Summary
הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך שלב אחר שלב לייצור, תחזוקה והזדקנות הניתנים לשכפול של אורגנואידים מוחיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם (iPSCs). שיטה זו מאפשרת גידול והבשלה של אורגנואידים מוחיים לתקופות ממושכות, מה שמקל על מידול תהליכים המעורבים בהזדקנות המוח ובפתוגנזה הקשורה לגיל.
Abstract
המודלים הקיימים כיום בבעלי חיים ובתאים אינם משקפים באופן מלא את מורכבות השינויים המתרחשים במוח האנושי המזדקן. פיתוח עדכני של נהלים המתארים את הדור של אורגנואידים מוחיים אנושיים, שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs), הוא בעל פוטנציאל לשנות באופן יסודי את היכולת למדל ולהבין את הזדקנות המוח האנושי ותהליכים פתוגניים קשורים. כאן, מוצג פרוטוקול אופטימלי ליצירה, תחזוקה, הזדקנות ואפיון אורגנואידים מוחיים אנושיים שמקורם ב- iPSC. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי ליצור אורגנואידים במוח באופן הניתן לשחזור ומשמש כמדריך שלב אחר שלב, המשלב את הטכניקות העדכניות ביותר שמביאות להתבגרות אורגנואידים משופרת והזדקנות בתרבית. נושאים ספציפיים הקשורים להבשלת אורגנואידים, נמק, השתנות והשפעות אצווה מטופלות. יחד, פיתוחים טכנולוגיים אלה יאפשרו מידול של הזדקנות המוח באורגנואידים שמקורם במגוון תורמים אנושיים צעירים ומבוגרים, כמו גם אנשים הסובלים מהפרעות מוחיות הקשורות לגיל, ויאפשרו זיהוי מנגנונים פיזיולוגיים ופתוגניים של הזדקנות המוח האנושי.
Introduction
מודלים של מחלות הזדקנות הפכו רלוונטיים יותר ויותר ככל שתוחלת החיים האנושית ממשיכה לעלות. מחקרים גנומיים בקנה מידה גדול חשפו אוכלוסיות מבוגרות עם חוסר ויסות של תהליכים מולקולריים ושינויים גנטיים המשפיעים על איכות החיים1. תהליך ההזדקנות מאופיין באובדן כללי של התפקוד של האורגניזם, כולל אובדן תפקוד קוגניטיבי, סיכון מוגבר להפרעות נוירודגנרטיביות, ושורה של מחלות כרוניות2.
טכניקות תרבית התאים הנוכחיות אינן מייצגות כראוי את האופי הרב-גורמי של ההזדקנות, מכיוון שלא ניתן לשכפל כראוי תפקודים אלה באמצעות מוטציות, רעלים או זיהומים3. מודלים של בעלי חיים החוקרים את תהליך ההזדקנות קשורים לעתים קרובות לזמני ניסוי ארוכים ולעלויות גבוהות, אך גם מביאים איתם שיקולים אתיים. שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) מחולים יכול להבהיר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס התקדמות המחלה, שכן תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מאפשרים התפתחות טבעית של תאים לרקמה בוגרת3. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים הפכו לסוס העבודה של מעבדות רבות החוקרות הפרעות נוירודגנרטיביות, שכן נראה כי תכנות מחדש של תאים שנקטפו אינו מוחק את המחלה או את טביעות ההזדקנות של התורמים4. טביעות אלה משחזרות פנוטיפים תאיים שהודגמו במודלים של בני אדם ובעלי חיים, מה שהופך את תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למתאימים לבחינת הידרדרות תאית אינדיבידואלית של רקמת המוח הצפופה מאוד 5,6. אורגנואידים שמקורם ב-IPSC הפכו למודל המוביל לתרבית תלת-ממדית של רקמות, ומאפשרים אינטראקציות מורכבות יותר בין תאים ושחזור התפתחותי משופר. למרות שאורגנואידים משמשים בעיקר לנתונים התפתחותיים, אורגנואידים מיושמים יותר ויותר במידול מחלות, במיוחד מודלים לדלקת, ניוון עצבי והזדקנות7. בהתבסס על מחקרי iPSC קודמים, אורגנואידים שומרים על פנוטיפים של מחלות ופנוטיפים תאיים בהקשר הפיזיולוגי של חיבורי רשת דמויי רקמות 8,9. עם זאת, גידול רקמה תלת ממדית בממדים מסוימים יכול להיות מאתגר, במיוחד לפרקי זמן ממושכים.
עבודה זו מציגה שיטה מפורטת לייצור מחדש של אורגנואידים מוחיים המאפשרת לרקמה להבשיל באופן משמעותי בגודלה לתקופות ארוכות יותר. יצירת אורגנואידים מוחיים נותרה סטנדרטית יחסית, ואימצה שיטות מכמה פרוטוקולים בולטים10,11. עם זאת, הוצעו מספר שינויים לשיפור הבידול והתחזוקה. שיטות חלופיות אלה כוללות שימוש בגורמים נוירוגניים לשיפור התמיינות עצבית12, פיגומים נוספים לשיפור חילופי החומרים המזינים המקדמים אריכות ימים בתאים 13, ותסיסת מתח נמוכה לתרבית וצמיחה ממושכת14. שיפורים אלה שולבו בשיטה זו כדי לפתח אורגנואידים בוגרים המסוגלים לבטא פנוטיפים נוירודגנרטיביים ומזדקנים.
Protocol
מחקרי המטופלים אושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית. כל המשתתפים חתמו על הסכמה מדעת בכתב והסכמה למאגר כדי לאפשר לשנות את ייעוד הנתונים והדגימות הביולוגיות שלהם. קווי iPSC נוצרו בעקבות IRB והנחיות מוסדיות. איור 1 מדגים סקירה סכמטית של זרימת העבודה של פרוטוקול זה.
1. תכנות מחדש ותחזוקה של iPSC
- לאסוף 8 מ"ל מהדם של הנבדק (חולה מבוגר או חולה; גילאי 65 ומעלה) לתוך צינורות הכנת תאים (CPT) עם ציטראט נתרן או לתוך EDTA או צינורות heparinized.
- צנטריפוגה במהירות 1,800 x גרם למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לאיסוף גלולה המכילה דם היקפי בלבד וללא סרום15.
- השתמש בווקטורים מיוחדים לתכנות מחדש בהתאם לפרוטוקול היצרן (ראה טבלת חומרים) כדי להשיג iPSCs16.
- תאי גזע מושרים ב-LDEV (LDEV) ללא מזין וללא לקטוז דהידרוגנאז המצופים במטריצת קרום מרתף מצופות 6 בארות במדיה חיונית 8 (E8) (ראה טבלת חומרים) ב-37°C באטמוספירה לחה עם 5% CO2.
- יש לשמור על תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במדיית E8 למשך 3-4 ימים על מנת למנוע צפיפות או בידול ספונטני.
- אמת את הפלוריפוטנציה של קווי iPSC באמצעות סמנים אימונופלואורסצנטיים (שלב 2) ובדוק מיקופלסמה (שלב 3).
2. צביעת פלוריפוטנציה
- כדי לשמר תמיסות ונוגדנים, זרעו את התאים על צלחות תרבית מצופות (שלב 1.4) 24 בארות 3-4 ימים לפני הניתוח. שאפו את המדיום עם פיפטה וקבעו את התאים עם 4% פורמלדהיד במי מלח חוצצים פוספט (1x PBS) למשך 15-20 דקות ב-RT.
- שטפו את התאים 3x עם 1x PBS וחדרו עם 0.1% Triton-X 100 in 1% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS למשך 15 דקות לפחות, אך לא יותר משעה אחת ב-RT.
- שטפו 3x עם 1x PBS וחסמו עם 5% BSA ב-PBS למשך 30 דקות ב-RT.
- יש לשטוף שוב 3x עם 1x PBS ולהוסיף את הנוגדנים Sox2 ו-Oct3/4 (דילול 1:100; ראו טבלת חומרים), ואת כתם הגרעין DAPI ב-1% BSA (דילול 1:4,000) למשך הלילה ב-4°C. יש לעטוף ברדיד אלומיניום להגנה מפני אור.
- שטפו 3x עם 1x PBS והשאירו את התאים ב-PBS. תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 10-20. ודא כי סמני פלוריפוטנציה Sox2 ו- Oct3/4 ממוקמים בגרעין התאים17,18.
3. בדיקת מיקופלסמה
הערה: עיין בפרוטוקול של ערכת האיתור (ראה טבלת חומרים) לקבלת שלבים מפורטים לביצוע הבדיקה ולניתוחה. ערכת הזיהוי מספקת את המגיב, המצע ומאגר הבדיקה לבדיקת מיקופלסמה.
- לפני העברת תאים או מדיום רענון, אספו 2-3 מ"ל של מדיום תרבית תאים בצינור צנטריפוגה ושחררו את כל התאים או הפסולת במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות ב-RT. אחסנו את הסופרנאטנט בטמפרטורה של 4°C למשך ≤5 ימים. לדגור על התאים עם המדיום במשך 24 שעות לפחות כדי להבטיח אות לזיהוי.
- יש להוסיף 100 μL של תא-על-נאטנט לצינור טרי או לבאר של צלחת בעלת דופן לבנה בעלת 96 בארות (מומלץ להשתמש בתחתית אטומה, ראו טבלת חומרים). הרכיבו מחדש את המגיב והמצע במאגר הבדיקה ושיווי משקל למשך 15 דקות ב- RT.
- הוסף 100 μL של מגיב לדגימה ודגר במשך 5 דקות ב RT. למדוד את luminescence עם luminometer (מדידה #1).
- הוסף 100 μL של המצע לדגימה ודגר במשך 10 דקות ב RT. למדוד את ההארה (מדידה #2).
- לקבוע את זיהום מיקופלסמה על ידי יחס המדידה #2 ל #1. עיין במדריך הערכה לפירוש התוצאות.
4. הכנת מיקרופילמנט
- התחל את הכנת המיקרופילמנטים הפולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA, ראה טבלת חומרים) על ידי שחיקת גדיל התפר עם הקצה הקהה של אזמל. עקרו קלות את הסיב המרופט עם 70% אתנול.
- תחת המיקרוסקופ ובאמצעות סרגל, מתחילים לחתוך את סיבי PLGA לשברים של גדילים באורך 500 מיקרומטר עד 1 מ"מ. חותכים כ -25 מ"מ מהסיבים בסך הכל. שמור את החוטים בצינור 15 מ"ל עם 1 מ"ל פתרון אנטיביוטי-אנטי-מיקוטי.
- במכסה המנוע, דללו את תמיסת הסיבים עם 10 מ"ל של DMEM/F-12 (טבלה 1). מערבלים היטב כדי לערבב את הפתרון.
הערה: עבודה במכסה מנוע זרימה של תרבית תאים בסביבה סטרילית.
- במכסה המנוע, דללו את תמיסת הסיבים עם 10 מ"ל של DMEM/F-12 (טבלה 1). מערבלים היטב כדי לערבב את הפתרון.
- הוסף 20 μL של תמיסת סיבים לשלושה גופים עובריים (EB) היוצרים בארות של צלחת 96 בארות. תחת מיקרוסקופ brightfield, לספור ולממוצע את הסיבים לכל באר. לדלל או להתרכז בממוצע 5-10 microfilaments PLGA לכל באר. הכינו כל באר באופן זה.
- הבארות מוכנות כעת להזרעה עם תאים. אחסנו את הצלחת בטמפרטורת החדר עד לצורך או בטמפרטורה של 4°C ליום המחרת.
5. היווצרות גוף עוברי (EB)
הערה: יש לחמם את כל המדיה והפתרונות ל-RT.
- ברגע שהגזעים הפלוריפוטנטיים מושרים הגיעו למפגש של 70%-80% (איור 2A), הם מוכנים למעבר ולשימוש ליצירת EB. בדוק את התאים עם מיקרוסקופ בהגדלה של 10x-20x. ודא שהמושבות מציגות אזורים מינימליים (<10%) של בידול ספונטני.
- שואפים את המדיום עם פיפטה ולשטוף את התאים פעם אחת עם DPBS. נתקו את המושבות על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים (ראו טבלת חומרים) או 0.5 מילימטר של חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ודגרו במשך 3-5 דקות ב-37°C.
הערה: עבודה במכסה מנוע זרימה של תרבית תאים בסביבה סטרילית. - אספו את התאים ששוחררו על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיה E8 טרייה לכל באר ופיפטה בעדינות עד שכל התאים מנותקים.
- העבר 1.5 מ"ל של תרחיף תאים לצינור של 15 מ"ל, והוסף עוד 1 מ"ל של מדיה E8 טרייה כדי להגיע לנפח כולל של 2.5 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך 3 דקות ב RT.
- שאפו את הסופרנאטנט עם פיפטה, השהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של מדיה חיונית 6 (E6, ראו טבלת חומרים) בתוספת מעכב ROCK של 50 מיקרומטר, וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר19.
- הכינו תרחיף תאים של 60,000-90,000 תאים/מ"ל, בהתאם לצפיפות הזריעה הרצויה, במדיית E6 בתוספת 50 מיקרומטר של מעכב ROCK (ראו טבלת חומרים).
- הוסף 150 μL של תרחיף התא לתוך כל באר של צלחת ULA 96 באר (או צלחת קעורה מוכנה20). זרעו 9,000-11,000 תאים לבאר.
- צנטריפוגה את הצלחת כדי לצבור בכוח את התאים ב 290 x גרם במשך דקה אחת ב RT. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 ° C באווירה לחה עם 5% CO2.
6. אינדוקציה נוירואפיתל
- לאחר 24 שעות, בזהירות לשאוף 120 μL של התקשורת עם פיפטה. ודא לא לשאוף את EB על ידי הורדת קצה פיפטה רחוק מדי לתוך הבאר.
- הוסף 150 μL של מדיה E6 (ב- RT) בתוספת 2 μM של XAV939 ומעכבי SMAD: 10 מיקרומטר של SB431542 ו- 500 ננומטר של LDN 193189 לכל באר (ראה טבלת חומרים).
- שנה את המדיום מדי יום עם מדיה E6 מוכן טרי בתוספת 2 מיקרומטר של XAV939, 10 מיקרומטר של SB431542, ו 500 ננומטר של LDN 193189.
הערה: עד היום השישי (DIV6), ה- EBs צריכים להיות בקוטר של 550-600 מיקרומטר ולהיות מוכנים להבחנה נוספת.
7. הבחנה והתבגרות אורגנואידים
הערה: יש לחמם את כל המדיה ל- RT.
- בקירוב DIV7, בדקו אם כל ה-EBs הגיעו לקוטר של 550-600 מיקרומטר ומציגים קצה חלק וברור (איור 2B); בשלב זה, הם מוכנים להיות מוטמעים במטריצה חוץ-תאית (ECM).
הערה: עבוד בסביבה סטרילית. - הכינו יריעות הטבעה מסרט האיטום התרמופלסטי (ראו טבלת חומרים) על ידי הנחת יריעת פילם (באורך של כ-12 ס"מ) על קופסת P200 ריקה. באמצעות צינור חרוטי 15 מ"ל או צינור מיקרוצנטריפוגה 500 μL, לחץ בעדינות על יריעת הסרט לתוך החורים כדי ליצור 12 גומות. רססו את יריעת הסרט באתנול 70% והניחו לה להתייבש בתוך מכסה המנוע כאשר אור ה-UV דולק למשך 30 דקות לפחות.
- הפשירו כמות מספקת של מטריצת קרום מרתף (Matrigel, ראו טבלת חומרים) על קרח והניחו אותה בתוך מכסה הזורם.
הערה: לכל EB, יש צורך בכ- 30 μL של מטריצת קרום לא מדוללת. יש לשמור תמיד על מטריצת הממברנה מתחת ל-4°C כדי למנוע ממנה להצטמרר. קצות פיפטה מקוררים מראש מומלצים גם מכיוון שהם מאטים את המטריצה מפילמור בקצה במהלך פיפטינג, ובכך מפחיתים את אובדן החומר. - בעזרת קצה P200 רחב, העבירו EB אחד לכל גומה, והסירו כמה שיותר מדיה עם קצה פיפטה רגיל. שימו לב לא לתת ל-EBs להתייבש. באמצעות קצה P200 רגיל, הוסף ~ 30 μL של מטריצת ממברנה לא מדוללת לכל אורגנואיד, וודא שה- EB נמצא במרכז הטיפה.
- לאחר שכל ה-EBs מוטמעים במטריצה, הניחו את יריעת הסרט המכילה את ה-EBs בצלחת פטרי סטרילית.
הערה: לחלופין, ניתן להניח צלחת פטרי קטנה מלאה במים סטריליים בצלחת הפטרי הגדולה יותר ליד יריעת הסרט כדי למנוע אידוי.- מעבירים את המנה לאינקובטור ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה עם 5%CO2 למשך כ-10 דקות כדי לאפשר למטריצת הממברנה להתמצק.
- עבור כל קבוצה של 12 אורגנואידים משובצים, הכינו 5 מ"ל של אמצעי התמיינות עם B27 ללא ויטמין A (טבלה 1) בבאר אחת של צלחת ULA 6 בארות. מחממים מראש את הצלחת ל 37 מעלות צלזיוס באינקובטור.
- לאחר סיום זמן הדגירה, העבר את ה- EBs המוטבעים לצלחת ULA 6-well על ידי לקיחת יריעת הסרט ודחיפת הגומות מגב הסדין. במידת הצורך, לקחת 1 מ"ל מן הבאר ו pipete אותו על היריעה כדי לעזור טיפות להתנתק מן הסרט.
הערה: ניתן לראות שינויים מורפולוגיים חשובים יום אחד לאחר ההטבעה; EBs עוברים מקצוות חלקים לבליטות בולטות היוצרות ניצנים (איור 2C). - לאחר יומיים (DIV9), בצע שינוי חצי מדיה. היזהרו שלא לשאוף או לפגוע בטיפות מטריצת הממברנה בתהליך.
- לאחר יומיים נוספים (DIV11), בצע שינוי מדיה מלא, והשלים את המדיה עם 3 מיקרומטר של CHIR99021 (ראה טבלת חומרים).
- ב-DIV14, שנו את המדיה למדיה מבדלת עם B27 עם ויטמין A (טבלה 1) לעלייה הדרגתית בגודל האורגנואידים.
- ב- DIV16, הניחו את צלחת הבאר על שייקר מסלול ב -90 סל"ד בתוך אינקובטור. שנה את המדיה כל יומיים.
- כל 40 DIV, לדלל 500 μL של מטריצת הממברנה עבור כל 50 מ"ל של מדיה עבור חומרים מזינים נוספים במדיה.
Representative Results
שילוב סיבי PLGA, הטבעה של גומות חן ותסיסה מוביל ליצירה חזקה של אורגנואידים מוחיים המאפשרת לתרביות שמקורן ב-iPSC להישמר לפרקי זמן ממושכים (איור 1).
איור 1: המחשה סכמטית של זרימת העבודה וציר הזמן של שיטה זו. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
תקופת האינדוקציה העצבית הראשונית דומה להליכים שפורסמו בעבר11. הגופים העובריים (EB) מתחילים כאגרגטים מעגליים (איור 2B) עם קצוות לבנים או שקופים. כאשר ה-EB משתנה ממדיה אינדוקציה עצבית למדיה של תחזוקה עצבית ב-DIV7, בליטות וניצנים מופיעים תוך 24 שעות מהרקמה המעגלית (איור 2C). יתר על כן, ככל שהאורגנואיד ממשיך לגדול, שטח הפנים של סיבי PLGA מסייע לאורגנואיד להתארך (איור 2D). במהלך ההתבגרות, הקצוות של אורגנואיד צריך להישאר שלם, כפי שהוא סימן טוב של תאים בריאים ופיתוח; אחרת, יש לספק חומרי מזון נוספים13 (איור 2E). הצמיחה של אורגנואידים הוא הקל עוד יותר על ידי תסיסה של תרבות אורגנואידים, כמו זה משפר זילוח עם חומרים מזינים.
איור 2: התמיינות והבשלה של אורגנואידים מוחיים. (A) תמונה מייצגת של תרבית iPSC במפגש של 70%-80%. (B) גופים עובריים (EBs) נוצרו והיווצרות נוירואפיתל הושרה עד DIV7. EBs הוטמעו אז במטריצת הממברנה והתמיינו עוד יותר לכיוון אורגנואידים מוחיים. (C) אורגנואידים ב-DIV10 המציגים תצורות ניצנים מובחנות. אורגנואידים יכולים להבשיל עוד יותר במטריצת הממברנה באמצעות (D) גומה או (E) הטבעה של סנדוויץ', כאן מוצג ב-DIV30. (F) תרבית ארוכת טווח מראה אורגנואידים מוחיים הגדלים לגדלים משמעותיים (DIV70). סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
את הממדים והמורפולוגיה החיצונית של האורגנואיד משלימה ארכיטקטורה מורכבת בתוך האורגנואיד. לאחר קיבוע הרקמה ב-DIV7 לאחר השלב הראשון של ההתמיינות, תאים של EB מבטאים SOX2, גורם שעתוק קופסת HMG הפועל כסמן עבור תאי גזע עצביים רב-פוטנטיים21, כמו גם קופסת חלבון מזווגת, Pax-6, המציינת תאי אב עצביים (איור 3). תאי עצב לא בשלים המסומנים על ידי TuJ1 (Class III β-tubulin)22 כבר נראים מפוזרים ברחבי הרקמה.
בשלב זה מתגלה דוגמה לארגון העצמי שעוברים אורגנואידים אלה. ארגון מבנים רדיאליים, הנקראים רוזטות, מקביל לצינור העצבי, עם תאי SOX2+ במרכז הרוזטה21 ו-PAX6 לכיוון פריפריית הרוזטה. רוזטות אלה יוצרות תאי עצב כאשר הן נודדות החוצה. תאים מקרינים אלה הם בתחילה חיוביים כפולים עבור סמן תאי גזע/אב עצבי Nestin23 וחלבון גליה פיברילרי חומצי (GFAP), בדומה לגליה רדיאלית המצויה באזורים נוירוגניים במוח in vivo . כאשר תאי עצב נודדים אלה מתבגרים, הסמנים הציטו-שלדיים משקפים את השינוי הזה22. סמן התמיינות עצבית בשלב מוקדם TuJ1 22 נראה במעגל הפנימי של הרוזטה ועובר לחלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2 )24, סמן התבגרות ספציפי לנוירון בפריפריה.
איור 3: גופים עובריים ב-DIV7 מראים ארגון מבני ואפיון לא בשל. תמונת אימונוהיסטוכימיה של הר שלם של EB ב- DIV7. (A) תמונה מורכבת של EB המציגה (B) רוזטות עצביות SOX2+, (C) תאי עצב לא בוגרים (TUJ1) המפוזרים ברחבי EB, (D) תאי אב עצביים (PAX6), ו-(E) גרעינים המתוארים על-ידי DAPI. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ככל שהאורגנואידים מזדקנים, הארגון והסמנים של תאי העצב המתפתחים מתחילים לשכפל מצבים פיזיולוגיים. ב-DIV30 ניתן לראות רוזטות רבות היוצרות אזורים נוירוגניים המקבילים למוח המתפתח25. לפי DIV60, האזורים הנוירוגניים האלה של SOX2+ אינם קיימים והם מוחלפים על-ידי MAP2 ו-NeuN26 בוגרים, סמן התמיינות של נוירונים, ותאי עצב חיוביים (איור 4 ואיור 5).
איור 4: אורגנואידים ב-DIV120 מראים אפיון עצבי בוגר. תמונה אימונוהיסטוכימית של קטע אורגנואיד ב-DIV 120. (A) תמונה מורכבת של המקטע המציגה סמנים עצביים בוגרים של (B) MAP2 (סגול) ו-(C) NeuN (ירוק). (D) גרעינים הודגמו על ידי DAPI. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: PCR טיפתי דיגיטלי של אורגנואידים DIV120. גרפים דיגיטליים של טיפות PCR המציגים את ערך הביטוי המוחלט של (A) MAP2 (למעלה, כחול) ו- (B) NeuN (למטה, ירוק). קווים צהובים חתוכים מפרידים בין קווי iPSC שונים (A, B, C וכו'), ואורגנואידים חוברו יחד. N = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
הסמנים הציטו-שלדיים האלה יכולים לשמש בשילוב עם סמנים פוסט-מיטוטיים אחרים (כמו doublecortin27 ו-synapsin28) כדי לחפש פלסטיות סינפטית וירידות אחרות הקשורות לגיל (איור 6), כמו גם רקמת מוח נוספת כמו אסטרוציטים וגליה (איור 7).
איור 6: דוגמה לניתוח מסוף סינפטי. תמונה אימונוהיסטוכימית של קטע מהאורגנואיד ב-DIV 120. (A) תמונה מורכבת של המקטע המוכתם עבור (B) MAP2, (C) doublecortin (DCX) ו-(D) synapsin I (SYN). (E) גרעינים הודגמו על ידי DAPI. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: עדות להתפתחות גלייה. תמונה אימונוהיסטוכימית של קטע מהאורגנואיד ב-DIV 120. (A) תמונה מורכבת של החלק המוכתם עבור (B) מולקולת מתאם קשירת סידן מיונן 1 (Iba1) ו-(C) NeuN. (D) גרעינים הודגמו על ידי DAPI. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| מגיב | ריכוז סופי | נפח (50 מ"ל סה"כ) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 מ"ל |
| מדיום נוירובזלי | 50% | 25 מ"ל |
| תוסף N2 (100x) | 1x | 0.25 מ"ל |
| תוסף B27 -/+ ויטמין A (50x) | פי 0.5 | 0.5 מ"ל |
| אינסולין | 0.25% | 12.5 מיקרוליטר |
| GlutaMAX (פי 100) | 1x | 0.5 מ"ל |
| MEM-NEAA (פי 100) | פי 0.5 | 0.25 מ"ל |
| HEPES (1 מטר) | 10 מ"מ | 0.5 מ"ל |
| אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית (100x) | 1x | 0.5 מ"ל |
| 2-β-מרקפטואתנול | 50 מיקרומטר | 17.5 מיקרוליטר |
| *הערה: חלק מה-DMEM-F12 כבר מכיל GlutaMAX, אין צורך להוסיף עוד. | ||
טבלה 1: הרכב אמצעי הבידול שנעשה בהם שימוש במחקר הנוכחי.
Discussion
ההיווצרות המתוקננת של EBs היא שלב קריטי בהמרה הניתנת לשחזור של תאי גזע פלוריפוטנטיים לאורגנואידים במוח. צבירת הכוח של תאי גזע לרקמות בודדות יכולה להשתנות בהתאם לגיאומטריה של הבארות הקעורות, צפיפות הזריעה והטיפול היטב. למרות שהשיטה הנוכחית מציינת טווח קוטר של 500-600 מיקרומטר לאחר 6 ימים, קטרים אלה אינם שוללים קטרים אחרים של היווצרות אורגנואידים נכונה, שכן קטרים רבים אחרים הוכחו כמוצלחים. עם זאת, קטרים משתנים הוכחו כמשפיעים על שיעורי בידול והצלחה29. למטרות שחזור, שינויי קוטר מתחת ל-50 מיקרומטר מומלצים מאוד20. בנוסף, ניתן להאריך את מספר ימי ההשראה העצבית מ-6 ל-10 ימים כדי לאפשר ל-EBs לגדול בקוטר, שכן השימוש במעכבי SMAD הוכח כמייצר ושומר ביעילות על היווצרות נוירואפיתליה לאחר 5 ימים בלבד של חשיפה30. בהיעדר מעכבי SMAD, אינדוקציה עצבית יכולה להניב תוצאות לא עקביות, הדורשות תקופות השראה ארוכות יותר. מעכבי SMAD שצוטטו בעבודה זו הם היעילים ביותר, אך ניתן להשתמש במולקולות קטנות אחרות של דורסומורפין ו- TGF-β בריכוז היעיל שלהן.
מטריצת קרום המרתף מספקת מצע מצוין לצמיחה וניתן לנהל אותה אחרת. שימושים מוקדמים במטריצה כללו את קרום הבסיס כציפוי באר31. עם זאת, השימוש במטריצה להטמעת רקמה הראה שיפור התמיינות והתבגרות ברקמות אלה32. עבור אורגנואידים, השימוש במטריצה הוכח כמשפר את התמיינות EB לאורגנואידים, מקדם התבגרות ומאריך תקופות תרבית33. בעוד אורגנואידים עדיין יכולים להיווצר ללא המטריצה, כפי שקבוצות רבות שאפו להשיג תרבית רקמה נטולת מטריצה 34,35, מחקרים מצאו כי לאורגנואידים המשובצים במטריצה יש סיכוי גבוה יותר לזמני תרבית ארוכים יותר ודורשים פחות תחזוקה36. שיטת הגומה של הטבעה מספקת כיסוי שווה של משטח האורגנואידים, ומבטיחה דיפוזיה דומה, גישה לחומרים מזינים והתמיינות הניתנת לשחזור. לחלופין, ניתן להשתמש בהטבעה של כיפה כדי לתמצת באופן מלא את האורגנואידים37.
העברת ה- EBs לגומות החן של מטריצת הממברנה היא שלב קריטי. למרות שלקצה פיפטה של 1 מ"ל יש פתח רחב מספיק כדי להעביר את ה- EBs, קצה של 200 מיקרוליטר עדיף כדי להקל על ההעברה. יש לחתוך את הקצוות של 200 μL כדי ליצור פתח גדול מספיק, מה שמבטיח קצה חלק כדי להפחית את לחץ הגזירה בעת פיפט. לחלופין, קיימים טיפים רחבים של 200 μL כדי להקל על ההעברה. פיפטינג צריך להיעשות לאט, שכן פיפטינג מהיר עלול לשבש את הפריפריה האורגנואידית ולעכב צמיחה תקינה. יש להקדיש תשומת לב מיוחדת כדי להבטיח העברת מספיק מדיום כדי לספק חומרים מזינים. מעט מדי מדיום מסתכן בייבוש האורגנואיד וגורם לנמק. העברת EB עם יותר מדי מדיה תרבותית יכולה לגרום למטריצה להיות מדוללת מדי ולא לתמצת את האורגנואיד בצורה מאובטחת. באופן אידיאלי, אין לדלל את המטריצה ביותר מ -50% כדי להבטיח את פילמור שלה ולתפקד כ- ECM עבור EBs. אם ההטבעה נכשלת, ניתן לשחזר את ה- EB ולתמצת אותו מחדש. אנקפסולציה מחדש במטריצה הטרייה יכולה להיעשות בכל נקודה כדי לספק לאורגנואיד תמיכה נוספת.
בדומה להטמעת מטריצה לפיגומים, סיבי PLGA מספקים תמיכה נוספת לצמיחה תלת מימדית. שילוב סיבי PLGA, ששולבו במקור כדי לייצר אורגנואידים מוארכים ולהגדיל את שטח הפנים38, זוהה בהדרגה ככלי נוסף לשיפור התמיינות והבשלה של אורגנואידים39. ככל שמעבדות נוספות מנסות לצמצם את השימוש במטריצה או לבטל אותה לחלוטין, תכונות הארגון העצמי של אורגנואידים הנתמכות על ידי הסיבים המשולבים מספקות מספיק פיגומים ליצירת רקמות תלת ממדיות והתמיינות39. כאן, שתי השיטות שולבו כדי להגדיל את הסיכויים לתרבות ארוכת טווח38,39. שילוב הסיבים במהלך הצבירה הראשונית הוא קריטי, שכן אלה עשויים שלא להיות מוצגים בשלב מאוחר יותר. לאחר הצנטריפוגה, בדיקה כי כמה סיבים נמצאים בין התאים המצטברים תבטיח כי סיב משולב EB. אם לא יצליח, שאיפה עדינה של הבאר וצנטריפוגה מחדש אמורה להבטיח ערבוב.
צעד קריטי נוסף בתחזוקת אורגנואידים הוא הכנסת שייקר אורביטלי לזילוח מדיה טוב יותר. באיטרציות מוקדמות של פרוטוקולים אורגנואידים, ביוריאקטור מסתובב שימש ליצירת תסיסה11. שייקר אורביטלי ב-90 סל"ד מספק תסיסה מספקת מבלי להרוס את טיפת המטריצה או לפגוע במורפולוגיה של אורגנואידים. חלק מהקבוצות נמנעות משימוש בפיגום המטריקס אך שומרות על תסיסה כדי לספק סביבה מתאימה34. כמו בכל הפרוטוקולים, יש להתאים את מהירות הסיבובים בהתאם לשייקר כדי להפחית את כמות לחץ הגזירה. אם נבחרה הטמעת כיפה, ניתן להשתמש בשייקר מוטה כדי להפחית את כמות לחץ הגזירה11,34.
יחד, השילוב של מספר טכניקות נבחרות מספק שיטה חזקה ליצירת אורגנואידים הנגזרים מ- iPSC. ישנן מספר דרכים ליצור ולשמר אורגנואידים, אך רבות מהן מתמקדות במסלולי התמיינות מוקדמים. בעבודה זו, טכניקות רבות ושונות שולבו לתרבית אורגנואידים לפרקי זמן ממושכים, מעבר לשלב ההתמיינות, ולתקופת הבשלה שבה פנוטיפים מזדקנים יכולים להתחיל להתפתח. שילוב טכניקות אלה מאפשר התבגרות ממושכת ללא צורך בגורמים ביולוגיים אקסוגניים כדי לשמור על התרביות, תוך שמירה על הארגון העצמי וההתקדמות הטבעית של ההזדקנות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי יוזמת איבר-על-שבב ההולנדית, פרויקט כבידה של NWO (024.003.001) במימון משרד החינוך, התרבות והמדע של ממשלת הולנד. D.C.B. מודה תודה על התמיכה הכספית של Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) בצורה של מלגת דוקטורט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-β-Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindoledihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 1:4000 |
| 6-well Clear Flat Bottom CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate | Greiner Bio-One | 657185 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Well Plate | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | Thermo Fisher Scientific | 136101 | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | 46964 | cell detachment solution |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | |
| B27 Suppement (with Vitamin A) (50x) | Gibco | 17504044 | |
| B27 Supplement (minus Vitamin A) (50x) | Gibco | 12587010 | |
| BD Vacutainer™ Glass Mononuclear Cell Preparation (CPT) Tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-685-125 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | With plate holders |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune Sendai Reprogramming Vector | Thermo Fisher Scientific | A1378001 | |
| ddPCR primers | human | MAPT | Bio-Rad | dHsaCPE192234 | |
| ddPCR primers | human | RBFOX3 (NeuN) | Bio-Rad | dHsaCPE5052108 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
| Doublecortin (DCX) | Santa Cruz Biotechnology | SC-8066 | 1:500 |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | no calcium, no magnesium |
| Eppendorf cups, 1.5 mL | Eppendorf | 0030 125.215 | |
| Essential 6 | Gibco | A1516401 | |
| Essential 8 | Gibco | A1517001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Invitrogen | 15575020 | |
| Falcon tubes, 15 mL, conical | Greiner Bio-One | 188271-N | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | 37% Stock solution, diluted to 4% in PBS |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413202 | |
| GlutaMax (100x) | Gibco | 35050038 | |
| Hemacytometer cell counter | Hausser scientific | 1490 | |
| HEPES Buffer | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| LDN 193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| MAP2 | Abcam | ab32454 | 1:200 |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 356230 | basement membrane matrix |
| MEM-Non Essential Amino Acid Solution (MEM-NEAA; 100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Multilabel Counter Victor 3 Plate Reader | Perkin Elmer | 1420 | luminometer |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | LT07-318 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NeuN | Millipore | MAB377 | 1:500 |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 AF647 | 1:100 |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | thermoplastic film sheet |
| PAX6 | Thermo Fisher Scientific | 42-6600 | 1:200 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microfilaments | Ethicon | J463 | |
| QX200 Droplet digital PCR system | Bio-Rad | 1864001 | |
| ROCK inhibitor (Y27632) | Selleck Chemicals | S1049 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614/50 | |
| SOX2 Monoclonal Antibody (Btjce), Alexa Fluor 488, eBioscience | Invitrogen | 53-9811-80 | 1:100 |
| Synapsin I (SYN) | Calbiochem | 574777 | 1:200 |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TUJ1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-80005 | Beta-3-tubulin; 1:500 |
| XAV939 | Tocris Bioscience | 3748 |
References
- Liu, G. H., et al. Aging Atlas: a multi-omics database for aging biology. Nucleic Acids Research. 49, 825-830 (2021).
- Ferrucci, L., et al. Measuring biological aging in humans: A quest. Cell. 19 (2), 13080 (2020).
- Mertens, J., Reid, D., Lau, S., Kim, Y., Gage, F. H. Aging in a dish: iPSC-derived and directly induced neurons for studying brain aging and age-related neurodegenerative diseases. Annu Rev Genet. 52, 271-293 (2018).
- Mertens, J., et al. Age-dependent instability of mature neuronal fate in induced neurons from Alzheimer's patients. Cell Stem Cell. 28 (9), 1533-1548 (2021).
- Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1141-1154 (2018).
- Fang, E. F., et al. Mitophagy inhibits amyloid-β and tau pathology and reverses cognitive deficits in models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 22 (3), 401-412 (2019).
- Hu, J. L., Todhunter, M. E., LaBarge, M. A., Gartner, Z. J. Opportunities for organoids as new models of aging. Journal of Cell Biology. 217 (1), 39-50 (2018).
- Choi, S. H., et al. A three-dimensional human neural cell culture model of Alzheimer's disease. Nature. 515 (7526), 274-278 (2014).
- Gonzalez, C., et al. Modeling amyloid beta and tau pathology in human cerebral organoids. Molecular Psychiatry. 23 (12), 2363-2374 (2018).
- Yoon, S. -J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Muratore, C. R., Srikanth, P., Callahan, D. G., Young-Pearse, T. L. Comparison and optimization of hiPSC forebrain cortical differentiation protocols. PLoS ONE. 9 (8), 105807 (2014).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2020).
- Goto-Silva, L., et al. Computational fluid dynamic analysis of physical forces playing a role in brain organoid cultures in two different multiplex platforms. BMC Developmental Biology. 19 (1), 1-10 (2019).
- Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. Journal of Visualized Experiments. (68), e4327 (2012).
- Beers, J., et al. A cost-effective and efficient reprogramming platform for large-scale production of integration-free human induced pluripotent stem cells in chemically defined culture. Scientific Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
- Wakao, S., et al. Morphologic and gene expression criteria for identifying human induced pluripotent stem cells. PLoS ONE. 7 (12), e48677 (2012).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).
- JoVE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2022).
- Choy Buentello, D., Koch, L. S., Trujillo-De Santiago, G., Alvarez, M. M., Broersen, K. Use of standard U-bottom and V-bottom well plates to generate neuroepithelial embryoid bodies. PLOS ONE. 17 (5), 0262062 (2022).
- Ellis, P., et al. SOX2, a persistent marker for multipotential neural stem cells derived from embryonic stem cells, the embryo or the adult. Developmental Neuroscience. 26 (2-4), 148-165 (2004).
- Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. European Journal of Cell Biology. 84 (2-3), 453-459 (2005).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Soltani, M. H., et al. Microtubule-associated protein 2, a marker of neuronal differentiation, induces mitotic defects, inhibits growth of melanoma cells, and predicts metastatic potential of cutaneous melanoma. The American Journal of Pathology. 166 (6), 1841-1850 (2005).
- Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2 (1), 67-77 (2006).
- Gusel'nikova, V. V., Korzhevskiy, D. E. NeuN as a neuronal nuclear antigen and neuron differentiation marker. Acta Naturae. 7 (25), 42-47 (2015).
- Rao, M. S., Hattiangady, B., Shetty, A. K. The window and mechanisms of major age-related decline in the production of new neurons within the dentate gyrus of the hippocampus. Aging Cell. 5 (6), 545-558 (2006).
- Meng, L., et al. A synapsin I cleavage fragment contributes to synaptic dysfunction in Alzheimer's disease. Aging Cell. 21 (5), 13619 (2022).
- Moon, S. H., et al. Optimizing human embryonic stem cells differentiation efficiency by screening size-tunable homogenous embryoid bodies. Biomaterials. 35 (23), 5987-5997 (2014).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Lee, S. -W., et al. Optimization of Matrigel-based culture for expansion of neural stem cells. Animal Cells and Systems. 19 (3), 175-180 (2015).
- Zhang, J., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Hocevar, S. E., Liu, L., Duncan, R. K. Matrigel is required for efficient differentiation of isolated, stem cell-derived otic vesicles into inner ear organoids. Stem Cell Research. 53, 102295 (2021).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
- Kozlowski, M. T., Crook, C. J., Ku, H. T. Towards organoid culture without Matrigel. Communications Biology. 4 (1), 1-15 (2021).
- Kaiser, A., Kale, A., Novozhilova, E., Olivius, P. The effects of Matrigel® on the survival and differentiation of a human neural progenitor dissociated sphere culture. The Anatomical Record. 303 (3), 441-450 (2020).
- Kakni, P., et al. Intestinal organoid culture in polymer film-based microwell arrays. Advanced Biosystems. 4 (10), 2000126 (2020).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nature Biotechnology. 35 (7), 659-666 (2017).
- Tejchman, A., Znój, A., Chlebanowska, P., Frączek-Szczypta, A., Majka, M. Carbon fibers as a new type of scaffold for midbrain organoid development. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 5959 (2020).
