeutung, da die Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe die grundlegende Eigenschaft ist, die bei der Cantilever-basierten Nanoindentation gemessen wird. Die folgenden Fragen sind von besonderer Bedeutung bei der Auswahl einer Sonde für ein bestimmtes Experiment. Was ist die erwartete (oder gemessene) Oberflächenrauheit und der Elastizitätsmodulbereich der Probe? Proben mit hoher Rauheit können aufgrund der erhöhten seitlichen Kräfte, die bei der Verfolgung steiler Merkmale auf die Spitze wirken, im Vergleich zu glatteren Proben zu einem beschleunigten Verschleiß führen und die Wahrscheinlichkeit von Spitzenbruchereignissen erhöhen⁵³. Je härter die Probe ist, desto schneller verschleißt die Sondenspitze. Wie viele Bilder und/oder Nanoindenten sind außerdem notwendig? Mit weniger Bildgebung und Eindrücken ist ein geringerer Spitzenverschleiß zu erwarten. Wie weiter unten ausführlicher beschrieben, kann der Spitzenverschleiß durch die Verwendung von diamantähnlichen Kohlenstoffbeschichtungen (DLC) verringert oder durch die Verwendung von Diamantspitzensonden praktisch eliminiert werden (wobei die hohen Anschaffungskosten im Laufe der Zeit durch die nahezu unbegrenzte Lebensdauer der Sonde ausgeglichen werden).

Eine weitere Überlegung bei der Auswahl einer geeigneten Sonde ist die Größe der interessierenden Merkmale. Für die Nanoindentation ist es oft am besten, die größtmögliche Spitzengröße zu verwenden und gleichzeitig die für die fragliche(n) Probe(n) erforderliche(n) räumliche Auflösung und den gewünschten Informationsgehalt beizubehalten, da größere Spitzen seltener plötzliche Änderungen der Spitzengeometrie aufgrund von Brüchen erfahren und auch geringere Verschleißraten aufweisen⁵⁴. Es ist auch wichtig zu überlegen, ob es andere AFM-Methoden gibt, die mit der Nanoindentation kolokalisiert werden können, wie z. B. das leitfähige AFM⁵⁵, die Kelvin-Sondenkraftmikroskopie (KPFM)56 oder die Magnetkraftmikroskopie (MFM)⁵⁷. Wenn zusätzliche Messungen wie diese verwendet werden sollen, muss die Sondenspitze möglicherweise elektrisch leitfähig oder magnetisch sein, was sich auf die Materialzusammensetzung und damit auf eine Vielzahl von Eigenschaften wie Härte, Verschleißfestigkeit und Spitzenradius auswirkt. Wenn eine Vertiefung in Flüssigkeit durchgeführt wird, ist die Zusammensetzung der reflektierenden Rückseitenbeschichtung der Sonde (falls vorhanden) ein weiterer wichtiger Aspekt, da sie korrosionsbeständig sein muss (z. B. ist eine Au-Rückseitenbeschichtung für Flüssigkeitssonden üblich). Schließlich, und das ist vielleicht das Wichtigste, muss die Federkonstante des Sondencantilevers auf den erwarteten Bereich der zu messenden Elastizitätsmodule abgestimmt sein. Wenn die Federkonstante nicht gut mit dem Probenmodul übereinstimmt, kann einer von zwei Fällen eintreten. Wenn der Ausleger zu steif ist, wird wenig oder gar keine Durchbiegung gemessen und eine Charakterisierung wird unmöglich. Wenn der Cantilever hingegen zu weich ist, kann er die Probe nicht ausreichend verformen, um ihre mechanischen Eigenschaften zu messen.

Verschleiß der Spitzen
Verschleiß kann auf vielfältige Weise definiert werden; Für die Erörterung des Verschleißes der AFM-Sondenspitze wird er hier definiert als jede Änderung der Oberflächentopographie der Sondenspitze aufgrund einer plastischen Verformung ohne Materialverlust sowie jede Materialabtragung von der Oberfläche aufgrund physikalischer Wechselwirkungen⁵⁸. Im weiteren Sinne kann Verschleiß auch chemische Reaktionen wie Oxidation und Hydratation beinhalten. Bei normalen AFM-Anwendungen wird die laterale räumliche Auflösung in der Regel durch den Spitzenradius⁵⁹ begrenzt, und die Wechselwirkung zwischen Spitze und Probe ist die primäre gemessene Eigenschaft. Da der Spitzenradius ein Schlüsselparameter bei der Modellierung der Kontaktmechanik des Spitzen-Proben-Systems und der anschließenden Bestimmung der mechanischen Eigenschaften ist, ist der Spitzenverschleiß bei der Durchführung von Nanoindentationsexperimenten von besonderer Bedeutung und stellt eine wesentliche Einschränkung für die genaue Interpretation von Nanoindentationsergebnissen^{dar 53}. Aufgrund der normalerweise allmählichen Natur des Spitzenverschleißes (abgesehen von Spitzenbruchereignissen) ist es nicht möglich, den Spitzenverschleiß aufgrund eines einzelnen Nanoindentationszyklus (d. h. Rampe) zu quantifizieren. Darüber hinaus bietet sich die senkrechte Bewegung der Sondenspitze relativ zur Probe in Nanoindentation (ohne Berücksichtigung der auf schnellen Kraftkurven basierenden Bildgebung) an, um die Verschleißrate zu verringern, da die primäre Art des Spitzenverschleißes typischerweise Scherkräfte sind, die sich während der Abtastmodi⁶⁰ entwickeln. Daher ist die Hauptursache für den Spitzenverschleiß bei Nanoindentationsexperimenten jede Bildgebung, die nach der anfänglichen Sondenkalibrierung (insbesondere Messungen der Ablenkungsempfindlichkeit und des Spitzenradius), aber vor der Nanoindentation durchgeführt wird. Es wird daher empfohlen, bei Verwendung von Silizium- oder Siliziumnitrid-Sonden den Spitzenradius sowohl vor als auch nach jedem Experiment zu überprüfen, um den Spitzenverschleiß mit einer der oben beschriebenen Methoden (z. B. REM-Analyse oder BTR) zu überwachen und zu berücksichtigen.

Sonden-Materialien
Diamantähnlicher Kohlenstoff (DLC)
Durch die Verwendung von DLC-beschichteten Tastspitzen oder Diamantspitzen kann der Spitzenverschleiß erheblich reduziert oder ganz negiert werden⁵³. Die erhöhte Verschleißfestigkeit dieser alternativen Spitzenmaterialien ist sehr verlockend für die Messung mechanischer Eigenschaften, insbesondere von sehr steifen Materialien. Es hat sich gezeigt, dass DLC-Sondenspitzen eine 1.600-fache Erhöhung der Verschleißfestigkeit im Vergleich zu normalen Silizium-Sondenspitzen aufweisen können⁵⁴. Dieser dramatische Anstieg der Verschleißfestigkeit kann auf mehrere Faktoren zurückgeführt werden. Erstens gehören die in DLC vorhandenen Bindungen (C-C und C=C) und seine Grenzfläche mit Silizium (Si-O, Si-C) zu den stärksten Bindungen aller Elementpaare und sind viel stärker als die Si-Si-Bindungen, die in Siliziumspitzen vorhanden sind. DLC hat auch den Effekt, die Reibung zu verringern, was wiederum die Scherspannungen innerhalb der Spitze senkt und dadurch den Verschleiß reduziert. Darüber hinaus unterscheidet sich die DLC-Oberflächenchemie von der einer Siliziumspitze, da Siliziumspitzen bei Umgebungsfeuchtigkeit tribochemisch geätzt werden können, während DLC-Spitzen dies nicht tun (oder zumindest nicht in sinnvoller Weise im Vergleich zum primären Verschleißmodus)⁵⁴. Der Hauptnachteil von DLC-beschichteten Spitzen (abgesehen vom höheren Preis im Vergleich zu unbeschichteten Standard-Silikonspitzen) ist der vergrößerte Spitzenradius aufgrund der Beschichtung selbst. Die meisten DLC-Sondenspitzenradien betragen ≥30 nm, während nicht DLC-beschichtete Spitzen zuverlässig 1-2 nm im Radius⁶¹ erreichen können. Ein größerer Spitzenradius kann jedoch für Nanoindentationsexperimente oft wünschenswert sein, um Fehler bei Eigenschaftsmessungen zu reduzieren, da nanoskalige Diskrepanzen zwischen der idealen Flächentiefenfunktion und der tatsächlichen Flächentiefenfunktion aufgrund von Sondendefekten oder Unebenheiten aufgrund des größeren relativen Fehlers unverhältnismäßig stark auf Messungen mit Sonden mit kleinerem Radius wirken. Darüber hinaus kann sich die DLC-Beschichtung trotz ihrer überlegenen Verschleißfestigkeit an einigen Stellen abnutzen, was zu einem unterschiedlichen Verschleiß zwischen dem freiliegenden Siliziumkern und der verbleibenden DLC-Beschichtung führt. Leider kann die Verschleißfestigkeit der DLC-Beschichtung auch durch die Haftung der Beschichtung an der Silikonspitze und nicht allein durch die tatsächliche Härte der Beschichtung eingeschränkt werden.

Diamant
Diamant ist als eines der härtesten und verschleißfestesten Materialien der Welt bekannt. Nichtsdestotrotz wurde gezeigt, dass bei Diamantspitzen immer noch ein erheblicher Verschleiß auftreten kann, wenn große Kräfte (60 μN) verwendet werden, um den Spitzenverschleiß⁶² zu untersuchen. Umgekehrt gibt es in normalen Nanoindentations- und Bildgebungsszenarien, in denen die auf die Spitze ausgeübten Kräfte viel geringer sind, keine strengen Studien zum Verschleiß der Diamantspitze. Wie in Abbildung 8E,F zu sehen ist, erzeugte die BTR-Modellierung derselben Diamantsondenspitze unter identischen Bedingungen auf derselben Probe zur Charakterisierung der Spitze im Abstand von 6 Monaten praktisch nicht unterscheidbare Spitzenformmodelle (d. h. keine erkennbaren Anzeichen von Verschleiß). Zwischen dem ersten und zweiten BTR-Bild wurde die Sonde verwendet, um Tausende von Nanoindenten durchzuführen und Hunderte von Millionen von Wechselwirkungen zwischen Spitze und Probe zu durchlaufen, während eine Vielzahl von steifen Materialien (E > 15 GPa) abgebildet wurden, darunter Holz (Loblolly-Kiefer), Schiefer, hochgeordneter pyrolytischer Graphit (HOPG) und verschiedene Graphen-Dünnschichten. Bezeichnenderweise änderte sich der geschätzte Spitzenradius zwischen den beiden Bildern in Abbildung 8E,F um ~1 nm, was deutlich innerhalb des Fehlers⁶³ der BTR-Methode liegt. Obwohl es sich nicht um eine vollständige Studie handelt, zeigt dieser Vergleich die hervorragende Haltbarkeit einer Diamantsonde unter normalen experimentellen Nanoindentationsbedingungen (und sogar Bildgebungsbedingungen). Die größten Nachteile, die mit der Verwendung von Diamantspitzen verbunden sind (abgesehen von den teuren Anschaffungskosten), sind der vergrößerte Spitzenradius und, in gewisser Weise, das geringe Seitenverhältnis der Würfeleckengeometrie der meisten handelsüblichen Diamantspitzen. Abbildung 11A,B zeigt gegenüberliegende, vergleichende AFM-Bilder desselben Bereichs einer Bakken-Schieferprobe, die mit einer scharfen Siliziumsonde mit einem nominalen Spitzenradius von 8 nm und einem durchschnittlichen halben Winkel von ~19° aufgenommen wurden, im Vergleich zu einer Diamantspitzensonde mit einem nominalen Spitzenradius von 40 nm und einem durchschnittlichen Seitenwinkel von 47°. Wenn die vergrößerten Bereiche verglichen werden (Abbildung 11C,D und Abbildung 11E,F), ist es leicht ersichtlich, dass die Diamantspitzensonde nicht in der Lage ist, die steileren Merkmale (höheres Seitenverhältnis) im Bild aufzulösen und genau zu verfolgen. Stattdessen berührt die Seitenwand der Spitze bei steilen Merkmalen die Oberkante, und das AFM-System verfolgt im Wesentlichen die Seitenwand der Sonde, bis das Spitzenende wieder Kontakt mit der Oberfläche hat und die normale Nachführung wieder aufgenommen wird.

Anpassung der Federkonstante/-modul
Wie bereits erwähnt, muss die Federkonstante des Sondenfreitragens an den erwarteten Bereich der zu messenden Elastizitätsmodule angepasst werden. Um die Auswahl einer geeigneten Sonde zu erleichtern, enthält Tabelle 3 vorgeschlagene ungefähre nominale Cantilever-Federkonstanten, die für ausgewählte breite Bereiche der erwarteten Probenelastizitätsmodule im Bereich von wenigen MPa bis 100 GPa im Fall von ~30-40 nm Radius-Sondenspitzen geeignet sind, die häufig für die Nanoindentation⁵² verwendet werden. Für noch weichere Materialien (kPa-Bereich) wie z.B. Zellen stehen untere Federkonstantsonden (k < 0,1 N/m) zur Verfügung.

Federkonstante (N/m)	Erwarteter Probenmodulbereich
0.25	≤ 15 MPa
5	5 – 500 MPa
40	200 – 8,000 (0,2 – 8 GPa)
200	1.000 – 50.000 (1 – 50 GPa)
450	10.000 – 100.000 (10 – 100 GPa)

Tabelle 3: Ideale Sondenfederkonstanten zur Messung verschiedener Modulbereiche. Ungefähre nominale Sondenfederkonstanten für die optimale Messung von Elastizitätsmodulen in unterschiedlichen Bereichen von wenigen MPa bis 100 GPa, unter der Annahme eines typischen Sondenradius von ~30-40 nm⁵².

Neben der Federkonstante müssen im Spezialfall biologischer Materialien auch der Spitzenradius und die bei der Bildgebung und Nanoindentation aufgebrachten Kräfte sorgfältig berücksichtigt werden, um Beschädigungen zu vermeiden. In dem Anwendungsbeispiel zur Messung der mechanischen Eigenschaften von cholesterinhaltigen Lipiddoppelschichten, das im repräsentativen Ergebnisteil vorgestellt wird, wurde speziell eine relativ scharfe (10 nm) Spitze für die Analyse der Durchbruchskraft in Lipiddoppelschichten verwendet. Wenn dagegen der ROI des Materials groß genug ist (z. B. wie es bei Zellen und Zellkernen der Fall ist) und Bedenken hinsichtlich des Durchstoßpotenzials bestehen, sind größere halbkugelförmige Spitzen im Mikrometerbereich, wie sie bei den Steifigkeitsmessungen an MSC-Kernen verwendet werden, die in einem der Anwendungsbeispiele im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" beschrieben sind, ideal und liefern hervorragende Ergebnisse für weiche, zerbrechliche Proben wie lebende Zellen und isolierte Zellkerne. Kain et al. präsentieren eine eingehende Diskussion darüber, wie die optimale Kombination aus Sondenradius und Federkonstante gewählt werden kann, um die höchstmögliche Messempfindlichkeit für solche Proben zu erreichen⁶⁴.

Sonden-Kalibrierung
Empfindlichkeit bei der Durchbiegung
Die Auslenkungsempfindlichkeit setzt die Bewegung des Z-Piezos (und damit die Auslenkung des Cantilevers beim Eindrücken auf einem unendlich steifen Substrat unter der Annahme eines Betriebs im Grenzbereich kleiner Auslenkungen) in Beziehung zu einer gemessenen Spannungsänderung am PSD⁶⁵. Die Auslenkungsempfindlichkeit (manchmal auch als inverse optische Hebelempfindlichkeit [InvOLS] bezeichnet) kann in nm/V oder V/nm angegeben werden. Nachfolgend finden Sie einen Überblick über die gängigsten Methoden zur Kalibrierung der Durchbiegungsempfindlichkeit.

Kontakt mit harten Oberflächen
Die einfachste und am weitesten verbreitete Methode zur Bestimmung der Ablenkempfindlichkeit des Strahlreflexionslasers/AFM-Sonden/PSD-Systems ist die treffend als "harte Oberflächenkontakt"-Methode⁶⁵ bezeichnete Methode. Die Einfachheit, die einfache Integration in die Arbeitsabläufe der AFM-Steuerungssoftware und die In-situ-Natur tragen zur Attraktivität und weit verbreiteten Anwendung der Methode für den Kontakt mit harten Oberflächen bei. Um diese Methode zu implementieren, wird die AFM-Sondenspitze gegen ein Material gestampft, das viel steifer ist als der Ausleger. Die Steigung des Kontaktbereichs der Kraft-Weg-Kurve (dargestellt als Volt des vertikalen Auslenkungsfehlersignals auf dem PSD als Funktion der Z-Piezobewegung in nm oder der angelegten Spannung) gibt dann die Auslenkungsempfindlichkeit an (Abbildung 3A). Die Verwendung eines steifen Substrats stellt sicher, dass die gesamte gemessene Durchbiegung durch die Biegung des Auslegers und nicht durch eine Faltung der Probenverformung und der Verschiebung des Auslegers entsteht. Bei weichen Auslegern (z. B. k < 10 N/m) sind Silizium (E ≈ 170 GPa)²⁷ oder Glimmer¹⁷ leicht zugängliche und leicht verwendbare Materialien (oder alternativ Glas, E≈ 70 GPa oder geeigneter Hartkunststoff im Falle von Zellen, die auf einem Objektträger oder einer Petrischale immobilisiert sind), während für steifere Ausleger wie sie für einige Nanoindentationsexperimente verwendet werden (z. B. k > 200 N/m; Tabelle 3), muss möglicherweise Saphir (E≈ 345 GPa)^26,66 verwendet werden^, um sicherzustellen, dass keine Verformung der Probe auftritt. Da diese Methode von der Kraft-Weg-Messung abhängig ist, muss der Z-Piezo des AFM-Scanners entweder einen Höhensensor mit geschlossenem Regelkreis verwenden oder gut kalibriert sein (wenn er im Open-Loop-Modus betrieben wird) mit einer Vielzahl von Höhenstandards. Der größte Fehlerfaktor bei der Kontaktmethode für harte Oberflächen ist die Bewegung des Laserpunkts auf dem Ausleger aufgrund thermischer Fluktuationen. Änderungen der Temperatur des Cantilevers werden am häufigsten durch den Detektionslaser verursacht, obwohl auch die Joulesche Erwärmung in der umgebenden Elektronik dazu beitragen kann. Es wurden Gesamttemperaturunterschiede von 6 °C zwischen dem Cantilever und der Umgebungsluft berichtet, die zu Laserpunktverschiebungen von mehreren Mikrometern führen können⁶⁷. Um eine eventuelle Erwärmung zu berücksichtigen, ist es ratsam, nach der anfänglichen Ausrichtung des Laserpunkts ≥30 Minuten zu warten, damit der Ausleger in ein thermisches Gleichgewicht mit seiner Umgebung kommen kann, um die besten und genauesten Ergebnisse zu erzielen. Die Mittelung der Steigungen der Annäherungs- und Rückzugskurven für jede Empfindlichkeitsmessung berücksichtigt alle Spitzenreibungs- oder Gleiteffekte und sollte nach Möglichkeit durchgeführt werden⁶⁸. Darüber hinaus hilft die Mittelung über mehrere Empfindlichkeitsmessungen hinweg, die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der Messung zu beurteilen. Messungen mit guter Empfindlichkeit sollten zu Abweichungen von ≤1 % führen und mit ungefähr der gleichen Auslenkung wie die erwarteten experimentellen Nanoeindrücke durchgeführt werden, um die Wirksamkeit der Kalibrierung zu maximieren⁶⁹. Der Hauptnachteil der Kontaktmethode für harte Oberflächen besteht darin, dass der für die Kalibrierung erforderliche physische Kontakt möglicherweise zu Schäden an zerbrechlichen Siliziumspitzen führen kann (z. B. Abstumpfung oder Entstehung von Spitzenartefakten wie einer Doppelspitze).

Methode des thermischen Rauschens
Das Verfahren des thermischen Rauschens zur Bestimmung der Durchbiegungsempfindlichkeit erfordert eine vorherige Kalibrierung der Auslegerfederkonstante und die Fähigkeit, das thermische Rauschspektrum des Auslegers⁶⁷ zu messen. Die Methode des thermischen Rauschens wird häufig in moderne AFM-Steuerungssoftware integriert und kann zusammen mit der Sader-Methode (siehe unten) zur schnellen Analyse und Berechnung sowohl der Federkonstante als auch der Durchbiegungsempfindlichkeit verwendet werden. Aufgrund der verringerten Schwingungsamplitude kann es jedoch schwierig oder unmöglich sein, die Methode des thermischen Rauschens auf steiferen (k > 10 N/m) Auslegern anzuwenden. Darüber hinaus ist die berichtete relative Unsicherheit der Methode des thermischen Rauschens signifikant größer, ~20% im Vergleich zur oben beschriebenen Methode des Kontakts mit harten Oberflächen⁷⁰. Diese Technik kann nicht verwendet werden, wenn das nachstehend beschriebene thermische Tune-Verfahren zur Bestimmung der Federkonstante⁶⁷ angewendet wird.

Federkonstante
Der Goldstandard für die Messung von Cantilever-Federkonstanten ist die Laser-Doppler-Vibrometrie (LDV), und es gibt mittlerweile viele kommerziell erhältliche Sonden, die mit LDV-abgeleiteten Federkonstanten-Kalibrierungsinformationen geliefert werden, die vom Hersteller für jede einzelne Sonde bereitgestellt werden (siehe Materialtabelle). Während die genaue Messung der Cantilever-Federkonstante für quantitative nanomechanische Messungen eine absolute Notwendigkeit ist, sind die praktischen Methoden dafür im typischen Labor für nicht kalibrierte Sonden sehr unterschiedlich und können etwas komplex sein. Daher wird hier nur ein kurzer Überblick über die beiden gebräuchlichsten Vor-Ort-Kalibrierungsmethoden für Federkonstanten gegeben, mit einer Auflistung zusätzlicher Methoden und entsprechender Literaturzitate, die Sie für weitere Informationen konsultieren können.

Thermische Tune-Methode
Die thermische Tune-Methode zur Bestimmung von Cantilever-Federkonstanten ist wahrscheinlich die gebräuchlichste Methode, die in den heutigen kommerziellen AFMs verfügbar ist, und ist in die Steuerungssoftware für viele Systeme integriert. Obwohl es aufgrund der reduzierten Erkennung der Cantilever-Durchbiegung und der begrenzten Elektronikbandbreite nicht ideal für steifere Ausleger (k > 10 N/m) ist, ist das thermische Tune-Verfahren relativ einfach zu implementieren und gilt für eine Vielzahl von Spitzengeometrien⁷¹. Die thermische Tune-Methode verwendet die Messung und Anpassung des thermischen Rauschspektrums des Cantilevers, gefolgt von der Anwendung des Äquipartitionstheorems zur Berechnung der potentiellen Energie des Cantilevers, wobei der Cantilever im Allgemeinen als einfacher harmonischer Oszillator⁷² modelliert wird. Die thermische Tune-Methode hat einen Fehler von ~5%-10% für weiche Sonden und ist für jede Cantilever-Form anwendbar^73,74. Ausführlichere Informationen finden Sie in den in diesem Abschnitt zitierten Referenzen.

Sader-Methode
Die Sader-Methode ist eine weitere Methode, die häufig in die Steuerungssoftware vieler moderner AFMs integriert wird^75,76,77. Die Sader-Methode verwendet die hydrodynamische Belastung, der ein Ausleger ausgesetzt ist, wenn er in einem flüssigen Medium (normalerweise Luft oder Wasser) schwingt, zusammen mit den Draufsichtabmessungen und dem Qualitätsfaktor des Auslegers, um die Auslegerfederkonstante zu berechnen. Die Sader-Methode führt zu einem Fehler von ~10%-15% für die Cantilever-Federkonstante⁷⁴. Entsprechende Abhandlungen über das "Originalverfahren"76,78, das "allgemeine Verfahren"^79, eine Erweiterung des allgemeinen Verfahrens⁷⁷ und die gerätespezifische Dokumentation können weitere Einzelheiten liefern.

Andere Methoden
Es gibt mehrere andere Methoden, die entwickelt und implementiert wurden, um die Federkonstante von AFM-Auslegern zu bestimmen, die den Rahmen dieses Artikels sprengen würden. Obwohl keine dieser Methoden so einfach zu implementieren oder so weit verbreitet ist wie die Sader- oder Thermal-Tune-Kalibrierungsmethoden, besitzen sie jeweils einzigartige Vor- und Nachteile. Die zitierte Literatur gibt Aufschluss über deren Anwendung und Umsetzung. Insbesondere bietet Sikora einen hervorragenden Überblick über viele Kalibrierungsmethoden für Federkonstanten und ist eine hervorragende Ressource zum Thema⁷². Eine nicht erschöpfende Liste anderer Methoden zur Bestimmung von Federkonstanten umfasst die Laser-Doppler-Vibrometrie (LDV)73,74,80, die auf mikroelektrisch-mechanischen Systemen (MEMS) basierenden Geräte 81, den Referenz-Ausleger 82,83, die hinzugefügte Masse (sowohl dynamisch 75 als auch statisch ⁸⁴), die Präzisionswaage^85,86, die elektromagnetische Betätigung ⁸⁷ und die Finite-Elemente-Analyse (FEA) ^88,89.

Radius der Spitze
Gängige Methoden zur Bestimmung des Spitzenradius sind sowohl die Sekundärelektronen-REM-Bildgebung als auch die Blindspitzen-Rekonstruktionsmethode (BTR).

REM-Analyse
Die Sekundärelektronen-REM-Bildgebung kann eine Auflösung von bis zu 1 nm liefern, so dass progressive Verschleißbilder direkt und einfach verglichen werden können. Ein Nachteil der REM-Bildgebung besteht darin, dass die AFM-Sonde in der Regel demontiert und zur Analyse zum REM transportiert werden muss, da es nur hochexperimentelle kombinierte AFM-REM-Werkzeuge⁹⁰ gibt, was sowohl zeitaufwändig sein als auch die Sonde potenziell kontaminieren kann. Ein weiterer Nachteil des REM besteht darin, dass das resultierende Bild von Natur aus eine 2D-Projektion der Spitze ist, ohne dass quantitative 3D-Informationen verfügbar sind. Es muss darauf geachtet werden, dass die Sonde jedes Mal in genau der gleichen Ausrichtung ausgerichtet wird, damit Vergleichsergebnisse aussagekräftig sind, da selbst kleine Änderungen des Einfallswinkels des Elektronenstrahls die scheinbare Größe und Form der Sondenspitze verändern können. Schließlich kann die REM-Bildgebung von Aufladungseffekten und Kohlenstoffverunreinigungen geplagt werden, die das Bild unscharf machen bzw. physikalische Veränderungen an der Sondenspitze verursachen können.

Rekonstruktion der blinden Spitze
Im Gegensatz zum REM handelt es sich bei der BTR-Methode um eine In-situ-Technik , bei der die 3D-Spitzengeometrie auf der Grundlage der Abbildung einer Probe mit zahlreichen scharfen Merkmalen (hohes Aspektverhältnis) modelliert wird, die viel kleiner als der Radius der Sonde sind. Diese Methode funktioniert, weil das beobachtete Bild im AFM immer eine Faltung der Form der Sondenspitze und der Form des Probenmerkmals ist, so dass durch die Modellierung extrem scharfer Merkmale als unendlich scharfe Merkmale die Spitzenform geschätzt werden kann. Leider kann die BTR-Technik neben der Annahme von unendlich scharfen Spitzen (d. h. Oberflächenmerkmalen, die viel kleiner als der Spitzenradius sind) durch Abbildungsrauschen und Scanparameter beeinflusst werden, so dass Vergleichsbilder mit sehr ähnlichen Abbildungsparametern erhalten werden sollten. Da mehrere "Bilder" der Spitze verwendet werden, um ihre Geometrie zu rekonstruieren, ist eine direkte inverse Eins-zu-Eins-Berechnung der Spitzenform nicht möglich. Aufgrund ihrer Beschaffenheit ist das BTR-Verfahren praktisch nur in der Lage, den Benutzer über die Obergrenze der Spitzenform⁶³ zu informieren, und der Akt der Abbildung der Sonde zur Implementierung des BTR-Verfahrens kann zu Spitzenverschleiß führen (z. B. Abstumpfen oder Absplittern der Sondenspitze).

Relative Kalibrierung
Manchmal kann eine bestimmte Sondeneigenschaft nicht ohne weiteres und genau gemessen werden. Beispielsweise ist die Federkonstante steiferer Ausleger wegen Bandbreiten- und Durchbiegungsbeschränkungen⁹¹ mit dem thermischen Tune-Verfahren nur schwer oder gar nicht zu messen. Wie bereits erwähnt, gibt es andere Methoden zur Bestimmung der Federkonstante, aber da die thermische Tune-Methode in viele moderne AFMs integriert ist, wird sie oft für den einfachen täglichen Gebrauch implementiert. Ebenso muss die Ablenkempfindlichkeit für die Umrechnung der Laserbewegung auf dem PSD in die physikalische Auslenkung des Sondenauslegers immer vor dem Versuch kalibriert werden. In der Praxis ist die Messung des Spitzenradius jedoch der zeitaufwändigste Kalibrierungsschritt und derjenige, der die Sondenspitze am ehesten beschädigt. Wenn es nicht möglich ist, den Spitzenradius direkt mittels REM oder BTR zu messen, kann alternativ ein relatives Kalibrierverfahren zur Bestimmung des effektiven Spitzenradius verwendet werden, sofern eine Standardreferenzprobe mit minimaler Oberflächenrauheit (idealerweise atomar flach) und einem bekannten Modul nahe dem erwarteten experimentellen Modul verfügbar ist. Beispiele für solche idealen Referenzstandards für die relative Kalibrierung sind Muskovit-Glimmer 17,92,93,94,95 und HOPG ⁹⁶, aber auch die Schwierigkeit zu verdeutlichen^, geeignete Referenzstandards für weichere Proben mit Moduln im kPa- bis MPa-Bereich zu identifizieren. Um eine relative Kalibrierung durchzuführen, sollte zunächst die Durchbiegungsempfindlichkeit wie im Hauptprotokoll beschrieben kalibriert werden. Zweitens sollte die Nennfederkonstante für die Sonde eingegeben werden (in der Regel mit der Sonde geliefert) oder mit einer der oben beschriebenen Methoden gemessen werden. Der dritte Schritt ist die Einkerbung auf der Modul-Referenz-Standardprobenoberfläche unter Verwendung geeigneter Parameter. Abschließend sollten die gesammelten F-D-Kurvendaten analysiert und der Spitzenradiusparameter angepasst werden, bis der experimentell gemessene reduzierte Modul mit dem erwarteten reduzierten Modul übereinstimmt. Die durchschnittliche Verformungstiefe, die an der Referenzprobe erreicht wird, sollte beachtet werden, da diese Tiefe beim Einrücken auf die zu untersuchende Versuchsprobe beibehalten werden muss, damit die Kalibrierung relevant ist. Jetzt kann eine Einkerbung auf der interessierenden Probe auftreten, wobei die Rampenparameter an die Verformungstiefe angepasst werden, die auf dem Modul-Standardreferenzmaterial erreicht wird.

Ein Vorteil des relativen Kalibrierverfahrens besteht darin, dass es potentiell akkumulierte Fehler vermeidet, die durch eine ungenaue Kalibrierung der Durchbiegungsempfindlichkeit, der Federkonstante und des Spitzenradius⁵² verursacht werden. Darüber hinaus ist es vielleicht etwas schneller und weniger wahrscheinlich, die Sonde zu beschädigen als die BTR-Methode. Die größten Nachteile der relativen Kalibriermethode sind: 1) die Notwendigkeit einer qualitativ hochwertigen Referenzprobe mit einer Oberflächenrauheit im nm- bis Angstrom-Bereich und bekannten mechanischen Eigenschaften, die denen der interessierenden Probe ähneln und mit derselben Sonde wie die experimentelle Probe analysiert werden können, und 2) die Anforderung, die gleiche oder eine sehr ähnliche Verformungstiefe sowohl auf der Referenz- als auch auf der experimentellen Probe zu erreichen, damit die Kalibrierung gültig ist. Dementsprechend ist es vorzuziehen, den Spitzenradius nach Möglichkeit direkt zu messen.

Datenanalyse
Die Analysemethode, mit der die mechanischen Eigenschaften der Probe aus den gemessenen F-D-Kurven bestimmt werden, ist ebenso wichtig wie die Qualität der Nanoindentationsdaten selbst. Es gibt mehrere gängige kontaktmechanische Theorien, die Kraft-Verschiebungs-Beziehungen auf der Grundlage unterschiedlicher zugrunde liegender Annahmen modellieren (und daher in verschiedenen Szenarien anwendbar sind). Zu diesen Modellen der Kontaktmechanik gehören Hertz 97, Sneddon²⁸, JKR (Johnson, Kendall und Roberts)98, DMT (Derjaguin, Muller und Toporov)^35,99, MD (Maugis-Dugdale)100 und MYD (Muller, Yushchenko und Derjaguin)^101,102. Eine eingehende Analyse und ein Vergleich verschiedener Modelle der Kontaktmechanik und ihrer Anwendung für die Analyse wurde an anderer Stelle vorgestellt 29,30,103,104. Obwohl es den Rahmen dieses Artikels sprengen würde, bietet Tabelle 4 einen kurzen Überblick über einige der gebräuchlichsten Modelle der Kontaktmechanik. Besonders hervorzuheben ist, dass komplexere Modelle wie JKR, DMT und andere die Auswirkungen der Spitzen-Proben-Adhäsion 30,35,98,99,100,101,102,103,104 berücksichtigen^, die signifikant sein können und oft leicht durch das Auftreten einer negativen Durchbiegung in der Kraftkurve erkennbar sind (siehe Abbildung 3). In der Praxis wird das gewählte Analysemodell verwendet, um die gesammelten F-D-Daten anzupassen und die mechanischen Eigenschaften, wie z. B. den Elastizitätsmodul, zu bestimmen. Um die Daten richtig anzupassen, ist eine flache Basislinie erforderlich, um den ersten Kontaktpunkt oder einen effektiven Kontaktpunkt zu bestimmen, der zu dem Teil der experimentellen Daten mit der größten Korrelation zum Modell passt.

Theorie	Anwendbarkeit	Annahmen	Begrenzungen
Hertz	Einfach; Wird häufig für Proben in Flüssigkeiten verwendet.	Keine Verklebung.	Ungültig für Systeme, bei denen Haftkräfte vorhanden sind.
Derjaguin-Müller-Toporov (DMT)	Steif mit kleinen Verformungen.	Nahbereichshaftung im Kontaktbereich plus langstreckenige Adhäsion außerhalb des Kontaktbereichs.	Eine eingeschränkte Geometrie kann zu einer Unterschätzung der Kontaktfläche führen.
Johnson-Kendall-Roberts (JKR)	Weich mit großen Verformungen.	Kurzfristige Adhäsionskräfte nur im Kontaktbereich.	Kann die Belastung aufgrund von Adhäsion unterschätzen.
Maugis – Dugdale (MD)	Diese allgemeine Lösung deckt die anderen Klebstoffmodelle ab.	Tip-Sample-Schnittstelle, die als Riss modelliert ist.	Analytische Lösung mit parametrischen Gleichungen.

Tabelle 4: Gängige Modelle der Kontaktmechanik. Ausgewählte gängige Modelle der Kontaktmechanik mit Anwendbarkeit, Annahmen und Einschränkungen.

Die praktische Anwendung der oben genannten Modelle zur Analyse von F-D-Kurven erfordert den Einsatz von Computersoftware, um die Stapelverarbeitung von Tausenden oder Millionen von Kurven in großem Maßstab in kurzer Zeit zu ermöglichen und die Ergebnisse statistisch zu analysieren. Bei der Analyse von F-D-Daten wird häufig eigens geschriebener Code verwendet, und verschiedene AFM-Hersteller bieten auch Softwarepakete an. Aufgrund des Open-Source-Charakters, der Benutzerfreundlichkeit und der detaillierten ergänzenden Informationen empfehlen die Autoren jedoch die Verwendung von AtomicJ²³. Das Programm ermöglicht eine einfache und genaue Analyse von F-D-Daten unter Verwendung einer der oben beschriebenen Theorien sowie mehrerer anderer. Da es sich bei dem Code um Open Source handelt, lässt er sich leicht manipulieren und für bestimmte Anwendungsfälle anpassen, ohne dass komplexer Code von Grund auf neu erstellt werden muss. Ausführliche Informationen zum AtomicJ-Softwarepaket finden Sie in Hermanowicz et ^al.23 .

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass durch sorgfältige Kalibrierung der Sonde die Kontaktfläche und die Kraft, die von einer AFM-Sondenspitze auf eine Probenoberfläche ausgeübt werden, quantifiziert werden können, um die Bestimmung der mechanischen Eigenschaften im Nanobereich, insbesondere des Elastizitätsmoduls, zu ermöglichen. Ein verallgemeinertes Protokoll, das Best Practices für die erfolgreiche Implementierung von AFM-Cantilever-basierter Nanoindentation in Luft oder Flüssigkeit sowohl an weichen als auch an harten Proben mit Elastizitätsmodulen von kPa bis GPa hervorhebt, wurde mit repräsentativen Beispielen vorgestellt. Wichtige Überlegungen wie die Auswahl der Sonde (einschließlich der Rauheit der Probenoberfläche, der Strukturgrößen, des Aspektverhältnisses der Sonde und des Spitzenverschleißes), der Sondenkalibrierung und der Datenanalyse (einschließlich kontaktmechanischer Modelle und Messstatistiken) wurden erörtert. Schließlich wurde die Kolokalisierung von AFM-abgeleiteten nanomechanischen Karten mit anderen Charakterisierungstechniken, die Informationen über die Zusammensetzung liefern, wie z.B. REM/EDS, demonstriert, sowie ein Beispiel für die Messung einer anderen nanomechanischen Eigenschaft als des Elastizitätsmoduls (d.h. der Lipid-Doppelschicht-Bruchkraft) mittels AFM-Cantilever-basierter Nanoindentation, um Beispiele für zusätzliche synergistische Anwendungen der Technik zu liefern. Zusammengenommen sollten die hier vorgestellten Beispiele und Diskussionen einen Einstiegspunkt für Forscher bieten, die die auf AFM basierende Cantilever-basierte Nanoindentation einsetzen möchten, um die mechanischen Eigenschaften praktisch jedes Probentyps zu messen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.