Summary
原子間力顕微鏡(AFM)プローブチップが試料表面に与える接触面積と力を定量化することで、ナノスケールの機械的特性測定が可能になります。弾性率やその他のナノ機械的特性を測定するために、柔らかいサンプルと硬いサンプルの空気または流体にAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを実装するためのベストプラクティスについて説明します。
Abstract
原子間力顕微鏡(AFM)は、ナノスケールのAFMプローブ先端とサンプル表面との相互作用を根本的に測定します。プローブ先端によって加えられる力とそのサンプルとの接触面積を定量化できれば、プローブされる表面のナノスケールの機械的特性(弾性率やヤング率など)を決定することができます。ここでは、定量的AFMカンチレバーベースのナノインデンテーション実験を実行するための詳細な手順を、kPaからGPaまでのさまざまなサンプルタイプの弾性率を決定するためにこの手法を適用する方法の代表的な例とともに提供します。これらには、生きた間葉系幹細胞(MSC)と生理学的バッファー中の核、樹脂が埋め込まれた脱水ロブロリーパイン断面、およびさまざまな組成のバッケン頁岩が含まれます。
さらに、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを使用して、リン脂質二重層の破断強度(すなわち、突破力)を調査します。メソッドの選択と開発、プローブの選択とキャリブレーション、関心領域の識別、サンプルの不均一性、フィーチャーサイズとアスペクト比、チップの摩耗、表面粗さ、データ分析と測定統計などの重要な実用的な考慮事項について説明し、テクニックの適切な実装を支援します。最後に、AFM由来のナノメカニカルマップと、元素組成に関する追加情報を提供する電子顕微鏡技術との共局在化が実証されます。
Introduction
材料の機械的特性を理解することは、工学における最も基本的で不可欠なタスクの1つです。バルク材料特性の解析には、引張試験1、圧縮試験2、3点または4点曲げ(曲げ)試験3など、材料システムの機械的特性を特徴付けるために利用できる多数の方法があります。これらのマイクロスケール試験は、バルク材料特性に関する貴重な情報を提供できますが、一般的に故障するために実施されるため、破壊的です。さらに、薄膜、生体材料、ナノコンポジットなど、今日注目されている多くの材料システムのマイクロおよびナノスケールの特性を正確に調査するために必要な空間分解能が不足しています。大規模な機械的試験、主にその破壊的な性質のいくつかの問題に対処し始めるために、鉱物学から微小硬度試験が採用されました。硬度は、特定の条件下での塑性変形に対する材料の耐性の尺度です。一般に、微小硬さ試験では、通常は硬化鋼またはダイヤモンドで作られた硬いプローブを使用して、材料にインデントします。結果として生じるくぼみの深さおよび/または面積を使用して、硬度を決定することができます。ビッカース4、ヌープ5、ブリネル6 硬度など、いくつかの方法が開発されています。それぞれがマイクロスケールの材料硬度の尺度を提供しますが、異なる条件と定義の下で、そのため、同じ条件下で実行されたテストと比較できるデータのみを生成します。
計装ナノインデンテーションは、さまざまな微小硬度試験方法で得られた相対値を改善し、機械的特性の分析に可能な空間分解能を向上させ、薄膜の分析を可能にするために開発されました。重要なことに、OliverとPharr7によって最初に開発された方法を利用することにより、サンプル材料の弾性率またはヤング率Eを計装されたナノインデンテーションを介して決定できます。さらに、Berkovich 3面ピラミッド型ナノインデンタープローブ(理想的な先端面積関数がビッカース4面ピラミッド型プローブと一致する)8を採用することで、ナノスケールと従来のマイクロスケール硬度測定を直接比較することができます。AFMの人気が高まるにつれ、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションも、特に柔らかい材料の機械的特性を測定するために注目され始めました。その結果、図1に模式的に示されているように、ナノスケールの機械的特性を調査および定量化するために今日最も一般的に採用されている2つの技術は、計装化されたナノインデンテーション(図1A)とAFMカンチレバーベースのナノインデンテーション(図1B)9であり、後者はこの研究の焦点です。
図1:計装システムとAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションシステムの比較。 (A)計装ナノインデンテーションおよび(B)AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを実施するための典型的なシステムを示す概略図。この図はQianら51から修正された。略称:AFM =原子間力顕微鏡。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
計装およびAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションはどちらも、剛性プローブを使用して目的のサンプル表面を変形させ、時間の関数として合力と変位を監視します。通常、所望の荷重(すなわち、力)または(Zピエゾ)変位プロファイルのいずれかがソフトウェアインターフェース を介して ユーザーによって指定され、機器によって直接制御され、他のパラメータが測定される。ナノインデンテーション実験から最も頻繁に得られる機械的特性は、圧力の単位を有するヤング率とも呼ばれる弾性率(E)である。材料の弾性率は、接着剛性に関する基本的な特性であり、塑性変形が始まる前の弾性(可逆的または一時的な)変形中の軸ひずみ(ε、くぼみ軸に沿った比例変形)に対する引張応力または圧縮応力(σ、単位面積あたりの適用力)の比率として定義されます(式[1])。
(1)
多くの材料(特に生体組織)は実際には粘弾性であるため、実際には、(動的または複雑な)弾性率は弾性(貯蔵、位相内)と粘性(損失、位相外)成分の両方からなることに注意する必要があります。実際には、ナノインデンテーション実験で測定されるのは、式(2)に示すように、対象の真のサンプル弾性率Eに関連する還元弾性率E*です。
(2)
ここで、Eチップとνチップはそれぞれナノインデンターチップの弾性率とポアソン比であり、νはサンプルの推定ポアソン比です。ポアソン比は、横ひずみと軸ひずみの負の比であるため、式(3)に示すように、軸ひずみを受けたとき(ナノインデンテーション荷重時など)のサンプルの横方向の伸びの程度を示します。
(3)
a)圧子先端によって与えられる軸ひずみの一部が横ひずみに変換される可能性がある(すなわち、試料が荷重方向に垂直な膨張または収縮によって変形する可能性がある)、およびb)圧子先端が無限に硬くないため、したがって、試料をインデントする行為は、先端のいくらかの(小さな)変形をもたらすので、減少弾性率から実際の弾性率への変換が必要である。EチップがE>>場合(つまり、圧子チップがサンプルよりもはるかに硬い場合、ダイヤモンドプローブを使用する場合によく当てはまります)、減少したサンプル弾性率と実際のサンプル弾性率の関係は、E≈E*(1-v2)に大きく単純化されます。インストルメンテーションされたナノインデンテーションは、正確な力の特性評価とダイナミックレンジの点で優れていますが、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションは高速で、桁違いに大きな力と変位の感度を提供し、より高い解像度のイメージングと改善されたインデンテーションの位置特定を可能にし、ナノスケールの磁気特性と電気的特性を同時にプローブできます9.特に、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションは、柔らかい材料(ポリマー、ゲル、脂質二重層、細胞または他の生物学的材料など)、非常に薄い(サブμm)フィルム(くぼみの深さに応じて基質効果が作用する)10,11、およびグラフェンなどの懸濁された2次元(2D)材料12,13,14のナノスケールでの機械的特性の定量化に優れています15,16、雲母17、六方晶窒化ホウ素(h-BN)18、または遷移金属ダイカルコゲナイド(TMDC;例えば、MoS2)19。これは、その絶妙な力(sub-nN)と変位(sub-nm)感度によるものであり、初期接触点を正確に決定し、弾性変形領域内に留まるために重要です。
AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションでは、AFMプローブの試料表面への変位は、較正された圧電素子(図1B)によって作動し、フレキシブルカンチレバーは、試料表面との接触時に受ける抵抗力により最終的に曲がります。カンチレバーのこの曲がりまたはたわみは、通常、カンチレバーの背面から光検出器(位置検出器[PSD])にレーザーを反射することによって監視されます。片持ち梁の剛性(nN/nm)とたわみ感度(nm/V)の知識と組み合わせることで、この測定された片持ち梁のたわみ(V)をサンプルに加えられた力(nN)に変換することができます。接触後、Zピエゾの動きとカンチレバーのたわみの差により、サンプルのくぼみの深さが得られます。チップ面積関数の知識と組み合わせることで、チップとサンプルの接触面積の計算が可能になります。次に、結果として得られる力-距離または力-変位(F-D)曲線の接触部分の傾きを、適切な接触力学モデル(説明の 「データ分析 」セクションを参照)を使用して適合し、サンプルのナノ機械的特性を決定できます。AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションは、上記のように計装されたナノインデンテーションに比べていくつかの明確な利点がありますが、ここで説明するキャリブレーション、チップ摩耗、データ分析など、いくつかの実用的な実装上の課題も提示します。AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションのもう1つの潜在的な欠点は、接触半径とくぼみ深さが圧子半径よりもはるかに小さくする必要があるため、線形弾性の仮定であり、ナノスケールのAFMプローブや大きな表面粗さを示すサンプルで作業する場合、これを達成するのは難しい場合があります。
従来、ナノインデンテーションは、個々の場所または小さなグリッドインデンテーション実験に限定されており、所望の位置(すなわち、関心領域[ROI])が選択され、単一の制御されたインデント、いくつかの待ち時間で区切られた単一のロケーション内の複数のインデント、および/またはインデントの粗いグリッドがHzのオーダーの速度で実行される。しかし、近年のAFMの進歩により、荷重制御下でkHzの速度で力曲線を伝導し、最大先端サンプル力をイメージング設定値として利用する高速力曲線ベースのイメージングモード(システムメーカーによってさまざまな商品名で呼ばれる)を利用して、機械的特性とトポグラフィーを同時に取得できるようになりました。ポイントアンドシュート法も開発されており、AFMトポグラフィ画像を取得した後、画像内の関心のあるポイントで選択的なナノインデンテーションを可能にし、ナノインデンテーション位置のナノスケール空間制御を可能にします。この研究の主な焦点ではありませんが、力曲線ベースのイメージングとポイントアンドシュートカンチレバーベースのナノインデンテーションの両方の特定の 選択されたアプリケーション例 が代表的な結果に提示されており、採用されている特定のAFMプラットフォームで利用可能な場合は、以下に概説するプロトコルと組み合わせて使用できます。具体的には、この作業では、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを任意の可能なAFMシステムに実際に実装するための一般化されたプロトコルの概要を説明し、代表的な結果とニュアンス、課題、および技術を成功させるための重要な考慮事項の詳細な議論を含む、技術の4つのユースケース例(空気中2つ、流体中2つ)を提供します。
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Protocol
注:市販のAFMは多種多様であり、カンチレバーベースのナノインデンテーションにはサンプルタイプと用途が多様であるため、以下のプロトコルは、機器やメーカーに関係なく、すべてのカンチレバーベースのナノインデンテーション実験に必要な共有ステップに焦点を当てて、本質的に比較的一般的になるように意図的に設計されています。このため、著者らは、読者がカンチレバーベースのナノインデンテーションを実行するために選択された特定の機器の操作に少なくとも基本的な知識を持っていると想定しています。ただし、以下に概説する一般的なプロトコルに加えて、流体中のサンプルのカンチレバーベースのナノインデンテーションに焦点を当てた、ここで使用するAFMとソフトウェアに固有の詳細なステップバイステップの標準操作手順(SOP)( 材料表を参照)が 補足資料として含まれています。
1. サンプル調製と装置のセットアップ
- 表面粗さ(理想的にはナノメートルスケール、意図したくぼみ深さの~10倍小さい)と汚染の両方を最小限に抑える方法で、目的の領域の機械的特性を変更することなくサンプルを準備します。
- 媒体(空気または流体など)、予想される弾性率、サンプルのトポグラフィー、および関連する特徴サイズに基づいて、目的のサンプルのナノインデンテーションに適したAFMプローブを選択します(説明の プローブ選択の考慮事項 を参照)。プローブをプローブホルダーにロードし( 材料表を参照)、プローブホルダーをAFMスキャンヘッドに取り付けます。
- AFMソフトウェアで適切なナノインデンテーションモードを選択して、個々のランプ(力-変位曲線など)をユーザーが制御できるようにします。
注:特定のモードは、AFMメーカーや個々の機器によって異なります(詳細と具体的な例については、 補足資料 に記載されているSOPを参照してください)。 - レーザーをプローブカンチレバーの背面、プローブ先端の位置の反対側、PSDに合わせます。
注:レーザーを整列させ、流体中でナノインデンテーションを行う際の重要な考慮事項、特にビームを散乱または屈折させる可能性のある浮遊破片や気泡を回避する際の重要な考慮事項の詳細については、間葉系幹細胞 のアプリケーション例 を参照してください。AFM光学系は、流体の屈折率を補正し、表面と噛み合うときにプローブがクラッシュしないように調整する必要がある場合もあります。- 合計電圧を最大化することにより、カンチレバーの背面にレーザービームスポットを中央に配置します(図2A)。
- XとY(つまり、水平および垂直)の偏向信号を可能な限りゼロに近づけるように調整することにより、反射されたレーザービームスポットをPSDの中央に配置し(図2A)、カンチレバーのたわみに比例した出力電圧を生成するための検出可能な最大偏向範囲を提供します。
- サンプルのトポグラフィー、表面粗さ、および/または表面密度(フレークまたは粒子の場合)が不明な場合は、ステップ1.1およびディスカッションのサンプル調製部分で説明されているように、ナノインデンテーション実験の前にAFMトポグラフィー調査スキャンを実行してサンプルの適合性を確認します。
図2:位置感知検出器モニター。 (A)サンプル表面にかみ合う(つまり、プローブがサンプルと接触していない)前に、プローブカンチレバーの背面からPSDの中心に反射する適切に位置合わせされたレーザーを示すPSDディスプレイ(大きな合計電圧と垂直または水平のたわみの欠如によって証明されます)。(B)カンチレバーが偏向すると(プローブがサンプルと接触したときなど)、垂直たわみ電圧が増加します。略語:PSD =位置感知検出器;VERT = 垂直;ホリッツ=水平。アンプル=振幅;N/A = 該当なし。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
2. プローブのキャリブレーション
注:カンチレバーベースのナノインデンテーション中に収集されたF-D曲線データを使用してサンプルの機械的特性を定量化するには、カンチレバー/ PSDシステムのたわみ感度(DS) (nm/VまたはV/nm)、 カンチレバースプリング定数 (nN / nm)、および プローブ接触面積の3つの値が必要です(球形プローブの場合、プローブ半径よりも小さい所定のくぼみ深さでの有効プローブ先端半径(nm)で表されることがよくあります先端。
- 非常に硬い材料(サファイア、 E = 345 GPaなど)をランプで覆ってプローブ/AFMシステムのDSを校正し、サンプルの変形を最小限に抑え、チップとサンプルの接触開始後のピエゾの測定されたZ運動がカンチレバーたわみのみに変換されるようにします。
注:DSキャリブレーションは、実験中のシステムのDSを正確に反映するために、計画されたナノインデンテーション実験と同じ条件(つまり、温度、媒体など)で実行する必要があります。熱平衡に達し、安定したレーザー出力パワーとポインティング安定性を確立するために、最大の精度を得るには、長い(30分)レーザーウォームアップ期間が必要になる場合があります。DSは、レーザーの強度とカンチレバーの位置、およびプローブからの反射の品質(つまり、プローブの裏面コーティングの劣化がDSに影響を与える)とPSD20の感度に依存するため、同じプローブを使用する場合でも、レーザーを再調整するたびにDSを再測定する必要があります。- 測定された変位は先端のたわみ角の関数であり、大きなたわみでは非線形になるため、計画されたサンプルのくぼみとほぼ同じプローブのたわみ(Vまたはnm)を達成するために、サファイアに DSキャリブレーションくぼ みを設定して実行します。
- 図3Aに示すように、結果のF-D曲線の最初の接触点後の接触レジームの線形部分の傾きから、DS(nm/V)、または逆光レバー感度(V/nm)を決定します。
- ランプを少なくとも5回繰り返し、各DS値を記録します。精度を最大にするには、値の平均を使用します。測定値の相対標準偏差(RSD)が~1%を超える場合は、最初のいくつかのF-D曲線が最初に接着力を導入するために理想的でない場合があるため、DSを再測定します。
- プローブカンチレバーのばね定数kが工場で校正されていない場合(たとえば、レーザードップラー振動計[LDV]を介して)、ばね定数を校正します。
注意: サーマルチューン法は、k < 10 N / mの比較的柔らかいカンチレバーに最適です(特にk > 10 N / mの硬いカンチレバーの代替方法のリストと説明については、説明のばね定数のセクションを参照してください)。図3B、Cに示すように、サーマルチューニングは通常、AFM制御ソフトウェアに統合されています。
- プローブに工場で校正された先端半径測定 (走査型 電子顕微鏡[SEM]イメージングなど)が付属していない場合は、有効先端半径 Rを測定します。
注: 先端半径 を測定する一般的な方法は2つありますが(対応する説明セクションを参照)、ナノメートルスケールのプローブチップで最も一般的なのは、チップがサンプルをイメージングするのではなく、チップを効果的にイメージングするのに役立つ多数の非常に鋭い(サブnm)特徴を含む粗さ標準( 材料表を参照)を利用するブラインドチップ再構成(BTR)法です。- BTR法を採用する場合は、非常にシャープな特徴の追跡を最適化するために、低速のスキャンレート(<0.5 Hz)と高いフィードバックゲインを使用して粗さ(チップの特性評価)サンプルをイメージングします。予想される先端半径に基づいて画像サイズとピクセル密度(解像度)を選択します(たとえば、3 μm x 3 μmの領域の1024 x 1024ピクセルの画像は、~3 nmの横方向の解像度を持ちます)。
- AFM画像解析ソフトウェア(材料表を参照)を使用してプローブチップをモデル化し、図3D-Fに示すように、予想されるサンプルのくぼみ深さでその端部半径と有効チップ直径を推定します。
- プローブのキャリブレーションが完了したら、図4Aに示すように、DS、k、およびRの値を機器ソフトウェアに入力します。
- サンプルのポアソン比 νの推定値を入力して、測定された還元弾性率を実際のサンプル弾性率9に変換できるようにします。先端形状とくぼみ深さに基づく円錐形または円錐形の接触力学モデルを採用する場合は、先端半角を入力する必要もあります(図4C)。
注:係数は、推定ポアソン比の小さな誤差や不確実性に比較的敏感ではありません。ν = 0.2-0.3の推定値は、多くの材料21の出発点として適しています。
- サンプルのポアソン比 νの推定値を入力して、測定された還元弾性率を実際のサンプル弾性率9に変換できるようにします。先端形状とくぼみ深さに基づく円錐形または円錐形の接触力学モデルを採用する場合は、先端半角を入力する必要もあります(図4C)。
図3:プローブのキャリブレーション。 (A)たわみ感度の決定。反射裏面アルミニウムコーティングを施した標準タッピングモードプローブ(公称k = 42 N/m、材料表を参照)のサファイア基板(E = 345 GPa)で実施した代表的なたわみ感度測定の結果。示されているのは、測定されたアプローチ曲線(青いトレース)と後退または撤退(赤いトレース)曲線です。測定されたたわみ感度59.16 nm/Vは、垂直の赤い点線の間の領域で示されているように、スナップツーコンタクトポイントとターンアラウンドポイントの間のアプローチ曲線をフィッティングすることによって決定されました。表面を引き抜く前の収縮/引き抜き曲線に明らかな負方向のたわみの領域は、チップとサンプルの接着を示しています。(B,C)サーマルチューニング。代表的なカンチレバー熱雑音スペクトル(青色のトレース)と、2つの異なるプローブに対応する適合(赤色のトレース)。(B)公称ばね定数k = 0.4 N / mを最初の推測として使用した標準的な力曲線ベースのAFMイメージングプローブ(材料表を参照)の熱調整セットアップとフィットパラメータ。カンチレバー熱雑音スペクトルの適合により、f 0 = 79.8 kHzの基本共振周波数が得られ、これはf0 = 70 kHzの公称値とかなりよく一致します。測定されたQ係数は58.1です。適合度(R2 = 0.99)は、2本の赤い縦破線の間のデータとの適合度の一致に基づいています。正確な結果を得るには、周囲温度とたわみ感度の両方を把握して入力することが重要です。(C)生細胞および単離された核のナノ機械的測定を実行するために使用される非常に柔らかいカンチレバーについて、カンチレバー熱雑音スペクトルと対応する適合(すなわち、熱調整)と、結果として計算されたばね定数k = 0.105 N / m。固有共振周波数が~2-3kHzと大幅に低いことに注意してください。(D-F)ブラインドチップの再構築。ダイヤモンドチッププローブの代表的なブラインドチップ再構成ワークフロー(公称R = 40 nm、材料表を参照)。(D)AFMプローブの先端を画像化するのに役立つ一連の非常に鋭い(サブnm)チタンスパイクで構成されるチップ特性評価サンプルの5 μm x 5 μmの画像。(E)得られたプローブ先端の再構成モデル(反転高さ画像)。(F)ブラインドチップ再構成フィッティング結果、ユーザーが選択した8nmの高さ(すなわち、くぼみ深さ<
図4:ソフトウェアインターフェース入力。 (A)プローブ校正定数。測定されたたわみ感度、ばね定数、および先端半径を入力するためのソフトウェアユーザーインターフェイス( 材料表を参照)により、定量的なナノメカニカル測定が可能になります。プローブとサンプルの両方のポアソン比は、カンチレバーベースのナノインデンテーション力曲線からサンプルの弾性率またはヤング率を計算するために必要です。(B)ランプコントロールウィンドウ。カンチレバーベースのナノインデンテーション実験を設定するためのソフトウェアユーザーインターフェイス( 材料表を参照)、ランプ自体(つまり、くぼみプロファイル)、機器のトリガー(力対変位制御など)、その後の力分析、および移動制限(Zピエゾの制御とPSDたわみの読み取りにおいてA/Dコンバーターが動作しなければならない範囲を狭めることにより、測定感度を向上させます)。(C)円錐形、ピラミッド型、または円錐形の接触力学モデル(Sneddonなど)を使用する場合、先端半角(プローブの形状または直接測定に基づく)が重要です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
3. 力-変位(F-D)データを収集する
注意: ここに示すパラメータ値( 図4Bを参照)は、特定のサンプルの力とくぼみの範囲によって異なる場合があります。
- AFMヘッドの下でサンプルをナビゲートし、目的の関心領域に移動します。
- 垂直たわみ信号を監視するか(図2B)、小さな初期ランプ(~50-200 nm)を実行して(図4B)、チップとサンプルが接触していることを確認します(図5Aを参照)。
- AFMヘッドの位置を少し上向きに調整し(フルランプサイズの~50%に対応するステップで)、再度ランプします。チップとサンプルがちょうど接触しなくなるまで繰り返し、ほぼ平坦な傾斜角(図5B)とカンチレバーの垂直方向のたわみの最小化(図2A)によって証明されます。
- チップとサンプルの明らかな相互作用が存在しない場合(図2Aと図2Bを比較)、AFMヘッドを手動で動かしながらプローブチップがサンプルに衝突しないように、ランプサイズの~50%-100%に相当する量だけAFMヘッドを下げます。再びランプを、良好な曲線(図5D)または図5Cと同様の曲線が観察されるまで繰り返す。後者の場合、ランプサイズの~20%-50%に等しい小さなAFMヘッド下降調整を1回追加して、良好な接触と図5Dに示すような力曲線を実現します。
- ランプパラメータを調整します(以下で説明し、 図 4B)を使用して、機器、プローブ、およびサンプルを最適化し、に示すようなランプを取得します。 図 5D.
- サンプル(厚さ、期待弾性率、表面粗さなど)と希望のくぼみ深さに応じて、適切なランプサイズ(つまり、1回のランプサイクルでの合計Zピエゾ運動)を選択します。
注:硬いサンプルの場合、サンプルの変形が少ない(したがって、特定のZピエゾの動きに対するプローブのたわみが大きくなる)可能性が高いため、ランプサイズは一般に柔らかいサンプルよりも小さくすることができます。硬いサンプルとカンチレバーの一般的なランプサイズは数十nmですが、柔らかいサンプルとカンチレバーのランプのサイズは数百nmから数μmです。特定の 選択されたアプリケーション例は 、代表的な結果のセクションに示されています。可能な最小および最大ランプサイズは機器に依存することに注意してください。 - 適切なランプレートを選択します(ほとんどのサンプルでは1Hzが適切な開始点です)。
注意: ランプレートは、制御および/または検出の電子速度/帯域幅によって制限される場合があります。ランプサイズと組み合わせて、ランプレートによって先端速度が決まります。先端速度は、粘弾性効果がヒステリシスアーチファクトを引き起こす可能性のある柔らかい材料をインデントするときに考慮することが特に重要です9,22。 - トリガ(負荷制御)または非トリガ(変位制御)ランプのどちらを使用するかを選択します。
注意: トリガーされたランプでは、システムは、目的のトリガーしきい値(つまり、セットポイント力またはカンチレバーたわみ)が検出されるまで、ユーザー定義のステップ(ランプのサイズと分解能またはデータポイントの数に基づいて)でサンプルに近づき、その時点でシステムは元の位置に後退し、F-D曲線を表示します。トリガーなしのランプでは、システムはZピエゾをユーザー定義のランプサイズで指定された距離まで延長し、測定されたF-D曲線を表示するだけです。トリガーランプはほとんどのユースケースに適していますが、トリガーされていないランプは、鋭く簡単に識別できる接触点を示さない柔らかい材料を調査する場合に役立ちます。- トリガーランプを選択した場合は、トリガーしきい値(ユーザー定義の最大許容力またはランプのたわみ)を設定して、サンプルに目的のくぼみを入れます。
注意: トリガーしきい値を使用すると、指定されたフルランプサイズ(Zピエゾ拡張)に達する前にランプが終了する(つまり、プローブが収縮し始める)可能性があります。値は、チップサンプルシステムに応じて、数nNから数μNの範囲であり得る。 - ランプ位置を設定して、ランプの実行に使用されるZピエゾの最大範囲の部分を決定します。ランプサイズの合計範囲が最大Zピエゾ範囲外で開始または終了しないことを確認してください(図6の代表的な例を参照)、そうしないと、F-D曲線の一部が物理的な測定値を表しません(つまり、Zピエゾは完全に伸びたり引っ込められたりし、移動しません)。
- トリガーランプを選択した場合は、トリガーしきい値(ユーザー定義の最大許容力またはランプのたわみ)を設定して、サンプルに目的のくぼみを入れます。
- サンプル/ランプの数(例:512 サンプル/ランプ )を設定して、測定の目的の分解能(つまり、F-D曲線の点密度)を達成します。
注:最大サンプル/ランプは、ソフトウェア(ファイルサイズ)またはハードウェアの制約(ランプレートに応じて、アナログからデジタル[A / D]への変換速度など)によって制限される場合があります。また、許容Zピエゾまたはたわみ範囲( 図4Bの制限パラメータを参照)を制限して、システムのA/Dコンバータの有効分解能を高めることもできます。 - X回転を設定して、プローブをX方向(カンチレバーに平行)にわずかに動かすと同時に、Z方向(カンチレバーに垂直)にインデントすることにより、サンプルとチップにかかるせん断力を低減します。X回転には、表面法線に対するプローブホルダーのオフセット角度に等しい値を使用します(12°が標準です)。
注意: 入射レーザービームがPSDに反射できるように、カンチレバーが表面に対して小さな角度でプローブホルダーに取り付けられているため、X回転が必要です。さらに、プローブ先端の前後の角度は互いに異なる場合があります(つまり、プローブ先端が非対称である可能性があります)。より具体的な情報は、個々のプローブおよびAFMメーカーから入手できます。
- サンプル(厚さ、期待弾性率、表面粗さなど)と希望のくぼみ深さに応じて、適切なランプサイズ(つまり、1回のランプサイクルでの合計Zピエゾ運動)を選択します。
図5:良好な力曲線を得るために、噛み合った後のチップとサンプルの分離を最適化します。 半径5μmの半球状の先端で終わる較正された軟質窒化ケイ素カンチレバー(公称 k = 0.04 N / m)を用いて、生きた間葉系幹細胞核上の流体(リン酸緩衝生理食塩水)にインデントしながら得られた代表的な力-変位曲線の連続例( 材料表を参照)。曲線は、細胞表面を係合し、インデンテーションパラメータを最適化する過程で得られ、プローブアプローチは青色で示され、収縮/撤退は赤色で示されました。(A)ランプを開始する前に、チップがすでにサンプルとかみ合って接触しているため、カンチレバーのたわみと力が大きくなり、接触前のベースラインが平坦ではありません。(B)チップをサンプルから十分に離して手動で移動した後、トリガーなしの2 μmランプにより、F-D曲線はほぼ平坦になります(つまり、力の変化はほとんどありません)。周囲条件では、曲線はより平坦になりますが、流体では、媒体の粘度により、表面が接触していなくても、ここで見られるように、ランプ中にプローブカンチレバーがわずかにたわむ可能性があります。(C)傾斜路の開始前に表面に少し近づいた後、アプローチ曲線とリトラクト曲線は、傾斜路の折り返し点付近でわずかに力が増加する(傾斜が増加する)ことを示します(つまり、アプローチから撤退への移行)。探すべき明らかな兆候は、アプローチ(青)と撤退(赤)の曲線が重なり始め(黒い円で示された領域)、表面との物理的な相互作用を示すことです。(D)ランプパラメータの最適化後に取得され、 C よりもセル表面にわずかに(~1μm)近づくと、プローブはランプの約半分を細胞に接触させ、アプローチ曲線の接触部分に適合するのに十分な変形を可能にし、弾性率を決定します。比較的長く、平坦で、低ノイズのベースラインにより、フィッティングアルゴリズムが接触点を決定しやすくなります。略語:F-D =力変位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ランプのサイズと位置。 利用可能なZピエゾ移動範囲の合計(緑色のバー)に対するランプ(青いバー)の範囲を示すZピエゾモニター。(A)Zピエゾの位置は、青いバーが緑色のバーのほぼ中央にあり、現在のZピエゾ電圧(-78.0 V)がほぼ完全に収縮した(-212.2 V)値と拡張(+102.2 V)値の間にあることから示されるように、移動範囲の中央近くにあります。(B)ZピエゾはAに対して拡張されており、バイアス電圧は印加されていません。(C)ZピエゾはAとBに対して後退しています。(D)Zピエゾの位置は-156.0VでCと同じですが、Zピエゾの全可動域をより多く活用するために、ランプサイズがA-Cに比べて大きくなっています。€ランプサイズが現在のランプ位置に対して大きすぎるため、Zピエゾがその範囲の終わりまで拡張されます。これにより、システムがZピエゾをさらに拡張できないため、F-D曲線が平坦になります。略語:F-D =力変位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
4. F-D カーブ解析
- 適切なデータ分析ソフトウェアパッケージを選択してください。分析するデータを選択してロードします。
注:多くのAFMメーカーとAFM画像処理ソフトウェアプログラムには、F-D曲線分析のサポートが組み込まれています。あるいは、オープンソースのAtomicJソフトウェアパッケージなどの専用のF-D曲線解析パッケージの柔軟性と機能の向上は、特に大規模なデータセットのバッチ処理と統計解析、または複雑な接触力学モデルの実装に有益である可能性があります23。 - ばね定数、DS、プローブ先端半径の校正値を入力し、プローブ先端のヤング率とポアソン比の推定値(材料組成に基づく)、およびサンプルのポアソン比を入力します。
注意: ダイヤモンドチップ圧子を使用する場合、値Eチップ= 1140 GPaおよびνチップ= 0.07は21,24,25,26を使用できます。標準的なシリコンプローブの場合、Eチップ= 170 GPaおよびνチップ= 0.27が典型的に使用されるが、シリコンのヤング率は結晶学的配向に依存する27。 - 先端とサンプルに適したナノインデンテーション接触力学モデルを選択してください。
注:多くの一般的な球面チップモデル(ヘルツ、モージス、DMT、JKRなど)では、サンプルへのくぼみの深さがチップ半径よりも小さいことが不可欠です。そうしないと、プローブ先端の球形の形状が円錐形またはピラミッド形になります(図4C)。円錐形(例えば、Sneddon28)およびピラミッド型モデルの場合、先端半角(すなわち、先端の側壁と先端に垂直な二等分線との間の角度; 図4C)既知である必要があり、通常はプローブの製造元から入手できます。接触力学モデルの詳細については、ディスカッションのデータ 分析 セクションを参照してください。 - フィットアルゴリズムを実行します。F-D曲線の適切なフィッティングを確認します。ユニティに近い平均R2に対応する低い残差誤差(例えば、R2>0.9)は、典型的には、選択されたモデル29、30への良好な適合を示す。必要に応じて、個々の曲線をスポットチェックして、曲線、モデルの適合、および計算された接触点を視覚的に検査します(たとえば、図7および説明のデータ分析セクションを参照)。
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Representative Results
力-変位曲線
図7は、樹脂が埋め込まれたロブロリーマツサンプル(図7A)および間葉系幹細胞(MSC)核上の流体(リン酸緩衝生理食塩水[PBS])(図7B)で空気中で行われたナノインデンテーション実験から得られた代表的なほぼ理想的なF-D曲線を示しています。接触力学モデルの使用は、最初のチップとサンプルの接触点の正確で信頼性の高い決定に依存します。したがって、図7に示すF-D曲線の初期接触点に先行する比較的平坦で低ノイズのベースラインと接触部分の滑らかな傾きは、差し込み図のアプローチ曲線(青色のトレース)と対応する適合(緑色のトレース)の間の優れた一致によって証明されるように、機械的特性を抽出するための解析に最適です。
逆に、カンチレバーベースのナノインデンテーションを実行しているときにユーザーが遭遇する可能性のあるいくつかの一般的な問題があり、理想的でないF-D曲線につながります。最も一般的な問題の1つは、特に係合直後は、ランプの開始前にプローブの先端がすでにサンプルに接触しているため(図5A)、最初の接触点を決定するために必要な接触外ベースラインの取得が妨げられていることです。これはまた、トリガーされていない(つまり、制御された変位)ランプの場合に過度に大きな力につながる可能性があります。硬いカンチレバーで大きなランプを実行する場合、結果として生じる力がカンチレバーを破壊したり、サンプルやチップを損傷したりする可能性があるため、これは特に懸念されます。これを回避するには、最初の係合中および後の垂直たわみ電圧を監視します。 図2Bに示すように、測定された垂直たわみ電圧が正の場合(適切な初期位置合わせを前提と)、カンチレバーは偏向しており、先端はサンプルと接触しています。正の電圧が大きいほど、カンチレバーのたわみが大きくなりますが、たわみの大きさに関係なく、ユーザーはAFMヘッドを手動で持ち上げる必要があります(たとえば、ステッピングモーターを使用して)サンプルから離します。垂直たわみ電圧はゆっくりと低下し、チップとサンプルの接着力が強い場合は一時的にゼロを下回ることもありますが、チップがサンプルと接触しなくなると、最終的には0V(または0V近く)に達します(図2A)。この時点から、ユーザーはランプパラメータの最適化とインデントの実行を再開できます。
もう1つの一般的な問題(特にトリガーなしのランプの場合)は、 図5Bで前に示したように、F-D曲線全体がほぼ平坦に見え、チップとサンプルの相互作用の明らかな兆候がないことです。装置で利用可能な場合、これに対する解決策は、SPMヘッドを手動でランプサイズより~10%小さく下げ(プローブチップのクラッシュを回避するため)、再度ランプし、チップとサンプルの相互作用により力の明らかな増加が観察されるまで繰り返します(図5C、D)その後、他のランプパラメータの最適化に進みます。
チップウェア
図8は、実験環境でのチップ摩耗の例を示しています。単一の硬いシリコンタッピングモードAFMプローブ( 材料表を参照)を使用して、高速(kHzレート)力曲線ベースのイメージング法を使用してバッケン頁岩サンプルのいくつかの広い領域を画像化し(詳細については対応する アプリケーション例 を参照)、BTR法を使用して先端形状をモデル化し、3つの連続した画像の前後の先端半径を推定しました。調査中の頁岩サンプルは、粘土と有機物のマトリックス(E ~5 GPa)で構成され、はるかに硬い無機鉱物介在物が全体に分散していました(E >30 GPa)。サンプルには、画像化された大きなスキャン領域(85 μm x 85 μm)の表面トポグラフィ(±2 μm)に大きなばらつきがあったため、スキャンレートは使用した機器で許容される最小の0.1 Hzに設定しました。フォースカーブの取得レートが2 kHz、スキャンレートが0.1 Hzの場合、1024 x 1024ピクセルの単一画像で、チップとサンプルの相互作用は2,000万回を超えました。その結果、プローブの先端は、サンプルのイメージングの過程で元の状態(図8A)に比べて著しい摩耗を経験し、3つの画像の最後に~11 nmの有効端半径~11 nmから~129 nmまで桁違いに増加しました(図8D)。最初の画像では、先端が折れているように見え、 図8Bに見られる大きな形態学的変化が生じています。その後の各画像では、先端が徐々に丸みを帯びており、段階的な摩耗のより一般的な現象の優れた例です(説明を参照)。BTRモデルから推定された先端半径を 図8に示します。
対照的に、図8E、Fは、6か月間隔で取得したダイヤモンドチッププローブ(材料表を参照)のBTRモデルを示しており、その間に数千のナノインデントと数億のフォースカーブイメージングベースのチップとサンプルの相互作用が発生しています。29 nm(図8E)と28 nm(図8F)の推定先端半径からわかるように、プローブ先端半径はBTR法の範囲内で変化せず、ダイヤモンドの極端な耐摩耗性を浮き彫りにしました。ただし、ダイヤモンドチッププローブ(すべてのAFMプローブと同様に)は、チップ領域の機能と有効硬度に影響を与える可能性のある、緩く付着した破片による汚染の影響を受けやすいことに注意してください。したがって、サンプルの清浄度は、チップの保存と正確なナノメカニカル測定にとって依然として不可欠です。
アプリケーション例
カンチレバーベースのナノインデンテーションは、プローブ材料の組成、カンチレバーのばね定数、チップの形状と半径を慎重に選択することで、流体中および周囲条件下の両方で、kPaからGPaの範囲の弾性率を持つ材料のナノスケールの機械的特性を定量化できます。以下に、カンチレバーベースのナノインデンテーションで可能な幅広いユースケースのいくつかを強調するために、選択されたアプリケーション例を紹介します。
バイオ燃料用途のためのロブロリーパインの機械的特性の調査
ロブロリーパインの木(Pinus taeda) は、米国南部で非常に豊富に生息する急成長している針葉樹種であり、1,300万ヘクタール以上を占めています31。その豊富さのために、ロブロリー松の木は米国南部で重要な商品作物であり、木材とパルプ木材の両方に一般的に使用されています。さらに、それらは第2世代のセルロース系バイオ燃料生産にとって重要な資源です32。重要なことに、2007年のエネルギー独立性および安全保障法(EISA)により、2022年までに米国の運輸業界における再生可能燃料の総使用量は360億ガロンで、160億ガロンがセルロース系バイオマスに由来することが義務付けられているため、セルロース系バイオ燃料原料の需要が高まっています。したがって、ロブロリーパインの急速な成長率とアグロフォレストリープロジェクトへの適合性により、近年大きな関心を集めているバイオ燃料原料になっています33。個々の樹木、解剖学的画分(例えば、ホワイトウッド、樹皮、針)、および細胞領域(例えば、細胞壁対内部)にわたる変動性を含む、ロブロリーマツの機械的特性に関する知識は、機械的処理および熱化学的変換を最適化するためのバイオマス流の的を絞った分離を可能にするかもしれない34。
図9は、ステンレス鋼カンチレバー(k= 256 N/m)。トポグラフィーマップと弾性率マップは、高速kHzレート力曲線ベースのAFMイメージングを使用して同時に生成され、モジュラスマップは、プローブキャリブレーション定数の公称値(つまり、ばね定数、たわみ感度、および先端半径)に基づいて半定量的な結果を提示し、力曲線をDMT(Derjaguin、Muller、およびToporov)接触力学モデル35にリアルタイムで適合させます.3次元(長さx幅x高さ)すべて<3 mmにトリミングされた断面サンプルは、エタノールの濃度(33%、55%、70%、90%、および100%)36を増やしてから、樹脂を浸透させ(材料表を参照)、60°Cで一晩重合する前に、連続脱水によってイメージング用に準備されました。完全に硬化した樹脂包埋サンプルを最初に粉砕し、次に、スライスあたり1 μmから50-70 nmに減少した送り厚さで~1 mm/sの切断速度で動作するダイヤモンドブレードでウルトラミクロトメドして、AFMイメージングに適した平坦な表面を生成しました。ただし、図9Aのカラースケールバーからわかるように、この場合の結果の表面は、おそらくサンプル表面および/またはウルトラミクロトームブレードに残留破片が存在し、セクショニング中にブレードの「チャタリング」につながるため、比較的粗いままですが、他のサンプルははるかに滑らかな表面トポグラフィーを示しました。
図9Cは図9AのAFMトポグラフィ画像を再現していますが、問題のプロジェクトの目標は、ロブロリーマツのナノ機械的特性がさまざまな組織タイプや樹齢でどのように異なるかを理解することであったため、ROI内の選択された細胞壁に沿って実行される50ナノインデントの8つのアレイの位置を示す白い十字線が付いています。ランプ(1 Hzのランプレートで実施される公称60 nmのランプサイズ)には、通常1 μNのトリガースレッショルドが使用され、細胞壁に沿って~10 nm(調査対象のすべてのサンプルで8 ± 2 nm)または細胞内部でわずかに深い(14 ± 4 nm)くぼみの深さが得られ、細胞壁よりもやや柔らかい。各ライン内のインデントは、適切に分離されるように≥100 nm間隔で配置され、ランプごとに1,024のデータポイントが収集され、適切に特徴付けられたアプローチ曲線とリトラクト曲線が生成されました。迅速な力曲線ベースのイメージングとポイントアンドシュートカンチレバーベースのナノインデンテーションを組み合わせることにより、統計を生成し、細胞構造全体の弾性率の違いを決定することができました。例えば、表1に示すように、細胞内部の平均弾性率は、年齢の異なる樹木の複数の枝に由来するホワイトウッドサンプル全体の細胞壁の約半分であることがわかった。
| 見本 | 場所 | E* (GPa) | E (GPa) | 変形(nm) | カウント (n) |
| 1 | インテリア | 1.5 ± 0.4 | 1.4 ± 0.4 | 14 ± 2 | 199 |
| 壁 | 4.7 ± 1.3 | 4.3 ± 1.3 | 7 ± 2 | 202 | |
| 2 | インテリア | 1.3 ± 0.3 | 1.2 ± 0.3 | 16 ± 3 | 198 |
| 壁 | 3.2 ± 0.9 | 2.9 ± 0.9 | 9 ± 2 | 199 | |
| 3 | インテリア | 1.9 ± 0.6 | 1.7 ± 0.6 | 12 ± 3 | 198 |
| 壁 | 5.7 ± 1.2 | 5.2 ± 1.2 | 6 ± 1 | 199 | |
| 4 | インテリア | 2.4 ± 0.8 | 2.2 ± 0.8 | 11±3 | 202 |
| 壁 | 4.2 ± 2.1 | 3.8 ± 2.1 | 9 ± 4 | 193 | |
| 5 | インテリア | 2.6 ± 0.8 | 2.3 ± 0.8 | 10 ± 2 | 198 |
| 壁 | 4.3 ± 1.6 | 3.9 ± 1.6 | 7 ± 2 | 199 | |
| 平均 | インテリア | 1.9 ± 0.6 | 1.8 ± 0.6 | 13 ± 3 | |
| 壁 | 4.4 ± 1.4 | 4.0 ± 1.4 | 8 ± 2 |
表1:ロブロリーパイン弾性率統計:細胞壁対細胞内部。 年齢の異なる2本の木から採取した5本のロブロリーパインホワイトウッド枝サンプルの細胞壁対細胞内部の弾性率を測定した。すべての弾性率は、力変位曲線のアプローチ部分をDMTモデルに適合させ、サンプルのポアソン比を0.3と仮定することによって計算されました。モジュライは、各サンプル位置の平均±標準偏差として報告され、力曲線の数(カウント、n)が分析されて、報告された結果が生成されます。測定された還元弾性率(E*)は、使用したダイヤモンド先端圧子のヤング率を1,140GPa、ポアソン比を0.07と仮定して、実際のサンプル弾性率(E)に変換しました。また、1μNの負荷に対する平均サンプル変形も示されています。
バッケン頁岩上の相関ナノメカニクスと電子顕微鏡分光法
バッケン頁岩鉱床は、米国のモンタナ州とノースダコタ州のウィリストン盆地とカナダのサスカチュワン州の一部にあります。それらは米国で2番目に大きい炭化水素貯留層ですが、鉱床の研究はまだ始まったばかりです37。 図10に示すように、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを走査型電子顕微鏡(SEM)イメージングおよびエネルギー分散型分光法(EDS)元素組成の特性評価と共局在化することにより、組成と熱成熟度の関数としてのバッケン頁岩のナノ機械的特性の調査が行われました。具体的には、SEM-EDSマッピングを使用して元素分布を特徴付け(図10C)、シェールマトリックス内のさまざまな鉱物介在物の存在と位置を決定しました。高速(kHzレート)力曲線ベースのAFMイメージング(図10B)は、二次電子(SE)SEM画像(図10A)で光学的に識別可能な起源を定義し、AFMとSEM38の両方のステージ移動を追跡することにより、SEM-EDSマップと共局在しました。剛性の高いステンレス鋼のカンチレバーに取り付けられたダイヤモンドチッププローブを再び利用することにより、目的の介在物を含む広い領域(85 μm x 85 μm)の弾性率の変動のマッピングが可能になりました(図10D)。 図10D に示す弾性率マップは、イメージングおよびデータ収集の前に適切なプローブキャリブレーション定数がソフトウェアに入力されていないため、本質的に定量的ではなく定性的であることに注意してください。
図10Bと図10DのAFM画像は、採用されたダイヤモンドチッププローブの欠点の1つ、つまり、立方体のコーナーチップ形状のために高アスペクト比の特徴を正確に追跡できないこと(図10Bの黒い楕円形の領域を参照)も強調しています。 解像度の低下と急峻な特徴を正確に追跡できないことは、バッケン頁岩サンプルの同じ一般的な領域が立方体のコーナーダイヤモンドチップ(図11A)と大幅にシャープで高アスペクト比の剛性タッピングモードシリコンAFMプローブ(図11B)によって画像化された図11でより明確に見ることができます。より具体的には、図11Bに示す画像は、図8A〜Dで特徴付けられたプローブを用いて、図8A(R=11nm)および図8B(R=43nm)のBTRモデル間で取得された。直接比較するために、画像ペア図11C、D、図11E、Fは、ダイヤモンドチップとシリコンプローブでそれぞれ得られた同じサンプル表面の特徴の拡大画像を示し、画像の解像度と忠実度に対するチップの形状と半径の影響を示しています。図11Gは、シャープで高アスペクトのシリコンプローブで取得した表面トポグラフィー(図8A、B)と、オーバーレイされたカラースキンとしてエンコードされたダイヤモンドチッププローブで取得した弾性率値(図8E、F)を組み合わせた合成3D画像を示しています。
図10と図11に示す大きな画像に加えて、完全に較正されたダイヤモンドチッププローブを使用して、より小さな(10 μm x 10 μm)急速力曲線ベースの画像を取得しました。これらの画像は、周囲の有機マトリックスの特性をより詳細に調査するために、光学的に見える無機鉱物インクルージョンがない領域に焦点を合わせました。512 x 512(~20 nm x 20 nmのサンプリングピクセル)のピクセル解像度を採用することで、10 μm x 10 μmの画像ごとに>262,000個のF-D曲線をキャプチャして保存し、優れた統計を可能にしました。F−Dデータは、AtomicJソフトウェアパッケージ23を用いてバッチ処理および解析され、デルジャギン−ミュラー−トポロフ(DMT)35接触力学モデルが実装された。フィッティングに続いて、データをクリーニングして曲線を除去し、他の研究と同様に計算された弾性率<0(非物理的)または>30 GPa(研究は頁岩の非鉱物部分、E << 30 GPaに焦点を当てていたため)他の研究39,40、およびモデル適合R2 < 0.7のデータ。R2カットオフはやや任意ですが、モデルが明らかに正確に適合できないデータのみを削除するように選択されました。イメージング領域に大きな鉱物インクルージョンを含む1つの外れ値を除いて、除去された曲線は、各画像の合計データの0.5%未満を占めました。統計結果の概要を表2に示します。計算された弾性率は3.5から6.1 GPaまで変化し、同様の研究でも39,40が見つかった範囲内です。
| 見本 | E (GPa) | データクリーニング後の歩留まり | カウント (n) |
| 1 | 6.1 ± 3.8 | 93.70% | 7,36,874 |
| 2 | 5.1 ± 2.6 | 99.70% | 7,84,267 |
| 3 | 3.5 ± 1.9 | 99.60% | 7,83,427 |
表2:バッケン頁岩の弾性率統計。 組成と熱成熟度の異なる3つのバッケン頁岩サンプルにおける有機マトリックスの弾性率を測定しました。サンプル1は対照であり、一方、サンプル2および3は、それぞれ12時間および48時間アニールされ、人工的に熱成熟をシミュレートした。弾性率は、各サンプル位置の平均±標準偏差として報告され、示されたテキストに記載されているデータクリーニング手順を使用した後の分析に含まれる力曲線の数(カウント、n)が含まれます。計算された平均弾性率(3.5-6.1 GPa)は、2.9-11.8 GPaの弾性率範囲を発見したLi et al.40などの他の同様の研究で報告された範囲内にあります。
間葉系幹細胞の核硬直は外部刺激により変化する
間葉系幹細胞(MSC)は、軟骨細胞、脂肪細胞、骨芽細胞、および筋細胞になり得る前駆細胞である41。これらの様々な組織型へのMSC分化は、細胞骨格と核骨格(LINC)複合体のリンカーを介した細胞上の外部機械的刺激によって影響を受け、これは外側の細胞膜を核膜41に物理的に連結する。LINC複合体は、細胞骨格と相互作用して細胞にかかる物理的な力を検出し、機械感受性因子β-カテニンとYAPの核内への輸入を促進して分化プロセスを開始するSUNおよびネスプリンタンパク質で構成されています42,43,44。細胞の機械刺激後のβ-カテニンとYAPの核内輸入に加えて、細胞骨格は、核の周りのF-アクチンフィラメントの形成やアクチン44,45,46の核転座を含む再配列も受けます。機械刺激は細胞骨格とアクチンの核侵入に変化を開始するため、細胞と核の全体的な剛性(弾性率)が影響を受け、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションによって測定できます。以前の研究では、LINC複合体の破壊後の細胞および核弾性率の低下、および逆にMSCの機械刺激後の細胞および核弾性率の増加を検出することによってこれが確認されています47。現在の研究では、アクチンが核に侵入するメカニズムと、アクチン重合が機械刺激後の細胞および核弾性率にどのように影響するかはまだ調査中です。
生細胞の機械的特性を調べるには、緩衝液(通常はPBS)で実験を行う必要があります。流体中でカンチレバーベースのナノインデンテーションを行うことは、特にMSC(E≈ 2 kPa)などの非常に柔らかいサンプルの測定において、独特の問題を引き起こします。特に、生細胞の弾性率が低いため、細胞構造に与えられる応力を低減し、膜の穿刺を回避するために、大きなプローブ半径を使用する必要があります。さらに、このような低い弾性率を測定するには、非常に低いばね定数カンチレバー(k = 0.04 N / m)が必要ですが、これにより、流体の粘性抗力による誤った係合の可能性が高まり、AFM係合プロセスの最初の高速下降ステップ中にソフトカンチレバーがたわみます。誤エンゲージの傾向が高いことを打ち消すには、より大きなエンゲージ設定値(つまり、エンゲージプロセスを終了するためのたわみ電圧トリガーしきい値)を利用する必要がある場合があります。柔らかいカンチレバーは一般に硬いカンチレバーよりも弾性的に変形する可能性があるため、流体の噛み合い設定値が高いほど大きな曲げが発生しても、一般にそのようなソフトプローブに悪影響を与えることはありません。さらに、浮遊する破片や気泡が流体を介したレーザーのPSDへの透過を一時的に妨害したり、カンチレバーに付着してレーザーを遮断したりする可能性があるため、流体環境で使用される溶液に破片や気泡がないことが不可欠です。レーザービームとの干渉は、結果として生じるF-D曲線に悪影響を及ぼし、多くの場合、誤った衝突検出または誤った係合を引き起こします。最後に、生細胞のナノインデンテーションは、より硬くて無生物の材料よりも多くのユーザー入力を必要とします。特に、細胞とその流体環境ははるかに動的であるため、良好なF-D曲線が得られるように、各ランプのプローブの高さを積極的に調整する必要がある場合があります。
生細胞のナノインデンテーションでは、硬いサンプルに対して同じカンチレバーのたわみをもたらすために、はるかに大きなサンプルの変形が必要になることがよくあります。このより大きな変形は、ヘルツモデルの線形弾性の仮定から逸脱した実験結果をもたらす可能性があり、したがって、正確なF−D解析のための超弾性挙動を説明するために補正係数を適用する必要があるかもしれない48。R2が圧子の半径、R1がセルの半径である幾何学的サイズ比
(図12Aを参照)を使用して、結果のデータのヘルツ力学への準拠を予測できることがわかっています。理想的な幾何学的サイズ比はβ = 0.3であり、β値<0.3は弾性率の過小評価につながり、β値はヘルツ接触理論48で分析した場合>弾性率の過大評価につながります。非線形効果を回避する一般的な方法の 1 つは、変形を小さく保つことです。この研究では、押し込み深さは500 nm-1 μmに制限されていました。
MSCおよび単離された核に対する単一セットのナノインデンテーション実験の結果を示す代表的なデータセットを図12Bに示す。図12Bに示されているデータでは、事前に校正された(LDVによるばね定数とSEMによる先端半径)、公称ばね定数がk = 0.04 N / mの半径5 μmの半球プローブを使用して、無傷の生きたMSCと孤立したMSC核の間の弾性率の違いを調査し、細胞および核の機械的特性に対する静的および動的ひずみの影響をテストするためのコントロールとして機能しました46.細胞と核との関わりの違いと課題のために、抽出されたモジュラスデータは大きな変動(すなわち、値の分布)を示す傾向があります。したがって、図12Bのデータセットは、収集されたデータの75パーセンタイルを示しています。生細胞間のこの生来の変動性と結果として生じる測定の広がりのために、データ分析と解釈のための堅牢な統計を生成するために、少なくとも3つの生物学的複製を持つ多数のサンプルに対して複製ナノインデンテーション実験を実施することが推奨されます30。
コレステロール含有脂質二重層の機械的性質
眼の水晶体膜に見られる典型的な組成物である、非常に高い(>50モル%)コレステロール(Chol)含量を有する支持脂質膜を調製し、新たに切断した白雲母49上でインキュベートした。Chol/POPC(POPC = 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン)混合比1で調製したこのような支持脂質膜(SLM)の代表的なAFMトポグラフィ像を図 13Aに示し、図の下に示す画像の紫色の線に沿った高さプロファイルを示します。 図13A のSLMは、トポグラフィー画像に識別可能な特徴がないことからも明らかなように、十分なインキュベーション時間(~25分)と十分な脂質濃度(0.3 mg/mL)で露出した雲母表面を完全に覆っていました。同様に、画像全体の高さプロファイルは、膜表面の粗さに関する構造の詳細を提供し、SLMは予想どおりに滑らかです。
図13Bは、図13Aに示すSLM上で捕捉された力曲線の接近断面の集合を示す。SLMの機械的特性に関するより良い統計を達成するために、力曲線は、SLMのほぼ全幅をカバーする、少なくとも100nm離れた等距離の点で収集されました。ポイント間の間隔 (インデントの深さの ≥10 倍) は、インデントが互いに近すぎるのを防ぐために選択されました。力曲線は、力曲線のアプローチ部分における~0 nmと~5 nmの分離距離の間の不連続性または突然のジャンプによって証明されるように、明確なブレークスルーイベントを示しており、力は~10 nNから~5 nNに急激に低下します。図13Bのアプローチ曲線に基づく図13Aに示す膜の平均破断力(Chol/POPC混合比1)は、9.25±0.27nNと計算されています。
対照的に、 図13C は、Chol/POPC混合比1で膜を再びインキュベートすることによって形成された部分膜または膜パッチのAFMトポグラフィー画像を示していますが、脂質の濃度ははるかに低く(~15 μg/mL)、インキュベーション時間は短く(~5-6分)49。画像中央のメンブレンパッチを横切る赤い線に沿った高さプロファイルを図の下に示します。部分二重層を横切る測定は、SLMの厚さを提供し、 図13C の黒い破線で示されているのは~7nmである。しかしながら、この測定された厚さはまた、膜と雲母ディスク50との間に1〜2nmの水層を組み込んでいる。部分膜は雲母表面に弱く付着しているだけであることが多く、スキャン中に部分膜パッチの端から脂質粒子が除去される可能性がありますが、インキュベーション時間をわずかに長くするか、イメージング力を下げることで、この困難を解消できます。
AFMプローブの校正は、SLMの機械的特性を正確に定量化するために重要です。特に、先端ばね定数は空気または流体媒体で一定ですが、たわみ感度は実験が行われるのと同じ媒体で校正する必要があります。裏面コーティングのレーザーアライメントや反射率は、特に流体では時間の経過とともに変化する可能性があるため、再現性のある結果を得るには、力曲線取得の各セットの直前にたわみ感度を校正することが重要です。非常に鋭いプローブは、SLMに簡単に穴を開け、誤って低いブレークスルー力を測定するか、ブレークスルーがまったくない可能性があるため、膜力曲線をキャプチャするためにお勧めしません。ただし、適切な洗浄を行わずに同じチップを繰り返し使用すると、チップに破片が蓄積し、チップが鈍くなったり、チップとサンプルの接着力に影響を与えたりする可能性が高くなります。アプローチ力曲線に明らかなブレークスルーイベントの欠如は、実際の膜ではなくマイカのみを押すことにも対応している可能性があります。そのため、力曲線を捉える前に膜形成を目視で確認する必要があります。
図7:空気および流体の代表的な力-変位(F-D)曲線。 (A)DMTモデル適合を伴う空気中のロブロリーマツ、および(B)ヘルツモデル適合を伴うPBS中の生きたMSC核で得られた代表的な力曲線。パネル A と B の挿入図は、対応するアプローチ曲線の接触領域 (青色のトレース) とそれに伴うフィット (緑色のトレース) のズームを示しています。各パネルでは、最初のチップとサンプルの接触点(フィッティングアルゴリズムによって決定)は緑色のひし形で示され、ターンアラウンドポイント(つまり、アプローチから後退または撤退への移行)はシアンの円で示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:シリコンとダイヤモンドのプローブ先端摩耗の比較。 (A-D)シリコンプローブチップ。バッケン頁岩サンプルの3つの連続した85 μm x 85 μm(1024 x 1024ピクセル)の力曲線ベースの画像の過程で経験した進行性の先端摩耗による、硬いカンチレバーシリコンチッププローブ(材料表を参照)の半径の進化を示す、チップ特性評価サンプルのイメージング後にブラインドチップ再構成法によって作成された一連のモデル、 0.1 Hzのラインスキャンレートと2 kHzのフォースカーブサンプリングレートで実施(つまり、~2,000万チップサンプル相互作用/画像)。(A)使用前に受け取ったチップ(箱から出して)。R = 11 nm。(B)1枚の画像(R=43nm)の後の先端。(C)2枚の画像(R = 94 nm)の後の先端。(D)3枚の画像(R=129nm)後の先端。(E,F)ダイヤモンドプローブチップ。同じダイヤモンドチッププローブのBTRモデル(材料表を参照)は、~6ヶ月間隔で入手しました。EおよびFに示すモデルの生成に使用される先端画像の取得の間に、プローブを使用して数千のナノインデントが実行され、力曲線ベースのイメージング中に数億の先端とサンプルの相互作用が発生しました。それにもかかわらず、ダイヤモンドの硬度のために、推定された~30nmの先端半径は、先端の初期(E)画像の取得と追跡(F)画像の取得の間のBTR技術の不確かさの範囲内で変化しませんでした。以前のモデルで観察されたアスペリティ(パネルEの黒い円で示されている)は、BTR法のアーティファクトであるか、先端の側面にナノスケールの汚染物質(ダスト粒子など)が存在することが原因である可能性があります。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図9:ロブロリーマツサンプルのAFM地形と弾性率マップ。 細胞壁のカンチレバーベースのナノインデンテーション測定を可能にするために、樹脂に埋め込まれた断面ロブロリーパインサンプルで空気中で取得した代表的なAFMデータ。(A)擬似3D描写として提示された、迅速な力曲線ベースのイメージングモード を介して 取得された複数の細胞をカバーするAFMトポグラフィ画像。(B)各ピクセルで取得した力曲線を解析し、データをDMTモデルに適合させることによってAFMソフトウェアによってリアルタイムで生成された弾性率またはヤング率マップは、細胞壁が細胞内部よりも硬いことを示しています。測定されたプローブキャリブレーションパラメータではなく公称プローブキャリブレーションパラメータを使用したため、弾性率値は定性的または半定量的なものとして扱う必要があることに注意してください。(C)AFM画像取得後に選択した細胞壁に沿って400ナノインデント(公称ランプサイズ60 nm、平均くぼみ深さ~10 nmに対応する1 μNのトリガー閾値)を行い、ナノスケールの精度でくぼみの位置を特定できるようにした場所(間隔≥100 nm)の50本の白い十字線で構成される8本の線)を示すROIの概要。スケールバー = 20 μm (A、B)。略語:AFM =原子間力顕微鏡;DMT = Derjaguin-Muller-Toporov. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図10:バッケン頁岩サンプルの共局在AFMとSEM / EDS 。 (A)バッケン頁岩試料の一部の二次電子SEM像。(B) Aの黒枠で示した領域のAFMトポグラフィ像。黒い楕円形は、プローブの低アスペクト比が、急峻で高アスペクト比の表面トポグラフィ機能ではなく、プローブ側壁のイメージングにつながる領域を示します。(c) Aに示すSEM画像について得られたEDS元素組成マップ。(d) AFM由来の弾性またはヤング率マップBにおけるAFMトポグラフィ画像を取得する過程で生成し、画像 A〜D の中心にある鉱物包有物が周囲の有機マトリックスよりも著しく硬いことを示す。スケールバー = 50 μm。略語:AFM =原子間力顕微鏡;SEM = 走査型電子顕微鏡;EDS = エネルギー分散型分光法。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図11:高アスペクト比の特徴の外観に対するプローブ先端の半径と形状の影響。バッケン頁岩サンプル上の同じ位置を画像化するために、(A)R≈ 30 nmの低アスペクト比(先端半角= 47°)ダイヤモンドチッププローブ(材料表を参照)または(B)R≈ 10 nmの高アスペクト比(先端半角≈19°)の剛性シリコンプローブ(公称k = 200 N / m、材料表を参照)のいずれかを使用して得られた特徴分解能の比較。(C-F)曲率半径が大きい低アスペクト比のダイヤモンドチッププローブ(C、E)またはよりシャープでアスペクト比の高い剛性シリコンタッピングモードプローブ(D、F)のいずれかで得られたAおよびBの青色(C、D)およびオレンジ(E、F)のボックス領域の拡大画像は、ダイヤモンドチッププローブで得られたAFMトポグラフィ画像における特徴分解能の低下と先端側壁アーチファクトの導入を強調しています。ハーフアングル。C-Fで強調表示されている領域には、横方向の解像度、正確なトラッキング、および画像忠実度の点で、より鈍く、最初は鋭利なシリコンプローブと、鈍くて耐摩耗性のあるダイヤモンドチッププローブの間のトレードオフを示す、急勾配で深い井戸のような特徴が含まれています。(G)シャープで高アスペクト比の硬いシリコンプローブで取得したAFMトポグラフィと、ダイヤモンドチッププローブを使用したサンプルの同じ領域の急速な力曲線イメージングから得られた弾性率データ(オーバーレイカラースキン)を組み合わせて生成された合成3D画像。AとBの青と白のボックスで強調表示されている機能は、Gにも示されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図12:細胞または核上のカンチレバーベースのナノインデンテーション。 (a)平らで硬い基板上に配置された半径R1のセルは、半径R2の球状圧子によって深さdまでインデントされています。この図はDingら48から複製された。(B)マウス間葉系幹細胞およびマウス間葉系幹細胞から抽出した単離核に対するAFMカンチレバーベースのナノインデンテーション実験から得られた代表的な弾性率測定値の個別値プロット。合計10個の細胞と10個の核を、500〜600 nmのくぼみの深さでそれぞれ5回測定しました(ヘルツ接触力学モデルの使用を許可するために選択)。得られた生のF−D曲線データをAtomic J23を用いて処理し、弾性率を算出した。細胞の生来の変動性が大きいため、データの75パーセンタイルがプロットされます。細胞と単離された核は弾性率に統計的な差を示さず、測定された平均弾性率はそれぞれ0.75±0.22 kPaと0.73±0.22 kPaでした。同様のデータが収集および分析され、機械的刺激、タンパク質ノックアウト、および化学的処理による核剛性の違いが特定されています。略語:MSC =間葉系幹細胞;AFM = 原子間力顕微鏡;F-D =力変位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図13:脂質二重層の形態とナノ機械的特性 。 (A)長いインキュベーション時間(~25分)と高い脂質濃度(0.3 mg/mL)で露出した雲母表面全体に形成された混合比1のChol/POPCで構成される完全支持脂質膜(SLM)の高さ変動が最小であることを示すAFMトポグラフィー画像。画像の中央を横切る紫色の線に沿った高さプロファイルが図の下に示されており、膜表面の構造の詳細を示しています。予想通り、SLMは非常にスムーズです。(B) Aに示すSLM上に捕捉された力曲線の接近断面の集合体。力曲線は、SLMのほぼ全体をカバーする≥100nm離れた等距離の点で収集されました。力曲線は、力曲線のアプローチセクションの不連続性または突然のジャンプによって証明されるように、明確なブレークスルーイベントを示しています。平均破断力は9.25 ± 0.27 nNです。(C)Chol/POPC混合比1で膜をインキュベートすることによって形成された部分膜または膜パッチで、 A49と比較してインキュベーション時間が短く(~5〜6分)、脂質濃度が低い(~15 μg/mL)。パッチの赤い線に沿った高さプロファイルが画像の下に示されています。部分的な二重層は、高さプロファイルの黒い破線で示されるSLMの厚さの測定を可能にします。なお、測定された厚さには、膜と雲母ディスク50との間に1〜2nmの水層も組み込まれている。この図は、エルゼビアの許可を得てKhadkaら49 から採用されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
サンプル調製
空気中のナノインデンテーションの場合、一般的な調製方法には、凍結切片(例えば、組織サンプル)、粉砕および/または研磨とそれに続くウルトラミクロトミング(例えば、樹脂包埋生物学的サンプル)、イオンミリングまたは集束イオンビーム調製(例えば、研磨に適さない半導体、多孔質、または混合硬度サンプル)、機械的または電気化学的研磨(例えば、金属合金)、または薄膜堆積(例えば、原子層または化学蒸着、 分子線エピタキシー)。目標は、最小限の表面粗さ(理想的にはnmスケール、意図したくぼみ深さの≤0.1倍)のサンプルを作成することです。前述の方法の多くでは、サンプルを高純度のろ過(HPLCグレードなど)溶媒ですすぎ、および/または超音波処理し、超高純度(99.999%)窒素(N2)ガスで乾燥させて粒子状破片を除去する必要があります。あるいは、フレーク(例えば、2D材料)または粒子(例えば、ナノ粒子またはマイクロカプセル)は、高純度の濾過溶媒を用いて調製された溶液からスピンコーティングまたはドロップキャストされ得る。この場合の目標は、サンプル上のランダムに選択された領域の視野内に複数の重なり合わないフレークまたは粒子を生成する表面密度を達成することです。流体中のナノインデンテーション(生存を維持するために緩衝液を必要とする生物学的サンプルによく使用されます)では、滑らかな(ナノメートルスケールの表面粗さ)基板(顕微鏡スライド、ペトリ皿、または新たに切断された白雲母雲母など)へのサンプルの堆積または調製が必要です46,47,49。
プローブの選択に関する考慮事項
チップとサンプルの相互作用はカンチレバーベースのナノインデンテーションで測定される基本的な特性であるため、適切なプローブの選択はF-D曲線の定量分析にとって最も重要です。以下の質問は、特定の実験用のプローブを選択する際に特に重要です。サンプルの予想される(または測定された)表面粗さと弾性率の範囲はどれくらいですか?高粗さのサンプルは、急峻な特徴を追跡するときにチップに存在する横方向の力の増加により、滑らかなサンプルと比較して摩耗を加速させる可能性があり、チップ破損イベントの可能性を高める可能性があります53。同様に、サンプルが硬いほど、プローブの先端が早く摩耗します。さらに、いくつの画像やナノインデントが必要ですか?イメージングとインデントが少ないため、チップの摩耗が少ないことが期待できます。以下で詳しく説明するように、ダイヤモンドライクカーボン(DLC)コーティングを利用することでチップの摩耗を低減することも、ダイヤモンドチッププローブを使用することで実質的に排除することもできます(取得にかかる高いコストは、プローブの寿命がほぼ無限であるため、時間の経過とともに相殺されます)。
適切なプローブを選択する際の別の考慮事項は、対象となる特徴のサイズです。ナノインデンテーションの場合、チップが大きいほど破壊によるチップ形状の急激な変化が発生する可能性が低く、摩耗率も低いため、問題のサンプルに必要な空間分解能と必要な情報コンテンツを維持しながら、可能な限り最大のチップサイズを使用するのが最善であることがよくあります54。また、導電性AFM 55、ケルビンプローブ力顕微鏡(KPFM)56、磁力顕微鏡(MFM)57など、ナノインデンテーションと共局在する他のAFM法があるかどうかを検討することも重要です。このような追加の計測を利用する場合、プローブチップは導電性または磁性である必要があり、材料の組成に影響を与え、したがって硬度、耐摩耗性、チップ半径などの多くの特性に影響を与えます。同様に、流体中で圧痕を行う場合、プローブの反射裏面コーティング(存在する場合)の組成は、耐食性がなければならないため、別の重要な考慮事項です(たとえば、流体プローブではAu裏面コーティングが一般的です)。最後に、そしておそらく最も重要なことは、プローブカンチレバーのばね定数を、測定する弾性率の予想される範囲に一致させる必要があることです。ばね定数がサンプル弾性率とうまく一致しない場合、2つのケースのいずれかが発生する可能性があります。カンチレバーが硬すぎると、たわみがほとんどまたはまったく測定されず、特性評価が不可能になります。逆に、カンチレバーが柔らかすぎると、サンプルを十分に変形させて機械的特性を測定することができません。
チップウェア
摩耗はさまざまな方法で定義できます。ここでのAFMプローブ先端摩耗の議論では、材料を失うことなく塑性変形によるプローブ先端の表面トポグラフィーの変化、および物理的相互作用58による表面からの材料の除去として定義されます。より広い意味では、摩耗には酸化や水和などの化学反応も含まれる場合があります。通常のAFMアプリケーションでは、横方向の空間分解能は通常、先端半径59によって制限され、先端とサンプルの相互作用が主要な測定特性です。先端半径は、チップサンプルシステムの接触力学をモデル化し、その後の機械的特性を決定する際の重要なパラメータであるため、先端の摩耗はナノインデンテーション実験を行う際に特に懸念され、ナノインデンテーション結果を正確に解釈するための重要な制限です53。チップ摩耗は通常緩やかな性質(チップ破損イベントを除く)のため、単一のナノインデンテーションサイクル(すなわち、ランプ)によるチップ摩耗を定量化することはできません。さらに、ナノインデンテーションにおけるサンプルに対するプローブ先端の垂直な動き(急速な力曲線ベースのイメージングを割り引く)は、先端摩耗の主なモードが通常スキャンモード60中に発生するせん断力であるため、摩耗率を低減するのに役立ちます。そのため、ナノインデンテーション実験におけるチップ摩耗の主な原因は、最初のプローブキャリブレーション(特に、たわみ感度とチップ半径の測定)後、ナノインデンテーションの前に実行されるイメージングです。したがって、シリコンまたは窒化シリコンプローブを使用する場合は、各実験の前後にチップ半径をチェックして、上記の方法(SEM分析やBTRなど)のいずれかを使用してチップの摩耗を監視および説明することをお勧めします。
プローブ材料
ダイヤモンドライクカーボン(DLC)
DLCコーティングされたプローブチップまたはダイヤモンドチップを使用することで、チップの摩耗を大幅に低減または完全に打ち消すことができます53。これらの代替チップ材料の強化された耐摩耗性は、特に非常に硬い材料の機械的特性の測定に非常に魅力的です。DLCプローブ先端部は、通常のシリコンプローブ先端部54と比較して、耐摩耗性の1,600倍の増加を示すことができることが示された。耐摩耗性のこの劇的な増加は、いくつかの要因に起因する可能性があります。まず、DLCに存在する結合(C-CおよびC = C)とそのシリコンとの界面(Si-O、Si-C)は、あらゆる元素対の中で最も強い結合の一部であり、シリコンチップに存在するSi-Si結合よりもはるかに強力です。DLCには摩擦を低減する効果もあり、チップ内のせん断応力を低減し、摩耗を低減します。さらに、DLC表面化学はシリコンチップのそれとは異なり、シリコンチップは周囲湿度条件下でトライボケミカルエッチングを経験する可能性がありますが、DLCチップはそうではありません(または少なくとも一次摩耗モードと比較して意味のある方法ではありません)54。DLCコーティングされたチップの主な欠点(標準のコーティングされていないシリコンチップと比較して価格の上昇を超えて)は、コーティング自体によるチップ半径の増加です。ほとんどのDLCプローブチップ半径は≥30nmですが、DLCコーティングされていないチップは半径61で1〜2nmに確実に到達できます。ただし、プローブの欠陥や凹凸による理想的な面積-深さ関数と実際の面積-深さ関数の間のナノスケールの不一致は、相対誤差が大きいために半径の小さいプローブで行われた測定に不釣り合いに影響するため、ナノインデンテーション実験では、より大きな先端半径が望ましいことがよくあります。さらに、その優れた耐摩耗性にもかかわらず、DLCコーティングは最終的にスポットで摩耗し、露出したシリコンコアと残りのDLCコーティングとの間に差動摩耗をもたらす可能性があります。残念ながら、DLCコーティングの耐摩耗性は、コーティング単独の実際の硬度ではなく、シリコンチップへのコーティングの接着によっても制限される場合があります。
ダイヤモンド
ダイヤモンドは、地球上で最も硬く、最も耐摩耗性のある材料の1つとしてよく知られています。それにもかかわらず、チップの摩耗を意図的に調査する試みで大きな(60μN)力を使用すると、ダイヤモンドチップに重大な摩耗が発生する可能性があることが実証されています62。逆に、チップにかかる力がはるかに少ない通常のナノインデンテーションおよびイメージングシナリオでは、ダイヤモンドチップの摩耗に関する厳密な研究は行われていません。しかし、図8E、Fに見られるように、6か月離れた同じチップ特性評価サンプルで同じ条件下で同じダイヤモンドプローブチップのBTRモデリングを行うと、事実上区別できないチップ形状モデルが生成されました(つまり、摩耗の識別可能な証拠はありません)。1枚目と2枚目のBTR画像の間に、プローブを使用して数千のナノインデントを実行し、木材(ロブロリーパイン)、頁岩、高秩序熱分解グラファイト(HOPG)、さまざまなグラフェン薄膜など、さまざまな硬い材料(E > 15 GPa)をイメージングしながら、数億のチップとサンプルの相互作用を行いました。重要なことに、推定先端半径は図8E,Fの2つの画像間で~1 nm変化し、BTR法の誤差63の範囲内です。完全な研究ではありませんが、この比較は、通常の実験的ナノインデンテーション(さらにはイメージング)条件下でのダイヤモンドプローブの優れた耐久性を示しています。ダイヤモンドチップの使用に関連する主な欠点(高価な初期費用を超えて)は、チップ半径の増加と、より懸念されるいくつかの点で、ほとんどの市販のダイヤモンドチップのキューブコーナージオメトリのアスペクト比が低いことです。図11A,Bは、公称先端半径8 nm、平均半角~19°のシャープシリコンプローブと、公称先端半径40 nm、平均側面角47°のダイヤモンドチッププローブで取得したバッケン頁岩サンプルの同じ領域のAFM画像を並べて比較したものです。拡大された領域を比較すると(図11C、Dと図11E、F)、ダイヤモンドチッププローブが画像内の急峻な(より高いアスペクト比)特徴を分解して正確に追跡できないことがすぐにわかります。代わりに、急峻な特徴が存在する場合、先端の側壁が上端と接触し、AFMシステムは基本的にプローブの側壁を追跡し、先端が再び表面に接触して通常の追跡が再開されます。
ばね定数/弾性率マッチング
前述のように、プローブカンチレバーのばね定数は、測定する弾性率の予想される範囲に一致させる必要があります。適切なプローブの選択を支援するために、 表3 は、ナノインデンテーションによく使用される~30-40nm半径のプローブチップの場合、数MPaから100GPaの範囲の予想されるサンプル弾性率の選択された広い範囲に適した推奨される公称カンチレバースプリング定数を示しています52。下部スプリング定数プローブ(k < 0.1 N/m)は、セルなどのさらに柔らかい材料(kPa範囲)に使用できます。
| ばね定数 (該当なし) | 予想されるサンプル弾性率の範囲 |
| 0.25 | ≤ 15メガパスカル |
| 5 | 5 – 500 メガパスカル |
| 40 | 200 – 8,000 (0.2 – 8 GPa) |
| 200 | 1,000 – 50,000 (1 – 50 GPa) |
| 450 | 10,000 – 100,000 (10 – 100 GPa) |
表3:さまざまな弾性率範囲を測定するための理想的なプローブスプリング定数。 典型的なプローブ半径を~30-40 nm52と仮定して、数MPaから100 GPaまでのさまざまな範囲にわたる弾性率の最適な測定のためのおおよその公称プローブばね定数。
ばね定数に加えて、生物学的材料の特殊なケースでは、損傷を避けるために、イメージングおよびナノインデンテーション中に加えられる先端半径と力を慎重に考慮する必要があります。代表的な結果のセクションで提示されたコレステロール含有脂質二重層の機械的特性の測定を含む アプリケーション例では 、比較的鋭い(10 nm)先端が、脂質二重層の突破力の分析に特に使用されました。対照的に、材料ROIが十分に大きく(例えば、細胞および細胞核の場合のように)、穿刺の可能性に関して懸念がある場合、代表的な結果のセクションの アプリケーション例 の1つに記載されているMSC核の剛性測定で使用されるような、より大きなミクロンスケールの半球チップが理想的であり、ソフトに対して優れた結果を提供します。 生細胞や単離された核などの壊れやすいサンプル。Kainらは、そのようなサンプル64について可能な限り最高の測定感度を達成するために、プローブ半径とばね定数の最適な組み合わせを選択する方法についての詳細な議論を提示する。
プローブキャリブレーション
たわみ感度
たわみ感度は、Zピエゾの動き(したがって、小さなたわみの限界での動作を想定して、無限に硬い基板にくぼみを入れるときのカンチレバーのたわみ)をPSD65の電圧の測定された変化に関連付けます。偏向感度(逆光レバー感度[InvOLS]とも呼ばれる)は、nm/VまたはV/nmで報告される場合があります。最も一般的なたわみ感度校正方法の概要を以下に示します。
硬い表面接触
ビームバウンスレーザー/AFMプローブ/PSDシステムの偏向感度を決定するための最も簡単で最も一般的な方法は、適切に「ハード表面接触」法65です。そのシンプルさ、AFM制御ソフトウェアワークフローへの統合の容易さ、および現場の性質はすべて、ハードサーフェスコンタクトメソッドの魅力と広範な使用に追加されます。この方法を実装するために、AFMプローブの先端は、カンチレバーよりもはるかに硬い材料に対して傾斜します。力-変位曲線の接触部分の傾き(nm単位のZピエゾ運動または印加電圧の関数としてPSD上の垂直たわみ誤差信号のボルトとして表示される)は、たわみ感度を与えます(図3A)。剛性の高い基板を使用することで、測定されたたわみのすべてが、サンプルの変形とカンチレバーの変位の畳み込みではなく、カンチレバーの曲げから生じることが保証されます。ソフトカンチレバー(例えば、k < 10 N/m)、シリコン(E ≈ 170 GPa)27またはマイカ17は、容易にアクセスでき、容易に使用できる材料(またはガラス、E≈ 70 GPa、または顕微鏡スライドまたはペトリ皿に固定された細胞の場合は適切に硬質プラスチック)であるが、より硬いカンチレバーの場合、 いくつかのナノインデンテーション実験に使用されるものなど(例えば、k > 200 N / m;表3)、サンプルの変形が発生しないようにするために、サファイア(E≈345 GPa)26,66を使用する必要がある場合があります。この方法は力変位測定に依存するため、AFMスキャナーのZピエゾは、閉ループ高さセンサーを使用するか、さまざまな高さ基準を使用して十分に校正する必要があります(開ループモードで動作している場合)。硬質表面接触法の誤差の最大の原因は、熱変動によるカンチレバー上のレーザースポットの移動です。カンチレバーの温度の変化は、最も一般的には検出レーザーによって引き起こされますが、周囲の電子機器のジュール加熱も寄与する可能性があります。カンチレバーと周囲空気との間の6°Cの全体的な温度差が報告されており、これは数ミクロン67のレーザースポットシフトをもたらし得る。加熱を考慮するために、最初のレーザースポットアライメントから≥30分待って、カンチレバーが周囲と熱平衡状態になり、最良かつ最も正確な結果を得ることをお勧めします。各感度測定のアプローチ曲線と引き出し曲線の傾きを平均化することは、先端の摩擦または滑りの影響を考慮し、可能であれば制定する必要があります68。さらに、複数の感度測定の平均化は、測定の信頼性と再現性を測定するのに役立ちます。良好な感度測定は、≤1%の偏差をもたらし、較正の有効性を最大化するために予想される実験用ナノインデントとほぼ同じたわみで実行されるべきである69。硬質表面接触法の主な欠点は、キャリブレーションに必要な物理的接触が、壊れやすいシリコンチップに損傷を与える可能性があることです(たとえば、鈍化やダブルチップなどのチップアーチファクトの作成)。
熱雑音法
たわみ感度を決定する熱雑音法は、カンチレバーばね定数の事前較正およびカンチレバー67の熱雑音スペクトルを測定する能力を必要とする。熱雑音法は、最新のAFM制御ソフトウェアに統合されていることが多く、Sader法(下記参照)と組み合わせて使用することで、ばね定数とたわみ感度の両方を迅速に分析および計算できます。ただし、振動振幅が低下するため、より硬い(k > 10 N / m)カンチレバーで熱ノイズ法を使用することは困難または不可能な場合があります。さらに、報告されている熱雑音法の相対的な不確かさは、上記の硬質表面接触法と比較して~20%と大幅に大きくなっています70。この手法は、後述するばね定数を決定するためのサーマルチューン法が採用されている場合には使用できない67。
ばね定数
カンチレバーばね定数を測定するためのゴールドスタンダードはレーザードップラー振動計(LDV)であり、現在、個々のプローブごとにメーカーが提供するLDV由来のばね定数校正情報が付属する市販のプローブが多数あります( 材料表を参照)。ただし、カンチレバーのばね定数を正確に測定することは、定量的なナノメカニカル測定には絶対に必要ですが、校正されていないプローブの一般的な実験室でこれを行うための実用的な方法は多種多様であり、やや複雑になる可能性があります。そのため、ここでは、最も一般的な2つのオンサイトスプリング定数校正方法の簡単な概要のみを提供し、追加の方法のリストと、詳細については参照する必要のある適切な文献引用を示します。
サーマルチューン方式
今日の商用AFMで利用可能な最も一般的な方法であると思われる、カンチレバースプリング定数を決定するためのサーマルチューン法は、多くのシステムの制御ソフトウェアに組み込まれています。カンチレバーたわみ検出の減少と電子機器の帯域幅の制限により、より剛性の高いカンチレバー(k > 10 N/m)には理想的ではありませんが、サーマルチューン法は比較的簡単に実装でき、広範囲の先端形状に有効です71。サーマルチューン法は、カンチレバーの熱雑音スペクトルの測定およびフィッティングを利用し、続いて等分割定理を適用してカンチレバーの位置エネルギーを計算し、カンチレバーは一般に単純な調和発振器72としてモデル化される。サーマルチューン方式は、ソフトプローブに対して~5%-10%の誤差があり、あらゆるカンチレバー形状73,74に適用できます。詳細については、このセクションで引用されている参考文献を参照してください。
サダー法
Sader法は、多くの最新のAFMの制御ソフトウェアにしばしば統合される別の方法です75,76,77。Sader法は、カンチレバーが流体媒体(通常は空気または水)で振動するときに受ける流体力学的負荷と、カンチレバーの平面図の寸法および品質係数を使用して、カンチレバーのばね定数を計算します。Sader法では、カンチレバーのばね定数74に対して~10%-15%の誤差が生じます。「元の方法」76,78、「一般的な方法」79、一般的な方法77の拡張、および機器固有のドキュメントに関する対応する論文は、さらなる詳細を提供することができます。
その他の方法
AFMカンチレバーのばね定数を決定するために開発および実装された他のいくつかの方法がありますが、このホワイトペーパーの範囲を超えています。これらの方法はどれも、Saderまたはサーマルチューンキャリブレーション方法ほど簡単に実装または普及していませんが、それぞれに独自の長所と短所があります。引用文献は、それらの適用と実装に関する詳細を提供します。特に、Sikoraは多くのばね定数校正方法の優れたレビューを提供し、トピック72に関する優れたリソースです。ばね定数を決定するための他の方法の非網羅的なリストには、レーザードップラー振動計(LDV)73,74,80、微小電気機械システム(MEMS)ベースのデバイス81、参照カンチレバー82,83、追加質量(動的75と静的84の両方)、精密天秤85,86、電磁作動87、および有限要素解析(FEA)88,89。
先端半径
先端半径を決定するための一般的な方法には、二次電子SEMイメージングとブラインドチップ再構成法(BTR)の両方が含まれます。
SEM分析
二次電子SEMイメージングは、1nmまでの解像度を提供し、摩耗のプログレッシブ画像を直接かつ簡単に比較することができます。SEMイメージングの欠点は、高度に実験的なAFM-SEMを組み合わせたツールしか存在しないため90であるため、AFMプローブは通常、マウントを解除して分析のためにSEMに輸送する必要があり、時間がかかり、プローブが汚染される可能性があることです。SEMのもう一つの欠点は、結果として得られる画像が本質的に先端の2D投影であり、定量的な3D情報が利用できないことです。電子ビームの入射角のわずかな変化でもプローブ先端の見かけのサイズと形状が変化する可能性があるため、比較結果が意味のあるものになるように、毎回プローブをまったく同じ方向に揃えるように注意する必要があります。最後に、SEMイメージングは、帯電効果と炭素汚染に悩まされる可能性があり、それぞれ画像がぼやけたり、プローブ先端に物理的な変化を引き起こしたりする可能性があります。
ブラインドチップの再構築
SEMとは対照的に、BTR法は、プローブの半径よりもはるかに小さい多数のシャープ(高アスペクト比)特徴を持つサンプルのイメージングに基づいて3Dチップ形状をモデル化する in situ 技術です。AFMでは、観測画像は常にプローブ先端形状と試料特徴形状の畳み込みであるため、極めてシャープな特徴を無限シャープとしてモデル化することで、先端形状を推定できるため、この方法が有効です。残念ながら、無限に鋭いスパイク(すなわち、先端半径よりもはるかに小さい表面の特徴)の仮定に加えて、BTR技術はイメージングノイズとスキャンパラメータの影響を受ける可能性があるため、非常に類似したイメージングパラメータを使用して比較画像を取得する必要があります。さらに、先端の複数の「画像」を使用して形状を再構築するため、先端の形状を直接1対1で逆計算することは不可能です。その性質上、BTR法は、先端形状63の上限をユーザに実際に知らせることしかできず、BTR法を実施するためにプローブを画像化する行為は、先端の摩耗(例えば、プローブ先端の鈍化または欠け)を招き得る。
相対キャリブレーション
特定のプローブ特性を容易かつ正確に測定できない場合があります。例えば、より硬いカンチレバーのばね定数は、帯域幅およびたわみの制限のために、サーマルチューン法で測定することが困難または不可能である91。上で説明したように、ばね定数を決定するための他の方法も存在しますが、サーマルチューン法は多くの最新のAFMに統合されているため、単純な日常使用のために実装されることがよくあります。同様に、PSD上のレーザーの動きをプローブカンチレバーの物理的なたわみに変換するために、実験の前にたわみ感度を常に校正する必要があります。ただし、実際には、先端半径の測定は最も時間のかかる校正ステップであり、プローブの先端を損傷する可能性が最も高いステップです。SEMまたはBTRを介して先端半径を直接測定できない場合は、表面粗さが最小(理想的には原子的に平坦)で、予想される実験弾性率に近い既知の弾性率を備えた標準参照サンプルが利用可能な場合、有効な先端半径を決定するための代替手段として相対校正手順を利用できます。相対較正のためのそのような理想的な参照標準の例には、白雲母雲母17、92、93、94、95およびHOPG96が含まれるが、kPaからMPaの範囲の弾性率を有するより柔らかいサンプルのための適切な参照標準を特定することの難しさを強調するのにも役立つ。相対キャリブレーションを実行するには、まず、メインプロトコルで説明されているようにたわみ感度をキャリブレーションする必要があります。次に、プローブの公称ばね定数を入力するか(通常はプローブに付属)、上記の方法のいずれかを介して測定する必要があります。3番目のステップは、適切なパラメータを使用したモジュラス参照標準サンプル表面のくぼみです。最後に、収集したF-D曲線データを分析し、実験的に測定された還元弾性率が予想される還元弾性率と一致するまで先端半径パラメータを調整する必要があります。キャリブレーションを適切とするために、対象の実験サンプルにインデントするときにこの深さを維持する必要があるため、参照サンプルで達成される平均変形深さに注意する必要があります。これで、対象のサンプルにくぼみが発生し、弾性率標準参照材料で達成された変形深さに一致するようにランプパラメータを調整できます。
相対較正法の利点の1つは、たわみ感度、ばね定数、および先端半径52の不正確な較正によって引き起こされる潜在的な累積誤差を回避することである。さらに、BTR方式よりもわずかに速く、プローブを損傷する可能性が低い可能性があります。相対キャリブレーション方法の最大の欠点は、1)nmからオングストロームスケールの表面粗さと、実験サンプルと同じプローブで分析できる目的のサンプルと同様のよく知られた機械的特性を備えた高品質の標準サンプルが必要であること、および2)キャリブレーションが有効であるためには、参照サンプルと実験サンプルの両方で同じまたは非常に類似した変形深さを達成する必要があります。したがって、可能であれば先端半径を直接測定することが好ましい。
データ分析
測定されたF-D曲線からサンプルの機械的特性を決定するために使用される分析方法は、ナノインデンテーションデータ自体の品質と同じくらい重要です。さまざまな基礎となる仮定に基づいて力と変位の関係をモデル化するいくつかの一般的な接触メカニズム理論があります(したがって、さまざまなシナリオに適用できます)。これらの接触力学モデルには、ハーツ97、スネドン28、JKR(ジョンソン、ケンドール、ロバーツ)98、DMT(デルジャギン、ミュラー、トポロフ)35,99、MD(モーギスダグデール)100、およびMYD(ミュラー、ユシチェンコ、デルジャギン)101,102が含まれます。さまざまな接触力学モデルの詳細な分析と比較、およびそれらの分析への応用が他の場所で提示されています29,30,103,104。このホワイト ペーパーの範囲を超えていますが、表 4 に、最も一般的な接触力学モデルの概要を示します。特に注目すべきは、JKR、DMTなどのより複雑なモデルには、チップとサンプルの接着30、35、98、99、100、101、102、103、104の効果が組み込まれており、力曲線に負のたわみが現れることで簡単に識別できることがよくあります(図3を参照)).実際には、選択した解析モデルを使用して、収集されたF-Dデータを適合させ、弾性率などの機械的特性を決定します。データを適切に適合させるには、初期接触点を決定するための平坦なベースライン、またはモデルとの相関が最大の実験データの部分に適合する有効接触点が必要です。
| 理論 | 適用性 | 仮定 | 制限 |
| ヘルツ | 簡単;流体中のサンプルによく使用されます。 | 癒着なし。 | 接着力が存在するシステムでは無効です。 |
| デルジャギン・ミュラー・トポロフ (DMT) | 小さな変形で硬い。 | 接触領域の短距離接着と接触領域外の長距離接着。 | 制限されたジオメトリは、接触面積の過小評価を引き起こす可能性があります。 |
| ジョンソン・ケンダル・ロバーツ(JKR) | 大きな変形で柔らかい。 | 接触領域のみの短距離接着力。 | 接着による負荷を過小評価する可能性があります。 |
| モーギス–ダグデール(MD) | この一般的なソリューションは、他の接着剤モデルをカバーしています。 | 亀裂としてモデル化されたチップ-サンプルインターフェース。 | パラメトリック方程式を含む解析ソリューション。 |
表4:一般的な接触力学モデル。 適用性、仮定、および制限が記載された一般的な接触力学モデルを選択します。
上記のモデルをF-D曲線の解析に実用化するには、コンピュータソフトウェアを使用して、数千または数百万の曲線を短時間で大規模にバッチ処理し、その結果を統計解析する必要があります。F-Dデータの解析には社内で書かれたコードがよく使われ、様々なAFMメーカーもソフトウェアパッケージを提供しています。ただし、そのオープンソースの性質、使いやすさ、および詳細な補足情報のために、著者はAtomicJ23の使用を推奨しています。このプログラムでは、上記の理論やその他の理論のいずれかを使用して、F-Dデータを簡単かつ正確に分析できます。コードはオープンソースであるため、複雑なコードを最初から構築することなく、特定のユースケースに合わせて簡単に操作およびカスタマイズできます。AtomicJソフトウェアパッケージの詳細については、Hermanowiczら23 を参照してください。
結論として、プローブの慎重なキャリブレーションにより、AFMプローブの先端がサンプル表面に加える接触面積と力を定量化して、ナノスケールの機械的特性、特に弾性率を決定できます。kPaからGPaの範囲の弾性率で、柔らかいサンプルと硬いサンプルの両方で空気または流体にAFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを正常に実装するためのベストプラクティスを強調する一般化されたプロトコルが、代表的な例とともに提示されました。プローブの選択(サンプル表面粗さ、フィーチャーサイズ、プローブアスペクト比、チップ摩耗を含む)、プローブキャリブレーション、データ解析(接触力学モデルと測定統計を含む)などの重要な考慮事項について説明しました。最後に、AFM由来のナノメカニカルマップとSEM / EDSなどの組成情報を提供する他の特性評価技術との共局在化が実証され、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーション を介した 弾性率以外のナノメカニカル特性(すなわち、脂質二重層破断力)の測定例が実証され、この技術の追加の相乗的応用の例が提供されます。まとめると、ここで提供される例と議論は、AFMカンチレバーベースのナノインデンテーションを使用して事実上すべてのサンプルタイプの機械的特性を測定しようとしている研究者にとってのエントリポイントを提供するはずです。
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Disclosures
著者は、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
すべてのAFM実験は、ボイシ州立大学表面科学研究所(SSL)で実施されました。SEMの特性評価は、ボイシ州立材料特性評価センター(BSCMC)で実施されました。バイオ燃料原料に関するこの出版物で報告された研究は、原料変換インターフェースコンソーシアム(FCIC)の一部として、米国エネルギー省、エネルギー効率および再生可能エネルギー局、バイオエネルギー技術局、およびDOEアイダホオペレーションオフィス契約DE-AC07-051ID14517。細胞力学研究は、米国国立衛生研究所(米国)の助成金AG059923、AR075803、P20GM109095、および国立科学財団(米国)の助成金1929188および2025505によって支援されました。モデル脂質二重層システムの研究は、助成金R01 EY030067の下で国立衛生研究所(米国)によってサポートされました。著者らは、 図11に示す合成画像を作成したElton Graugnard博士に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atomic force microscope | Bruker | Dimension Icon | Uses Nanoscope control software, including PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM), FastForce Volume (FFV), and Point-and-Shoot Ramping experimental workspaces |
| AtomicJ | American Institute of Physics | https://doi.org/10.1063/1.4881683 | Flexible, powerful, free open source Java-based force curve analysis software package. Supports numerous contact mechanic models, such as Hertz, Sneddon DMT, JKR, Maugis, and cone or pyramid (including blunt and truncated). Also includes a variety of initial contact point estimation methods to choose from. Supports batch processing of data and subsequent statistical analysis (e.g., averages, standard deviations, histograms, goodness of fit, etc.). Literature citation is: P. Hermanowicz, M. Sarna, K. Burda, and H. Gabry , “AtomicJ: An open source software for analysis of force curves” Rev. Sci. Instrum. 85: 063703 (2014), https://doi.org/10.1063/1.4881683 |
| Buffer solution (PBS) | Fisher Chemical (NaCl), Sigma Aldrich (KCl), Fisher BioReagents (Na2HPO4 and KH2PO4) | S271 (>99% purity NaCl), P9541 (>99% purity KCl), BP332(>99% purity Na2HPO4), BP362 (>99% purity KH2PO4) | Phosphate buffered saline (PBS) was prepared in the laboratory as an aqueous solution consisting of 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4 dissolved in ultrapure water. Reagents were measured out using an analytical balance, and glassware was cleaned with soap and water followed by autoclaving immediately prior to use. |
| Chloroform | |||
| Diamond tip AFM probe | Bruker | PDNISP | Pre-mounted factory-calibrated cube corner diamond (E = 1140 GPa) tip AFM probe (nominal R = 40 nm) with a stainless steel cantilever (nominal k = 225 N/m, f0 = 50 kHz). Spring constant is measured at the factory (k = 256 N/m for the probe, Serial #13435414, used here) and calibration data (including AFM images of indents showing probe geometry) is provided with the probe. |
| Diamond ultramicrotome blade | Diatome | Ultra 35° | 2.1 mm width. Also used a standard glass blade for intial rough cut of sample surface before transitioning to diamond blade for final surface preparation |
| Epoxy | Gorilla Glue | 26853-31-6 | Epoxy resin and hardner were mixed in a 1:1 ratio, a small drop was placed on a stainless steel sample puck (Ted Pella), and V1 grade muscovite mica (Ted Pella) was attached to create an atomically flat surface for preparation of phospholipid membranes. |
| Ethanol | |||
| LR white resin, medium grade (catalyzed) | Electron Microscopy Sciences | 14381 | 500 mL bottle, Lot #150629 |
| Mesenchymal stem cells (MSCs) | N/A | N/A | MSCs for nanomechanical studies were primary cells harvested from 8-10 week old male C57BL/6 mice as described in Goelzer, M. et al. "Lamin A/C Is Dispensable to Mechanical Repression of Adipogenesis" Int J Mol Sci 22: 6580 (2021) doi:10.3390/ijms22126580 and Peister, A. et al. "Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential" Blood 103: 1662-1668 (2004), doi:10.1182/blood-2003-09-3070. |
| Modulus standards | Bruker | PFQNM-SMPKIT-12M | Used HOPG (E = 18 GPa) and PS (E = 2.7 GPa). Also contains 2x PDMS (Tack 0, E = 2.5 MPa; Tack 4, E = 3.5 MPa), PS-LDPE (E = 2.0/0.2 GPa), fused silica (E = 72.9 GPa), sapphire (E - 345 GPa), and tip characterization (titanium roughness) sample. All samples come pre-mounted on a 12 mm diameter steel disc (sample puck). |
| Muscovite mica | Ted Pella | 50-12 | 12 mm diameter, V1 grade muscovite mica |
| Nanscope Analysis | Bruker | Version 2.0 | Free AFM image processing and analysis software package, but designed for, and proprietary/limited to Bruker AFMs; similar functionality is available from free, platform-independent AFM image processing and analysis software packages such as Gwyddion, WSxM, and others. Has built-in capabilities for force curve analysis, but AtomicJ is more flexible/full featured (e.g., more built-in contact mechanics models to choose from, statistical analysis of force curve fitting results, etc.) for force curve analysis and handles batch processing of force curves. |
| Phospholipids: POPC, Cholesterol (ovine) | Avanti Polar Lipids | POPC: CAS # 26853-31-6, Cholesterol: CAS # 57-88-5 | POPC lipid dissolved in chloroform (25 mg/mL) was obtained from vendor and used without further purification. Cholesterol powder from the same vendor was dissolved in chloroform (20 mg/mL). |
| Probe holder (fluid, lipid bilayers) | Bruker | MTFML-V2 | Specific to the particular AFM used; MTFML-V2 is a glass probe holder for scanning in fluid on a MultiMode AFM. |
| Probe holder (fluid, MSCs) | Bruker | FastScan Bio Z-scanner | Used with Dimension FastScan head (XY flexure scanners). Serial number MXYPOM5-1B154. |
| Probe holder (standard, ambient) | Bruker | DAFMCH | Specific to the particular AFM used; DAFMCH is the standard contact and tapping mode probe holder for the Dimension Icon AFM, suitable for nanoindentation (PF-QNM, FFV, and point-and-shoot ramping) |
| Sample Puck | Ted Pella | 16218 | Product number is for 15 mm diameter stainless steel sample puck. Also available in 6 mm, 10 mm, 12 mm, and 20 mm diameters at https://www.tedpella.com/AFM_html/AFM.aspx#anchor842459 |
| Sapphire substrate | Bruker | PFQNM-SMPKIT-12M | Extremely hard surface (E = 345 GPa) for measuring deflection sensitivity of probes (want all of the deflection to come from the probe, not the substrate). Part of the PF-QNM/modulus standards kit. |
| Scanning electron microscope | Hitachi | S-3400N-II | Located at Boise State. Used to perform co-localized SEM/EDS on all samples except additively manufactured (AM) Ti-6Al-4V. |
| Silicon AFM probes (standard) | NuNano | Scout 350 | Standard tapping mode silicon probe with reflective aluminum backside coating; k = 42 N/m (nominal), f0 = 350 kHz. Nominal R = 5 nm. Also available uncoated or with reflective gold backside coating. Probes with similar specifications are available from other manufacturers (e.g., Bruker TESPA-V2). |
| Silicon AFM probes (stiff) | Bruker | RTESPA-525, RTESPA-525-30 | Rotated tip etched silicon probes with reflective aluminum backside coating; k = 200 N/m (nominal), f0 = 525 kHz. Nominal R = 8 nm for RTESPA-525, R = 30 nm for RTESPA-525-30. Spring constant of each RTESPA-525-30 is measured individually at the factory via laser Doppler vibrometry and supplied with the probe. |
| Silicon carbide grit paper (abrasive discs) | Allied | 50-10005 | 120 grit |
| Silicon nitride AFM probes (soft, large radius hemispherical tip) | Bruker | MLCT-SPH-5UM, MLCT-SPH-5UM-DC | Also MLCT-SPH-1UM-DC. New product line of factory-calibrated (probe radius and spring constants of all cantilevers) large radius (R = 1 or 5 mm) hemispherical tip (at the end of a 23 mm long cylindrical shaft) probes. DC = drift compensation coating. 6 cantilevers/probe (A-F). Nominal spring constants: A, k = 0.07 N/m; B, k = 0.02 N/m; C, k = 0.01 N/m; D, k = 0.03 N/m; E, k = 0.1 N/m; F, k = 0.6 N/m. |
| Silicon nitride AFM probes (soft, medium sharp tip) | Bruker | DNP | 4 cantilevers/probe (A-d). Nominal spring constants: A, k = 0.35 N/m; B, k = 0.12 N/m; C, k = 0.24 N/m; D, k = 0.06 N/m. Nominal radii of curvature, R = 10 nm. |
| Silicon nitride AFM probes (soft, sharp tip) | Bruker | ScanAsyst-Air | Nominal values: resonance frequency, f0 = 70 kHz; spring constant, k = 0.4 N/m; radius of curvature, R = 2 nm. Designed for force curve based AFM imaging. |
| Superglue | Henkel | Loctite 495 | Cyanoacrylate based instant adhesive. Lots of roughly equivalent products are readily available. |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000US | One channel syringe pump system with infusion and withdrawal capacity |
| Tip characterization standard | Bruker | PFQNM-SMPKIT-12M | Titanium (Ti) roughness standard. Part of the PF-QNM/modulus standards kit. |
| Ultrahigh purity nitrogen (UHP N2), 99.999% | Norco | SPG TUHPNI - T | T size compressed gas cylinder of ultrahigh purity (99.999%) nitrogen for drying samples |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC6 | Equipped with a glass blade (standard, for intial sample preparation) and a diamond blade (for final preparation) |
| Ultrapure water | Thermo Fisher | Barnstead Nanopure Model 7146 | Model has been discontinued, but equivalent products are available. Produces ≥18.2 MΩ*cm ultrapure water with 1-5 ppb TOC (total organic content), per inline UV monitoring. Includes 0.2 µm particulate filter, ion exchange columns, and UV oxidation chamber. |
| Variable Speed Grinder | Buehler | EcoMet 3000 | Used with silicon carbide grit papers during hand polishing. |
| Vibration isolation table (active) | Herzan | TS-140 | Used with Bruker MultiMode AFM. Sits on a TMC 65-531 vibration isolation table. Bruker Dimension Icon AFM utilizes strictly passive vibration isolation (comes from manufacturer with custom acoustic hood, air table, and granite slab). |
| Vibration isolation table (passive) | TMC | 65-531 | 35" x 30" vibration isolation table with optional air damping (disabled). Used with Bruker MultiMode AFM. Herzan TS-140 "Table Stable" active vibration control table is located on top. |
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