Атомно-силовая микроскопия Наноиндентирование на основе кантилеверов: измерения механических свойств на наноуровне в воздухе и жидкости

Summary

Количественная оценка площади контакта и силы, приложенной наконечником зонда атомно-силового микроскопа (АСМ) к поверхности образца, позволяет определять наноразмерные механические свойства. Обсуждаются лучшие практики реализации наноиндентирования на основе консолей АСМ в воздухе или жидкости на мягких и твердых образцах для измерения модуля упругости или других наномеханических свойств.

Abstract

Атомно-силовой микроскоп (АСМ) фундаментально измеряет взаимодействие между наноразмерным наконечником зонда АСМ и поверхностью образца. Если сила, приложенная наконечником зонда, и площадь его контакта с образцом могут быть количественно определены, можно определить наноразмерные механические свойства (например, упругость или модуль Юнга) исследуемой поверхности. Здесь представлена подробная процедура проведения количественных экспериментов по наноиндентированию на основе кантилеверов на основе АСМ с репрезентативными примерами того, как этот метод может быть применен для определения модулей упругости самых разных типов образцов, начиная от кПа и заканчивая ГПа. К ним относятся живые мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и ядра в физиологическом буфере, залитые смолой обезвоженные поперечные сечения сосны и сланцы Баккена различного состава.

Кроме того, наноиндентирование на основе консолей AFM используется для исследования прочности на разрыв (т.е. силы прорыва) фосфолипидных бислоев. Обсуждаются важные практические соображения, такие как выбор и разработка метода, выбор и калибровка зонда, идентификация интересующей области, гетерогенность образца, размер элемента и соотношение сторон, износ наконечника, шероховатость поверхности, а также анализ данных и статистика измерений, чтобы помочь правильной реализации метода. Наконец, продемонстрирована совместная локализация наномеханических карт, полученных на основе АСМ, с методами электронной микроскопии, которые предоставляют дополнительную информацию об элементном составе.

Introduction

Понимание механических свойств материалов является одной из наиболее фундаментальных и важных задач в машиностроении. Для анализа свойств сыпучих материалов существует множество методов характеристики механических свойств систем материалов, включая испытания на растяжение 1, испытания на сжатие² и испытания^на трех- или четырехточечный изгиб (изгиб)³. Хотя эти микромасштабные испытания могут предоставить бесценную информацию о свойствах сыпучих материалов, они, как правило, проводятся до отказа и, следовательно, являются разрушительными. Кроме того, им не хватает пространственного разрешения, необходимого для точного исследования микро- и наноразмерных свойств многих материальных систем, представляющих интерес сегодня, таких как тонкие пленки, биологические материалы и нанокомпозиты. Чтобы начать решать некоторые проблемы крупномасштабных механических испытаний, главным образом их разрушительного характера, из минералогии были заимствованы испытания на микротвердость. Твердость - это мера сопротивления материала пластической деформации в определенных условиях. Как правило, в тестах на микротвердость используется жесткий зонд, обычно изготовленный из закаленной стали или алмаза, для вдавливания в материал. Полученная глубина вдавливания и/или площадь затем могут быть использованы для определения твердости. Было разработано несколько методов, в том числе твердость по Виккерсу⁴, Кнупу⁵ и Бринеллю⁶; Каждый из них обеспечивает меру твердости материала в микромасштабе, но при разных условиях и определениях, и как таковой дает только данные, которые можно сравнить с испытаниями, проведенными в тех же условиях.

Инструментальное наноиндентирование было разработано для улучшения относительных значений, полученных с помощью различных методов испытаний на микротвердость, улучшения пространственного разрешения, возможного для анализа механических свойств, и обеспечения анализа тонких пленок. Важно отметить, что, используя метод, впервые разработанный Оливером и Фарром⁷, упругость или модуль Юнга, E, образца материала может быть определен с помощью инструментального наноиндентирования. Кроме того, используя трехсторонний пирамидальный наноинденторный зонд Берковича (чья идеальная функция площади наконечника совпадает с функцией четырехстороннего пирамидального зонда Виккерса)⁸, можно провести прямое сравнение между наноразмерными и более традиционными микромасштабными измерениями твердости. С ростом популярности АСМ наноиндентирование на основе консоли АСМ также стало привлекать внимание, особенно для измерения механических свойств более мягких материалов. В результате, как схематично показано на рисунке 1, двумя наиболее часто используемыми сегодня методами для опроса и количественной оценки наноразмерных механических свойств являются инструментальное наноиндентирование (рис. 1A) и наноиндентирование на основе консоли AFM (рис. 1B)⁹, последний из которых находится в центре внимания этой работы.

Рисунок 1: Сравнение инструментальных и консольных систем наноиндентирования на основе АСМ. Принципиальные схемы, изображающие типичные системы для проведения (А) инструментального наноиндентирования и (Б) наноиндентирования на основе АСМ на основе консоли. Эта цифра была изменена по сравнению с Qian et ^al.51. Аббревиатура: АСМ = атомно-силовая микроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Как инструментальное, так и консольное наноиндентирование на основе АСМ используют жесткий зонд для деформации интересующей поверхности образца и контроля результирующей силы и смещения в зависимости от времени. Как правило, желаемый профиль нагрузки (т.е. силы) или (Z-пьезо) смещения задается пользователем через программный интерфейс и непосредственно управляется прибором, в то время как другой параметр измеряется. Механическим свойством, наиболее часто получаемым в результате экспериментов по наноиндентированию, является модуль упругости (E), также называемый модулем Юнга, который имеет единицы давления. Модуль упругости материала является фундаментальным свойством, относящимся к жесткости связи, и определяется как отношение растягивающего или сжимающего напряжения (σ, приложенная сила на единицу площади) к осевой деформации (ε, пропорциональная деформация вдоль оси вдавливания) во время упругой (т.е. обратимой или временной) деформации до начала пластической деформации (уравнение [1]):

(1)

Следует отметить, что, поскольку многие материалы (особенно биологические ткани) на самом деле являются вязкоупругими, в действительности (динамический или сложный) модуль состоит как из упругих (хранение, в фазе), так и вязких (потеря, вне фазы) компонентов. На практике в эксперименте по наноиндентированию измеряется приведенный модуль Е *, который связан с истинным интересующим модулем выборки, Е, как показано в уравнении (2):

(2)

Где наконечник E и _{наконечник} ν — модуль упругости и отношение Пуассона, соответственно, _{наконечника} наноиндентора, а ν — расчетное отношение Пуассона образца. Коэффициент Пуассона представляет собой отрицательное отношение поперечной к осевой деформации и, следовательно, указывает степень поперечного удлинения образца при воздействии осевой деформации (например, при наноиндентификационной нагрузке), как показано в уравнении (3):

(3)

Преобразование из приведенного модуля в фактический необходимо, потому что: а) часть осевой деформации, создаваемой наконечником индентора, может быть преобразована в поперечную деформацию (т.е. образец может деформироваться за счет расширения или сжатия перпендикулярно направлению нагрузки), и б) наконечник индентора не является бесконечно твердым, и, таким образом, акт вдавливания образца приводит к некоторой (небольшой) величине деформации наконечника. Обратите внимание, что в случае, когда наконечник E >> E (т. е. _{наконечник} индентора намного тверже образца, что часто верно при использовании алмазного зонда), соотношение между приведенным и фактическим модулем образца значительно упрощается до E ≈ E*(1 - v²). В то время как инструментальное наноиндентирование превосходит его с точки зрения точной характеристики силы и динамического диапазона, наноиндентирование на основе консоли АСМ происходит быстрее, обеспечивает на порядки большую чувствительность к силе и смещению, обеспечивает визуализацию с более высоким разрешением и улучшенное определение местоположения вдавливания, а также может одновременно исследовать наноразмерные магнитные и электрические свойства⁹. В частности, консольное наноиндентирование на основе АСМ превосходит количественное определение механических свойств на наноуровне мягких материалов (например, полимеров, гелей, липидных бислоев и клеток или других биологических материалов), чрезвычайно тонких (суб-мкм) пленок (где субсубтрейные эффекты могут вступать в игру в зависимости от глубины вдавливания)^10,11 и взвешенных двумерных (2D) материалов^12,13,14, таких как графен ^15,16, слюда 17, гексагональный нитрид бора (h-BN)18 или дихалькогениды переходных металлов (TMDC; например, MoS₂)¹⁹. Это связано с его исключительной чувствительностью к силе (sub-nN) и смещению (sub-nm), что важно для точного определения начальной точки контакта и сохранения в области упругой деформации.

При наноиндентировании на основе консолей АСМ смещение зонда АСМ к поверхности образца приводится в действие калиброванным пьезоэлектрическим элементом (рис. 1B), при этом гибкий кантилевер в конечном итоге изгибается из-за силы сопротивления, возникающей при контакте с поверхностью образца. Этот изгиб или отклонение кантилевера обычно контролируется путем отражения лазера от задней части кантилевера в фотодетектор (позиционно-чувствительный детектор [PSD]). В сочетании со знанием жесткости консоли (в нН/нм) и чувствительности к прогибу (в нм/В) можно преобразовать это измеренное консольное отклонение (в V) в силу (в нН), приложенную к образцу. После контакта разница между Z-пьезодвижением и прогибом консоли дает глубину вдавливания образца. В сочетании со знанием функции площади наконечника это позволяет рассчитать площадь контакта наконечника с образцом. Наклон контактных частей результирующих кривых «сила-расстояние» или «сила-смещение» (F-D) может быть затем подогнан с использованием соответствующей модели контактной механики (см. раздел «Анализ данных ») для определения наномеханических свойств образца. В то время как наноиндентирование на основе АСМ на основе консолей обладает некоторыми явными преимуществами по сравнению с инструментальным наноиндентированием, как описано выше, оно также представляет несколько практических проблем реализации, таких как калибровка, износ наконечника и анализ данных, которые будут обсуждаться здесь. Другим потенциальным недостатком наноиндентирования на основе кантилеверов на основе АСМ является предположение о линейной упругости, поскольку радиус контакта и глубина вдавливания должны быть намного меньше радиуса индентора, чего может быть трудно достичь при работе с наноразмерными зондами АСМ и/или образцами, демонстрирующими значительную шероховатость поверхности.

Традиционно наноиндентирование было ограничено отдельными местами или экспериментами по вдавливанию с небольшой сеткой, в которых выбирается желаемое местоположение (т.е. область интереса [ROI]) и выполняется один контролируемый отступ, несколько отступов в одном месте, разделенных некоторым временем ожидания, и/или грубая сетка отступов выполняется со скоростью порядка Гц. Тем не менее, последние достижения в области АСМ позволяют одновременно получать механические свойства и топографию за счет использования высокоскоростных режимов визуализации на основе кривых силы (называемых различными торговыми наименованиями в зависимости от производителя системы), в которых кривые силы проводятся с частотой кГц под управлением нагрузкой, при этом максимальная сила наконечника образца используется в качестве заданного значения изображения. Также были разработаны методы «наведи и стреляй», позволяющие получать топографическое изображение АСМ с последующим селективным наноиндентированием в точках интереса на изображении, обеспечивая наноразмерный пространственный контроль над местоположением наноиндентирования. Несмотря на то, что это не является основным направлением этой работы, конкретные избранные примеры применения как визуализации на основе кривой силы, так и наноиндентирования на основе консолей «наведи и стреляй» представлены в репрезентативных результатах и могут использоваться в сочетании с протоколом, изложенным ниже, если он доступен на конкретной используемой платформе АСМ. В частности, в этой работе описывается обобщенный протокол для практической реализации наноиндентирования на основе консолей АСМ на любой способной системе АСМ и приводятся четыре примера использования (два в воздухе, два в жидкости) метода, включая репрезентативные результаты и подробное обсуждение нюансов, проблем и важных соображений для успешного использования метода.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за большого разнообразия коммерчески доступных АСМ и разнообразия типов образцов и применений, которые существуют для наноиндентирования на основе консолей, следующий протокол намеренно разработан так, чтобы носить относительно общий характер, фокусируясь на общих этапах, необходимых для всех экспериментов по наноиндентированию на основе консолей, независимо от прибора или производителя. Из-за этого авторы предполагают, что читатель обладает, по крайней мере, базовым знакомством с работой с конкретным инструментом, выбранным для выполнения наноиндентирования на основе консоли. Тем не менее, в дополнение к общему протоколу, описанному ниже, в качестве дополнительного материала включена подробная пошаговая стандартная операционная процедура (СОП), специфичная для АСМ и используемого здесь программного обеспечения (см. Таблицу материалов), ориентированная на наноиндентирование образцов в жидкости на основе консолей.

1. Пробоподготовка и настройка прибора

1. Подготовьте образец таким образом, чтобы свести к минимуму шероховатость поверхности (в идеале в нанометровом масштабе, ~ в 10 раз меньше предполагаемой глубины вдавливания) и загрязнение без изменения механических свойств интересующей области (областей).
2. Выберите подходящий зонд АСМ для наноиндентирования предполагаемого образца в зависимости от среды (т. е. воздуха или жидкости), ожидаемого модуля упругости, топографии образца и соответствующих размеров элементов (см. рекомендации по выбору зонда в обсуждении). Нагрузите зонд на держатель щупа (см. Таблицу материалов) и прикрепите держатель зонда к сканирующей головке AFM.
3. Выберите подходящий режим наноиндентирования в программном обеспечении AFM, который позволяет пользователю управлять отдельными пандусами (т. е. кривыми смещения силы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретный режим будет отличаться у разных производителей АСМ и отдельных приборов (см. СОП, приведенную в Дополнительных материалах для получения более подробной информации и конкретного примера).
4. Совместите лазер с задней стороны консоли датчика, напротив расположения наконечника датчика и с PSD.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См. пример применения мезенхимальных стволовых клеток для получения более подробной информации о важных соображениях при выравнивании лазера и проведении наноиндентирования в жидкости, в частности, избегая плавающего мусора и/или пузырьков воздуха, которые могут рассеивать или преломлять луч. Оптика АСМ также может нуждаться в регулировке, чтобы компенсировать показатель преломления жидкости и избежать столкновения зонда при зацеплении поверхности.
   1. Отцентрируйте пятно лазерного луча на задней части кантилевера, максимизировав суммарное напряжение (рис. 2A).
   2. Центрируйте отраженное пятно лазерного луча на PSD, регулируя сигналы отклонения X и Y (т. е. горизонтальные и вертикальные) так, чтобы они были как можно ближе к нулю (рис. 2A), тем самым обеспечивая максимальный обнаруживаемый диапазон отклонения для создания выходного напряжения, пропорционального отклонению кантилевера.
5. Если вы не уверены в топографии образца, шероховатости поверхности и/или поверхностной плотности (в случае чешуек или частиц), выполните топографическое сканирование АСМ перед любыми экспериментами по наноиндентированию, чтобы подтвердить пригодность образца, как описано в шаге 1.1 и части обсуждения, посвященной подготовке пробы.

Рисунок 2: Монитор детектора, чувствительный к положению. (A) Дисплей PSD, показывающий, что лазер правильно выровнен и отражается от задней части контактной консоли зонда в центр PSD (о чем свидетельствует большое суммарное напряжение и отсутствие вертикального или горизонтального отклонения) до попадания на поверхность образца (т.е. зонд не контактирует с образцом). (B) Напряжение вертикального отклонения увеличивается при отклонении консоли (например, при контакте зонда с образцом). Сокращения: PSD = позиционно-чувствительный детектор; VERT = вертикальный; HORIZ = по горизонтали; AMPL = амплитуда; n/a = не применяется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Калибровка зонда

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки механических свойств образца с использованием данных кривой F-D, собранных во время наноиндентирования на основе консоли, необходимы три значения: чувствительность к отклонению (DS) консольной/ PSD-системы (нм/В или В/нм), константа консольной пружины (нН/нм) и площадь контакта зонда, часто выражаемая в терминах эффективного радиуса наконечника зонда (нм) при заданной глубине вдавливания, меньшей радиуса зонда в случае сферического зонда кончик.

1. Откалибруйте DS системы зонд/АСМ, надавливая на чрезвычайно твердый материал (например, сапфир, E = 345 ГПа) таким образом, чтобы свести к минимуму деформацию образца и, таким образом, измеренное Z-движение пьезо после начала контакта наконечника с образцом преобразуется исключительно в консольное отклонение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка DS должна выполняться в тех же условиях, что и запланированные эксперименты по наноиндентированию (т.е. температура, среда и т.д.), чтобы точно отражать DS системы во время экспериментов. Для максимальной точности может потребоваться длительный (30 минут) период прогрева лазера, чтобы дать время для достижения теплового равновесия и установления стабильной выходной мощности лазера и стабильности наведения. DS необходимо повторно измерять каждый раз, когда лазер перестраивается, даже если используется один и тот же датчик, так как DS зависит от интенсивности лазера и положения на консоли, а также от качества отражения от датчика (т. е. деградация покрытия задней стороны датчика повлияет на DS) и чувствительности PSD²⁰.
   1. Установите и выполните калибровочные отступы DS на сапфире, чтобы получить примерно такое же отклонение зонда (в V или нм), что и запланированные отступы образца, поскольку измеренное смещение является функцией угла отклонения наконечника и становится нелинейным для больших отклонений.
   2. Определите DS (в нм/В) или, альтернативно, обратную чувствительность оптического рычага (в В/нм) по наклону линейной части контактного режима после начальной точки контакта на результирующей кривой F-D, как показано на рисунке 3A.
   3. Повторите рампу не менее 5 раз, записывая каждое значение DS. Используйте среднее значение значений для максимальной точности. Если относительное стандартное отклонение (RSD) измерений превышает ~ 1%, повторно измерьте DS, так как иногда первые несколько кривых F-D неидеальны из-за первоначального введения адгезионных сил.
   4. Если константа пружины консоли, k, не откалибрована на заводе (например, с помощью лазерной доплеровской виброметрии [LDV]), откалибруйте постоянную пружины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метод тепловой настройки оптимален для относительно мягких консолей с k < 10 Н/м (см. раздел обсуждения о пружинной постоянной для списка и описания альтернативных методов, особенно для жестких консолей с k > 10 Н/м). Как показано на рисунке 3B, C, термонастройка обычно интегрирована в управляющее программное обеспечение AFM.
2. Если зонд не поставляется с откалиброванным на заводе измерением радиуса наконечника (например, с помощью сканирующего электронного микроскопа [SEM]), измерьте эффективный радиус наконечника, R.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует два распространенных метода измерения радиуса наконечника (см. соответствующий раздел обсуждения), но наиболее распространенным для наконечников зонда нанометрового масштаба является метод реконструкции слепого наконечника (BTR), в котором используется стандарт шероховатости (см. Таблицу материалов), содержащий многочисленные чрезвычайно четкие (субнм) особенности, которые служат для эффективного изображения наконечника, а не наконечника для визуализации образца.
   1. При использовании метода BTR визуализируйте образец шероховатости (характеристика наконечника), используя медленную частоту сканирования (<0,5 Гц) и высокий коэффициент усиления обратной связи, чтобы оптимизировать отслеживание очень четких объектов. Выберите размер изображения и плотность пикселей (разрешение) в зависимости от ожидаемого радиуса наконечника (например, изображение размером 1024 x 1024 пикселя с площадью 3 мкм x 3 мкм будет иметь боковое разрешение ~3 нм).
   2. Используйте программное обеспечение для анализа изображений АСМ (см. Таблицу материалов) для моделирования наконечника зонда и оценки его конечного радиуса и эффективного диаметра наконечника при ожидаемой глубине вдавливания образца, как показано на рисунке 3D-F.
3. После завершения калибровки датчика введите значения DS, k и R в программное обеспечение прибора, как показано на рисунке 4A.
   1. Введите оценку коэффициента Пуассона образца, ν, чтобы можно было преобразовать измеренный приведенный модуль в фактический модуль образца⁹. При использовании модели конической или конисферической контактной механики, основанной на форме наконечника и глубине вдавливания, также необходимо ввести полуугол наконечника (рис. 4C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Модуль относительно нечувствителен к небольшим ошибкам или неопределенностям в расчетном коэффициенте Пуассона. Оценка ν = 0,2-0,3 является хорошей отправной точкой для многих материалов²¹.

Рисунок 3: Калибровка зонда. А) Определение чувствительности к прогибу. Результат репрезентативного измерения чувствительности к прогибу, проведенного на сапфировой подложке (E = 345 ГПа) для стандартного датчика режима нарезания резьбы (номинальное k = 42 Н/м; см. Таблицу материалов) с отражающим алюминиевым покрытием с обратной стороны. Показаны измеренные кривые захода на посадку (синяя трасса) и втягивания или отвода (красная трасса). Измеренная чувствительность к отклонению 59,16 нм/В была определена путем подгонки кривой захода на посадку между точками защелкивания контакта и разворота, на что указывает область между вертикальными пунктирными красными линиями. Область отрицательного отклонения, видимая на кривой втягивания/отвода до отрыва от поверхности, указывает на адгезию наконечника к образцу. (В,В) Термотюнинг. Репрезентативные спектры кантилевера теплового шума (синие следы) с соответствующими соответствиями (красные следы) для двух разных зондов. (B) Настройка тепловой настройки и параметры подгонки для стандартного датчика АСМ на основе кривой силы (см. Таблицу материалов) с его номинальной постоянной пружины k = 0,4 Н/м, используемой в качестве начального предположения. Подгонка спектра консольного теплового шума дает фундаментальную резонансную частоту f 0 = 79,8 кГц, что достаточно хорошо согласуется с номинальным значением f₀ = 70 кГц. Измеренный добротность равен 58,1. Доброта подгонки (R² = 0,99) основана на совпадении соответствия с данными между двумя вертикальными пунктирными красными линиями. Обратите внимание, что для получения точных результатов важно знать и вводить как температуру окружающей среды, так и чувствительность к отклонению. (C) Консольный спектр теплового шума и соответствующая подгонка (т.е. тепловая настройка) с результирующей расчетной постоянной пружины k = 0,105 Н/м для чрезвычайно мягкого кантилевера, используемого для выполнения наномеханических измерений на живых клетках и изолированных ядрах. Обратите внимание на значительно меньшую частоту собственного резонанса ~2-3 кГц. (Д-Ж) Реконструкция глухого наконечника. Репрезентативный рабочий процесс реконструкции глухого наконечника для зонда с алмазным наконечником (номинальное значение R = 40 нм; см. Таблицу материалов). (D) Изображение образца для определения характеристик наконечника размером 5 мкм x 5 мкм, состоящего из ряда чрезвычайно острых (субнм) титановых шипов, которые служат для изображения наконечника зонда АСМ. е) результирующая реконструированная модель (изображение с перевернутой высотой) наконечника зонда. (F) Результаты подгонки слепого наконечника, включая расчетный радиус конца R = 29 нм и эффективный диаметр наконечника 40 нм при выбранной пользователем высоте 8 нм (т.е. глубина вдавливания << R) от вершины наконечника, рассчитанные путем преобразования площади контакта наконечника с образцом на этой высоте в эффективный диаметр при условии круглого профиля (т.е. A = πr 2 = π(d/2)²) для использования с моделями сферической контактной механики. Сокращения: АСМ = атомно-силовая микроскопия; ETD = эффективный диаметр наконечника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Входы программного интерфейса. (A) Калибровочные константы зонда. Пользовательский интерфейс программного обеспечения (см. Таблицу материалов) для ввода измеренной чувствительности к прогибу, постоянной пружины и радиуса наконечника для проведения количественных наномеханических измерений. Коэффициент Пуассона как зонда, так и образца необходим для расчета упругости или модуля Юнга образца по кривым силы наноиндентирования на основе консоли. (B) Окно управления рампой. Пользовательский интерфейс программного обеспечения (см. Таблицу материалов) для постановки экспериментов по наноиндентированию на основе консолей, организованных по параметрам, описывающим саму рампу (т. е. профиль вдавливания), запуск прибора (например, управление силой и смещением), последующий анализ силы и пределы движения (для повышения чувствительности измерений за счет сужения диапазона, в котором должен работать аналого-цифровой преобразователь при управлении Z-пьезо и считывании отклонения PSD). (C) Полуугол наконечника (основанный на геометрии зонда или прямом измерении) важен, если используется коническая, пирамидальная или конисферная модель контактной механики (например, Снеддона). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Сбор данных о силовом смещении (F-D)

ПРИМЕЧАНИЕ: Значения параметров, представленные здесь (см. рис. 4B), могут варьироваться в зависимости от силы и диапазона вдавливания для данного образца.

1. Перемещайтесь по образцу под головкой AFM и занимайтесь нужной областью интереса.
   1. Следите за сигналом вертикального отклонения (рис. 2B) или выполняйте небольшую (~50-200 нм) начальную рампу (рис. 4B), чтобы убедиться, что наконечник и образец находятся в контакте (см. рис. 5A).
   2. Отрегулируйте положение головки AFM немного вверх (шагами, соответствующими ~ 50% от полного размера рампы) и снова наклоняйтесь. Повторяйте до тех пор, пока наконечник и образец не выйдут из контакта, о чем свидетельствует почти плоская рампа (рис. 5B) и минимальное вертикальное отклонение консоли (рис. 2A).
   3. Если нет очевидного взаимодействия наконечника и образца (сравните рис. 2A и рис. 2B), уменьшите головку АСМ на величину, соответствующую ~ 50%-100% размера рампы, чтобы убедиться, что наконечник зонда не врежется в образец при ручном перемещении головки АСМ. Снова набирайте рампу, повторяя до тех пор, пока не будет наблюдаться либо хорошая кривая (рис. 5D), либо кривая, аналогичная рисунку 5C. В последнем случае выполните одну дополнительную небольшую регулировку опускания головки АСМ, равную ~20%-50% от размера рампы, чтобы добиться хорошего контакта и кривой силы, аналогичной показанной на рисунке 5D.
2. Отрегулируйте параметры рампы (как описано ниже и показано в разделе Рисунок 4В) для оптимизации прибора, зонда и образца и получения пандусов, аналогичных показанным на рисунке Рисунок 5D.
   1. Выберите подходящий размер рампы (т. е. общее движение Z-пьезо за один цикл рампы) в зависимости от образца (например, толщины, ожидаемого модуля упругости, шероховатости поверхности) и желаемой глубины вдавливания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для более жестких образцов может произойти меньшая деформация образца (и, следовательно, большее отклонение зонда при данном Z-пьезодвижении), поэтому размер рампы обычно может быть меньше, чем для более мягких образцов. Типичные размеры рампы для жестких образцов и консолей могут составлять десятки нм, в то время как для мягких образцов и консолей рампы могут составлять от сотен нм до нескольких мкм; Конкретные избранные примеры применения представлены в разделе «Репрезентативные результаты». Обратите внимание, что минимальные и максимально возможные размеры рампы зависят от инструмента.
   2. Выберите подходящую частоту нарастания (1 Гц является хорошей отправной точкой для большинства сэмплов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость нарастания может быть ограничена электронными скоростями/полосами пропускания управления и/или обнаружения. В сочетании с размером рампы скорость рампы определяет скорость наконечника. Скорость наконечника особенно важно учитывать при вдавливании мягких материалов, где вязкоупругие эффекты могут вызывать артефакты^{гистерезиса 9,22}.
   3. Выберите, следует ли использовать триггерную (управляемую нагрузкой) или нетриггерную (управляемую смещением) рампу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При срабатывании рампы система будет приближаться к образцу с заданными пользователем шагами (в зависимости от размера и разрешения рампы или количества точек данных) до тех пор, пока не будет обнаружен желаемый порог срабатывания (т.е. сила заданного значения или консольное отклонение), после чего система втянется в исходное положение и отобразит кривую F-D. На рампе без срабатывания система просто удлиняет Z-пьезо на расстояние, указанное пользователем заданным размером рампы, и отображает измеренную кривую F-D. Триггерные пандусы предпочтительны для большинства случаев использования, но нетриггерные пандусы могут быть полезны при исследовании мягких материалов, которые не имеют четкой, легко идентифицируемой точки контакта.
      1. Если выбрана триггерная рампа , установите порог срабатывания (определяемое пользователем максимально допустимое усилие или отклонение рампы), чтобы привести к желаемому углублению в образец.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Использование порога срабатывания означает, что рампа может закончиться (т.е. зонд может начать втягиваться) до того, как будет достигнут указанный полный размер рампы (Z-пьезорасширение). Значения могут варьироваться от нескольких нН до нескольких мкН, в зависимости от системы наконечник-образец.
      2. Установите положение рампы , чтобы определить часть максимального диапазона Z-пьезо, которая будет использоваться для выполнения рампы. Убедитесь, что общий диапазон размеров рампы не начинается и не заканчивается за пределами максимального Z-пьезодиапазона (см. репрезентативные примеры на рисунке 6), в противном случае часть кривой F-D не будет представлять никаких физических измерений (т. е. Z-пьезо будет полностью вытянуто или втянуто, а не двигаться).
   4. Установите количество образцов на рампу (например, 512 образцов на рампу) для достижения желаемого разрешения измерения (т. е. плотности точек кривой F-D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное количество выборок/рампа может быть ограничено программными (размер файла) или аппаратными ограничениями (например, скорость аналого-цифрового [аналого-цифрового] преобразования, в зависимости от скорости нарастания). Также можно ограничить допустимый Z-пьезо или диапазон отклонения (см. параметры пределов на рисунке 4B), чтобы увеличить эффективное разрешение аналого-цифрового преобразователя системы.
   5. Установите X-вращение , чтобы уменьшить усилия сдвига на образце и наконечнике, одновременно слегка перемещая зонд в направлении X (параллельно консоли) и делая отступ в направлении Z (перпендикулярно консоли). Используйте значение для X-поворота, равное углу смещения держателя зонда относительно нормали поверхности (типичное значение 12°).
      ПРИМЕЧАНИЕ: X-поворот необходим, потому что консоль установлена в держателе зонда под небольшим углом относительно поверхности, чтобы падающий лазерный луч отражался в PSD. Кроме того, передний и задний углы наконечника зонда могут отличаться друг от друга (т. е. наконечник зонда может быть асимметричным). Более конкретную информацию можно получить у отдельных производителей датчиков и АСМ.

Рисунок 5: Оптимизация разделения наконечника и образца после включения для получения хороших кривых силы. Последовательные примеры репрезентативных кривых силового смещения, полученных при вдавливании в жидкость (фосфатно-буферный физиологический раствор) на живое ядро мезенхимальных стволовых клеток с калиброванным мягким кантилевером из нитрида кремния (номинальное k = 0,04 Н/м), оканчивающимся полусферическим наконечником радиусом 5 мкм (см. Таблицу материалов). Кривые были получены в процессе вовлечения поверхности клетки и оптимизации параметров вдавливания, при этом зондовый подход показан синим цветом, а втягивание/отвод - красным. (A) Наконечник уже находится в зацеплении и контакте с образцом до начала рампы, что приводит к большому консольному прогибу и силам без плоской базовой линии предварительного контакта. (B) После ручного перемещения наконечника достаточно далеко от образца несрабатывающая рампа размером 2 мкм приводит к почти плоской кривой F-D (т.е. практически без изменения силы). В условиях окружающей среды кривая будет более плоской, но в жидкости вязкость среды может вызвать небольшие отклонения консольного зонда во время рампы, как показано здесь, даже без контакта с поверхностью. (C) После приближения немного ближе к поверхности до начала рампы кривые подхода и втягивания показывают некоторое увеличение силы (увеличение уклона) вблизи точки поворота рампы (т.е. переход от подхода к уходу). Контрольным признаком, на который следует обратить внимание, является то, что кривые подхода (синий) и отвод (красный) начинают перекрываться (область, обозначенная черным кругом), что указывает на физическое взаимодействие с поверхностью. (D) Идеальная кривая F-D, полученная после оптимизации параметров рампы и приближения немного (~ 1 мкм) ближе к поверхности ячейки, чем в ячейке C, так что зонд проводит примерно половину рампы в контакте с ячейкой , обеспечивая достаточную деформацию для соответствия контактной части кривой приближения и определения модуля упругости. Относительно длинная, плоская базовая линия с низким уровнем шума облегчает алгоритму подгонки определение точки контакта. Аббревиатура: F-D = сила-смещение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Размер и положение рампы. Z-пьезомонитор, показывающий протяженность рампы (синяя полоса) относительно общего доступного диапазона движения Z-пьезо (зеленая полоса). (A) Z-пьезоположение находится примерно в середине диапазона его движения, на что указывает как синяя полоса, расположенная примерно посередине зеленой полосы, так и текущее Z-пьезонапряжение (-78,0 В), находящееся примерно между его полностью втянутыми (-212,2 В) и расширенными (+102,2 В) значениями. (B) Z-пьезо удлиняется относительно A без приложения напряжения смещения. (C) Z-пьезо втягивается относительно A и B. (D) Z-пьезоположение такое же, как и в C при -156,0 В, но размер рампы был увеличен по сравнению с A-C, чтобы использовать большую часть полного диапазона движения Z-пьезо. € Размер рампы слишком велик для текущего положения рампы, в результате чего Z-пьезо расширяется до конца своего диапазона. Это приведет к тому, что кривая F-D станет плоской, поскольку система не может расширить Z-пьезо дальше. Аббревиатура: F-D = сила-смещение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

4. Анализ кривой F-D

1. Выберите подходящий пакет программного обеспечения для анализа данных. Выберите и загрузите данные для анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Многие производители АСМ и программы обработки изображений АСМ имеют встроенную поддержку анализа кривой F-D. С другой стороны, повышенная гибкость и возможности специального пакета анализа кривых F-D, такого как программный пакет AtomicJ с открытым исходным кодом, могут быть полезны²³, особенно для пакетной обработки и статистического анализа больших наборов данных или реализации сложных моделей контактной механики.
2. Входные калиброванные значения для постоянной пружины, DS и радиуса наконечника зонда, а также оценки модуля Юнга и коэффициента Пуассона для наконечника зонда (на основе его состава материала) и коэффициента Пуассона образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании индентора с алмазным наконечником можно использовать значения наконечника E = 1140 ГПа и _{наконечника} ν = 0,07^21,24,25,26. Для стандартного кремниевого зонда обычно можно использовать наконечник E = 170 ГПа и _{наконечник} ν = 0,27, хотя модуль кремния по модулю Юнга изменяется в зависимости от кристаллографической ориентации²⁷.
3. Выберите модель механики контакта наноиндентирования, подходящую для наконечника и образца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для многих распространенных моделей сферических наконечников (например, Hertz, Maugis, DMT, JKR) крайне важно, чтобы глубина вдавливания в образец была меньше радиуса наконечника; в противном случае сферическая геометрия наконечника зонда уступает место конической или пирамидальной форме (рис. 4C). Для конических (например, Снеддон²⁸) и пирамидальных моделей угол полунаконечника (т.е. угол между боковой стенкой наконечника и линией, делящей пополам перпендикулярно концу наконечника; Рисунок 4В) должен быть известен и обычно доступен у производителя датчика. Для получения дополнительной информации о моделях контактной механики, пожалуйста, обратитесь к разделу «Анализ данных » на сайте thedDiscussion.
4. Запустите алгоритм подгонки. Проверьте правильность подгонки кривых F-D; низкая остаточная погрешность, соответствующая среднему значению R 2, близкому к единице (например, R² > 0,9), обычно указывает на хорошее соответствие выбранной модели^29,30. При необходимости проведите выборочную проверку отдельных кривых, чтобы визуально проверить кривую, подгонку модели и вычислить точки контакта (например, см. рисунок 7 и раздел «Анализ данных»).

Representative Results

Кривые сила-смещение
На рисунке 7 показаны репрезентативные, почти идеальные кривые F-D, полученные в результате экспериментов по наноиндентированию, проведенных на воздухе на образцах сосны, покрытых смолой (рис. 7A) и в жидкости (фосфатно-буферный физиологический раствор [PBS]) на ядрах мезенхимальных стволовых клеток (МСК) (рис. 7B). Использование любой модели контактной механики основано на точном и надежном определении начальной точки контакта наконечника с образцом. Таким образом, относительно плоская базовая линия с низким уровнем шума, предшествующая начальной точке контакта, и плавный наклон контактной части кривых F-D, показанных на рисунке 7, делают их идеальными для анализа с целью извлечения механических свойств, о чем свидетельствует превосходное согласование между кривыми сближения (синие следы) и соответствующими посадками (зеленые следы) на вставках.

И наоборот, существует несколько распространенных проблем, с которыми пользователь может столкнуться при выполнении консольного наноиндентирования, что приведет к неидеальным кривым F-D. Одной из наиболее распространенных проблем, особенно сразу после зацепления, является то, что наконечник зонда уже находится в контакте с образцом до начала рампы (рис. 5A), что препятствует получению необходимой исходной линии вне контакта для определения начальной точки контакта. Это также может привести к чрезмерно большим усилиям в случае несрабатывающих (т.е. управляемых смещений) рамп. Это вызывает особую озабоченность при выполнении большой рампы с жесткой консолью, так как возникающие силы могут сломать консоль и/или повредить образец или наконечник. Чтобы избежать этого, следите за напряжением вертикального отклонения во время и после первоначального включения. Если измеренное напряжение вертикального отклонения положительно (при условии правильного начального выравнивания), как показано на рисунке 2B, то консоль отклоняется, и наконечник соприкасается с образцом. Большие положительные напряжения соответствуют большим консольным отклонениям, но независимо от величины отклонения пользователь должен вручную поднять головку АСМ (например, с помощью шагового двигателя) от образца. Напряжение вертикального отклонения должно медленно снижаться и может даже временно опуститься ниже нуля в случае сильных сил сцепления наконечника с образцом, но в конечном итоге достигнет 0 В (или близко к 0 В), как только наконечник больше не контактирует с образцом (рис. 2A). С этого момента пользователь может возобновить оптимизацию параметров рампы и выполнение отступов.

Другая распространенная проблема (особенно для нетриггерных пандусов) заключается в том, что вся кривая F-D выглядит почти плоской, без явных признаков взаимодействия наконечника с образцом, как показано ранее на рисунке 5B. Если это доступно на приборе, решение этой проблемы состоит в том, чтобы вручную опустить головку SPM на ~ 10% меньше, чем размер рампы (чтобы избежать разрушения наконечника датчика) и снова нагнетать, повторяя до тех пор, пока не будет наблюдаться очевидное увеличение силы из-за взаимодействия наконечника с образцом (рис. 5C, D), прежде чем приступить к оптимизации других параметров рампы.

Износ наконечника
На рисунке 8 представлен пример износа наконечника в экспериментальных условиях. Одиночный, жесткий, кремниевый АСМ-зонд (см. Таблицу материалов) был использован для получения изображения нескольких больших областей образца сланца Баккена (см. соответствующий пример применения для получения более подробной информации) с использованием метода визуализации на основе кривой силы на основе быстрой (частота кГц), а метод BTR использовался для моделирования геометрии наконечника и оценки радиуса конца наконечника до и после каждого из трех последовательных изображений. Исследуемые образцы сланца состояли из матрицы глины и органического материала (E ~ 5 ГПа) с гораздо более твердыми неорганическими минеральными включениями, рассеянными повсюду (E > 30 ГПа). Поскольку образец содержал значительные различия в топографии поверхности (±2 мкм) на больших участках сканирования (85 мкм x 85 мкм), частота сканирования была установлена на минимально допустимую для используемого прибора частоту 0,1 Гц. При частоте захвата кривой силы 2 кГц и частоте сканирования 0,1 Гц в ходе одного изображения размером 1024 x 1024 пикселя было проведено более 20 миллионов взаимодействий наконечника с образцом. В результате наконечник зонда подвергся значительному износу по сравнению с его первозданным состоянием (рис. 8A) в ходе визуализации образца, увеличившись более чем на порядок с эффективного радиуса конца ~ 11 нм, полученного до ~ 129 нм в конце трех изображений (рис. 8D). Во время первого изображения наконечник, по-видимому, был сломан, что привело к большим морфологическим изменениям, наблюдаемым на рисунке 8B. На каждом последующем изображении наконечник становится все более округлым, что является отличным примером более распространенного явления постепенного износа (см. обсуждение). Расчетные радиусы наконечников от моделей БТР приведены на рисунке 8.

Напротив, на рисунке 8E, F представлены модели БТР зонда с алмазным наконечником (см. Таблицу материалов), полученного с интервалом в 6 месяцев, с тысячами нановмятин и сотнями миллионов взаимодействий между наконечником и образцом на основе визуализации кривой силы. Как видно из расчетных радиусов наконечника 29 нм (рис. 8E) и 28 нм (рис. 8F), радиус наконечника зонда не изменялся в пределах метода BTR, что подчеркивает чрезвычайную износостойкость алмаза. Однако следует отметить, что зонды с алмазным наконечником (как и все датчики AFM) подвержены загрязнению неплотно прилипшим мусором, который может повлиять на функцию области наконечника и эффективную твердость. Соответственно, чистота образца остается жизненно важной для сохранения наконечника и точных наномеханических измерений.

Примеры применения
Благодаря разумному выбору состава материала зонда, консолиевой постоянной пружины, геометрии и радиуса наконечника, наноиндентирование на основе консоли может быть использовано для количественной оценки наноразмерных механических свойств материалов с модулями упругости от кПа до ГПа, как в жидкости, так и в условиях окружающей среды. Ниже приведены избранные примеры применения, чтобы выделить некоторые из широкого спектра возможных вариантов использования наноиндентирования на основе консолей.

Исследование механических свойств сосны лоблолли для применения в биотопливе
Сосны Лоблолли (Pinus taeda) - быстрорастущий хвойный вид, который широко распространен на юге Соединенных Штатов, занимая более 13 миллионов гектаров³¹. Из-за своего обилия сосны являются важнейшей коммерческой культурой на юге США, обычно используемой как для древесины, так и для балансовой древесины. Кроме того, они являются важным ресурсом для производства целлюлозного биотоплива второго поколения³². Важно отметить, что спрос на целлюлозное биотопливо растет из-за Закона об энергетической независимости и безопасности (EISA) 2007 года, который предусматривает, что к 2022 году общее использование возобновляемого топлива в транспортной отрасли США должно составить 36 миллиардов галлонов, причем 16 миллиардов галлонов будут получены из целлюлозной биомассы. Соответственно, из-за быстрых темпов роста сосны лоблолли и пригодности для агролесоводческих проектов, она стала сырьем для биотоплива, представляющим большой интерес в последние годы³³. Знание механических свойств сосны лоблолли, включая изменчивость отдельных деревьев, анатомических фракций (например, белой древесины, коры, хвои) и клеточных областей (например, клеточной стенки по сравнению с внутренней частью), может позволить целенаправленное разделение потоков биомассы для оптимизации механической обработки и термохимической конверсии³⁴.

На рисунке 9 представлено репрезентативное изображение топографии АСМ (датчик высоты) (рис. 9А) и соответствующая карта модуля упругости (рис. 9В) образца поперечного сечения белой древесины, полученного из ветви 23-летней сосны лоблолли, с зондом с алмазным наконечником кривизны ~ 30 нм, установленным на консоль из нержавеющей стали (k = 256 Н/м). Карты топографии и модуля были построены одновременно с использованием АСМ-визуализации на основе быстрой кривой силы кГц, при этом карта модулей представляла полуколичественные результаты, основанные на номинальных значениях калибровочных констант зонда (т. е. постоянной пружины, чувствительности к отклонению и радиусе наконечника) и подгонке кривых силы в реальном времени к модели^{контактной механики DMT} (Дерягин, Мюллер и Топоров). Образцы поперечного сечения, обрезанные до размера <3 мм во всех трех измерениях (длина х ширина х высота), были подготовлены для визуализации путем серийной дегидратации с использованием возрастающих концентраций этанола (33%, 55%, 70%, 90% и 100%)³⁶, прежде чем проникнуть в смолу (см. Таблицу материалов) и полимеризоваться при 60 ° C в течение ночи. Полностью отвержденные образцы, залитые смолой, сначала шлифовали, а затем ультрамикротомировали с помощью алмазного диска, работающего со скоростью резания ~ 1 мм / с с толщиной подачи, уменьшающейся с 1 мкм до 50-70 нм на срез, чтобы получить плоскую поверхность, поддающуюся АСМ-визуализации. Однако, как видно из цветовой шкалы на рисунке 9А, результирующая поверхность в этом случае все еще относительно шероховатая, возможно, из-за присутствия остаточного мусора на поверхности образца и/или лезвии ультрамикротома, что приводит к «болтанью» лопасти во время секции, в то время как другие образцы демонстрируют гораздо более гладкую топографию поверхности.

На рисунке 9C воспроизведено изображение топографии АСМ с рисунка 9A, но с белым перекрестием, указывающим расположение восьми массивов по 50 наноотступов в каждом, которые должны быть выполнены вдоль выбранных клеточных стенок в пределах ROI, поскольку цель рассматриваемого проекта состояла в том, чтобы понять, как наномеханические свойства сосны лоблолли различаются в зависимости от различных типов тканей и возраста деревьев. Триггерный порог 1 мкН обычно использовался для рамп (номинальный размер рампы 60 нм, проводимый с частотой нарастания 1 Гц), что приводило к глубине вдавливания ~ 10 нм вдоль клеточных стенок (8 ± 2 нм во всех изученных образцах) или немного глубже (14 ± 4 нм) во внутренних слоях клеток, которые несколько мягче, чем клеточные стенки. Отступы внутри каждой строки были расположены на расстоянии ≥100 нм друг от друга, чтобы обеспечить их хорошее разделение, и 1,024 точки данных были собраны на рампу для получения хорошо охарактеризованных кривых подхода и втягивания. Комбинируя быструю визуализацию на основе кривой силы с наноиндентированием на основе консоли «наведи и стреляй», можно было генерировать статистику и определять различия в модулях между клеточными структурами. Например, как показано в таблице 1, было обнаружено, что средний модуль упругости внутренней части клетки составляет примерно половину модуля упругости клеточной стенки в образцах белой древесины, полученных из нескольких ветвей деревьев разного возраста.

Образец	Местоположение	E* (ГПа)	E (ГПа )	Деформация (нм)	Количество (n)
1	Внутренний	1.5 ± 0.4	1.4 ± 0.4	14 ± 2	199
	Стена	4.7 ± 1.3	4.3 ± 1.3	7 ± 2	202
2	Внутренний	1.3 ± 0.3	1.2 ± 0.3	16 ±3	198
	Стена	3.2 ± 0.9	2.9 ± 0.9	9 ± 2	199
3	Внутренний	1.9 ± 0.6	1.7 ± 0.6	12 ±3	198
	Стена	5.7 ± 1.2	5.2 ± 1.2	6 ± 1	199
4	Внутренний	2.4 ± 0.8	2.2 ± 0.8	11 ±3	202
	Стена	4.2 ± 2.1	3.8 ± 2.1	9 ± 4	193
5	Внутренний	2.6 ± 0.8	2.3 ± 0.8	10 ± 2	198
	Стена	4.3 ± 1.6	3.9 ± 1.6	7 ± 2	199
Средний	Внутренний	1.9 ± 0.6	1.8 ± 0.6	13 ±3
	Стена	4.4 ± 1.4	4.0 ± 1.4	8 ± 2

Таблица 1: Статистика модуля упругости сосны Loblolly: клеточные стенки в сравнении с внутренней частью клетки. Измерены модули упругости клеточных стенок по сравнению с внутренними слоями клеток для пяти образцов ветвей белой сосны, собранных с двух деревьев разного возраста. Все значения модуля были рассчитаны путем подгонки подходящей части кривой смещения силы к модели DMT и предположения коэффициента Пуассона, равного 0,3 для образца. Модули представлены как среднее ± стандартное отклонение для каждого местоположения образца, при этом указывается количество кривых силы (количество, n), проанализированных для получения отчетного результата. Измеренные приведенные модули (E*) были преобразованы в фактические модули выборки (E), предполагая, что модуль Юнга равен 1,140 ГПа, а коэффициент Пуассона равен 0.07 для используемого индентора алмазного наконечника. Показана средняя деформация образца при приложенной нагрузке 1 мкН.

Коррелированная наномеханика и электронная микроспектроскопия на сланцах Баккена
Сланцевые месторождения Баккен находятся в бассейне Уиллистон в Монтане и Северной Дакоте в Соединенных Штатах и в некоторых частях Саскачевана в Канаде. Они являются вторым по величине резервуаром углеводородов в США, но изучение месторождений все еще находится в зачаточном состоянии³⁷. Исследование наномеханических свойств сланца Bakken в зависимости от состава и термической зрелости проводилось путем совместной локализации наноиндентирования на основе консоли AFM с визуализацией сканирующего электронного микроскопа (SEM) и характеристикой элементного состава энергодисперсионной спектроскопии (EDS), как показано на рисунке 10. В частности, картирование SEM-EDS использовалось для характеристики распределения элементов (рис. 10C), тем самым определяя наличие и расположение различных минеральных включений в сланцевой матрице. Быстрое (частота кГц) изображение силы на основе кривой силы (рис. 10B) было локализовано совместно с картами SEM-EDS путем определения оптически идентифицируемого происхождения в изображении вторичного электрона (SE) SEM (рис. 10A) и отслеживания движения ступени как AFM, так и SEM³⁸. Снова используя зонд с алмазным наконечником, установленный на жесткой консоли из нержавеющей стали, стало возможным отображение вариаций модуля упругости для больших областей (85 мкм x 85 мкм), содержащих интересующие включения (рис. 10D). Обратите внимание, что карта модулей упругости, представленная на рисунке 10D, носит качественный, а не количественный характер, поскольку соответствующие константы калибровки зонда не были введены в программное обеспечение до получения изображений и данных.

Изображения АСМ на рисунках 10B и 10D также подчеркивают один из недостатков используемого зонда с алмазным наконечником, а именно его неспособность точно отслеживать особенности с высоким соотношением сторон (см. черную овальную область на рисунке 10B) из-за геометрии углового наконечника куба. Пониженное разрешение и неспособность точно отслеживать крутые участки можно более четко увидеть на рисунке 11, где та же общая область образца сланца Баккена была изображена алмазным наконечником кубического угла (рис. 11A) и значительно более четким кремниевым АСМ-зондом с более высоким соотношением сторон (рис. 11B). В частности, изображение, показанное на рисунке 11B, было получено с помощью зонда, описанного на рисунке 8A-D, между моделями БТР на рисунке 8A (R = 11 нм) и рисунке 8B (R = 43 нм). Для прямого сравнения пары изображений на рисунке 11C, D вместе с рисунком 11E, F представляют увеличенные изображения тех же особенностей поверхности образца, полученных с помощью алмазного наконечника и кремниевого зонда, соответственно, демонстрируя влияние геометрии и радиуса наконечника на разрешение и точность изображения. На рисунке 11G представлено составное 3D-изображение, сочетающее в себе топографию поверхности, полученную с помощью резкого кремниевого зонда с высоким ракурсом (рис. 8A, B), и значения модуля упругости, полученные с помощью зонда с алмазным наконечником (рис. 8E, F), закодированные в виде наложенной цветной кожи.

В дополнение к большим изображениям, показанным на рисунках 10 и 11, с использованием полностью откалиброванного зонда с алмазным наконечником были получены изображения меньшего размера (10 мкм x 10 мкм) на основе быстрой кривой силы. Эти изображения были сфокусированы на областях без оптически видимых неорганических минеральных включений, чтобы более детально исследовать свойства окружающей органической матрицы. Используя пиксельное разрешение 512 x 512 (т.е. ~ 20 нм x 20 нм пикселей выборки), было захвачено и сохранено >262 000 отдельных кривых F-D с каждым изображением размером 10 мкм x 10 мкм, что обеспечивает превосходную статистику. Данные F-D были подвергнуты пакетной обработке и анализу с использованием программного пакета^{AtomicJ 23} для реализации модели контактной механики Дерягина-Мюллера-Топорова (DMT)³⁵. После подгонки данные были очищены для удаления кривых, которые привели к расчетному модулю упругости <0 (нефизический) или >30 ГПа (поскольку исследование было сосредоточено на неминеральной части сланца, E << 30 ГПа), аналогично другим исследованиям^39,40, а также данные с модельным соответствием R² < ^0,7. Хотя отсечка R² несколько произвольна, она была выбрана только для удаления данных, которые модель явно не могла точно соответствовать. За исключением одного выброса, который включал большое минеральное включение в области изображения, удаленные кривые составляли менее 0,5% от общего объема данных для каждого изображения. Сводные статистические результаты можно найти в таблице 2. Расчетные модули упругости варьируются от 3,5 до 6,1 ГПа, в пределах того, что аналогичные исследования также обнаружили^39,40.

Образец	E (ГПа )	Урожайность после очистки данных	Количество (n)
1	6.1 ± 3.8	93.70%	7,36,874
2	5.1 ± 2.6	99.70%	7,84,267
3	3.5 ± 1.9	99.60%	7,83,427

Таблица 2: Статистика модуля упругости сланцев Баккена. Измерены модули упругости органических матриц в трех образцах сланцев Bakken различного состава и термической зрелости. Образец 1 является контрольным, в то время как образцы 2 и 3 были отжжены в течение 12 ч и 48 ч соответственно для искусственной имитации термического созревания. Модули упругости указываются как среднее ± стандартное отклонение для каждого местоположения образца, при этом количество кривых силы (количество, n) включается в анализ после использования процедуры очистки данных, описанной в указанном тексте. Рассчитанные средние модули (3,5-6,1 ГПа) находятся в пределах диапазона, о котором сообщалось в других аналогичных исследованиях, таких как Li et ^al.40, в которых был обнаружен диапазон модулей 2,9-11,8 ГПа.

Изменения жесткости ядра мезенхимальных стволовых клеток из-за внешних раздражителей
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются клетками-предшественниками, которые могут становиться хондроцитами, адипоцитами, остеобластами и миоцитами⁴¹. На дифференцировку МСК в эти различные типы тканей влияют внешние механические раздражители на клетку через линкер комплекса цитоскелета и нуклеоскелета (LINC), который физически связывает внешнюю клеточную мембрану с ядерной мембраной⁴¹. Комплекс LINC состоит из белков SUN и Nesprin, которые взаимодействуют с цитоскелетом клетки для обнаружения физических сил на клетке и облегчения ядерного импорта механочувствительных факторов β-катенина и YAP для инициации процесса дифференцировки^42,43,44. Наряду с ядерным импортом β-катенина и YAP после механостимуляции клеток цитоскелет также подвергается перестройке, включая образование F-актиновых филаментов вокруг ядра, а также ядерную транслокацию актина^44,45,46. Поскольку механостимуляция инициирует изменения в клеточном цитоскелете и ядерном входе актина, это влияет на общую жесткость (модуль) клеток и ядер и может быть измерена с помощью наноиндентирования на основе консолей AFM. Предыдущие исследования подтвердили это, обнаружив снижение клеточного и ядерного модуля после разрушения комплекса LINC и, наоборот, увеличение клеточного и ядерного модуля после механостимуляции МСК⁴⁷. Текущие исследования все еще изучают механизмы импорта актина в ядро и то, как полимеризация актина влияет на модуль упругости клеток и ядра после механостимуляции.

Чтобы исследовать механические свойства живых клеток, эксперименты должны проводиться в буферном растворе, обычно PBS. Проведение консольного наноиндентирования в жидкости создает уникальные проблемы, особенно для измерения очень мягких образцов, таких как МСК (E≈ 2 кПа). В частности, низкие модули упругости живых клеток обуславливают необходимость использования большого радиуса зонда, чтобы уменьшить напряжение, оказываемое на клеточную структуру, и избежать прокола мембраны. Кроме того, для измерения таких низких модулей упругости необходимы консолии с очень низкой пружинной постоянной (k = 0,04 Н/м), но это увеличивает вероятность ложного зацепления из-за вязкого сопротивления жидкости, что приводит к отклонению мягкой консоли во время начального шага быстрого опускания процесса зацепления AFM. Чтобы противодействовать более высокой склонности к ложным включениям, может потребоваться использовать большее заданное значение включения (т. е. порог срабатывания напряжения отклонения для завершения процесса включения). Поскольку более мягкие консоли, как правило, могут быть упруго деформированы в большей степени, чем жесткие консоли, больший изгиб, возникающий при более высоком заданном значении зацепления в жидкости, обычно не наносит вреда таким мягким зондам. Кроме того, крайне важно, чтобы растворы, используемые в жидкой среде, не содержали мусора и пузырьков, так как плавающий мусор или пузырьки могут временно мешать передаче лазера через жидкость в PSD или прилипать к кантилеверу и блокировать лазер. Помехи лазерному лучу отрицательно влияют на результирующие кривые F-D и часто приводят к ложному обнаружению аварии или ложному включению. Наконец, наноиндентирование на живых клетках также требует большего вмешательства пользователя, чем на более твердых, неодушевленных материалах. В частности, поскольку ячейки и их жидкая среда гораздо более динамичны, может потребоваться активная регулировка высоты зонда для каждой рампы, чтобы обеспечить получение хорошей кривой F-D.

При наноиндентировании живых клеток часто требуется гораздо большая деформация образца, чтобы привести к такому же прогибу кантилевера по сравнению с более жесткими образцами. Эта большая деформация может привести к экспериментальным результатам, отклоняющимся от предположения модели Герца о линейной упругости, и, следовательно, может потребоваться применение поправочного коэффициента для учета гиперупругого поведения для точного анализа F-D⁴⁸. Было обнаружено, что геометрическое соотношение размеров, где R ₂ — радиус индентора, а R₁ — радиус ячейки (см. рис. 12А), может быть использовано для прогнозирования соответствия полученных данных механике Герца. Было обнаружено, что идеальное геометрическое соотношение размеров составляет β = 0,3, при этом значения β <0,3 приводят к недооценке модуля упругости, а значения β > 0,3 приводят к переоценке модуля упругости при анализе с помощью теории контактов^{Герца 48}. Одним из распространенных способов избежать нелинейных эффектов является сохранение небольших деформаций. В этом исследовании глубина вдавливания была ограничена 500 нм-1 мкм.

Репрезентативный набор данных, показывающий результаты одной серии экспериментов по наноиндентированию на МСК и изолированных ядрах, показан на рисунке 12B. В данных, представленных на рисунке 12B, предварительно откалиброванных (постоянная пружины через LDV и радиус наконечника через SEM), полусферические зонды радиусом 5 мкм с номинальной постоянной пружины k = 0,04 Н/м использовались для исследования различий в модуле упругости между интактными живыми МСК и изолированными ядрами МСК, которые служили контролем для проверки влияния статических и динамических деформаций на ячейки и ядерно-механические свойства⁴⁶. Из-за различий между клетками и ядрами и проблем с их взаимодействием извлеченные данные о модуле имеют тенденцию демонстрировать большие вариации (т. е. распределение значений). Соответственно, набор данных на рисунке 12B представляет собой^75-й процентиль собранных данных. Из-за этой врожденной изменчивости среди живых клеток и результирующего распространения измерений рекомендуется проводить повторные эксперименты по наноиндентированию на большом количестве образцов, по крайней мере, с тремя биологическими репликами, чтобы получить надежную статистику для анализа и интерпретации данных³⁰.

Механические свойства холестеринсодержащих липидных бислоев
Поддерживаемые липидные мембраны с очень высоким (>50 мол%) содержанием холестерина (Chol), типичным для композиции, обнаруженной в мембранах хрусталика глаза, были приготовлены и инкубированы на свежерасщепленной мусковитовой слюде⁴⁹. Репрезентативное топографическое изображение АСМ такой поддерживаемой липидной мембраны (SLM), полученное при соотношении смешивания Chol/POPC (POPC = 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолин), равном 1, показано на рисунке 13A с профилем высоты вдоль фиолетовой линии на изображении, показанном под рисунком. SLM на рисунке 13A полностью покрывал открытую поверхность слюды с достаточным временем инкубации (~ 25 мин) и достаточной концентрацией липидов (0,3 мг / мл), о чем свидетельствует отсутствие различимых черт на топографическом изображении. Аналогичным образом, профиль высоты на изображении обеспечивает структурные детали, касающиеся шероховатости поверхности мембраны, при этом SLM гладкий, как и ожидалось.

На рисунке 13В представлена коллекция участков сближения силовых кривых, захваченных на SLM, показанных на рисунке 13A. Для получения более точных статистических данных о механических свойствах УЗП были собраны кривые сил в равноудаленных точках, расположенных на расстоянии не менее 100 нм друг от друга, охватывающих почти всю ширину УЗП. Расстояние между точками (≥в 10 раз больше глубины отступа) было выбрано таким образом, чтобы отступы не происходили слишком близко друг к другу. Кривые силы показывают явное событие прорыва, о чем свидетельствует разрыв или внезапный скачок между расстояниями разделения ~0 и ~5 нм в секции приближения кривых силы, где сила резко падает с ~ 10 нН до ~ 5 нН. Средняя сила прорыва мембраны, показанная на рисунке 13A (соотношение смешивания Chol/POPC, равное 1), основанная на кривых приближения на рисунке 13B, рассчитывается как 9,25 ± 0,27 нН.

Напротив, на рисунке 13C показано топографическое изображение АСМ частичной мембраны или мембранных пятен, образованных повторной инкубацией мембран при соотношении смешивания Chol/POPC, равном 1, но при гораздо более низкой концентрации липидов (~ 15 мкг / мл) и с более коротким временем инкубации (~ 5-6 мин)⁴⁹. Профиль высоты вдоль красной линии поперек мембранного пятна в центре изображения показан под рисунком. Измерение по частичному бислою обеспечивает толщину SLM, показанную черными пунктирными линиями на рисунке 13C , равную ~ 7 нм. Однако эта измеренная толщина также включает слой воды 1-2 нм между мембраной и слюдяным диском⁵⁰. Следует отметить, что частичная мембрана часто слабо прикреплена к поверхности слюды, что может привести к удалению липидных частиц с края участков частичной мембраны во время сканирования, но немного более длительное время инкубации или снижение силы визуализации может устранить эту трудность.

Калибровка датчика АСМ имеет решающее значение для точной количественной оценки механических свойств SLM. В частности, несмотря на то, что константа пружины наконечника остается неизменной в воздухе или жидкой среде, чувствительность к отклонению должна быть откалибрована в той же среде, где проводятся эксперименты. Крайне важно калибровать чувствительность к отклонению непосредственно перед каждым набором захватов кривой силы, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты, поскольку лазерное выравнивание и/или отражательная способность покрытия обратной стороны могут меняться со временем, особенно в жидкости. Очень острые зонды не рекомендуются для захвата кривых силы мембраны, так как они легко пробивают SLM и могут привести к измерению ошибочно низкой силы прорыва или вообще к отсутствию прорыва. Однако повторное использование одного и того же наконечника без надлежащей очистки увеличивает вероятность накопления мусора на наконечнике и, таким образом, притупления наконечника или влияния на адгезионное усилие наконечника с образцом. Отсутствие прорывных событий, очевидных на кривых силы сближения, также может соответствовать давлению только на слюду, а не на фактическую мембрану; Таким образом, необходимо визуальное подтверждение образования мембраны перед захватом кривых силы.

Рисунок 7: Репрезентативные кривые силы-смещения (F-D) в воздухе и жидкости. Репрезентативные кривые силы, полученные на (A) лоблоллиевой сосне в воздухе с сопутствующей подгонкой модели DMT, и (B) живом ядре MSC в PBS с сопутствующей подгонкой модели Герца. Вставки на панелях A и B показывают масштабирование области контакта соответствующих кривых сближения (синие следы) с сопутствующей посадкой (зеленые следы). На каждой панели начальная точка контакта наконечника с образцом (определенная алгоритмом подгонки) обозначена зеленым ромбом, а точка поворота (т. е. переход от подхода к втягиванию или отводу) обозначена голубым кругом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Сравнение износа кремниевого и алмазного наконечника зонда. (А-Д) Кремниевый наконечник зонда. Серия моделей, созданных методом реконструкции слепого наконечника после визуализации образца характеристик наконечника, демонстрирующих эволюцию радиуса жесткого консольного кремниевого наконечника (см. Таблицу материалов) из-за прогрессирующего износа наконечника, наблюдаемого в течение трех последовательных изображений образца сланца Баккена на основе кривой силы 85 мкм x 85 мкм (1024 x 1024 пикселей), проводится с частотой линейного сканирования 0,1 Гц и частотой дискретизации кривой силы 2 кГц (т.е. ~ 20 миллионов взаимодействий наконечника с выборкой / изображение). (A) Наконечник в том виде, в котором он был получен (из коробки), перед использованием. R = 11 нм. (B) Наконечник после одного изображения (R = 43 нм). (C) Наконечник после двух изображений (R = 94 нм). (D) Наконечник после трех изображений (R = 129 нм). (Е,Ж) Алмазный наконечник зонда. Модели БТР с одним и тем же зондом с алмазным наконечником (см. Таблицу материалов) получены с интервалом ~6 месяцев. Между получением изображений наконечника, используемых для создания моделей, показанных в E и F, с помощью зонда были выполнены тысячи наноотступов, и произошли сотни миллионов взаимодействий наконечника с образцом во время визуализации на основе кривой силы. Тем не менее, из-за твердости алмаза расчетный радиус конца наконечника ~30 нм не изменялся в пределах неопределенности метода BTR между получением начального (E) и последующего (F) изображений наконечника. Неровность, наблюдаемая в более ранней модели (обозначенная черным кругом на панели E), скорее всего, является либо артефактом метода BTR, либо из-за присутствия наноразмерного загрязнения (например, частицы пыли) на боковой стороне наконечника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Карты топографии и модуля упругости АСМ образца сосны лоблолли. Репрезентативные данные АСМ, полученные на воздухе на образце сосны с поперечным сечением, встроенном в смолу, позволяют проводить измерения наноиндентирования на клеточных стенках с помощью консолей. (A) Топографическое изображение АСМ, охватывающее несколько ячеек, полученное в режиме визуализации на основе быстрой кривой силы, представленное в виде псевдо-3D-изображения. (B) Карта упругости или модуля Юнга, генерируемая в режиме реального времени программным обеспечением АСМ путем анализа кривой силы, полученной на каждом пикселе, и подгонки данных к модели DMT, показывая, что клеточные стенки жестче, чем внутренние части клеток. Обратите внимание, что использовались номинальные, а не измеренные параметры калибровки зонда, поэтому значения модуля следует рассматривать как качественные или только полуколичественные. (C) Обзор ROI с указанием мест (восемь линий, состоящих из 50 белых перекрестий каждая, расположенных на расстоянии ≥100 нм друг от друга), где 400 наноиндентов (номинальный размер рампы 60 нм с порогом срабатывания 1 мкН, соответствующим средней глубине вдавливания ~ 10 нм) были выполнены вдоль выбранных клеточных стенок после получения изображения AFM, чтобы обеспечить обнаружение отступов с наноразмерной точностью. Масштабные линейки = 20 мкм (A, B). Сокращения: АСМ = атомно-силовая микроскопия; ДМТ = Держягин-Мюллер-Топоров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10: Совместно локализованные АСМ и СЭМ/ЭДС образца сланца Баккен. (A) Вторичное электронное СЭМ-изображение части образца сланца Баккена. (B) Топографическое изображение АСМ области, обозначенной черным прямоугольником в А. Черный овал указывает на область, в которой низкое соотношение сторон датчика приводит к визуализации боковой стенки датчика, а не к крутой топографии поверхности с высоким соотношением сторон. (C) Карта элементного состава EDS, полученная для изображения SEM, показанного в A. (D) Полученная из АСМ упругая карта или карта модуля Юнга, полученная в ходе получения изображения топографии АСМ в B, показывающая, что включение минералов в центре изображений A-D значительно тверже, чем окружающая органическая матрица. Масштабные линейки = 50 мкм. Сокращения: АСМ = атомно-силовая микроскопия; СЭМ = сканирующая электронная микроскопия; EDS = энергодисперсионная спектроскопия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 11: Влияние радиуса и формы наконечника зонда на внешний вид элементов с высоким соотношением сторон. Сравнение разрешения характеристик, полученного с использованием (A) зонда с алмазным наконечником R≈ 30 нм с низким соотношением сторон (половина угла наконечника = 47°) или (B) зонда из жесткого кремниевого зонда R≈ с высоким соотношением сторон 10 нм (половина угла наконечника ≈ 19°) (номинальное k = 200 Н/м; см. Таблицу материалов) для получения изображения того же места на образце сланца Bakken. (С-Ж) Увеличенные изображения синих (C, D) и оранжевых (E, F) областей в коробках A и B, полученные либо с помощью алмазного зонда с большим радиусом кривизны с низким соотношением сторон (C, E), либо с более четким зондом с жестким кремниевым наконечником с более высоким соотношением сторон (D, F), подчеркивая пониженное разрешение элементов и появление артефактов боковины наконечника в топографическом изображении АСМ, полученном с помощью зонда с алмазным наконечником из-за его большего радиуса наконечника и Полуугол. Области, выделенные в C-F, содержат крутые, глубокие особенности, похожие на колодцы, которые демонстрируют компромиссы с точки зрения бокового разрешения, точного отслеживания и точности изображения между более легко тусклым, изначально острым кремниевым датчиком или более тупым, износостойким датчиком с алмазным наконечником. (G) Составное 3D-изображение, полученное путем объединения топографии АСМ, полученной с помощью резкого кремниевого зонда с более высоким соотношением сторон, с данными о модуле упругости (наложенная цветная кожа), полученными в результате быстрой визуализации кривой силы той же области образца с помощью зонда с алмазным наконечником. Объекты, выделенные синими и белыми прямоугольниками в точках A и B, также обозначены буквой G. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 12: Наноиндентирование на основе консолей на клетках или ядрах. (A) Ячейка с радиусом R ₁, расположенная на плоской жесткой подложке, вдавливается на глубину d сферическим индентором с радиусом R₂. Эта цифра была воспроизведена из Ding et ^al.48. (B) Индивидуальные графики значений репрезентативных измерений модуля упругости, полученные в результате экспериментов по наноиндентированию на основе кантилеверов АСМ на МСК мыши и изолированных ядрах, извлеченных из МСК мышей. В общей сложности 10 ячеек и 10 ядер были измерены пять раз каждая на глубине вдавливания 500-600 нм (выбрано для использования модели контактной механики Герца). Полученные необработанные данные кривой F-D были обработаны с использованием Atomic J²³ для расчета модулей упругости. Из-за большой врожденной изменчивости ячеек строится^75-й процентиль данных. Клетки и изолированные ядра не показали статистической разницы в модуле упругости с измеренными средними модулями 0,75 ± 0,22 кПа и 0,73 ± 0,22 кПа соответственно. Аналогичные данные были собраны и проанализированы для определения различий в ядерной жесткости из-за механической стимуляции, нокаутов белка и химической обработки. Сокращения: МСК = мезенхимальная стволовая клетка; АСМ = атомно-силовая микроскопия; F-D = смещение силы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 13: Морфология и наномеханические свойства липидных бислоев. (A) Топографическое изображение AFM, показывающее минимальное изменение высоты полной поддерживаемой липидной мембраны (SLM), состоящей из Chol / POPC с соотношением смешивания 1, которое образуется по всей открытой поверхности слюды с длительным временем инкубации (~ 25 мин) и высокой концентрацией липидов (0,3 мг / мл). Профиль высоты вдоль фиолетовой линии в середине изображения показан под рисунком, предоставляя структурные детали поверхности мембраны. Как и ожидалось, SLM чрезвычайно плавный. b) Сбор участков сближения силовых кривых, полученных на УЗР, показанном в пункте А. Кривые сил были собраны в равноудаленных точках ≥100 нм друг от друга, охватывающих почти весь SLM. Кривые силы показывают явное событие прорыва, о чем свидетельствует разрыв или внезапный скачок на участке сближения кривых силы. Среднее усилие прорыва составляет 9,25 ± 0,27 нН. (C) Частичная мембрана или мембранные пятна, образованные инкубационными мембранами при соотношении смешивания Chol/POPC, равном 1, с более коротким временем инкубации (~5-6 мин) и более низкой концентрацией липидов (~15 мкг/мл) по сравнению с A⁴⁹. Профиль высоты вдоль красной линии на нашивке показан под изображением. Частичный бислой позволяет измерять толщину SLM, показанную черными пунктирными линиями в профиле высоты. Обратите внимание, что измеренная толщина также включает слой воды 1-2 нм между мембраной и слюдяным диском⁵⁰. Этот рисунок был адаптирован из Khadka et ^al.49 с разрешения Elsevier. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Пробоподготовка
Для наноиндентирования на воздухе распространенные методы подготовки включают криосекцию (например, образцов тканей), шлифовку и/или полировку с последующей ультрамикротомией (например, биологические образцы, залитые смолой), ионное измельчение или подготовку сфокусированного ионного пучка (например, полупроводниковые, пористые или смешанные образцы твердости, не поддающиеся полировке), механическую или электрохимическую полировку (например, металлические сплавы) или осаждение тонких пленок (например, атомно-слоевое или химическое осаждение из паровой фазы). молекулярно-лучевая эпитаксия). Цель состоит в том, чтобы создать образец с минимальной шероховатостью поверхности (в идеале в масштабе нм, ≤0,1x предполагаемой глубины вдавливания). При многих из предыдущих методов образец может потребоваться впоследствии промыть и/или обработать ультразвуком в фильтрованном растворителе высокой чистоты (например, класса ВЭЖХ) и высушить газообразным азотом (_N2) сверхвысокой чистоты (99,999%) для удаления твердых частиц. Альтернативно, хлопья (например, 2D-материалы) или частицы (например, наночастицы или микрокапсулы) могут быть покрыты отжимом или отлиты по каплям из растворов, приготовленных с использованием фильтрованных растворителей высокой чистоты. В этом случае цель состоит в том, чтобы достичь поверхностной плотности, которая дает несколько неперекрывающихся хлопьев или частиц в поле зрения в любой случайно выбранной области образца. Для наноиндентирования в жидкости (часто используемого для биологических образцов, для сохранения жизнеспособности которых буферный раствор сохраняется) необходимо осаждение или подготовка образцов на гладкой (шероховатости поверхности нанометрового масштаба) подложке (например, предметном стекле микроскопа, чашке Петри или свежерасщепленной мусковитовой слюде)^46,47,49.

Рекомендации по выбору зонда
Выбор подходящего зонда имеет первостепенное значение для количественного анализа кривых F-D, поскольку взаимодействие наконечника с образцом является фундаментальным свойством, измеряемым при наноиндентировании на основе консоли. Следующие вопросы имеют особое значение при выборе зонда для данного эксперимента. Каков ожидаемый (или измеренный) диапазон шероховатости поверхности и модуля упругости образца? Образцы с высокой шероховатостью могут вызывать ускоренный износ по сравнению с более гладкими образцами из-за повышенных боковых сил, присутствующих на наконечнике при отслеживании крутых участков, а также увеличивать вероятность событий^{поломки наконечника 53}. Точно так же, чем тверже образец, тем быстрее он будет изнашивать наконечник зонда. Кроме того, сколько изображений и/или наноотступов необходимо? При меньшем количестве изображений и вмятин можно ожидать меньшего износа наконечника. Как более подробно описано ниже, износ наконечника может быть уменьшен за счет использования алмазоподобного углеродного (DLC) покрытия или практически устранен за счет использования алмазных наконечников (при этом высокая стоимость приобретения со временем компенсируется почти бесконечным сроком службы датчика).

Еще одним соображением при выборе подходящего зонда является размер интересующих объектов. Для наноиндентирования часто лучше всего использовать максимально возможный размер наконечника при сохранении пространственного разрешения, необходимого для рассматриваемого образца (образцов), и желаемого информационного содержания, поскольку более крупные наконечники с меньшей вероятностью будут испытывать внезапные изменения геометрии наконечника из-за разрушения, а также будут демонстрировать более низкие скорости износа⁵⁴. Также важно учитывать, существуют ли другие методы АСМ, которые могут быть локализованы совместно с наноиндентированием, такие как проводящий АСМ⁵⁵, зондовая силовая микроскопия Кельвина (KPFM)56 или магнитно-силовая микроскопия (MFM)⁵⁷. Если будут использоваться дополнительные метрологии, подобные этим, наконечник зонда может быть электропроводящим или магнитным, что повлияет на состав материала и, следовательно, на множество свойств, включая твердость, износостойкость и радиус наконечника. Аналогичным образом, если вдавливание будет выполняться в жидкости, состав отражающего покрытия задней стороны датчика (если оно присутствует) является еще одним важным соображением, поскольку оно должно быть коррозионно-стойким (например, покрытие задней стороны Au является обычным для датчиков жидкости). Наконец, и, возможно, самое главное, постоянная пружины консолии зонда должна быть согласована с ожидаемым диапазоном измеряемых модулей упругости. Если постоянная пружины плохо совпадает с модулем выборки, может произойти один из двух случаев. Если консоль слишком жесткая, прогиб будет незначительным или отсутствовать, и характеристика станет невозможной; И наоборот, если кантилевер слишком мягкий, он не сможет деформировать образец настолько, чтобы измерить его механические свойства.

Износ наконечника
Износ можно определить по-разному; для обсуждения износа наконечника зонда АСМ здесь он будет определяться как любое изменение топографии поверхности наконечника зонда из-за пластической деформации без каких-либо потерь материала, а также любое удаление материала с поверхности из-за физических взаимодействий⁵⁸. В более широком смысле износ может также включать химические реакции, такие как окисление и гидратация. В обычных приложениях АСМ боковое пространственное разрешение обычно ограничено радиусом наконечника⁵⁹, а взаимодействие наконечника с образцом является основным измеряемым свойством. Поскольку радиус наконечника является ключевым параметром при моделировании контактной механики системы наконечник-образец и последующем определении механических свойств, износ наконечника вызывает особую озабоченность при проведении экспериментов по наноиндентированию и является ключевым ограничением для точной интерпретации результатов наноиндентирования⁵³. Из-за обычно постепенного износа наконечника (за исключением случаев поломки наконечника) невозможно количественно оценить износ наконечника из-за одного цикла наноиндентирования (т. е. рампы). Кроме того, перпендикулярное движение наконечника зонда относительно образца при наноиндентировании (без учета визуализации на основе быстрой кривой силы) позволяет снизить скорость износа, поскольку основным режимом износа наконечника обычно являются силы сдвига, развивающиеся во время режимов⁶⁰ сканирования. Таким образом, основным источником износа наконечника в экспериментах по наноиндентированию является любая визуализация, выполненная после первоначальной калибровки зонда (в частности, измерения чувствительности к отклонению и радиуса наконечника), но до наноиндентирования. Поэтому рекомендуется, если используются зонды из кремния или нитрида кремния, радиус наконечника следует проверять как до, так и после каждого эксперимента для мониторинга и учета любого износа наконечника с использованием одного из методов, описанных выше (например, анализ SEM или BTR).

Материалы зонда
Алмазоподобный углерод (DLC)
Благодаря использованию наконечников зондов с DLC-покрытием или алмазных наконечников износ наконечника может быть значительно уменьшен или полностью сведен на нет⁵³. Повышенная износостойкость этих альтернативных материалов наконечников очень привлекательна для измерения механических свойств, особенно очень жестких материалов. Было показано, что наконечники зондов DLC могут демонстрировать увеличение износостойкости в 1,600 раз по сравнению с обычными кремниевыми наконечниками⁵⁴. Такое резкое повышение износостойкости можно объяснить несколькими факторами. Во-первых, связи, присутствующие в DLC (C-C и C = C) и его интерфейс с кремнием (Si-O, Si-C), являются одними из самых прочных связей любых элементарных пар и намного прочнее, чем связи Si-Si, присутствующие в кремниевых наконечниках. DLC также имеет эффект уменьшения трения, что, в свою очередь, снижает напряжения сдвига внутри наконечника, тем самым уменьшая износ. Кроме того, химический состав поверхности DLC отличается от химического состава кремниевого наконечника, поскольку кремниевые наконечники могут подвергаться трибохимическому травлению в условиях влажности окружающей среды, в то время как наконечники DLC этого не делают (или, по крайней мере, не каким-либо значимым образом по сравнению с режимом первичного износа)⁵⁴. Основным недостатком наконечников с DLC-покрытием (помимо увеличения цены по сравнению со стандартными силиконовыми наконечниками без покрытия) является увеличенный радиус наконечника из-за самого покрытия. Большинство радиусов наконечников датчиков DLC составляют ≥30 нм, тогда как наконечники без покрытия DLC могут надежно достигать 1-2 нм в радиусе⁶¹. Тем не менее, больший радиус наконечника часто может быть желателен для экспериментов по наноиндентированию, чтобы уменьшить погрешность в измерениях свойств, поскольку наноразмерные расхождения между идеальной функцией площади-глубины и фактической функцией площади-глубины из-за дефектов или неровностей зонда будут непропорционально влиять на измерения, выполненные с датчиками меньшего радиуса из-за большей относительной погрешности. Кроме того, несмотря на превосходную износостойкость, покрытие DLC может в конечном итоге изнашиваться пятнами, что приводит к дифференциальному износу между открытым кремниевым сердечником и оставшимся покрытием DLC. К сожалению, износостойкость покрытия DLC также может быть ограничена адгезией покрытия к силиконовому наконечнику, а не только фактической твердостью покрытия.

Алмаз
Алмаз хорошо известен как один из самых твердых и износостойких материалов на Земле. Тем не менее, было продемонстрировано, что значительный износ алмазных наконечников все еще может происходить при использовании больших (60 мкН) сил в преднамеренной попытке исследовать износ наконечника⁶². И наоборот, в обычных сценариях наноиндентирования и визуализации, где силы, действующие на наконечник, намного меньше, не проводилось строгих исследований износа алмазного наконечника. Однако, как видно на рисунке 8E, F, моделирование БТР одного и того же алмазного наконечника зонда в идентичных условиях на одном и том же образце характеристик наконечника с интервалом в 6 месяцев привело к практически неразличимым моделям формы наконечника (т. е. без заметных признаков износа). Между первым и вторым изображениями BTR зонд использовался для выполнения тысяч наноотступов и подвергся сотням миллионов взаимодействий наконечника с образцом при визуализации различных жестких материалов (E > 15 ГПа), включая древесину (сосну), сланец, высокоупорядоченный пиролитический графит (HOPG) и различные тонкие пленки графена. Примечательно, что расчетный радиус наконечника изменился на ~ 1 нм между двумя изображениями на рисунке 8E, F, что находится в пределах погрешности⁶³ метода BTR. Хотя это и не полное исследование, это сравнение демонстрирует превосходную долговечность алмазного зонда в нормальных условиях экспериментального наноиндентирования (и даже визуализации). Основными недостатками, связанными с использованием алмазных наконечников (помимо дорогостоящих первоначальных затрат), являются увеличенный радиус наконечника и, в некотором роде более серьезный, низкое соотношение сторон геометрии кубического угла большинства коммерчески доступных алмазных наконечников. На рисунке 11A,B представлены параллельные сравнительные АСМ-изображения той же области образца сланца Баккена, полученные с помощью острого кремниевого зонда с номинальным радиусом наконечника 8 нм и средним полууглом ~ 19° по сравнению с зондом с алмазным наконечником с номинальным радиусом наконечника 40 нм и средним боковым углом 47°. При сравнении увеличенных областей (рис. 11C, D и рис. 11E, F) становится очевидным, что щуп с алмазным наконечником не может разрешать и точно отслеживать более крутые (с более высоким соотношением сторон) объекты на изображении. Вместо этого, там, где присутствуют крутые участки, боковая стенка наконечника соприкасается с верхним краем, и система АСМ по существу отслеживает боковую стенку зонда до тех пор, пока конец наконечника снова не соприкоснется с поверхностью и нормальное отслеживание не возобновится.

Согласование постоянной пружины/модуля упругости
Как упоминалось выше, постоянная пружины консолии зонда должна быть согласована с ожидаемым диапазоном измеряемых модулей упругости. Чтобы помочь в выборе подходящего зонда, в таблице 3 представлены предлагаемые приблизительные номинальные константы консольной пружины, подходящие для выбранных широких диапазонов ожидаемых модулей упругости образца в диапазоне от нескольких МПа до 100 ГПа в случае наконечников зондов радиусом ~30-40 нм, часто используемых для наноиндентирования⁵². Датчики постоянной пружины с более низкой пружиной (k < 0,1 Н/м) доступны для еще более мягких материалов (диапазон кПа), таких как ячейки.

Постоянная пружины (Н/м)	Ожидаемый диапазон модуля отбора проб
0.25	≤ 15 МПа
5	5 – 500 МПа
40	200 – 8,000 (0.2 – 8 ГПа)
200	1,000 – 50,000 (1 – 50 ГПа)
450	10 000 – 100 000 (10 – 100 ГПа)

Таблица 3: Идеальные константы пружины зонда для измерения различных диапазонов модулей упругости. Приблизительные номинальные константы пружины зонда для оптимального измерения модулей упругости в различных диапазонах от нескольких МПа до 100 ГПа, при условии, что типичный радиус зонда ~30-40 нм⁵².

В дополнение к постоянной пружины, в особом случае биологических материалов, необходимо тщательно учитывать радиус наконечника и силы, приложенные во время визуализации и наноиндентирования, чтобы избежать повреждения. В прикладном примере , включающем измерение механических свойств холестеринсодержащих липидных бислоев, представленном в репрезентативном разделе результатов, относительно острый (10 нм) наконечник был специально использован для анализа силы прорыва в липидных бислоях. Напротив, если ROI материала достаточно велик (например, как в случае с клетками и ядрами клеток) и есть опасения относительно возможности прокола, более крупные полусферические наконечники микронного масштаба, подобные тем, которые используются при измерениях жесткости ядер МСК, описанных в одном из примеров применения в разделе репрезентативных результатов, являются идеальными и обеспечивают отличные результаты для мягких, хрупкие образцы, такие как живые клетки и изолированные ядра. Kain et al. представляют подробное обсуждение того, как выбрать оптимальную комбинацию радиуса зонда и постоянной пружины для достижения максимально возможной чувствительности измерений для таких образцов⁶⁴.

Калибровка зонда
Чувствительность к прогибу
Чувствительность к прогибу связывает движение Z-пьезо (и, следовательно, отклонение кантилевера при вдавливании на бесконечно жесткую подложку, предполагая работу в пределе малых отклонений) с измеренным изменением напряжения на PSD⁶⁵. Чувствительность к отклонению (также иногда называемая обратной чувствительностью оптического рычага [InvOLS]) может быть указана в нм/В или В/нм. Ниже приведен обзор наиболее распространенных методов калибровки чувствительности к прогибу.

Контакт с твердой поверхностью
Самым простым и популярным методом определения чувствительности к отклонению лазера отражения луча/АСМ-зонда/системы PSD является метко названный метод⁶⁵ «контакта с твердой поверхностью». Его простота, легкость интеграции в рабочие процессы программного обеспечения для управления АСМ и природа на месте - все это делает метод контакта с твердой поверхностью привлекательным и широко используемым. Чтобы реализовать этот метод, наконечник зонда АСМ прижимается к материалу, намного более жесткому, чем консоль. Наклон контактной части кривой силы-смещения (отображаемый в виде вольт сигнала об ошибке вертикального отклонения на PSD в зависимости от движения Z-пьезо в нм или приложенном напряжении) дает чувствительность к отклонению (рис. 3A). Использование жесткой подложки гарантирует, что все измеренные прогибы возникают из-за изгиба кантилевера, а не из-за свертки деформации образца и смещения консоли. В случае мягких консолей (например, k < 10 Н/м) кремний (E ≈ 170 ГПа)²⁷ или слюда¹⁷ являются легкодоступными и легко используемыми материалами (или, альтернативно, стеклом, E≈ 70 ГПа, или соответствующим твердым пластиком в случае клеток, иммобилизованных на предметном стекле микроскопа или чашке Петри), в то время как для более жестких консолей например, те, которые используются для некоторых экспериментов по наноиндентированию (например, k > 200 Н/м; Таблица 3), сапфир (E≈ 345 ГПа)^26,66, возможно, потребуется использовать для предотвращения деформации образца. Поскольку этот метод зависит от измерения силы перемещения, Z-пьезо сканера АСМ должно либо использовать датчик высоты с замкнутым контуром, либо быть хорошо откалибровано (при работе в режиме разомкнутого контура) с использованием различных стандартов высоты. Наибольший вклад в ошибку в методе контакта с твердой поверхностью вносит перемещение лазерного пятна на кантилевер из-за тепловых флуктуаций. Изменения температуры кантилевера чаще всего вызваны лазером обнаружения, хотя джоулев нагрев в окружающей электронике также может внести свой вклад. Сообщалось об общей разнице температур в 6 °C между консольным и окружающим воздухом, что может привести к смещению лазерного пятна на несколько микрон⁶⁷. Чтобы учесть любой нагрев, рекомендуется подождать ≥30 минут после первоначального выравнивания лазерного пятна, чтобы позволить кантилеверу прийти в тепловое равновесие с окружающей средой для достижения наилучших и наиболее точных результатов. Усреднение наклонов кривых захода на посадку и съезда для каждого измерения чувствительности будет учитывать любые эффекты трения или скольжения наконечника и должно быть введено по возможности⁶⁸. Кроме того, усреднение по нескольким измерениям чувствительности поможет оценить надежность и воспроизводимость измерений. Хорошие измерения чувствительности должны приводить к отклонениям в ≤1% и выполняться примерно с тем же отклонением, что и ожидаемые экспериментальные наноотступы, чтобы максимизировать эффективность калибровки⁶⁹. Основным недостатком метода контакта с твердой поверхностью является то, что физический контакт, необходимый для калибровки, может потенциально привести к повреждению хрупких кремниевых наконечников (например, затупление или создание артефактов наконечника, таких как двойной наконечник).

Метод теплового шума
Термический шумовой метод определения чувствительности к прогибу требует предварительной калибровки постоянной консольной пружины и возможности измерения спектра теплового шума кантилевера⁶⁷. Метод теплового шума часто интегрируется в современное программное обеспечение для управления АСМ и может использоваться в тандеме с методом Садера (см. ниже) для быстрого анализа и расчета как постоянной пружины, так и чувствительности к отклонению. Однако может быть трудно или невозможно использовать метод теплового шума на более жестких (k > 10 Н/м) консолях из-за снижения амплитуды вибрации. Кроме того, сообщаемая относительная неопределенность метода теплового шума значительно больше, ~ 20% по сравнению с методом контакта с твердой поверхностью, описанным выше⁷⁰. Этот метод не может быть использован, если используется метод тепловой настройки для определения постоянной пружины, описанный ниже⁶⁷.

Весенняя постоянная
Золотым стандартом для измерения констант консольной пружины является лазерная доплеровская виброметрия (LDV), и в настоящее время существует множество коммерчески доступных датчиков, которые поставляются с информацией о калибровке константы пружины, полученной из LDV, предоставляемой производителем для каждого отдельного датчика (см. Таблицу материалов). Однако, в то время как точное измерение постоянной консольной пружины является абсолютной необходимостью для количественных наномеханических измерений, практические методы для этого в типичной лаборатории для некалиброванных зондов широко варьируются и могут быть несколько сложными. Таким образом, здесь представлен лишь краткий обзор двух наиболее распространенных методов калибровки постоянной пружины на месте, а также список дополнительных методов и соответствующие ссылки на литературу, к которым можно обратиться для получения дополнительной информации.

Метод термонастройки
Вероятно, наиболее распространенный метод, доступный в современных коммерческих АСМ, метод тепловой настройки для определения констант консольной пружины встроен в управляющее программное обеспечение для многих систем. Несмотря на то, что метод тепловой настройки не идеален для более жестких консолей (k > 10 Н/м) из-за уменьшенного обнаружения консольного отклонения и ограниченной полосы пропускания электроники, метод тепловой настройки относительно прост в реализации и действителен для широкого диапазона геометрии наконечника⁷¹. Метод тепловой настройки использует измерение и подгонку спектра теплового шума консоли с последующим применением теоремы о равнораспределении для расчета потенциальной энергии консоли, при этом кантилевер обычно моделируется как простой гармонический осциллятор⁷². Метод термонастройки имеет погрешность ~5%-10% для мягких зондов и применим для любой формы консоли^73,74. Для получения более подробной информации см. ссылки, приведенные в этом разделе.

Метод Сейдера
Метод Сейдера является еще одним методом, часто интегрируемым в программное обеспечение управления многими современными АСМ^75,76,77. Метод Садера использует гидродинамическую нагрузку, испытываемую консолью, когда она вибрирует в жидкой среде (обычно в воздухе или воде), а также размеры и коэффициент качества консоли для расчета постоянной консольной пружины. Метод Садера приводит к погрешности ~10%-15% для константы^{консольной пружины 74}. Более подробную информацию можно получить в соответствующих документах по «оригинальному методу»^76,78, «общему методу»^79, расширению общего метода ⁷⁷ и документации по конкретному инструменту.

Другие методы
Существует несколько других методов, которые были разработаны и внедрены для определения постоянной пружины консолей АСМ, которые выходят за рамки данной статьи. Хотя ни один из этих методов не так прост в реализации и не так широко распространен, как методы калибровки Sader или термической настройки, каждый из них обладает уникальными преимуществами и недостатками; В цитируемой литературе приводится подробная информация об их применении и реализации. В частности, Sikora предоставляет отличный обзор многих методов калибровки пружинных постоянных и является отличным ресурсом по теме⁷². Неполный список других методов определения констант пружины включает лазерную доплеровскую виброметрию (LDV)73,74,80, устройства⁸¹ на основе микроэлектрическо-механических систем (MEMS), опорную консоль 82,83, добавленную массу (как динамическую ⁷⁵, так и статическую ⁸⁴), прецизионный баланс^85,86, электромагнитное срабатывание ⁸⁷ и анализ методом конечных элементов (FEA) ^88,89.

Радиус наконечника
Общие методы определения радиуса наконечника включают как визуализацию вторичного электронного СЭМ, так и метод реконструкции слепого наконечника (BTR).

SEM-анализ
Вторично-электронная СЭМ-визуализация может обеспечить разрешение до 1 нм, что позволяет напрямую и легко сравнивать прогрессивные изображения износа. Недостатком визуализации SEM является то, что, поскольку существует только высокоэкспериментальные комбинированные инструменты AFM-SEM⁹⁰, зонд AFM обычно должен быть размонтирован и транспортирован в SEM для анализа, что может занять много времени и потенциально подвергнуть зонд загрязнению. Еще одним недостатком SEM является то, что полученное изображение по своей сути является 2D-проекцией наконечника без какой-либо количественной 3D-информации. Необходимо позаботиться о том, чтобы каждый раз выравнивать зонд в одной и той же ориентации, чтобы сравнительные результаты были значимыми, поскольку даже небольшие изменения угла падения электронного пучка могут изменить видимый размер и форму наконечника зонда. Наконец, визуализация SEM может страдать от эффектов зарядки и углеродного загрязнения, которые могут размыть изображение или вызвать физические изменения наконечника зонда соответственно.

Реконструкция глухого наконечника
В отличие от SEM, метод BTR представляет собой метод in situ , в котором 3D-геометрия наконечника моделируется на основе визуализации образца с многочисленными резкими (с высоким соотношением сторон) особенностями, намного меньшими, чем радиус зонда. Этот метод работает, потому что в АСМ наблюдаемое изображение всегда представляет собой свертку формы наконечника зонда и формы элемента образца, поэтому, моделируя чрезвычайно резкие черты как бесконечно резкие, можно оценить форму наконечника. К сожалению, в дополнение к предположению о бесконечно острых шипах (т.е. поверхностных особенностях, намного меньших, чем радиус кончика), на технику БТР могут влиять шумы визуализации и параметры сканирования, поэтому сравнительные изображения должны быть получены с использованием очень похожих параметров изображения. Кроме того, поскольку для восстановления его геометрии используется несколько «изображений» наконечника, прямой обратный расчет формы наконечника один к одному невозможен. Из-за своей природы метод BTR практически способен информировать пользователя только о верхней границе формы⁶³ наконечника, и акт визуализации зонда для реализации метода BTR может привести к износу наконечника (например, затуплению или сколу наконечника зонда).

Относительная калибровка
Иногда конкретное свойство зонда не может быть легко и точно измерено. Например, постоянную пружины более жестких консолей трудно или невозможно измерить с помощью метода тепловой настройки из-за ограничений полосы пропускания и отклонения⁹¹. Как обсуждалось выше, существуют и другие методы определения постоянной пружины, но поскольку метод тепловой настройки интегрирован во многие современные АСМ, он часто применяется для простого повседневного использования. Аналогичным образом, чувствительность к отклонению всегда должна быть откалибрована перед экспериментами по преобразованию движения лазера на PSD в физическое отклонение консоли зонда. Однако с практической точки зрения измерение радиуса наконечника является наиболее трудоемким этапом калибровки и наиболее вероятным повреждением наконечника зонда. Если невозможно непосредственно измерить радиус наконечника с помощью СЭМ или БТР, то в качестве альтернативы для определения эффективного радиуса наконечника может быть использована процедура относительной калибровки при условии наличия стандартного эталонного образца с минимальной шероховатостью поверхности (в идеале атомарно плоской) и хорошо известного модуля, близкого к ожидаемому экспериментальному модулю. Примеры таких идеальных эталонов для относительной калибровки включают мусковитовую слюду 17,92,93,94,95 и HOPG ⁹⁶, но также служат для того^, чтобы подчеркнуть трудность в определении подходящих эталонов для более мягких образцов с модулями в диапазоне от кПа до МПа. Чтобы выполнить относительную калибровку, сначала следует откалибровать чувствительность отклонения, как описано в основном протоколе. Во-вторых, номинальная постоянная пружины для зонда должна быть введена (обычно поставляется с датчиком) или измерена с помощью одного из методов, описанных выше. Третьим этапом является индентирование на поверхности эталонного эталонного образца модуля с использованием соответствующих параметров. Наконец, собранные данные кривой F-D должны быть проанализированы, и параметр радиуса наконечника должен быть скорректирован до тех пор, пока экспериментально измеренный приведенный модуль упругости не будет соответствовать ожидаемому уменьшенному модулю. Следует принять к сведению среднюю глубину деформации, достигнутую на эталонном образце, так как эта глубина должна сохраняться при отступах на интересующем экспериментальном образце для того, чтобы калибровка была актуальной. Теперь можно выполнить вдавливание на интересующем образце, отрегулировав параметры рампы в соответствии с глубиной деформации, достигнутой на эталонном эталонном материале с модулем упругости.

Одним из преимуществ метода относительной калибровки является то, что он позволяет избежать потенциальных накопленных ошибок, вызванных неточной калибровкой чувствительности прогиба, постоянной пружины и радиуса наконечника⁵². Кроме того, это, возможно, немного быстрее и с меньшей вероятностью повредит зонд, чем метод BTR. Самыми большими недостатками метода относительной калибровки являются: 1) потребность в высококачественном эталонном образце с шероховатостью поверхности от nm до ангстрема и хорошо известными механическими свойствами, аналогичными свойствам интересующего образца, который может быть проанализирован с помощью того же зонда, что и экспериментальный образец, и 2) требование достижения одинаковой или очень похожей глубины деформации как на эталонном, так и на экспериментальном образцах для того, чтобы калибровка была действительной. Соответственно, предпочтительно непосредственно измерять радиус наконечника, если это вообще возможно.

Анализ данных
Метод анализа, используемый для определения механических свойств образца по измеренным кривым F-D, так же важен, как и качество самих данных наноиндентирования. Существует несколько распространенных теорий контактной механики, которые моделируют отношения силы и смещения, основанные на различных базовых предположениях (и, следовательно, применимые в разных сценариях). Эти модели контактной механики включают Hertz 97, Sneddon 28, JKR (Джонсон, Кендалл и Робертс)⁹⁸, DMT (Держагин, Мюллер и Топоров)^35,99, MD (Maugis-Dugdale)100 и MYD (Мюллер, Ющенко и Держагин)^101,102. Углубленный анализ и сравнение различных моделей контактной механики и их применение для анализа были представлены в другом месте 29,30,103,104. Хотя это выходит за рамки данной статьи, в таблице 4 представлен краткий обзор некоторых наиболее распространенных моделей контактной механики. Следует особо отметить, что более сложные модели, такие как JKR, DMT и другие, включают эффекты адгезии наконечника к образцу 30,35,98,99,100,101,102,103,104^, которые могут быть значительными и часто легко идентифицируются по появлению отрицательного прогиба на кривой силы (см. рис. 3). На практике выбранная расчетная модель используется для подгонки собранных данных F-D и определения механических свойств, таких как модуль упругости. Чтобы правильно подогнать данные, необходима плоская базовая линия для определения начальной точки контакта или эффективной точки контакта, которая соответствует части экспериментальных данных с наибольшей корреляцией с моделью.

Теория	Применимость	Предположения	Ограничения
Герц	Простой; Часто используется для проб в жидкости.	Отсутствие адгезии.	Недопустимо для систем, в которых присутствуют силы сцепления.
Держягин-Мюллер-Топоров (DMT)	Жесткая с небольшими деформациями.	Сцепление на близком расстоянии в области контакта плюс адгезия на большом расстоянии за пределами области контакта.	Ограниченная геометрия может привести к недооценке площади контакта.
Джонсон-Кендалл-Робертс (JKR)	Мягкий с большими деформациями.	Силы сцепления на близком расстоянии только в области контакта.	Может недооценивать нагрузку из-за адгезии.
Могис – Дагдейл (Мэриленд)	Это общее решение распространяется на другие модели клеев.	Интерфейс наконечника-образца смоделирован в виде трещины.	Аналитическое решение с использованием параметрических уравнений.

Таблица 4: Модели общей контактной механики. Выбраны модели общей контактной механики с указанием применимости, допущений и ограничений.

Практическое применение упомянутых выше моделей для анализа кривых F-D требует использования компьютерного программного обеспечения для обеспечения крупномасштабной пакетной обработки тысяч или миллионов кривых за короткий промежуток времени и выполнения статистического анализа результатов. Собственный письменный код часто используется при анализе данных F-D, и различные производители AFM также предоставляют программные пакеты. Однако из-за его открытого исходного кода, простоты использования и подробной дополнительной информации авторы рекомендуют использовать AtomicJ²³. Программа позволяет проводить простой и точный анализ данных F-D, используя любую из описанных выше теорий, а также несколько других. Поскольку код является открытым исходным кодом, им легко манипулировать и настраивать его для конкретных случаев использования без необходимости создавать сложный код с нуля. Обратитесь к Hermanowicz et ^al.23 для получения подробной информации о программном пакете AtomicJ.

В заключение, благодаря тщательной калибровке зонда, площадь контакта и сила, приложенные наконечником зонда АСМ к поверхности образца, могут быть количественно определены, чтобы можно было определить наноразмерные механические свойства, в частности модуль упругости. С репрезентативными примерами был представлен обобщенный протокол, в котором изложены передовые методы успешного внедрения наноиндентирования на основе консолей АСМ в воздухе или жидкости как на мягких, так и на твердых образцах с модулями упругости в диапазоне от кПа до ГПа. Были обсуждены такие важные соображения, как выбор датчика (включая шероховатость поверхности образца, размеры элементов, соотношение сторон датчика и износ наконечника), калибровка датчика и анализ данных (включая модели контактной механики и статистику измерений). Наконец, была продемонстрирована совместная локализация наномеханических карт, полученных из АСМ, с другими методами характеризации, обеспечивающими композиционную информацию, такими как SEM/EDS, а также пример измерения наномеханических свойств, отличных от модуля упругости (т.е. силы разрыва липидного бислоя) с помощью наноиндентирования на основе консолей АСМ для предоставления примеров дополнительных синергетических применений метода. Взятые вместе, приведенные здесь примеры и обсуждение должны стать отправной точкой для исследователей, стремящихся использовать наноиндентирование на основе консолей АСМ для измерения механических свойств практически любого типа образца.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic force microscope	Bruker	Dimension Icon	Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces
AtomicJ	American Institute of Physics	https://doi.org/10.1063/1.4881683	Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry, “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683
Buffer solution (PBS)	Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4)	S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4)	Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use.
Chloroform
Diamond tip AFM probe	Bruker	PDNISP	Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe.
Diamond ultramicrotome blade	Diatome	Ultra 35°	2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation
Epoxy	Gorilla Glue	26853-31-6	Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes.
Ethanol
LR white resin, medium grade (catalyzed)	Electron Microscopy Sciences	14381	500 mL bottle, Lot #150629
Mesenchymal stem cells (MSCs)	N/A	N/A	MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070.
Modulus standards	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck).
Muscovite mica	Ted Pella	50-12	12 mm diameter, V1 grade muscovite mica
Nanscope Analysis	Bruker	Version 2.0	Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves.
Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine)	Avanti Polar Lipids	POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5	POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL).
Probe holder (fluid, lipid bilayers)	Bruker	MTFML-V2	Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM.
Probe holder (fluid, MSCs)	Bruker	FastScan Bio Z-scanner	Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154.
Probe holder (standard, ambient)	Bruker	DAFMCH	Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping)
Sample Puck	Ted Pella	16218	Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459
Sapphire substrate	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Scanning electron microscope	Hitachi	S-3400N-II	Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V.
Silicon AFM probes (standard)	NuNano	Scout 350	Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2).
Silicon AFM probes (stiff)	Bruker	RTESPA-525, RTESPA-525-30	Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe.
Silicon carbide grit paper (abrasive discs)	Allied	50-10005	120 grit
Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip)	Bruker	MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC	Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m.
Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip)	Bruker	DNP	4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm.
Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip)	Bruker	ScanAsyst-Air	Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging.
Superglue	Henkel	Loctite 495	Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available.
Syringe pump	New Era Pump Systems	NE1000US	One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity
Tip characterization standard	Bruker	PFQNM-SMPKIT-12M	Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit.
Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999%	Norco	SPG TUHPNI - T	T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples
Ultramicrotome	Leica	EM UC6	Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation)
Ultrapure water	Thermo Fisher	Barnstead Nanopure Model 7146	Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber.
Variable Speed Grinder	Buehler	EcoMet 3000	Used with silicon carbide grit papers during hand polishing.
Vibration isolation table (active)	Herzan	TS-140	Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab).
Vibration isolation table (passive)	TMC	65-531	35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top.